CN117143210A - 一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用 - Google Patents
一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种促进α‑乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用。所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示、或者如SEQ ID NO.13所示、或者如SEQ ID NO.14所示、或者如SEQ ID NO.15所示、或者如SEQ ID NO.16所示。本发明利用所述信号肽的编码基因、启动子，并选用枯草芽孢杆菌感受态细胞共同构建了一种促进α‑乳白蛋白表达的重组菌株，其能够最大程度上提高α‑乳白蛋白的表达量，并且所述重组菌株在添加麦芽糖质量分数为3％，添加麦芽糖时机OD600为0.8时可以达到最佳的表达量，且生产的重组α‑乳白蛋白安全性好，没有急性毒理作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用。
背景技术
α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）是哺乳动物乳汁中一种重要的乳清蛋白，广泛存在于人、牛、羊、骆驼、马、荷兰猪、兔、鼠等乳汁中，是由哺乳动物乳腺腺泡上皮细胞合成的特殊蛋白质。大部分哺乳动物的α-乳白蛋白有143个氨基酸组成，分子量为14.174 kDa。由于二硫键的存在，它具有很强的热稳定性，在70℃时只有6%的部分会出现变性的情况，是乳清蛋白中热稳定性最强的一类蛋白。α-乳白蛋白还含有微量糖基成分，有N-乙酞氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖、N-乙酞氨基半乳糖、甘露糖、岩藻糖等。α-乳白蛋白在婴儿的生长发育中起着至关重要的作用，是婴儿必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，也是调节睡眠、食欲情绪的重要因子，有较高的营养价值。α-乳白蛋白能够提高紧张状态下的认知能力，夜间摄入α-乳白蛋白会提高清晨大脑的注意力和反应能力，还能够提高女性或者抑郁症病人的记忆力。另外，α-乳白蛋白具有抗膀胱癌、杀死肿瘤细胞的作用，还能增加脑内血清生成、改善情绪以及降低皮脂浓度，具有细胞溶解活性等多种功能。
近年来随着合成生物学的快速发展，许多重要的食品成分和功能性食品添加剂都可以利用细胞工厂来进行高效安全地合成，包括乳铁蛋白、人乳低聚糖等。近年来对于α-乳白蛋白的异源表达主要集中在转基因动物乳腺生物反应器中，而对于其在微生物体系中表达的研究较少。
枯草芽孢杆菌具有明确的遗传背景和一系列基因组工程工具，这使得枯草芽孢杆菌成为生物生产的重要宿主。与真核表达系统相比，枯草芽孢杆菌具有培养简单、生长速度快等优点。与目前研究充分的大肠杆菌之类的革兰氏阴性菌表达系统比较来说，枯草芽孢杆菌表达系统可以一定程度上避免蛋白质在细胞内积累以及形成不溶性的包涵体而出现毒性，因此，其迅速成为代谢工程和合成生物学研究有竞争力的主体。
本发明成功克隆人α-乳白蛋白基因并在枯草芽孢杆菌中高效表达，并对其做了安全性评价，为婴幼儿配方奶粉深度模拟人乳，进一步开发生物工程乳奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用。所述信号肽能够提升α-乳白蛋白的产量，且制备得到了由最佳信号肽YjcN和启动子构建的重组菌株RIK1285-pBE-Pglv-YjcN-LALBA，具有大规模生产α-乳白蛋白的潜力。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示、或者如SEQ ID NO.13所示、或者如SEQ ID NO.14所示、或者如SEQ ID NO.15所示、或者如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了一种促进α-乳白蛋白表达的重组菌株，其中含有所述的信号肽的编码基因以及启动子。
进一步的，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、或者如SEQ ID NO.18所示。
进一步的，所述重组菌株选自枯草芽孢杆菌。
进一步的，所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：
（1）将α-乳白蛋白的基因序列优化后，构建于质粒上，以得到的重组质粒质粒为模版进行扩增，得到α-乳白蛋白的基因片段LALBA；
（2）对穿梭质粒pBE-S进行酶切后，将其与所述步骤（1）的LALBA基因片段进行连接，得到重组质粒pBE-LALBA；
（3）对所述步骤（2）的重组质粒pBE-LALBA进行酶切后，将其与所述信号肽的编码基因进行连接，得到含有信号肽的重组质粒pBE-信号肽-LALBA；
（4）对所述步骤（3）的重组质粒pBE-信号肽-LALBA进行酶切，同时合成所述启动子并扩增，将得到的扩增产物与酶切产物进行连接，连接产物转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，得到含有信号肽和启动子的重组菌株RIK-pBE-启动子-信号肽-LALBA。
进一步的，所述步骤（1）中扩增的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述酶切产物与基因片段或扩增产物的质量比为200:2-3。
本发明还提供了所述的信号肽或者所述的重组菌株在生产α-乳白蛋白中的应用。
进一步的，所述重组菌株生产α-乳白蛋白的培养条件为：培养温度35-38℃，培养时机OD600值为0.4-1.6，培养基为LB培养基并添加质量分数为1.5%-6%的麦芽糖。
优选的，所述重组菌株生产α-乳白蛋白的培养条件为：培养温度37℃，培养时机OD600值为0.8，培养基为LB培养基并添加质量分数为3%的麦芽糖。
本发明还提供了所述的信号肽或者所述的重组菌株在制备乳制食品或保健品中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
（1）本发明成功地将α-乳白蛋白基因LAL BA进行克隆，并经测序鉴定后将其成功构建于穿梭质粒pBE-S中得到重组质粒pBE-LALBA。随后将其转化进入枯草芽孢杆菌RIK1285得到重组菌株RIK1285-pBE-LALBA，其能够分泌α-乳白蛋白。
（2）本发明将来自枯草芽孢杆菌168基因组的同源信号肽文库连接于LALBA中得到重组质粒文库，并从信号肽文库中筛选出能够帮助α-乳白蛋白进行分泌表达的31种不同的信号肽，其中最佳信号肽YjcN能将α-乳白蛋白的产量最高提升至119.76 μg/mL，得到由YjcN信号肽驱动的菌株RIK1285-pBE-YjcN-LALBA，且α-乳白蛋白的产量与信号肽的GRAVY和疏水性呈低正相关性。本发明还筛选了3种启动子（PaprE、P43、Pglv），并证实诱导型启动子Pglv能够最大程度上提高α-乳白蛋白的表达量至122.04 μg/mL，组成型启动子P43也能够促进一定程度的蛋白表达。同时，本发明对诱导型启动子的诱导条件进行了优化，菌株RIK1285-pBE-Pglv-YjcN-LALBA在添加麦芽糖质量分数为3％，添加麦芽糖时机OD600为0.8时可以达到最佳的表达量。
（3）本发明在重组α-乳白蛋白的安全性评价试验中，判定重组α-乳白蛋白没有急性毒理作用。因此，人α-乳白蛋白在枯草芽孢杆菌中的成功表达和分泌且具有食用安全性，为模拟婴儿配方奶粉的母乳和开发生物工程乳奠定了基础，由此本发明提供了一种新生产α-乳白蛋白的枯草芽孢杆菌表达系统，具有大规模生产α-乳白蛋白的潜力，有助于牛奶或其他蛋白质的生物合成，进而开发人造乳制品等产品。
附图说明
图1为α-乳白蛋白基因的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图2为穿梭质粒pBE-S酶切的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中泳道1、2、3：酶切穿梭质粒pBE-S的条带。
图3为菌株RIK1285-pBE-LALBA验证的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中泳道1、3、5、7：使用引物LAyz-F和LAyz-R1；泳道2、4、6、8：使用引物LAyz-F和LAyz-R2。
图4为菌株RIK1285-pBE-LALBA表达α-乳白蛋白的SDS-PAGE分析；其中泳道1：RIK1285-对照的发酵上清液；泳道2-3：RIK1285-pBE-LALBA的发酵上清液；泳道4：超声破碎RIK1285-对照后的上清液；泳道5-6：超声破碎RIK1285-pBE-LALBA后的上清液；泳道7：超声破碎RIK1285-对照后的菌体；泳道8-9：超声破碎RIK1285-pBE-LALBA后的菌体。
图5为质粒pBE-LALBA酶切的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中泳道1、2：酶切质粒pBE-LALBA的条带。
图6为含有52种分泌α-乳白蛋白信号肽的枯草芽孢杆菌SDS-PAGE分析。
图7为含有31种信号肽α-乳白蛋白含量的枯草芽孢杆菌的分泌。
图8为启动子P43和Pglv片段的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中泳道1、2：启动子P43片段的条带；泳道3、4：启动子Pglv片段的条带。
图9为相应质粒酶切的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中泳道1：酶切载体pBE-Epr-LALBA；泳道2：酶切载体pBE-YwgB-LALBA；泳道3：酶切载体pBE-YjcN-LALBA；泳道4：酶切载体pBE-YwtD-LALBA；泳道5：酶切载体酶切载体pBE-YngK-LALBA。
图10为连接启动子P43(A)和Pglv(B)的菌株的验证琼脂糖凝胶电泳图谱；其中(A)为验证连接启动子P43的菌株的琼脂糖凝胶电泳图谱，泳道1为验证菌株RIK1285-pBE-P43-YjcN-LALBA，泳道2为验证菌株RIK1285-pBE-P43-YngK-LALBA，泳道3为验证菌株RIK1285-pBE-P43-YwtD-LALBA；泳道4为验证菌株RIK1285-pBE-P43-Epr-LALBA，泳道5为验证菌株RIK1285-pBE-P43-YwgB-LALBA；(B)为验证连接启动子Pglv的菌株的琼脂糖凝胶电泳图谱，泳道1为验证菌株RIK1285-pBE-Pglv-YwgB-LALBA，泳道2为验证菌株RIK1285-pBE-Pglv-Epr-LALBA，泳道3为验证菌株RIK1285-pBE-Pglv-YngK-LALBA；泳道4为验证菌株RIK1285-pBE-Pglv-YwtD-LALBA，泳道5为验证菌株RIK1285-pBE-Pglv-YjcN-LALBA。
图11为启动子的优化；其中(A)为连接不同启动子（PaprE，P43，Pglv）的菌株α-乳白蛋白的表达量；(B)为重组菌株的OD600。
图12为麦芽糖添加质量分数对α-乳白蛋白表达量的影响。
图13为麦芽糖诱导时机对α-乳白蛋白表达量的影响。
图14为7天内小鼠体重变化；其中(A)为7天内雌性小鼠体重变化；(B)为7天内雄性小鼠体重变化。
图15为7天内小鼠平均每笼摄食量、摄水量；其中(A)为7天内小鼠平均每笼摄食量；(B)为7天内小鼠平均每笼摄水量。
图16为急性经口毒性试验小鼠脏器绝对重量；其中(A)为雌性小鼠脏器绝对重量；(B)为雄性小鼠脏器绝对重量。
图17为急性经口毒性试验中各组织病理变化的HE染色。
图18为28天内小鼠体重变化；其中(A)为28天内雌性小鼠体重变化；(B)为28天内雄性小鼠体重变化。
图19为28天内小鼠平均每笼摄食量；其中(A)为28天内雌性小鼠平均每笼摄食量；(B)为28天内雄性小鼠平均每笼摄食量。
图20为28天经口毒性试验小鼠脏器绝对重量；其中(A)为雌性小鼠脏器绝对重量；(B)为雄性小鼠脏器绝对重量。
图21为28天经口毒性试验中各组织病理变化的HE染色。
实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1：人α-乳白蛋白在枯草芽孢杆菌中的异源表达
1、人α-乳白蛋白基因的获取
NCBI数据库中查询得到来源于人的α-乳白蛋白基因序列（Gene ID：3906），将得到基因序列利用软件Gene Optimizer根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性对其进行优化，然后于北京擎科生物科技有限公司合成。将合成好的片段构建于pUC57质粒上，得到pUC57-LALBA。
将pUC57-LALBA设为模板，根据选择的酶切pBE-S的酶切位点设计用于后续连接的同源臂，同时在目的基因序列的3’末端添加6×His标签用于后续镍柱纯化蛋白的实验，根据以上需求设计引物再通过多聚酶链式反应（PCR）对目的片段进行扩增。
引物序列如下：
LA-F：5’-CCGGTGCACATATGGAGCTCAAACAGTTTACGAAA-3’（SEQ ID NO.1）；
LA-R：
5’-GGTCGACAAGCTTGAATTCGGATCCTTAATGATGATGATGATGATG-3’ （SEQ ID NO.2）。
PCR反应体系如下：
| pUC57-LALBA | 1 µL |
| LA-F（引物浓度20 µmol/L） | 2 µL |
| LA-R（引物浓度20 µmol/L） | 2 µL |
| 2×Pfu PCR MasterMix | 25 µL |
| ddH2O | 至50 µL |
使用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将纯化后的产物进行电泳并鉴定观察条带大小。验证正确后将产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。
经电泳鉴定结果如图1所示，条带位置位于450 bp左右，α-乳白蛋白基因大小为435 bp与电泳中条带相符合。
2、重组菌株RIK1285-pBE-LALBA的构建
（1）穿梭质粒的酶切反应
同时使用SacI和BamH I两种限制性内切酶对穿梭质粒pBE-S进行双酶切，37℃条件下反应2 h，随后进行电泳验证以及胶回收收集酶切产物。
酶切反应体系如下：
| 穿梭质粒pBE-S | 2 µg |
| CutSmart buffer | 5 µL |
| SacI | 1 µL |
| BamH I | 1 µL |
| ddH2O | 至50 µL |
（2）LALBA与pBE-S的连接
将LALBA基因片段与酶切后的pBE-S使用一步克隆试剂盒对二者进行连接，从而获得重组穿梭质粒pBE-S-LALBA。
连接体系如下：
| Exnase MultiS | 2 µL |
| 5×CE MultiS Buffer | 4 µL |
| 酶切pBE-S产物 | 200 ng |
| LALBA基因片段 | 30 ng |
| ddH2O | 至20 µL |
3、重组穿梭质粒pBE-LALBA的验证
将连接好的重组穿梭质粒pBE-LALBA转入DH5α感受态细胞中，根据步骤孵育然后涂布至含有氨苄霉素（100 μg/mL）的LB平板上，倒置于37℃培养箱中培养。将平板上长出的单菌落挑入10 mL LB培养基中过夜培养后，用快速质粒小提试剂盒对DH5α中的质粒进行提取和收集。将提取到的质粒测量浓度后送至上海生工生物工程股份有限公司测序，并使用SnapGene软件将测序结果与α-乳白蛋白基因序列进行比对。
通过测序后比对扩增序列信息与α-乳白蛋白基因LALBA序列完全一致，说明已成功获得α-乳白蛋白的正确基因片段。
4、枯草芽孢杆菌感受态制备、转化及其验证
（1）将在-80℃超低温冰箱内保存的菌株枯草芽孢杆菌RIK1285的甘油保藏管取出，接种适量至LB平板，37℃培养箱内过夜培养。
（2）挑取菌落形态相对大的单菌落接种至2 mL LB液体培养基中，28℃摇床内150-180 rpm培养12 h。
（3）将步骤（2）中的菌液在超净台中取50 μL加入5 mL配置好的SP I缓冲液中，37℃，180 rpm培养。为了确定细胞密度，从加入菌液1 h后开始每30 min测量一次OD600值，一旦菌体生长进入平台期便进行下一步操作。
（4）将步骤（3）中培养液在超净台中取0.5 mL加入4.5 mL SP II缓冲液中，37℃，90-100 rpm条件下振荡90 min。
（5）向步骤（4）得到的整体培养液中加入50 μL的100 mM EGTA，继续在37℃，90-100 rpm条件下振荡培养5-10 min。
（6）将培养物根据实验需要以每管600 μL分装，并加入1 μg+测序成功的质粒。在同样条件继续培养90 min。
（7）短暂离心后选择适量菌液涂布于含有10 μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜。
（8）将上一步得到的阳性转化子通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，比对其条带是否与目的基因的位置相符合。
验证引物序列如下：
LAyz-F：5’-GAACTTAAGCAAAAGGAGAGGGA-3’（SEQ ID NO.3）；
LAyz-R1：5’-CCTGACTGCGTTAGCAATTT-3’ （SEQ ID NO.4）；
LAyz-R2：5’-GCTTTGCGGAACTTGTGA-3’ （SEQ ID NO.5）。
PCR反应体系如下：
| 重组菌株RIK1285-pBE-LALBA | 1 µL |
| LAyz-F（引物浓度20 µmol/L） | 1 µL |
| LAyz-R1/LAyz-R2（引物浓度20 µmol/L） | 1 µL |
| 2×Pfu PCR MasterMix | 10 µL |
| ddH2O | 至20 µL |
由图2可知，琼脂糖凝胶电泳条带位置在6000 bp左右，穿梭质粒pBE-S经SacI和BamH I酶切后条带大小为5924 bp，与电泳中条带相符合，结果表明酶切成功。
将连接产物转入DH5α成功后，经过试剂盒抽提质粒，经过上海生工生物工程有限公司测序，序列与理论序列一致。将测序正确的质粒转化进枯草芽孢杆菌RIK1285，选取阳性转化子用设计好的验证引物进行验证。电泳结果如图3所示。在300-700 bp之间能分别观测到不同的相对应的明显特异性条带，表明菌株RIK1285-pBE-LALBA构建成功。
5、α-乳白蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达
将上一步骤获得重组菌株RIK1285-pBE-LALBA接种至含10 mL LB液体培养基中，180 rpm培养12 h。然后将培养好的菌液以1%的接种量接种至含卡那霉素（100 μg/mL）的100 mL LB液体培养基中进一步发酵，在37℃、200 rpm的条件下振荡培养72 h。发酵结束后将发酵液12000 rpm离心15 min得到发酵上清液及菌体沉淀。
6、α-乳白蛋白表达水平鉴定
通过测量600 nm波长下的光密度（OD600）来量化细胞密度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定菌株RIK1285-pBE-LALBA所产的蛋白质分子量及其纯度。将发酵样品按比例加入蛋白上样缓冲液后100℃煮沸变性10 min，后加入浓度为15%的蛋白胶内进行蛋白电泳。电泳结束后，将蛋白胶浸于考马斯亮蓝溶液中进行振荡染色30min，然后将已染色的蛋白胶浸于脱色液中振荡脱色1 h后更换脱色液，继续振荡过夜脱色。
将重组菌株RIK1285-pBE-LALBA 72 h的发酵液离心后取上清液，通过SDS-PAGE未发现相应大小的条带。随后将菌体悬浮于0.01 M的PBS缓冲液中，保持低温进行超声波细胞破碎，观察到菌液变得较为澄清时（约为40 min），12000 rpm离心10 min分离上清液与破碎菌体。由图4可知，在超声破碎的上清液和菌体沉淀中发现约为14.2 kDa的条带，拟通过质谱进一步验证该条带是否为α-乳白蛋白。
7、LC MS/MS质谱分析
（1）将目的条带完整切下后将其分割为1 mm3的胶粒，装入EP管中。使用ACN和50mmol/L NH4HCO3溶液各半配置成脱色液进行脱色，置于室温10-30 min后吸出溶液，多次重复至胶粒变为透明。
（2）加入100% ACN 500 μL处理30 min，待观察到整体变为白色絮团状时，吸出溶剂并在室温下干燥。
（3）在各管中加入100 μL 10 mmol/L DTT，进行56℃水浴1 h。将DTT吸出后再加入100 μL 55 mmol/L IAA，置于室温下避光反应 1 h后吸出弃去。加脱色液洗一遍后吸出干燥。然后加入500 μL ACN，反应30 min，待观察到管内胶变为白色絮团状时在室温等待至完全干燥。
（4）加入足够的酶消化液，覆盖凝胶片。选取的蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶&Glu-C蛋白酶。将凝胶块在冰上孵育40 min。如果所有初始溶液都被凝胶块吸收，则添加更多消化溶液。密封好后放入37℃水浴锅中处理16 h，处理前根据溶液量每管补加5-10 μL酶消化溶液。
（5）将5% 三氟乙酸、50% ACN和45%超纯水配置成提取液，加其100 μL/管，37℃水浴1 h后，进行超声和离心处理各5 min，转移提取液后重复一次，将提取液合并，真空离心干燥。
（6）将前处理好后的肽段使用自填脱盐柱脱盐，后置于45℃真空离心浓缩仪中至溶剂挥发完全。用20 μL 0.1% FA溶液重悬后取10 μL进行仪器分析。使用MaxQuant（1.6.2.10）软件，根据样品的种类，对原始结果文件进行分析，并与目标蛋白质数据库进行检索。只有高置信度鉴定的多肽被选择用于下游蛋白鉴定分析。
切割相应的条带进行脱色、酶解等步骤得到数据后，用Xcalibur打开并分析，得到总离子色谱图。利用MaxQuant数据库检索（1.6.2.10），结合总离子色谱图分析后，得到蛋白质鉴定结果如表1所示。
表1 数据库检索产生的LC MS/MS鉴定结果
综合结果后，样品的总覆盖率如下（“_”标记为本次实验鉴定覆盖到的序列）
| 1-40 | KQFTKCELSQ LLKDIDGYGG IALPELICTM FHTSGYDTQA |
| 41-80 | IVENNESTEYGLFQISNKLW CKSSQVPQSR NICDISCDKF |
| 81-120 | LDDDITDDIM CAKKILDIKG IDYWLAHKAL CTEKLEQWLC |
| 121-123 | EKL |
结果覆盖了76.4%的P00709序列，检测到的序列全部与理论序列相符，可以说明通过超声破碎菌体得到的蛋白是α-乳白蛋白。
实施例2：枯草芽孢杆菌胞外分泌人α-乳白蛋白
一、实验步骤：
1、信号肽优化
1）连接信号肽文库
筛选有效信号肽是帮助α-乳白蛋白分泌到发酵上清液中的有效手段。将购买的SPDNA-mix信号肽文库通过试剂盒连接至质粒pBE-LALBA中，建立了含多种信号肽的质粒文库并从中筛选出分泌α-乳白蛋白最有效、产量最高的信号肽。
（1）用限制酶MluI和EagI对重组质粒pBE-LALBA进行双酶切，37℃处理2 h。酶切体系如下：
| 重组质粒 pBE-LALBA | 2 µg |
| CutSmart buffer | 5 µL |
| MluI | 1 µL |
| EagI | 1 µL |
| ddH2O | 至50 µL |
（2）通过同源重组的方法，使用In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒将信号肽文库（SP DNA-mix）连接至酶切后的质粒pBE-LALBA上，50℃处理15 min。连接体系如下：
| 5×In-Fusion Enzyme Premix | 2 µL |
| 酶切片段 | 200 ng |
| SP DNA-mix | 10 ng |
| ddH2O | 至10 µL |
2）筛选最佳信号肽
（1）将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中后，涂布至含有氨苄霉素（100 μg/mL）的LB平板上，37℃倒置过夜培养。将平板上的单菌落悬浮在LB培养基中并收获后，纯化质粒以产生质粒文库。
（2）按照上述步骤，将从悬浮的菌液中获得的质粒文库转化入制备的枯草芽孢杆菌RIK1285感受态中，得到含有不同种信号肽的菌株RIK1285-pBE-LALBA。涂布至含10 µg/mL卡那霉素的LB平板内，37℃过夜培养。
（3）挑取尽量多的单菌落至10 mL含卡那霉素的 LB 液体培养基内，置于摇床中200 rpm过夜培养。
（4）分别加入溶菌酶后提取每个单菌落的质粒DNA并测序，通过与已知信号肽序列比对得到含有相应信号肽的重组菌株。发酵后使用His亲和琼脂糖柱（Ni NTA）纯化其发酵上清液，并通过SDS-PAGE检测，用Bradford法（Bradford, 1976）测定α-乳白蛋白的产量，筛选出产量最高的菌株。
3）信号肽理化性质与表达水平的相关性分析
信号肽经过测序鉴定后，分析每个信号肽的物理性质，以确定鉴定的信号肽的特征与分泌蛋白量之间的统计学相关性。D-score由SignaIP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）网站计算，用于表示分泌蛋白的N端氨基酸序列与信号肽之间的总体效率。净电荷数由蛋白质计算器v3.4（http://protcalc.sourceforge.net/）在中性pH下确定。使用ProtParam计算等电点（pI）和亲水性平均系数（GRAVY）。GRAVY是信号肽序列中所有氨基酸亲水值的总和与氨基酸数量的比值，其正值和负值分别代表疏水性和亲水性，其数值越大代表相应性质越强。通过将疏水氨基酸总数除以残基总数来确定同样可以确定肽的疏水性。
首先对筛选得到的信号肽部分物理化学性质进行统计分析，目的是研究α-乳白蛋白的表达量是否与信号肽的部分理化性质存在相关性。皮尔逊相关系数（Pearsoncorrelation coefficient），也称皮尔逊积矩相关系数（Pearson product-momentcorrelation coefficient），是用来反映两个变量线性相关程度的统计量，可以反映两个变量间线性相关程度的大小。如果相关系数r其大小位于0.9和1.0之间说明二者极其相关；如果相关系数r的大小位于0.7和0.9之间，说明二者高度相关；如果r位于0.5和0.7之间，说明二者中度相关，；如果r值在0.3-0.5，说明二者低相关性。r是正值，两个变量间呈正相关；反之r是负值，两个变量间呈负相关。计算公式如下：
2、启动子优化
1）筛选最佳启动子
（1）启动子PaprE存在于质粒pBE-S中，组成型启动子P43（K02174.1，SEQ ID NO.17）和诱导型启动子Pglv（KU307277，SEQ ID NO.18）在NCBI GenBank中查到其序列并由北京擎科生物科技有限公司合成。根据序列设计并使用相应引物进行PCR扩增并增加同源臂。
引物序列如下：
P43-F：5’-TTTAAGCCGTCTGTACGTTCCTAAACTAGTAGCTTCGTGCATGCAGGCCGGGGCA-3’（SEQ ID NO.6）；
P43-R：5’-CTCACACGCGTCCCTCTCCTTTTGCTTAAGAAGCTTCTGTTATTAATTCTTGTCTG-3’（SEQ ID NO.7）；
Pglv-F：5’-TTTAAGCCGTCTGTACGTTCCTAAACTAGTGGGCCCGGCATGTATCCGAATC-3’ （SEQID NO.8）；
Pglv-R：5’-CTCACACGCGTCCCTCTCCTTTTGCTTAAGGAATTCCGACCTTCCTTGATAAATT-3’（SEQ ID NO.9）。
PCR反应体系如下：
| pUC57-P43/pUC57-Pglv | 1 µL |
| P43-F/Pglv-F（引物浓度20 µmol/L） | 2 µL |
| P43-R/Pglv-R（引物浓度20 µmol/L） | 2 µL |
| 2×Pfu PCR MasterMix | 25 µL |
| ddH2O | 至50 µL |
（2）将质粒pBE-YjcN-LALBA，pBE-YwtD-LALBA，pBE-YwgB-LALBA，pBE-YngK-LALBA，pBE-Epr-LALBA经AfIII和SpeI内切酶37℃消化2 h。酶切体系如下：
| 上述质粒 | 2 µg |
| CutSmart buffer | 5 µL |
| AfIII | 1 µL |
| SpeI | 1 µL |
| ddH2O | 至50 µL |
分别将（1）中获得的启动子P43、Pglv片段与酶切产物进行连接。连接体系如下：
| 酶切产物 | 200 ng |
| P43/Pglv片段 | 30 ng/20 ng |
| Exnase MultiS | 2 µL |
| 5×CE MultiS Buffer | 4 µL |
| ddH2O | 至20 µL |
后转入大肠杆菌DH5α感受态。将测序确认携带正确序列的重组质粒转入枯草芽孢杆菌RIK1285，转化及验证方法同上。
验证引物序列如下：
PYZ-F：5’-CCTTTACCTTGTCTACAAACCC-3’（SEQ ID NO.10）；
PYZ-R：5’-CTTTTAACAGCTGGCTCAGTTC-3’ （SEQ ID NO.11）。
PCR反应体系如下：
| 重组菌株 | 1 µL |
| PYZ-F（引物浓度20 µmol/L） | 1 µL |
| PYZ-R（引物浓度20 µmol/L） | 1 µL |
| 2×Pfu PCR MasterMix | 10 µL |
| ddH2O | 至20 µL |
发酵及纯化方法同上。
2）麦芽糖诱导条件分析
（1）麦芽糖不同质量分数的诱导效果
将上一步获得的重组菌株按照上述发酵培养。向5瓶100 mL LB培养基中分别添加麦芽糖质量分数为0%、1.5%、3%、4.5%和7.5%，37℃、200 rpm振荡培养72 h。按实施例1的步骤测定α-乳白蛋白产量。
（2）麦芽糖不同诱导时机的影响
为了确定最佳的诱导时机，在接种至5瓶装有100 mL LB培养基的250 mL锥形瓶中后，通过紫外分光光度计测定其OD600值，当测定OD600值分别到0、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6时，添加上一步得到的最佳麦芽糖质量分数，37℃、200 rpm振荡培养72 h。按实施例1的步骤测定α-乳白蛋白产量。
二、实验结果
1、筛选信号肽
1）酶切质粒pBE-LALBA并连接信号肽文库
将质粒pBE-LALBA双酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳。由图5可见，在6000 bp左右出现明显条带，条带大小与理论大小相符为6222 bp，无杂带，说明质粒酶切彻底。切胶回收并进行浓度检测后，用快速连接试剂盒进行连接。
2）筛选最佳信号肽
将含有173种信号肽的信号肽文库利用试剂盒连接到构建好的质粒pBE-LALBA中，收集到载有信号肽文库的质粒文库随后转化到菌株RIK1285内，涂布平板过夜培养后，挑取不同单克隆接种进行提质粒测序，将已知信号肽的菌株接种至100 mL LB培养基内进行发酵。
通过DNA测序可知，共连接成功52个信号肽。通过对发酵上清液进行SDS-PAGE（15%Bis-Tris Gel）分析，检测分泌蛋白的分子量（图6）。其中有31个信号肽可以SDS-PAGE凝胶上观察到位置相同深浅不同的条带，并且条带的大小为约14 kDa，其与α-乳白蛋白分子量相同。这31个信号肽能促进α-乳白蛋白的分泌表达但表达水平存在差异。还有21个信号肽如Bgls、Mpr、SpollQ、YddT等不能协助α-乳白蛋白进行分泌表达。这说明信号肽的促进分泌作用随蛋白的不同而不同。
图7显示了连接31个不同信号肽的菌株表达α-乳白蛋白的情况（经镍柱纯化后），结果显示由YjcN信号肽驱动的菌株RIK1285-pBE-YjcN-LALBA分泌α-乳白蛋白具有最佳的效果，蛋白表达量可达到119.76 μg/mL。通过筛选信号肽库的方式成功实现了α-乳白蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。
3）信号肽理化性质与表达水平的相关性分析
为了进一步了解31种信号肽的性质与其分泌量之间的潜在相关性，分析了信号肽的序列、D-score、净电荷数、pI、GRAVY和疏水性（表2）。所有鉴定的信号肽的氨基酸数量在21-35个之间，D-score>0.330（0.332-0.843）。所有天然信号肽等电点>7。GRAVY为0.100-2.117，疏水性为50.00-78.26%。
对于α-乳白蛋白来说，选择前3个信号肽的D-score不是最高的（YjcN为0.544，YwtD为0.601，YwgB为0.555），一些D-score较高的信号肽（LipB为0.843，Epr为0.792）没有分泌高水平的α-乳白蛋白。这也适用于信号肽的净电荷、pI、GRAVY和疏水性。但通过数据计算及统计学分析，发现GRAVY和疏水性与α-乳白蛋白的表达量呈低程度的正相关性，皮尔森系数分别为0.413、0.4289。相比而言，信号肽的D-score，净电荷数和pI并没有显示出与α-乳白蛋白的表达量有相关性，皮尔森系数分别为0.059、0.0239、-0.0475。
因此，α-乳白蛋白分泌的效率与GRAVY和疏水性有一定关系，与信号肽的D-score，净电荷数和pI无关。
表2 帮助α-乳白蛋白分泌的信号肽的物理性质
2、筛选最佳启动子
1）启动子P43和Pglv片段的获取
以公司合成的质粒为模板，使用相应引物进行PCR扩增得到基因片段P43和Pglv，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现分别在300和500 bp左右出现特异性电泳条带（图 8），与理论值334和536 bp相符，表明获得了启动子P43和Pglv片段。
2）酶切相应载体
经AfIII和SpeI酶切载体pBE-YjcN-LALBA，pBE-YwtD-LALBA，pBE-YwgB-LALBA，pBE-YngK-LALBA，pBE-Epr-LALBA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测发现在6000 bp左右出现特异性电泳条带（图9），表明各个载体酶切成功。
3）验证连接不同启动子的菌株
连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞成功后，抽提质粒经过上海生工生物工程有限公司测序后，相应质粒与理论序列一致。转入枯草芽孢杆菌RIK1285后进行PCR验证，如图10所示，连接启动子P43的菌株在500-530 bp附近能观察到有明显特异性条带，连接启动子Pglv的菌株在710-740 bp附近能观察到有明显特异性条带，表明连接启动子P43和Pglv的新菌株连接构建成功。
4）筛选最佳启动子
实验选取了在5个促进α-乳白蛋白分泌效果最好的信号肽（YjcN、YwtD、YwgB、YngK和Epr）来进行启动子的优化以进一步增加α-乳白蛋白分泌。为了进行比较，研究了三种不同的启动子（PaprE，P43和Pglv）。结果（图11）表明，诱导型启动子Pglv和信号肽YjcN在生物学密度大致一致的条件下最大限度地提高了α-乳白蛋白的表达水平，使菌株RIK1285-pBE-Pglv-YjcN-LALBA的产量为122.04 μg/mL。同时，不同的信号肽对启动子也有偏好，如YwtD、YwgB、Epr，当与P43联合使用时可以最大程度促进α-乳白蛋白的表达。P43与目标蛋白的亲和力以及各种枯草芽孢杆菌宿主的表达稳定性证实了P43具有高水平的报告基因产量和大量的酶。信号肽YjcN和YngK在Pglv存在下可以最大化表达。诱导型启动子Pglv在促进蛋白质产生方面也显示出良好的效果。这可能是因为麦芽糖既可以作为碳源被枯草芽孢杆菌利用又可以作为诱导剂。最后，选择菌株RIK1285-pBE-Pglv-YjcN-LALBA表达α-乳白蛋白。
5）麦芽糖诱导条件分析
（1）添加麦芽糖不同质量分数的诱导效果
从图12可以看出，在100 mL发酵培养基中分别添加质量分数为0%、1.5%、3%、4.5%、6%和7.5%的麦芽糖进行发酵，添加质量分数为3%时α-乳白蛋白表达量最高。麦芽糖添加质量分数到达3%以后，随着麦芽糖添加质量分数的提高，α-乳白蛋白表达量呈下降趋势。这种情况主要因为发酵后期培养基中的各种营养物质被消耗，而且麦芽糖也可以被微生物作为营养物质吸收，导致麦芽糖的在培养基中可作为诱导剂的质量分数变小，诱导能力减弱。因此麦芽糖诱导α-乳白蛋白表达的最佳质量分数为3%。
（2）麦芽糖不同诱导时机的影响
当菌体培养到OD600值为0、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6时，每瓶中添加质量分数为3%的麦芽糖，发酵72 h后取样测定，结果如图13。由图可得加入麦芽糖诱导效果最好的时机为菌体OD600值达到0.8时。OD600值更高或更低时添加相同质量分数的麦芽糖，α-乳白蛋白表达量均低于0.8时且OD600值更高时表达量总体呈下降趋势。
实施例3：重组α-乳白蛋白的食用安全性初步评价
一、实验方法
1、急性经口毒性试验
1）分组与处理
健康ICR小鼠（8周，斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010），饲养于温度20-26℃，湿度40%-70%条件下。小鼠适应7 d后随机分为对照组和实验组，每组10只，雌雄各半。首先试验前对小鼠进行禁食16 h处理。实验组小鼠采用急性经口试验中的限量法，给予纯化浓缩后的重组α-乳白蛋白一次性灌胃5 g/kg BW，灌胃体积为25mL/ kg BW，样品浓度20 mg/mL，对照组给予等体积蒸馏水灌胃。小鼠自由饮食，观察灌胃后7 d，记录有无中毒表现及死亡情况。
2）观察指标
（1）基础情况
测量灌胃后7 d内小鼠的摄食、饮水、体重变化，观察小鼠毛发、活动情况以及是否有不良反应，观察期结束后，对照组和实验组各随机取5只小鼠心肝脾肺肾组织进行称重。
（2）病理学检查
将已固定好的的小鼠心肝脾肺肾组织样本经75%、85%、95% Ⅰ、95% Ⅱ、100% Ⅰ、100% Ⅱ乙醇溶液脱水各60 min，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各45 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡ⅡI透蜡各50-60 min，石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后将切片放入二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、无水乙醇Ⅰ 3 min、无水乙醇Ⅱ 3 min、95%酒精3 min、80%酒精3min、纯水2 min。
然后放入苏木素染液染3-5 min，自来水洗，1%盐酸酒精分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。伊红染液中染色3-5 min，流水冲洗。再依次放入80%酒精、95%酒精、无水乙醇、无水乙醇II快速脱水，超净高级封片胶封片。最后利用显微镜镜检进行图像采集。
（3）统计分析
统计分析使用IBM SPSS Statistics 26软件。两组之间定量数值比较采用独立样本t检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法。检验水准p<0.05表示差异显著。定量结果用平均数±标准差（）表示。
2、28天经口毒性试验
1）分组与处理
小鼠适应7 d，随机分为对照组和实验组，每组10只，雌雄各半。试验前小鼠禁食16h、自由饮水。实验组小鼠给予纯化浓缩后的重组α-乳白蛋白灌胃5 g/kg BW，灌胃体积为10mL/kg BW，样品浓度20 mg/mL，对照组给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，连续28 d，每周记录小鼠体重变化及每笼摄食量。灌胃结束后，两组小鼠空腹过夜，摘其眼球取血测量血常规指标和血生化指标。
2）观察指标
（1）基础情况
测量灌胃过程中小鼠的摄食、饮水、体重变化，观察小鼠毛发、活动情况以及是否有不良反应。
（2）血液学指标检测
采用全自动血液分析仪测定白细胞计数及分类（包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞）红细胞计数、血红蛋白浓度、血细胞比容、血小板计数。
（3）血液生化学指标检测
取血清1000 g离心20 min，采用全自动生化分析仪检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、总蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）的水平。
（4）病理学检查
试验结束后每组各随机取5只小鼠心肝脾肺肾组织进行称重，组织固定保存进行组织病理学检查。方法同上。
（5）统计分析
方法同上。
二、结果与分析
1、急性经口毒性试验
1）一般情况观察
观察期间，小鼠饮食和活动正常，生长良好，未见任何中毒表现，无死亡。如图14所示，无论雌雄动物，在1-4天，实验组动物体重低于对照组，在5-7天，实验组动物体重高于对照组，但均无显著性差异。在图15中相较于对照组，虽然实验组每笼摄食量呈下降趋势，摄水量呈升高趋势，但无显著性差异。
2）小鼠脏器绝对重量和相对重量
如图16所示，相较于对照组，雌鼠实验组的肝脏重量显著升高（p＜0.05）；雄鼠实验组的肝脏重量呈下降趋势，但不显著；其他脏器重量几乎无变化。但通过计算小鼠的脏器相对重量发现，雌鼠实验组的肝脏重量与相应对照组相比差异无统计学意义，其他脏器情况相同。所以雌鼠实验组的肝脏重量升高是由于该雌鼠体重相应升高，无安全性问题。
表3 急性经口毒性试验中重组α-乳白蛋白对小鼠脏器相对重量的影响( % )
3）器官组织病理性检查
急性经口毒性试验中，灌胃及观察结束后，解剖两组小鼠肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾等各个组织均未发现明显病变部分。由HE染色结果（图17）可知，经过与对照组比较，在急性经口毒性试验中两组间病理改变差异不明显，重组α-乳白蛋白对小鼠主要组织大部分无不良影响。心脏结构正常，心肌纤维排列整齐无中断，无明显病理变化，无出血现象。对照组肝脏肝细胞呈放射状排列，肝索排列较为整齐，肝小叶结构完整，无明显炎症细胞浸润及纤维增生，实验组部分小鼠可见肝细胞轻微肿胀。两组小鼠脾脏结构正常，红髓和白髓之间界限清晰。对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡腔结构规则完整内无明显炎性细胞，呈薄壁结构，肺间质无明显变化，实验组偶有肺血管管腔内出现红细胞，间质可见有少量红细胞漏出。对照组肾脏肾小球结构正常，肾小管上皮细胞整齐排列，细胞饱满，无明显病理变化，实验组肾小管间血管有少量淤血。
2、28天经口毒性试验
1）一般情况观察
两组小鼠一般表现和行为均未见明显异常、无中毒表现、无死亡。5次小鼠体重数据显示（图18）：雌性实验组小鼠体重略低于对照组但不显著，对照组和实验组雄性小鼠体重几乎无差异。由图4、5可知，相较于对照组，雌性实验组小鼠总摄食量呈下降趋势，但不显著；雄性小鼠总摄食量几乎无变化。
2）小鼠脏器绝对重量和相对重量
如图19所示，相较于对照组，雌性实验组动物肝重下降，且显著（p＜0.05）；雄性实验组动物的肝重升高，但不显著，心脏、脾脏、肺、肾脏重量几乎没变化。与图20、表4结合来看，雌性小鼠实验组体重略低于对照组，并且实验组肝脏的脏体比与对照组相比差异不显著，所以实验组雌性小鼠肝脏绝对重量的显著下降并不会影响其正常生活。
表4 28天经口毒性试验中重组α-乳白蛋白对小鼠脏器相对重量的影响(%)
3）器官组织病理性检查
主要器官的宏观观察显示各组均无异常。28天经口毒性试验对照组和实验组主要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）的组织病理学特征如图21所示。染色后各组心脏组织中心肌细胞整体底色为粉红色，其中紫色的颗粒状为心肌细胞的细胞核。两组的心脏组织切片均有明显的横纹肌和完整的心肌细胞。肝组织横切面的实验组与对照组相比，其细胞核和细胞质染色均正常。各组细胞形态及排列均未见异常变化。脾脏组织病理切片的红髓、白髓及淋巴结明显，易区分。各组脾脏包膜均未见明显增厚。肺组织切片各组肺组织结构清晰，肺泡形态、结构、数量完整无明显炎性细胞，实验组肺泡间质有轻微红细胞漏出。两组肾脏组织切片中肾小球结构正常，未见内皮细胞和间质细胞增生，未见变性、坏死细胞。这些结果表明，从病理学上看，重组α-乳白蛋白对小鼠主要器官无不良影响。
4）血液学指标检测和血液生化学指标检测
两组小鼠的血液学和血清生化数据分别列于表5和表6。表5中的血液学指标（白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、红细胞计数、血红蛋白浓度）除血小板计数外，其他数据在2组间差异均无统计学意义。血小板计数高于对照组（p＜0.05），但均在正常值范围内。这些指标可能与免疫系统和免疫能力的发展有关。血液生化分析（表6）表明，在实验组小鼠中，无论性别，肝功能参数包括AST、ALT、ALB、TP和CHO均未发生改变。雌性小鼠TG水平均低于对照组（p＜0.05）。肾脏功能参数包括UREA和CREA，实验组的UREA水平与未处理的动物无显著差异。虽然CREA指标组间存在统计学差异，但实验组小鼠的肾脏组织切片并未出现异常，且在雌性小鼠与雄性小鼠中CREA指标表现并不相同，因此没有明确的生物学意义。
表5小鼠血液学指标检测
表6 小鼠血液生化学指标检测
综上所述，重组α-乳白蛋白对受试动物无毒性作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO.12所示、或者如SEQ ID NO.13所示、或者如SEQ ID NO.14所示、或者如SEQ ID NO.15所示、或者如SEQ ID NO.16所示。
2.一种促进α-乳白蛋白表达的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中含有权利要求1所述的信号肽的编码基因以及启动子。
3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示、或者如SEQ ID NO.18所示。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株选自枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：
（1）将α-乳白蛋白的基因序列优化后，构建于质粒上，以得到的重组质粒质粒为模版进行扩增，得到α-乳白蛋白的基因片段LALBA；
（2）对穿梭质粒pBE-S进行酶切后，将其与所述步骤（1）的LALBA基因片段进行连接，得到重组质粒pBE-LALBA；
（3）对所述步骤（2）的重组质粒pBE-LALBA进行酶切后，将其与所述信号肽的编码基因进行连接，得到含有信号肽的重组质粒pBE-信号肽-LALBA；
（4）对所述步骤（3）的重组质粒pBE-信号肽-LALBA进行酶切，同时合成所述启动子并扩增，将得到的扩增产物与酶切产物进行连接，连接产物转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，得到含有信号肽和启动子的重组菌株RIK-pBE-启动子-信号肽-LALBA。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述步骤（1）中扩增的引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述酶切产物与基因片段或扩增产物的质量比为200:2-3。
8.权利要求1所述的信号肽或者权利要求2所述的重组菌株在生产α-乳白蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组菌株生产α-乳白蛋白的培养条件为：培养温度35-38℃，培养时机OD600值为0.4-1.6，培养基为LB培养基并添加质量分数为1.5%-6%的麦芽糖。
10.权利要求1所述的信号肽或者权利要求2所述的重组菌株在制备乳制食品或保健品中的应用。
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