CN117138113A - 一种矿化胶原材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种矿化胶原材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117138113A CN117138113A CN202311086593.3A CN202311086593A CN117138113A CN 117138113 A CN117138113 A CN 117138113A CN 202311086593 A CN202311086593 A CN 202311086593A CN 117138113 A CN117138113 A CN 117138113A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- nhac
- mineralized
- col
- mineralized collagen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 262
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 262
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 260
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 143
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 61
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 61
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 28
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 83
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 32
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 23
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 20
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 15
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 claims description 11
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 11
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 230000001089 mineralizing effect Effects 0.000 claims description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- NKWPZUCBCARRDP-UHFFFAOYSA-L calcium bicarbonate Chemical compound [Ca+2].OC([O-])=O.OC([O-])=O NKWPZUCBCARRDP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000020 calcium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-L calcium bis(dihydrogenphosphate) Chemical compound [Ca+2].OP(O)([O-])=O.OP(O)([O-])=O YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 claims description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940062672 calcium dihydrogen phosphate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 claims description 3
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 claims description 3
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- JXRVKYBCWUJJBP-UHFFFAOYSA-L calcium;hydrogen sulfate Chemical compound [Ca+2].OS([O-])(=O)=O.OS([O-])(=O)=O JXRVKYBCWUJJBP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 235000019691 monocalcium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 33
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 17
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 15
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 14
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 13
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 13
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 11
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 11
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 11
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 4
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 4
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 229960001572 vancomycin hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- LCTORFDMHNKUSG-XTTLPDOESA-N vancomycin monohydrochloride Chemical compound Cl.O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 LCTORFDMHNKUSG-XTTLPDOESA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000003618 Intervertebral Disc Displacement Diseases 0.000 description 1
- 206010050296 Intervertebral disc protrusion Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 208000008312 Tooth Loss Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical group [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002436 femur neck Anatomy 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000003781 tooth socket Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/02—Inorganic materials
- A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
- A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医用材料技术领域,公开了一种矿化胶原材料及其制备方法和应用,由矿化胶原生物膜和胶原蛋白共混而成,所述矿化胶原生物膜为在胶原蛋白上原位矿化羟基磷灰石所得。本方案在矿化胶原生物膜表面包裹胶原蛋白制备所得矿化胶原生物膜/胶原共混材料(nHAC/Col膜),使得羟基磷灰石和患者细胞隔开,避免其直接接触患者细胞而降低细胞存活率,因此,其具有更低的细胞毒性,便于促进患者细胞增长,也便于患者快速恢复。申请人通过实验发现,本方案所得共混材料的细胞存活率高达95%,具有更低的细胞毒性;且本方案所得共混材料的孔隙率高达71%,提升药物小分子的负载量,还通过负载的药物缓释延长其治疗效果,实现长效缓释治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体涉及一种矿化胶原材料及其制备方法和应用。
背景技术
随着老龄化问题的日趋严重,诸如骨质疏松、椎间盘突出、股骨颈骨折、病理性掉牙等发病率也持续上升,而由运动、创伤、肿瘤等引起的骨缺损现象在临床中出现得也越来频繁。人们通过自体骨、同种异体骨、异种骨、人工合成的材料等手段用于骨修复缺损,虽然取得了一定的效果,但是日益复杂的病况及患者对医疗的要求日益严格,发展新的骨修复材料以丰富当前临床产品势在必行。
鉴于此,目前研发常采用胶原蛋白和羟基磷灰石共混工艺或矿化工艺制备形成骨修复材料,然而现有技术生产所得骨修复材料,多致力于解决提升材料的力学性能,进而提升其支撑效果。如现有技术CN115006589A公布了一种碳纳米管改性矿化胶原材料及其制备方法和应用,通过将改性碳纳米管粉末与胶原酸溶液、钙盐溶液、磷酸盐溶液混合矿化反应后,得到碳纳米管改性矿化胶原材料,有效保证生物性能的同时,提升材料的力学性能,可用于承重部位的小块骨缺损的修复。然而现有技术仍然存在如下问题:现有材料中含有较多碳纳米管和羟基磷灰石,而这两种原料均具有一定细胞毒性,且细胞毒性随这两种原料的含量增加而加重,从而使得现有材料具有较高的细胞毒性,而损害使用者身体。
综上,研发一种细胞毒性小、支撑效果好、孔隙率高的矿化胶原材料及其制备方法和应用,不仅有效弥补现有技术的不足,还对促进材料在修复的多方面应用中具有重要意义
发明内容
本发明意在提供一种矿化胶原材料及其制备方法和应用,以解决现有矿化胶原材料的细胞毒性较高的技术问题。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:一种矿化胶原材料,包括矿化胶原生物膜和胶原蛋白共混而成,所述矿化胶原生物膜为在胶原蛋白上原位矿化羟基磷灰石所得。
本方案的原理及优点是:
1、更低的细胞毒性:相比于现有材料中羟基磷灰石或碳纳米管直接与患者细胞接触而增加细胞毒性相比,本方案在矿化胶原生物膜表面包裹胶原蛋白制备所得矿化胶原生物膜/胶原共混材料(nHAC/Col膜),使得羟基磷灰石和患者细胞隔开,避免其直接接触患者细胞而降低细胞存活率,因此,其具有更低的细胞毒性,便于促进患者细胞增长,也便于患者快速恢复。申请人通过实验发现,本方案所得共混材料的细胞存活率高达95%,具有更低的细胞毒性。
2、兼具支撑效果和生物相容性:本发明通过在胶原上原位矿化获得纤维内、外表面均质分布羟基磷灰石的矿化胶原生物膜,其中,原位矿化所得羟基磷灰石具有一定的硬度,有效提升生物膜的支撑效果,便于将生物膜填充至骨骼、牙齿中后,有效承受来自软组织的压力,从而为骨再生保留空间;而在nHAC膜中作为模板以及共混后包裹在nHAC膜表面的胶原蛋白,具有较高的生物相容性,在使用过程中能直接被人体吸收,用于促进骨胶原蛋白的合成,保持骨骼的柔韧性和牙齿的硬度,从而促进患者尽快康复。
3、更高孔隙率,便于负载大量药物并缓释治疗:本方案的矿化胶原生物膜/胶原共混材料(nHAC/Col膜)具有较高的孔隙率,便于在共混材料中装载小分子药物和活性分子,随共混材料填充至患者体内时,药物缓慢释放,便于药物直达患处并长效缓释治疗,提升治疗效果。申请人通过实验发现,本方案的矿化胶原生物膜/胶原共混材料(nHAC/Col膜)孔隙率高达71%,使得负载的药物在前100h左右释放较快,而后持续微量释放药物直至30天以上,便于实现缓释及长效治疗。
然而,申请人在研发出本方案的矿化胶原生物膜/胶原共混材料(nHAC/Col膜)之前,也曾经尝试过多种矿化胶原生物膜的制备流程及工艺,然而其均无法达到本方案矿化胶原生物膜/胶原共混材料(nHAC/Col膜)的低细胞毒性及缓释效果。
如,申请人曾经尝试调整形成矿化胶原生物膜(nHAC)时的原料比例,使得nHAC中羟基磷灰石含量降低,从而降低其细胞毒性。然而其形成的nHAC因羟基磷灰石含量过低,支撑效果降低,导致其填充至患者体内后无法承受来自软组织的压力而为骨再生保留空间,导致其无法使用。而若是羟基磷灰石含量过多,胶原纤维占比少,材料甚至无法形成生物膜形状,且细胞毒性会显著上升。
也曾尝试减缓原位矿化的反应速度,尽可能使羟基磷灰石在胶原内部形成,然而减缓原位矿化速度只能降低羟基磷灰石在nHAC中含量,而无法保证将完全矿化吸附在胶原的内表面;而若是加快原位矿化的反应速度,也无法实现预想,只会导致羟基磷灰石含量增加,反而加重nHAC的细胞毒性。
最后,在一次偶然的机会,发明人在原位矿化后期沉淀过程中,无意间添加了部分胶原蛋白至沉淀溶液中,并在材料洗涤、干燥后检测其细胞毒性时,发现其细胞存活率升高了。发明人猜测是否是胶原包裹nHAC膜,隐藏了部分羟基磷灰石,从而降低了材料的细胞毒性。而在检测材料对药物的载药效果时发现,其能负载的药量更高了,发明人再猜测,是否胶原包裹nHAC膜时并未完全包裹,会留有部分通道,使得其孔隙率增加了,进而增加了载药量。
此外,发明人还发现,胶原和nHAC的混合比例、混合后材料的形态均能影响共混材料的细胞毒性和孔隙率,进而影响共混材料的应用。
本方案提供一种矿化胶原材料的制备方法,包括(一)制备矿化胶原生物膜nHAC阶段和(二)制备共混材料nHAC/COL阶段,所述(二)制备共混材料nHAC/COL阶段包括向胶原蛋白溶液中加入矿化胶原生物膜nHAC混匀后,再调节pH至析出白色沉淀;再静置收集白色沉淀,冷冻干燥白色沉淀,获得矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL。
有益效果:本方案采用上述设置,便于在矿化胶原生物膜nHAC表面包裹COL形成共混材料,从而降低共混材料生物毒性的同时,引入更多的胶原蛋白,溶胀状态的胶原蛋白纤维可保证复合材料的具有较高的孔隙率,便于提升要负载量而提升治疗效果。
优选的,所述胶原蛋白Col与矿化胶原生物膜nHAC按照2~3:2~3的比例共混。
有益效果:本方案采用上述设置,便于胶原蛋白Col包裹大部分矿化胶原生物膜nHAC的同时保持共混材料的膜状,保证其具有高孔隙率和低细胞毒性。申请人通过长期实验发现,若是将nHAC粉碎为细粉后在于胶原蛋白共混制备p-nHAC/Col,其细胞毒性仍然会较高而影响材料的应用,发明人分析其原因在于,粉末状的nHAC在于胶原蛋白共混时,反而会因过于分散而无法将nHAC包裹在Col内,使得p-nHAC/Col中羟基磷灰石仍然暴露在材料外围,而影响细胞增殖。而若是降低共混时胶原蛋白的用量,生产所得共混材料依然具有较高的细胞毒性,不利于患者恢复;而若是提高共混时胶原蛋白的用量,则可能使得材料呈现生物膜形态,而无法制备获得膜状材料,进而降低其使用时的支撑效果,影响其应用。
优选的,在(二)制备共混材料nHAC/Col阶段中,所述胶原蛋白溶液由40~60℃的ddH2O溶解胶原蛋白形成;调节pH至7-10;所述冷冻干燥为于-25~-15℃冷冻12~15h后,在-70~-35℃、10~20pa条件下冷冻干燥24~28h。
有益效果:本方案采用上述设置,便于溶解胶原蛋白形成胶原蛋白溶液;而本方案的冷冻干燥工艺通过两阶段冷冻干燥,即先将溶液中的水预冻成固态,然后在真空条件下使水蒸气直接从固体中升华,而共混材料nHAC/Col膜则留在冻结时的冰架子中,形成具有较多孔隙的膜状材料,提升其应用时的支撑效果和孔隙率;此外,冷冻干燥还能有效保证胶原蛋白的生物活性,便于其填充后的吸收转化。
优选的,所述(一)制备矿化胶原生物膜nHAC阶段包括如下步骤:
步骤1、配置胶原溶液:将胶原蛋白粉末分散于盐酸溶液中,形成胶原酸溶液;
步骤2、胶原与羟基磷灰石前体混合液的制备:向步骤1所得胶原酸溶液中加入钙液,搅拌均匀后加入磷酸溶液,混匀获得前体混合液;
步骤3、胶原与羟基磷灰石悬浊液的制备:调节前体混合液的pH至混合液呈现白色悬浊液状态停止,继续搅拌获得悬浊液;
步骤4、矿化胶原生物膜的制备:静置分层后弃去上清,收集并抽滤过滤洗涤下层白色沉淀,冷冻干燥白色沉淀,获得矿化胶原生物膜nHAC。
有益效果:本方案采用上述设置,便于在以胶原蛋白纤维为模板,钙离子吸附形成矿化位点后,加入磷酸反应形成羟基磷灰石,羟基磷灰石沉积在模板表面,获得矿化胶原生物膜nHAC。相比于直接混合羟基磷灰石和胶原蛋白纤维获得胶原、羟基磷灰石混合材料COL/HAP的结合效果较差而言,本方案采用“原位矿化”的方式所得矿化胶原生物膜nHAC,能在胶原蛋白模板的内外表面均结合羟基磷灰石,从而提升羟基磷灰石在nHAC中含量,提升nHAC膜的支撑效果。
优选的,在步骤1中,所述胶原酸溶液中胶原的浓度为1-5mg/mL,所述酸溶液的pH为1.5~6.5。
有益效果:本方案采用上述设置,便于快速溶胀胶原蛋白,松散胶原蛋白的三维结构,从而便于胶原蛋白的内表面和外表面均能与钙离子(Ca2+)结合形成原位矿化位点,从而提升羟基磷灰石的结合量以及结合强度,便于提升nHAC膜的力学性能,使其在填充至患者体内时能有效承受来自周围软组织的压力,从而为骨再生保留空间。
优选的,在步骤2中,所述胶原与Ca2+的摩尔比为8~20:1;所述Ca2+与磷酸的摩尔比为1.5~2:1;所述钙液是氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙中的任一种;所述钙液的添加速度为35~45ml/min。
有益效果:本方案采用上述设置,便于在胶原蛋白模板上形成足够的羟基磷灰石,兼顾nHAC的支撑效果和低细胞毒性。发明人通过长期实验发现,若是胶原过多或钙液添加速度过慢,均会导致形成的nHAC膜中羟基磷灰石含量过少,降低nHAC膜的支撑效果,甚至可能无法形成膜状的nHAC膜而影响其应用效果;而胶原过少或者钙液添加速度过快,均会导致nHAC膜中羟基磷灰石含量偏高,导致其在使用过程硬度过大使得部分患者不适(尤其是填充至牙槽的情况);另外,羟基磷灰石含量过高还会导致细胞毒性加重,从而降低患者恢复速度,延长恢复周期。
优选的,在步骤3中,所述pH的调节为采用0.1~1M的NaOH溶液调节pH至7~10;所述继续搅拌为在4-50℃、350~400rpm条件下继续搅拌2~24h。
有益效果:本方案采用上述设置,便于尽可能将原位矿化形成的nHAC膜均沉降为白色悬浊液,提升nHAC膜得率。发明人实验发现,若是调节pH的碱溶液浓度过高则会导致pH快速变化而降低nHAC膜的沉降量;而若是调节pH的碱溶液浓度过低则会导致调节过程过于缓慢,从而降低生产效率。
优选的,在步骤4中,所述静置时间为5-60min;所述抽滤过滤洗涤终点为抽滤过滤所得滤液的pH为7.2~7.3。
有益效果:本方案采用上述设置,便于沉降的白色悬浊物尽可能全部沉淀分层,而分层后收集的白色沉淀中仍然含有部分未反应的原料,需要在抽滤过滤状态下洗涤至滤液pH为弱碱性,此时nHAC膜的pH倾向于弱碱性,便于匹配人体体液pH,减少材料对使用者的刺激。
本方案还提供一种矿化胶原材料在制备载药填充物中的应用,包括将nHAC/COL膜浸泡在药物溶液中,震荡负载后取出HAC/COL材料真空恒温干燥,获得负载有药物的矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL/m。
有益效果:本方案采用上述设置,便于将药物负载与矿化胶原生物膜/胶原共混材料材料中,进而随矿化胶原生物膜/胶原复共混材料料的填充进入指定位置,对患者患处进行缓释治疗,提升治疗效果。
附图说明
图1为本发明对比例3中羟基磷灰石和胶原溶液直接共混所得材料COL/HAP的SEM图
图2为本发明对比例1中在胶原表面原位矿化羟基磷灰石所得材料矿化胶原生物膜nHAC的SEM图。
图3为本发明实施例1中矿化胶原生物膜nHAC和胶原Col共混所得矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/Col的SEM图。
图4为本发明实施例1和对比例3中材料的孔隙率对比图。
图5为本发明实施例1、对比例1~3中材料的细胞存活率对比图。
图6为本发明实施例1、对比例1~3中材料的pH对比图。
图7为本发明实施例1(nHAC/Col)和对比例3(Col/HAP)分别浸泡40天后的降解情况对比图。
图8为本发明万古霉素标准曲线。
图9为本发明实施例1(nHAC/Col)和对比例3(Col/HAP)分别负载万古霉素后的缓释曲线对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,且所用的材料、试剂等,均可从商业途径得到。若未特别指明,下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
本方案提供一种矿化胶原材料,由矿化胶原生物膜和胶原蛋白共混而成,矿化胶原生物膜为在胶原蛋白上原位矿化羟基磷灰石所得。
本方案还提供一种矿化胶原生物膜的制备方法,包括如下步骤:
步骤1、配置胶原溶液:将胶原蛋白粉末分散于pH为1.5~6.5的酸溶液中,形成胶原蛋白浓度为1~5mg/mL胶原酸溶液;作为一种参考,本方案酸溶液为冰乙酸、盐酸、硫酸中的任一种;
步骤2、胶原与羟基磷灰石前体混合液的制备:以35~45ml/min的速度,向步骤1所得胶原酸溶液中加入钙液,钙液的添加量使得胶原与Ca2+的摩尔比为8~20:1;作为一种参考,本方案中钙液具体为氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙中的任一种;搅拌均匀后加入磷酸溶液,混匀获得前体混合液;作为一种参考,本方案中磷酸溶液为磷酸氢二钠或磷酸二氢钠,磷酸溶液的添加量使得Ca2+与磷酸的摩尔比为1.5~2:1;
步骤3、胶原与羟基磷灰石悬浊液的制备:采用0.1~1M的NaOH溶液调节前体混合液的pH7~10,混合液呈现白色悬浊液状态停止,在4-50℃、350~400rpm条件下继续搅拌2~24h,获得悬浊液;
步骤4、矿化胶原生物膜的制备:静置5-60min后分层,弃去上清收集白色沉淀,并在抽滤过滤条件下采用ddH2O洗涤白色沉淀,直至抽滤过滤所得滤液的pH为7.2~7.3;于-25~-15℃冷冻12~15h后,在-70~-35℃、10~20pa条件下冷冻干燥24~28h,获得矿化胶原生物膜nHAC。
本方案采用原位矿化的方式制备矿化胶原生物膜nHAC,先采用酸溶液快速溶胀胶原蛋白,松散胶原蛋白的三维结构,从而便于胶原蛋白的内表面和外表面均能与钙离子(Ca2+)结合形成原位矿化位点,加入磷酸后,磷酸和钙离子反应即可在胶原内表面、外表面上均矿化形成羟基磷灰石,制备获得兼顾支撑效果和生物相容性的矿化胶原生物膜材料(nHAC)。
本方案还包括一种矿化胶原材料的制备方法,包括如下步骤:
(一)制备矿化胶原生物膜nHAC阶段
步骤同上述“矿化胶原生物膜的制备方法”。
(二)制备共混材料nHAC/COL阶段
步骤5、采用40~60℃的ddH2O溶解胶原蛋白形成胶原蛋白溶液,向胶原蛋白溶液中加入矿化胶原生物膜nHAC混匀(胶原蛋白Col与矿化胶原生物膜nHAC的混合质量比为2~3:2~3)后,再调节pH至7~10,析出白色沉淀;再静置4-48h收集白色沉淀,于-25~-15℃冷冻12~15h后,在-70~-35℃、10~20pa条件下冷冻干燥24~28h,获得矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL。
本方案通过将矿化胶原生物膜nHAC和胶原蛋白共混获得nHAC/COL膜,使得胶原蛋白包裹在nHAC膜表面,有效遮盖nHAC膜外表面的羟基磷灰石,从而有效降低共混材料nHAC/COL膜的细胞毒性,提升填充材料后的恢复速度。
实施例1
本实施例采用如下步骤制备矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL:
(一)制备矿化胶原生物膜nHAC阶段
步骤1、配置胶原溶液:电子天平称取分子量为1500g/moL的Ⅰ型胶原蛋白粉末200mg置于烧杯中,加入提前配置好的100mL 1.5%(v/v)的盐酸溶液,置于水浴搅拌器中,于25℃,350rpm转速下搅拌,使其充分溶解,得到2mg/ml的胶原酸溶液;
步骤2、胶原与羟基磷灰石前体混合液的制备:按照胶原和Ca2+摩尔比为10:1,向步骤1所得胶原酸溶液中加入Ca2+溶液,本实施例中具体为,Ca2+溶液为CaCl2溶液,利用蠕动泵往持续搅拌中的胶原酸溶液中按照40mL/min缓慢滴加30mg/ml的CaCl2溶液,而后于25℃、350rpm转速条件下继续搅拌30min;然后,按照Ca2+和磷酸摩尔比为1.67:1的比例,加入磷酸二氢钾KH2PO4溶液,混匀获得前体混合液;
步骤3、胶原与羟基磷灰石悬浊液的制备:用蠕动泵以50mL/min速度向前体混合液中缓慢滴加0.5M的NaOH,待调节pH至7、整个体系呈现白色悬浊液状态时,停止加入NaOH,继续搅拌16h,获得悬浊液;
步骤4、矿化胶原生物膜的制备:停止搅拌悬浊液,静置20min后,待体系分层后弃去上清,收集下层的白色沉淀,用抽滤过滤装置对白色沉淀进行ddH2O洗涤,待三角集液瓶中的滤液pH成7.2~7.3时停止过滤。收集白色沉淀,于-20℃冷冻12h后,在-40℃、10pa条件下冷冻干燥24h,获得矿化胶原生物膜nHAC;
(二)制备共混材料nHAC/COL阶段
步骤5、矿化胶原生物膜与胶原溶液共混:称取与矿化胶原生物膜nHAC等质量的胶原蛋白Col(即质量比为1:1,可选nHAC膜和Col的质量比为2~3:2~3),用50℃ddH2O溶解;待溶解胶原蛋白Col后,加入矿化胶原生物膜nHAC,搅拌溶解并调节pH至8.0,待白色沉淀析出;于30℃水浴中静置24h后,收集白色沉淀;冷冻干燥,得到矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL膜。
实施例2
本实施例基本同实施例1,区别在于:步骤1中,胶原酸溶液中胶原蛋白浓度为1mg/mL;步骤2中胶原和Ca2+摩尔比为15:1;Ca2+和磷酸摩尔比为1.5:1;步骤3中悬浊液pH为7,继续搅拌时间为2h;步骤5中Col与nHAC膜质量比为2:3。
实施例3
本实施例基本同实施例1,区别在于:步骤1中,胶原酸溶液中胶原蛋白浓度为5mg/mL;步骤2中胶原和Ca2+摩尔比为20:1;Ca2+和磷酸摩尔比为2:1;步骤3中悬浊液pH为7,继续搅拌时间为24h;步骤5中Col与nHAC膜质量比为3:2。
对比例1
本对比例基本同实施例1,区别在于:本对比例只进行步骤1~步骤4,获得产物矿化胶原生物膜nHAC。
对比例2
将实施例1中步骤4所得nHAC膜经过研磨、粉末、过筛得到粉料状p-nHAC,参照实施例1中步骤5,将矿化胶原生物膜nHAC改为粉料p-nHAC与胶原共混,获得粉料状矿化胶原生物膜/胶原共混材料p-nHAC/COL膜。
在本对比例中,将nHAC膜粉碎为细粉后在于胶原蛋白共混制备p-nHAC/Col膜,其细胞毒性仍然会较高而影响材料的应用,发明人分析其原因在于,粉末状的nHAC在于胶原蛋白共混时,反而会因过于分散而无法将nHAC包裹在Col内,使得p-nHAC/Col膜中羟基磷灰石仍然暴露在材料外围,而影响细胞增殖。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于:没有步骤5共混阶段,且在步骤2中,称取5mg市售纳米级羟基磷灰石(HAP,粒径50~200nm),先将HAP和20mL步骤1所得胶原酸溶液搅拌混匀,先后经过超声、震荡、均质机等步骤,使其充分分散,再加入80mL步骤1所得胶原酸溶液;
后续步骤同实施例1中步骤3和步骤4一致,得到胶原/羟基磷灰石共混材料COL/HAP。
对比例4
本对比例基本同实施例1,区别在于:步骤2中胶原与钙离子的摩尔比为25:1。
在本对比例中,采用过多的胶原与钙离子混合反应,使得制备所得nHAC膜中羟基磷灰石的含量偏低,进而降低其支撑效果。
对比例5
本对比例基本同实施例1,区别在于:步骤2中钙离子的添加速度为30ml/min。
在本对比例中,采用过慢钙离子添加速度,使得过少钙离子同一时间和胶原混合,减少胶原上的钙离子结合位点,而钙离子结合后其附近胶原结构改变使得后续添加进入胶原酸溶液中的钙离子无法再结合,使得nHAC膜中羟基磷灰石的含量降低,进而降低其支撑效果。
对比例6
本对比例基本同实施例1,区别在于:步骤2中钙离子的添加速度为50ml/min。
在本对比例中,采用过快钙离子添加速度,使得过多钙离子同一时间和胶原混合,钙离子之间相互抢夺胶原上的结合位点,使得钙离子过多结合至胶原上,从而提升nHAC膜中羟基磷灰石的含量,加重nHAC膜的细胞毒性。
实施例1-3、对比例1-6中原料、工艺参数及制备所得产品差异详见表1。
表1实施例1-3、对比例1-6中原料、工艺参数及制备所得产品差异
实验例1:不同材料外观的SEM图表征
采用扫描电子显微镜对实施例1、对比例1和对比例3制备所得材料进行扫描,对材料的形貌和微观结构进行表征;具体的,图1为实施例1中共混材料nHAC/Col膜的SEM图,图2为对比例1中材料nHAC膜的SEM图,图3为对比例3中材料COL/HAP的SEM图。
实验数据表明,对比例3中COL/HAP为胶原和羟基磷灰石直接共混而成,如图3所示,两者结合方式为物理吸附,纳米级羟基磷灰石单纯在胶原纤维表层沉积,降低结合效果,进而影响材料使用过程中的结构稳定性。而对比例1中nHAC为在胶原表面原位矿化形成羟基磷灰石,获得矿化胶原生物膜nHAC,如图2所示,在胶原蛋白上原位矿化生长出的羟基磷灰石能均质分布在纤维内表面,有效提升两者结合的稳定性。最后,实施例1中nHAC/Col膜为矿化胶原nHAC与胶原Col共混形成,如图1所示,nHAC与COL共混后,胶原纤维COL占比增多,导电性减弱,整体拍摄出现泛白;另外,微观上COL纤维能将nHAC膜进行包覆,纤维断层能看出nHAC膜中的粗糙感则是无机颗粒的存在造成。
实验例2:不同材料的孔隙率表征
【检测方法】采用液体置换法测定。具体为:用量筒量取V1体积的无水乙醇,取5cm×1cm的膜材料浸入其中,反复抽真空至量筒内无气泡逸出,记录量筒读数是V2,将含乙醇的支架材料移出后,记录所剩乙醇体积为V3。支架孔隙率(P)可用下式计算:P=(V1-V3)/(V2-V3),共测6个样品后取平均值,结果可见表2,实施例1和对比例3所得材料的孔隙率对比图详见图4。
表1实施例1-3、对比例1-5所得材料的孔隙率
实施例 | 孔隙率 |
实施例1 | 70.5±1.6% |
实施例2 | 71.1±2.5% |
实施例3 | 70.4±1.8% |
对比例1 | 71.5±2.1% |
对比例2 | 70.9±3.2% |
对比例3 | 49.2±1.1% |
对比例4 | 65.1±3.1% |
对比例5 | 70.4±2.8% |
对比例6 | 72.4±1.4% |
实验结果表明:本方案采用原位矿化的方式制备所得nHAC/COL膜的孔隙率平均值约为71%(如实施例1-3所示);而将胶原和羟基磷灰石直接共混所得COL/HAP膜的孔隙率只有50%左右(如对比例3所示),说明原位矿化方式能在胶原表面吸附更多羟基磷灰石,从而不仅增加材料的支撑效果,还能提升材料的孔隙率,从而提升材料的理论载药能力。
而本方案生产所得nHAC膜(对比例1)和将nHAC膜粉碎为粉末后再与胶原共混所得p-nHAC/Col膜(对比例2)的孔隙率基本与本方案制备所得nHAC/COL膜的孔隙率一致,发明人分析其原因可能为,共混并不会完全覆盖羟基磷灰石,使得共混后材料和共混前材料的孔隙率差异不大,均具有较高的药物负载能力。
实验例3:不同材料的细胞毒性检测
检测实施例1、对比例1~3中材料的细胞毒性。
【实验步骤】
1、细胞复苏及培养
1.1复苏:将冻存在液氮中的L929细胞取出,置于37℃水浴锅中解冻。待解冻完全后,迅速在超净工作台工作。首先用37℃水浴锅中提前温好加血清的培养基,细胞冻存管解冻后,用无菌滴管吹匀,吸取到15mL无菌离心管中,加入适量培养基,密封,放入离心机中,400G/离心5min。待离心完成,弃掉上清液,加入6mL培养基,重悬细胞,置于dish中,在37℃、5%CO2环境中培养。隔天换液。后续每隔2天进行一次换液;
1.2培养:显微镜观察细胞形态,待细胞无污染、细胞形状成纤维足状铺满dish约80%左右,对其进行传代。无菌PBS轻轻润洗三遍后,加入1mL 0.25%胰酶消化细胞1-2min,直接加入5mL完全培养基,终止消化;吹散细胞,离心重悬,记录细胞数,按照1E+05个/dish的细胞量进行传代。持续培养,得到新一代细胞;孵育培养中,每隔2天换液观察。
2、细胞接板
2.1材料灭菌:将实施例1、对比例1~3中材料分别裁剪成1×1cm2大小的膜片,75%酒精浸泡2h后,在超净工作台中通风状态下,保持12h,每隔4h,进行翻面通风,保证酒精挥发完;每组5个重复试验;
2.2接板:将上述膜片放于24孔板中,待用;L929细胞经过消化、计数、稀释,将细胞以2×104个/孔的密度接种到每个孔板中,于细胞孵箱进行正常培养;以空白组细胞做对照;
【结果检测】
3、检测方法:培养24h后,弃掉孔板中的培养液,并用PBS溶液轻轻润洗。避光条件下,向每孔200μL CCK-8工作液,细胞孵箱避光、静置孵育2h;吸取孔板中CCK8液至96孔板中,用酶标仪在450nm波长下检测各孔吸光值;
CCK-8检测细胞增殖及细胞毒性的原理在于:在PBS溶液存在的情况下,CCK-8可被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的四氮唑盐,颜色越深说明细胞增殖越多越快,颜色越浅,说明细胞毒性越大;颜色变化则可以吸光度表现;
4、数据处理:检测并记录实施例1、对比例1~3及空白组细胞的吸光度(OD值),每组样品5个重复的OD值取平均值,结果详见表3。另外,以实验组平均OD值和空白组平均OD值分别减去培养基OD值后的比值计算细胞存活率,本方案细胞存活率计算采用公式(一)进行:
细胞存活率=(实验组平均OD值-培养基OD值)/(空白组平均OD值-培养基OD值)*100%公式(一)
现有技术细胞存活率计算采用公式(二)进行:
细胞存活率=实验组平均OD值/空白组平均OD值*100%公式(二)
计算结果详见表3,4组样品的细胞存活率差异详见图5(图中*表示结果显著(p<0.05))。
表3实施例1、对比例1~3及空白组细胞的吸光度
实验数据表明,相比于现有技术采用公式(二)“细胞存活率=实验组平均OD值/空白组平均OD值*100%”计算细胞存活率时结果偏高而言,本方案的细胞存活率计算公式去除了培养基对检测结果的影响,更能准确指示材料的细胞毒性。
本方案通过将矿化胶原生物膜nHAC与胶原纤维COL共混形成nHAC/COL膜(即实施例1),能显著降低材料对细胞的毒性,提升细胞存活率。而若是将矿化胶原生物膜(膜状材料)经过研磨、粉末、过筛得到粉料状矿化胶原生物膜p-nHAC,再将p-nHAC和胶原纤维共混形成p-nHAC/COL膜(即对比例2),则因胶原蛋白Col对粉末状nHAC膜的包裹效果降低而使得羟基磷灰石较多暴露在外,从而导致其细胞毒性偏高。
实验例3:不同材料的pH
将实施例1、对比例1~3的材料分别裁剪成1×1cm2大小的膜,每组5个重复试验。
将材料置于装有1xPBS(pH7.3)的离心管中,37℃下震荡摇晃浸提24h后离心,检测上清液中的pH。
结果如图6所示,对比例1中得到的nHAC膜经过浸提后得到的上清液pH不到7.0,呈现弱酸性;经过实施例1和对比例2,将不同形态的nHAC与COL共混后得到的nHAC/COL膜或p-nHAC/Col膜浸提液在正常中性范围,其中实施例1的nHAC/COL膜浸提液的pH约为7.3,而p-nHAC/COL膜浸提液的pH低于7.2,与对比例3得到的COL/HAP浸提液接近。
实验例4:不同材料稳定性检测
将实施例1(nHAC/Col膜)和对比例3(Col/HAP样品)中材料分别用PBS溶液在密封容器浸泡40天后,取出样品对样品外观进行拍照,肉眼观察样品的差异。
结果如图7所示,对比例3中材料偏向于颗粒絮状,可紧密排布后浸泡;然而,经过40天的浸泡后,对比例3样品比实施例1样品降解更多,样品边缘几乎都崩解,本方案制备所得nHAC/COL材料明显具有更高的稳定性。
实施例4
本方案还提供一种矿化胶原材料在制备载药填充物中的应用,包括将nHAC/COL膜浸泡在药物溶液中,震荡负载后取出nHAC/COL膜真空恒温干燥,获得负载有药物的矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL/m。
具体的,将大小2cm*2cm的nHAC/COL膜浸泡在1mg/mL的万古霉素盐酸盐溶液中,保持轻微震荡5~6h,取出nHAC/COL膜于40℃下进行真空恒温干燥,重复“浸泡-干燥”3次,最终获得负载有万古霉素的nHAC/COL膜。
实施例5
本实施例基本同实施例4,区别在于:本实施例中药物为BMP2溶液。
对比例7
本实施例基本同实施例4,区别在于:将nHAC/COL膜更换成COL/HAP颗粒,获得负载有万古霉素的COL/HAP。
实验例5:不同材料负载万古霉素的缓释效果
【绘制万古霉素标准曲线】
用ddH2O配置1mg/mL万古霉素盐酸盐,待充分溶解后,用1xPBS(pH7.3)稀释成500、250、50、10、5、0μg/mL的系列浓度梯度的万古霉素盐酸盐溶液。用紫外分光光度计分别检测在280nm波长下,不同浓度万古霉素溶液的吸光度值,绘制万古霉素的浓度/吸光度值OD标准曲线,详见图8,标准曲线方程为:Y=0.0021X(R2=0.991)。
【负载万古霉素材料的缓释曲线】
将实施例1和对比例3中得到的材料裁剪成1cm*1cm大小(对比例3中材料偏向于颗粒絮状,可紧密排布后裁剪),分别用1xPBS(pH7.3)进行浸泡,置于容器中密封,在37℃摇床中持续放置。分别在第2h、5h、7h、24h、48h、72h、168h、240h、360h、480h、720h、960h吸取上清,做好标记后,往容器中补加等量PBS,容器持续在摇床中放置,待下一个时间点重复吸取、添加步骤。最终通过紫外光度计测量不同时间的上清液OD值,带入万古霉素标准曲线方程,统计上清液中释放的万古霉素浓度,具体结果见图9。
如图9所示,两种材料膜在100h左右释放较快,后续一直在持续释放,但释放量比较少,材料中药物释放时间可达30天以上。然而,直接共混方式制备所得Col/HAP材料较本方案原位矿化制备所得nHAC/Col膜的药物负载量更低,同等面积药物更少,也从侧面证明本方案制备所得nHAC/Col膜的孔隙率更大。
综上,本方案首先通过原位矿化的方式制备矿化胶原生物膜nHAC,该方式在胶原蛋白内表面和外表面均吸附结合较多羟基磷灰石,有效提升材料的力学性能和支撑效果,从而便于在将材料填充至患者体内时,有效承受来自周围软组织的压力,从而为骨再生保留空间。再将矿化胶原生物膜nHAC与胶原蛋白Col共混所得nHAC/COL胶原膜,其不仅具有较高孔隙率以提升载药效果,还通过在矿化胶原生物膜nHAC表面的羟基磷灰石外包裹胶原蛋白,有效隔开羟基磷灰石与周围细胞的直接接触,从而有效降低共混材料的细胞毒性。
以上所述的仅是本发明的实施例,方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明技术方案的前提下,还可以作出若干变形和改进,这些也应该视为本发明的保护范围,这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种矿化胶原材料,其特征在于:由矿化胶原生物膜和胶原蛋白共混而成,所述矿化胶原生物膜为在胶原蛋白上原位矿化羟基磷灰石所得。
2.根据权利要求1所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:包括(一)制备矿化胶原生物膜nHAC阶段和(二)制备共混材料nHAC/COL阶段,所述(二)制备共混材料nHAC/COL阶段包括向胶原蛋白溶液中加入矿化胶原生物膜nHAC混匀后,再调节pH至析出白色沉淀;再静置收集白色沉淀,冷冻干燥白色沉淀,获得矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL。
3.根据权利要求2所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:所述胶原蛋白Col与矿化胶原生物膜nHAC按照2~3:2~3的比例共混。
4.根据权利要求3所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:在(二)制备共混材料nHAC/Col阶段中,所述胶原蛋白溶液由40~60℃的ddH2O溶解胶原蛋白形成;调节pH至7-10;所述冷冻干燥为于-25~-15℃冷冻12~15h后,在-70~-35℃、10~20pa条件下冷冻干燥24~28h。
5.根据权利要求4所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:所述(一)制备矿化胶原生物膜nHAC阶段包括如下步骤:
步骤1、配置胶原溶液:将胶原蛋白粉末分散于盐酸溶液中,形成胶原酸溶液;
步骤2、胶原与羟基磷灰石前体混合液的制备:向步骤1所得胶原酸溶液中加入钙液,搅拌均匀后加入磷酸溶液,混匀获得前体混合液;
步骤3、胶原与羟基磷灰石悬浊液的制备:调节前体混合液的pH至混合液呈现白色悬浊液状态停止,继续搅拌获得悬浊液;
步骤4、矿化胶原生物膜的制备:静置分层后弃去上清,收集并抽滤过滤洗涤下层白色沉淀,冷冻干燥白色沉淀,获得矿化胶原生物膜nHAC。
6.根据权利要求5所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:在步骤1中,所述胶原酸溶液中胶原的浓度为1-5mg/mL,所述酸溶液的pH为1.5~6.5。
7.根据权利要求6所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:在步骤2中,所述胶原与Ca2+的摩尔比为8~20:1;所述Ca2+与磷酸的摩尔比为1.5~2:1;所述钙液是氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙中的任一种;所述钙液的添加速度为35~45ml/min。
8.根据权利要求7所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:在步骤3中,所述pH的调节为采用0.1~1M的NaOH溶液调节pH至7~10;所述继续搅拌为在4-50℃、350~400rpm条件下继续搅拌2~24h。
9.根据权利要求8所述的一种矿化胶原材料的制备方法,其特征在于:在步骤4中,所述静置时间为5-60min;所述抽滤过滤洗涤终点为抽滤过滤所得滤液的pH为7.2~7.3。
10.根据权利要求1所述的一种矿化胶原材料或权利要求2~9任一项所述的一种矿化胶原材料的制备方法制备所得一种矿化胶原材料在制备载药填充物中的应用,包括将nHAC/COL膜浸泡在药物溶液中,震荡负载后取出HAC/COL膜真空恒温干燥,获得负载有药物的矿化胶原生物膜/胶原共混材料nHAC/COL/m。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311086593.3A CN117138113A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种矿化胶原材料及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311086593.3A CN117138113A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种矿化胶原材料及其制备方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117138113A true CN117138113A (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=88909258
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311086593.3A Pending CN117138113A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种矿化胶原材料及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117138113A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993012736A1 (en) * | 1991-12-30 | 1993-07-08 | Norian Corporation | Mineralized collagen |
CN106512104A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-22 | 北京奥精医药科技有限公司 | 矿化胶原基牙槽骨修复材料及其制备方法 |
CN107952115A (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-24 | 北京湃生生物科技有限公司 | 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用 |
EP3311854A1 (en) * | 2016-10-20 | 2018-04-25 | Ústav Struktury A Mechaniky Hornin AV CR, V.V.I. | A nanocomposite layer on the basis of collagen nanofibers, and a method of preparation thereof |
WO2021105248A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Royal College Of Surgeons In Ireland | A collagen scaffold |
CN116492512A (zh) * | 2023-05-19 | 2023-07-28 | 重庆生物智能制造研究院 | 一种胶原羟基磷灰石复合材料仿生生物膜及其制备方法 |
-
2023
- 2023-08-25 CN CN202311086593.3A patent/CN117138113A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993012736A1 (en) * | 1991-12-30 | 1993-07-08 | Norian Corporation | Mineralized collagen |
CN107952115A (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-24 | 北京湃生生物科技有限公司 | 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用 |
EP3311854A1 (en) * | 2016-10-20 | 2018-04-25 | Ústav Struktury A Mechaniky Hornin AV CR, V.V.I. | A nanocomposite layer on the basis of collagen nanofibers, and a method of preparation thereof |
CN106512104A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-22 | 北京奥精医药科技有限公司 | 矿化胶原基牙槽骨修复材料及其制备方法 |
WO2021105248A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Royal College Of Surgeons In Ireland | A collagen scaffold |
CN116492512A (zh) * | 2023-05-19 | 2023-07-28 | 重庆生物智能制造研究院 | 一种胶原羟基磷灰石复合材料仿生生物膜及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107519534B (zh) | 聚乙二醇修饰氧化石墨烯载槲皮素交联脱细胞真皮基质的3d药物复合支架的制作方法 | |
CN112933288B (zh) | 兼具止血和术后抗肿瘤功能的交联止血海绵及其制备方法 | |
US10960106B2 (en) | Tissue repair material | |
CN103071190A (zh) | 一种组织引导再生用胶原基复合生物膜的制备方法 | |
CN113599528B (zh) | 一种仿生型膜-MOFs复合载药体系及其应用 | |
Dreanca et al. | Bioactive glass-biopolymers‑gold nanoparticle based composites for tissue engineering applications | |
Kim et al. | Preparation of a porous chitosan/fibroin-hydroxyapatite composite matrix for tissue engineering | |
CN107158465B (zh) | 一种骨支架复合材料的制备方法 | |
CN112158817A (zh) | 一种骨组织修复材料及其制备方法和应用 | |
CN111265716A (zh) | 一种骨材表面原位修饰金属有机框架的方法及其骨修复应用 | |
CN109395175B (zh) | 引导组织再生膜及其制备方法 | |
Gassling et al. | Magnesium-enhanced enzymatically mineralized platelet-rich fibrin for bone regeneration applications | |
CN117679560A (zh) | 一种负载黑磷可活性氧消除并缓释药物的骨缺损修复多孔支架及其制备方法 | |
CN117138113A (zh) | 一种矿化胶原材料及其制备方法和应用 | |
CN110279892B (zh) | 一种骨修复材料及其制备方法和应用 | |
CN114732962B (zh) | 一种可降解的抗菌引导骨再生膜及其制备方法和应用 | |
CN111870739A (zh) | 一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用 | |
CN112812576B (zh) | 一种新型含锌元素生物源性胶原膜及其制备方法和用途 | |
Fan et al. | Photothermal effect of indocyanine green modified scaffold inhibits oral squamous cell carcinoma and promotes wound healing | |
WO2017175509A1 (ja) | リン酸カルシウム含有多孔質複合体及びpthの組み合わせ | |
Shirosaki et al. | Synthesis and characterization of chitosan-silicate hydrogel as resorbable vehicle for bonelike® bone graft | |
Wang et al. | Comparison of the effects of 3D printing bioactive porous titanium alloy scaffolds and nano-biology for direct treatment of bone defects | |
CN113713120A (zh) | 一种递送抗肿瘤药物的羧甲基壳聚糖纳米凝胶 | |
CN113521386A (zh) | 一种可注射型含rhBMP-2的骨修复水凝胶及其制备方法 | |
CN117339026B (zh) | 用于植入人体牙槽骨中的可吸收支架的制备及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |