CN117122679A - 铝佐剂制剂、其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型铝佐剂制剂，包括：铝佐剂；以及至少一种单一分子量聚乙二醇配体，分别具有如下式(I)～式(III)任一所示的结构：其中，n为2～400；X为R1、R2和R3各自独立地选自下述结构中的任一种：其中，k为1～50；L1为单键、R4各自独立地选自H、卤素中的任一种；R5各自独立地选自醛基、C1～C10烷酰基、硼酸中的任一种。本发明还提供了一种新型铝佐剂制剂的制备方法及应用。

Description

铝佐剂制剂、其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及疫苗佐剂领域，尤其涉及一种铝佐剂制剂、其制备方法与应用。
背景技术
在结合疫苗、灭活疫苗、重组疫苗和类毒素疫苗中，佐剂被广泛使用，主要用于增强和持久的保护性免疫反应。根据疾病的类型和所需的免疫反应，开发了不同设计策略的佐剂。铝盐基佐剂是商业疫苗中使用最多的佐剂。含铝佐剂已被广泛用于白喉、破伤风和乙肝疫苗等。目前，在FDA批准的人类疫苗中，有25种含铝的疫苗。FDA批准的疫苗中铝盐基佐剂的类型包括氢氧化铝、磷酸铝和无定型羟基磷酸铝(AAHS)。大量的机理研究表明，以铝盐为基础的佐剂会刺激Th2免疫反应，而Th1反应则很少或没有。
相关研究表明抗原被吸附在佐剂上，抗原与铝盐的结合被认为是一种强烈的静电作用，能增强抗原呈递细胞(APC)对抗原的吸收和呈递。对抗原的吸附使其在一定时间内保持较高的局部浓度，这对抗原的摄取是有效的。Mannhalter等人证实，破伤风类毒素吸附的氢氧化铝能增强抗原的吸收，并调节抗原的呈现水平。Ghimire等人证明铝可以通过降低内化抗原的降解率来延长抗原呈递的时间和幅度。
此外，还有研究证明将铝佐剂与聚乙二醇结合来增加自身免疫肽段的耐受性，降低机体排斥反应，降低其免疫原性。还有一些生物纳米粒子可引起炎症免疫反应，而补体激活是生物纳米材料诱导的炎症反应和免疫激活反应的主要驱动因素。向纳米粒子添加聚乙二醇已被证明可以减少蛋白质吸附和补体激活。
然而，关于铝佐剂和聚乙二醇结合如何影响抗原作用还没有明确共识，还需要开发新的铝佐剂，为疫苗制剂的研究提供更精确的指导。此外，铝佐剂在运输或使用过程中，随着时间的延长容易发生聚沉，进而导致疫苗聚集，使得随着疫苗的广泛应用，其在生产、使用过程中的稳定性存在挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种铝佐剂制剂、其制备方法与应用，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
根据本发明一个方面的实施例，提供了一种铝佐剂制剂，包括：铝佐剂；以及至少一种单一分子量聚乙二醇配体，分别具有如下式(I)～式(III)任一所示的结构：
其中，n为2～400；
R1、R2和R3各自独立地选自下述结构中的任一种：
其中，k为1～50；L1为单键、R4各自独立地选自H、卤素中的任一种；R5各自独立地选自醛基、C1～C10烷酰基、硼酸中的任一种。
根据本发明另一个方面的实施例，提供了一种如上所述铝佐剂制剂的制备方法，包括：将含至少一种单一分子量聚乙二醇配体的溶液和铝佐剂分散液混合，在25℃孵育1小时，得到所述铝佐剂制剂的混合溶液。
根据本发明再一个方面的实施例，提供了一种如上所述的铝佐剂制剂在制备疫苗中的应用。
根据本发明的实施例，本发明的单一分子量聚乙二醇配体上的磷酸或酚羟基与铝佐剂通过静电作用结合，单一分子量聚乙二醇片段结构相较于多分散聚乙二醇更有利于稳定铝佐剂，抑制铝佐剂的聚沉，同时，聚乙二醇片段末端的功能性基团有利于捕获蛋白，为抗原结合研究提供更精确的指导。
附图说明
图1是本发明实施例1的聚合度为16的直链聚乙二醇，两端功能化的官能团分别为单磷酸与羟基的单一分子量聚乙二醇配体化合物(P-OEG16-OH)的质谱图。
图2是本发明实施例2的聚合度为16的直链聚乙二醇，两端功能化的官能团分别为单磷酸与甲氧基的单一分子量聚乙二醇配体化合物(P-OEG16-OMe)的质谱图。
图3是本发明实施例3的聚合度为16的直链聚乙二醇，两端功能化的官能团分别为单磷酸与马来酰亚胺基团的单一分子量聚乙二醇配体化合物(P-OEG16-MI)的质谱图。
图4是本发明实施例4的聚合度为16的直链聚乙二醇，两端功能化的官能团分别为单磷酸与丁二酰亚胺基团的单一分子量聚乙二醇配体化合物(P-OEG16-SI)的质谱图。
图5是本发明实施例4的聚合度为16的直链聚乙二醇，两端功能化的官能团分别为单磷酸与邻醛基硼酸基团的单一分子量聚乙二醇配体化合物(P-OEG16-FPBA)的质谱图。
图6是本发明实施例6的使用单一分子量聚乙二醇配体P-OEG16-OH、P-OEG16-OMe、P-OEG16-MI、P-OEG16-SI、P-OEG16-FPBA稳定铝佐剂的DLS粒径变化跟踪图。
图7是本发明实施例6的使用单一分子量聚乙二醇配体P-OEG16-OH、P-OEG16-OMe、P-OEG16-MI、P-OEG16-SI、P-OEG16-FPBA稳定铝佐剂的Zeta电位变化跟踪图。
图8是本发明实施例6的使用单一分子量聚乙二醇配体P-OEG16-OMe稳定铝佐剂的TEM跟踪图。
图9是本发明实施例6的使用单一分子量聚乙二醇配体P-OEG16-OMe稳定铝佐剂14天后的宏观变化图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
在实现本发明的过程中发现，通过设计系列的单一分子量聚乙二醇配体，具有精确的聚乙二醇分子量和结构，来与铝佐剂高效、稳定的结合，实现对铝佐剂的改性，一方面，可以抑制铝佐剂的聚沉，另一方面，在改性后铝佐剂表面的功能性基团有利于调控结合抗原或蛋白，为疫苗制剂的研究提供更精确的指导。
具体而言，根据本发明的一些实施例，提供了一种铝佐剂制剂，包括：铝佐剂；以及至少一种单一分子量聚乙二醇配体，分别具有如下式(I)～式(III)任一所示的结构：
其中，n为2～400；
R1、R2和R3各自独立地选自下述结构中的任一种：
其中，k为1～50；L1为单键、R4各自独立地选自H、卤素中的任一种；R5各自独立地选自醛基、C1～C10烷酰基、硼酸中的任一种。
根据本发明的实施例，单一分子量聚乙二醇配体的X基团为磷酸或苯酚时，有利于与铝佐剂进行稳定结合，形成以铝佐剂为核心，包覆聚乙二醇配体的结构，有利于抑制铝佐剂的聚沉。在对铝佐剂进行良好分散的同时，引入不同功能化基团来与抗原或蛋白作用，基于单一分子量聚乙二醇配体的精确分子量和结构有利于研究铝佐剂与抗原形成的关系，为疫苗的研究提供更精确的指导。
根据本发明的实施例，铝佐剂与单一分子量聚乙二醇配体的质量比为0.1～100，优选为0.1～50，例如可以是0.1、1、3、5、9、12、15、20、30、40。若质量比过低，则配体对铝佐剂的影响太小；若质量比过高，则无法起到良好的抑制铝佐剂聚沉的作用。
根据本发明的实施例，铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或无定型羟基磷酸铝，铝佐剂的平均粒径例如可以是10nm～20μm，例如可以是10nm、50nm、100nm、200nm、800nm、1μm、10μm、20μm等。
根据本发明的实施例，单一分子量聚乙二醇配体的种类有两种，以0.01～100例如0.05、0.1、1、10、20等的质量比进行混合，以对铝佐剂进行稳定。例如可以将如下式(Ia)所示化合物P-OEG16-OMe与如下式(Ib)所示化合物P-OEG16-FPBA以1:1的质量比进行混合。
需要说明的是，在本发明的通式化合物中，波浪线表示连接位点。单键的含义表示直接键连；卤素例如可以是氟、氯、溴或碘。CkH2k+1表示直链或支链的烷基，例如可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基等；相应地，OCkH2k+1表示直链或直链的烷氧基，例如可以是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、正庚氧基等。C1～C10烷酰基例如可以是甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丁酰基等。
根据本发明的实施例，上述式(I)～(III)化合物中，n可以是4、8、16、24、32、40、45、64、128、192等。进一步地，n优选为4～100，更优选为4～50。基于合适的n的范围，在便于配体制备的同时，更有利于提高铝佐剂的分散性和稳定性。
根据本发明的实施例，为了考察或研究与抗原或蛋白的形成作用机理，R1～R3可选择不同的功能性基团，以便更好地和抗原或蛋白以共价键合等方式结合。更具体地，R1、R2和R3各自独立地选自下述结构中的任一种：
根据本发明的实施例，单一分子量聚乙二醇配体有下述结构中的一种：
根据本发明的实施例，还提供了上述单一分子量聚乙二醇配体化合物的制备方法，包括：
以如式s1～s3任一所示的单一分子量聚乙二醇为原料，将该单一分子量聚乙二醇的一个羟基由X基团取代，将该单一分子量聚乙二醇的剩余羟基由R1～R3基团取代。
根据本发明的实施例，直接以单一分子量聚乙二醇为起始原料，无需复杂的纯化操作来形成单一分子量聚乙二醇配体化合物。进一步地，根据X基团和R1～R3基团的具体选择，采用常规合成路线，通过对羟基进行选择性保护和脱保护，可使得特定羟基被前述基团所取代。
根据本发明的实施例，为了合成上述直链或支链型的单一分子量聚乙二醇，上述制备方法还包括操作S201～操作S204：
在操作S201，将直链寡聚乙二醇p1的一端进行疏水性封端，得到一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇p2，如下式所示，其中TG表示疏水性封端基团。
在操作S202，将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇p2与多元醇进行缩合反应，使得多元醇键连直链寡聚乙二醇，其中多元醇具有式g1～g3任一所示结构，j为1～16，例如可以是2、4、8、16。：
在操作S203，对键连有直链寡聚乙二醇的多元醇进行水解反应，以去除疏水性封端基团，得到单一分子量聚乙二醇，其中单一分子量聚乙二醇具有式g4～g6任一所示结构。
在操作S204，将单一分子量聚乙二醇迭代为新的多元醇，重复缩合反应和水解反应的操作，直至得到的单一分子量聚乙二醇具有目标分子量，即达到式(I)～(III)所示的聚乙二醇链段的聚合度为n。
根据本发明的实施例，在聚乙二醇末端使用疏水性封端基团可以改变聚乙二醇的溶解性与极性，使得制备得到的带疏水性封端基团的化合物便于纯化分离，进而得到单一分子量精确聚乙二醇，聚合度可以达到40～200，适于进行大量制备，且分子量可控。
根据本发明的实施例，直链寡聚乙二醇(oligo ethylene glycon，简称OEG)是具有重复亚乙基氧结构单元的聚醚化合物，其中i可以为1～8，出于降低成本的考虑，i更优选为1～3。
根据本发明的实施例，操作S204还包括：将直链型的单一分子量聚乙二醇迭代为新的直链寡聚乙二醇，并重复疏水性封端的操作，得到新的一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇p2。
根据本发明的实施例，疏水性封端基团TG选自以下结构中的任意一种：
其中，f各自独立地为0～100，g各自独立地为0～201，e各自独立地为0～10。
根据本发明的实施例，CfHg相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；CfHgOe相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。CfHg可以是C18H37，CfHgOe可以是C20H41O。
根据本发明的实施例，C1～C100的烷基例如可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、正庚烷基等，C2～C100的烯基例如可以是乙烯基、烯丙基、3-丁烯基等，C2～C100的炔基例如可以是乙炔基，炔丙基，3-丁炔基等，C1～C100烷氧基例如可以是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正庚烷氧基等。
根据本发明的实施例，进一步可选的，操作S202中的缩合反应包括：将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇p2使用对甲苯磺酰基(Ts)保护，将得到的化合物p3与多元醇进行缩合反应，使得多元醇键连直链寡聚乙二醇。该反应条件温和，效率较高，适于工业化生产且分子量可控。
根据本发明的实施例，为便于对其中的操作S201～操作S203进一步说明，以疏水性封端基团为作为具体实例，一个具体的实施例如以下变化过程所示：
根据本发明的实施例，本发明的铝佐剂制剂还包括功能性蛋白、多肽或抗原，以混合制备不同的制剂。
根据本发明的一些实施例，还提供了一种如上所述的铝佐剂制剂的制备方法，包括：将含至少一种单一分子量聚乙二醇配体的溶液和铝佐剂分散液混合，在0～50℃孵育0～48小时，得到铝佐剂制剂的混合溶液。
根据本发明的实施例，通过混合孵育的方式，使得单一分子量聚乙二醇配体对铝佐剂进行良好的稳定和分散。
根据本发明的实施例，孵育温度例如可以是0、10、20、30、40、50℃等，孵育时间例如可以是1小时、5小时、12小时、24小时、36小时、48小时等。
根据本发明的实施例，铝佐剂分散液为通过将铝佐剂分散于生理盐水中得到，但并不局限于此，铝佐剂也可分散于其他常用的缓冲溶液中，例如磷酸缓冲液等。
根据本发明的一些实施例，还提供了一种如上所述的铝佐剂制剂在制备疫苗中的应用。
根据本发明的实施例，本发明的铝佐剂制剂应用于疫苗中，铝佐剂不易聚集，且更易和疫苗中的抗原、蛋白或多肽结合，有利于疫苗生产、使用过程的稳定性。
以下通过具体实施例结合附图对本发明的铝佐剂制剂、其制备方法与应用做进一步阐述说明。需要注意的是，下述的具体实施例仅是作为举例说明，本发明的保护范围并不限于此。下述实施例中使用的药品或试剂均为市售所得或通过公知的制备方法自制得到。
实施例1：P-OEG16-OH的制备方法
在瓶中加入原料A(18g,8.4mmol)和甲苯，共沸除水，冰浴下在氮气氛围下加入无水THF以及DIPEA(2.6g,10.1mmol)，而后缓慢加入TrtCl(4.6g,8.4mmol)，室温条件下反应4小时。旋干溶剂，使用EA：THF＝4：1，进行点板，产物使用EA：THF＝8:1进行过柱子，得到无色油状液体B12g。
将原料B(12g，12.45mmol)加入到250ml的烧瓶，而后加入100ml的THF，将NaOH(2.98g，74.69mmol)加入到反应体系中去，冰浴搅拌30min，将对甲苯磺酰氯(7.11g，37.34mmol)溶于10mlTHF,滴加到原料A的THF溶液，而后进行在冰浴下搅拌两小时，室温下反应过夜。使用EA:THF＝5:1进行点板监测反应。使用旋蒸除去溶剂，使用EA：THF＝10:1进行过柱子，得到无色油状液体产物C为11g。
将原料C(11g，9.98mmol)与碘化钠(13.30g，69.83mmol)加入到100mL的烧瓶中，而后加入50mL的丙酮，进行回流过夜。使用使用EA：PE＝5:1进行点板监测，待反应结束。使用旋蒸除去溶剂，而后加入100mL的水，加入100mL的DCM，进行萃取三次，有机相使用无水硫酸钠进行干燥，旋除溶剂，使用EA:THF＝12：1进行柱层析，得到淡黄色的油状液体为10g。将上一步液体(10g,9.31mmol)以及亚磷酸三乙酯(15.5g,93.1mmol)加入到25mL的烧瓶中，使用甲苯共沸除水，而后使用氩气进行保护，加热到160℃，进行回流1h，而后使用EA:THF＝5:1进行点板，待反应完全。使用油泵旋干体系，而后使用EA:THF＝1:1进行柱层析，得到微黄色油状液体产物J为9g。
将原料J(3g,3.56mmol)上一步原料溶解在无水的二氯甲烷中，在冰浴下冷却至0℃，并在30min分钟内滴加到三甲基溴硅烷中(5.45g,35.6mmol)。将反应体系在室温下搅拌两天。蒸发溶剂后，将产物在真空下干燥1h。之后，加入10mL甲醇，并将混合物在室温下搅拌20min，除去溶剂，而后使用DCM萃取，使用冻干机进行冻干过夜，得到微黄色油状液体P-OEG16-OH为2.6g。如图1所示，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)验证成功制备了P-OEG16-OH配体化合物。
实施例2：P-OEG16-OMe的制备方法
将原料E(1.24g，1.28mmol)与碘甲烷(1.82g，12.8mmol)加入到10mL的烧瓶中进行甲苯共沸除水，而后加入5ml的无水THF，再加入NaH(614mg，25.6mmol),室温下反应6h。使用使用EA：PE＝5:1进行点板监测，至反应结束。逐滴加入水进行消耗多余的NaH，而后旋去THF，加入DCM，进行萃取三次，最后使用饱和氯化钠洗涤一次，用无水硫酸钠进行干燥，旋除溶剂，得到淡黄色的油状液体F为1.0g。
将瓶中加入原料F(0.98g，1mmol)和36mL甲醇，将TsOH(19mg，0.1mmol)用4mL甲醇溶解，冰浴下缓慢加入体系，室温下反应过夜。旋蒸除去甲醇，加入100mL水，用EA:PE＝1:3洗涤水相(30mL*2)，再用DCM从水相萃取出产物(100mL*2)，将水相加入NaCl制备成饱和食盐水，再用100mL DCM萃取三次，再用饱和食盐水洗涤有机相(100mL)，有机相干燥，旋蒸除去有机相，得到无色透明产物G为0.9g.
将原料G(0.8g，1.08mmol)加入到50mL的烧瓶，而后加入20mL的THF，将NaOH(0.26g，6.5mmol)溶于0.2mL的水中，加入到反应体系中去，冰浴搅拌30min，将对甲苯磺酰氯(0.62g，3.25mmol)溶于10mLTHF,滴加到原料C的THF溶液，而后进行在冰浴下搅拌两小时，室温下反应过夜。使用EA:THF＝1:1进行点板监测反应。使用旋蒸除去溶剂，而后加入100mL水，使用50mL的PE和5mL的EA进行洗涤两次；再使用100mL的DCM从水相中萃取出产物，重复萃取三次，使用无水硫酸钠进行干燥，再使用旋蒸旋除溶剂，得到微黄色油状液体H为0.8g。
将原料H(0.8g，0.898mmol)与碘化钠(0.86g，4.49mmol)加入到100mL的烧瓶中，而后加入50mL的丙酮，进行回流过夜。使用旋蒸除去溶剂，而后加入100mL的水，加入50mLPE进行洗涤两次，再用DCM进行萃取三次，有机相使用无水硫酸钠进行干燥，旋除溶剂，得到黄色的油状液体I为0.72g。
将原料I(0.72g，0.886mmol)以及亚磷酸三乙酯(5g，30.01mmol)加入到10mL的烧瓶中，使用甲苯共沸除水，而后使用氩气进行保护，加热到160℃，进行回流1h。使用油泵旋干体系，而后使用石油醚进行沉降，得到微黄色油状液体V约0.7g。
将原料V(700mg，0.817mmol)溶解在无水的二氯甲烷中，在冰浴下冷却至0℃，而后将1mL三甲基溴硅烷(7.425mmol)滴加到反应瓶中。将反应体系在室温下搅拌两天。蒸发溶剂后，将产物在真空下干燥1h。之后，加入4mL甲醇，并将混合物在室温下搅拌20min，除去溶剂，而后使用PE进行沉降，使用油泵抽干溶剂，再使用冻干机进行冻干过夜，得到微黄色油状液体产物P-OEG16-OMe为500mg。如图2所示，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)验证成功制备了P-OEG16-OMe配体化合物。
实施例3：P-OEG16-MI的制备方法
将原料J(0.4g，0.54mmol)加入到50mL的烧瓶，而后加入20mL的THF，将NaOH(0.13g，3.25mmol)溶于0.2mL的水中，加入到反应体系中去，冰浴搅拌30min，将对甲苯磺酰氯(0.31g，1.62mmol)溶于10mL THF,滴加到原料对甲苯磺酰氯的THF溶液，而后进行在冰浴下搅拌两小时，室温下反应过夜。使用旋蒸除去溶剂，而后加入100mL水，使用100mL的DCM从水相中萃取出产物，重复萃取三次，使用无水硫酸钠进行干燥，再使用旋蒸旋除溶剂，使用乙醚:石油醚＝1:4的条件进行沉降,得到微黄色油状液体K为0.4g。
将原料K(0.2g，0.2mmol)、呋喃保护的马来酰亚胺(0.067g，0.4mmol)以及碳酸钾(0.138g，1mmol)加入到10mL的DMF在30℃的条件下搅拌24h。在反应体系中加入100mL二氯甲烷，而后使用100mL的水洗涤三次，使用无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，使用DCM溶解，不良溶剂EA：PE＝1:4进行沉降，而后进行干燥，得到微黄色油状物L约180mg。
将原料L(0.18g，0.18mmol)溶解在甲苯中，通入氮气，升温至110℃，反应三小时，而后使用油泵将溶剂旋干，再将产物M溶解在10mL无水二氯甲烷中，在冰浴下冷却至0℃，并在30min分钟内将三甲基溴硅烷(260.25mg,10eq)滴入其中。将反应体系在室温下搅拌两天。蒸发溶剂后，将产物在真空下干燥1h。之后，加入4mL甲醇，并将混合物在室温下搅拌20min，除去溶剂，而后使用PE进行沉降，使用油泵抽干溶剂，再使用冻干机进行冻干过夜，得到微黄色油状液体P-OEG16-MI约140mg。如图3所示，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)验证成功制备了P-OEG16-MI配体化合物。
实施例4：P-OEG16-SI的制备方法
与实施例3类似，区别在于，将呋喃保护的马来酰亚胺替换为丁二酰亚胺(0.039g，0.4mmol)。如图4所示，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-SI)验证成功制备了P-OEG16-SI配体化合物。
实施例5：P-OEG16-FPBA的制备方法
将邻醛基苯硼酸酰基叠氮P(50mg,0.166mmol)、DBTL以及原料J(140mg,0.166mmol)加入到100mL的烧瓶中进行甲苯共沸除水两次，而后在甲苯中，将烧瓶升温到85℃，通入氮气保护，反应四个小时，而后自然恢复至室温。旋除溶剂，而后使用DCM溶解产物，使用PE反复沉降三次，得到微黄色油状液体Q 170mg。
将原料Q(170mg,0.152mmol)溶解在无水的二氯甲烷中，在冰浴下冷却至0℃，并在30min分钟内滴加到三甲基溴硅烷中(232mg,1.52mmol)，将反应体系在室温下搅拌两天。蒸发溶剂后，将产物在真空下干燥1h。之后，加入10mL甲醇，并将混合物在室温下搅拌20min，除去溶剂，而后使用PE进行沉降，使用油泵抽干溶剂，再使用冻干机进行冻干过夜，得到微黄色油状液体R 120mg。
将原料R(120mg,0.113mmol)加入到25mL的圆底烧瓶，再加入8mL THF中搅拌充分溶解；而后将二乙醇胺(71.39mg,)溶入3mL THF，再滴入体系；于室温下反应12h。加入10mL的1M HCl,旋除THF，冻干，再使用乙醚进行沉降，之后进行干燥，得到约100mg的微黄色油状产物P-OEG16-FPBA。如图5所示，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)验证成功制备了P-OEG16-FPBA配体化合物。
实施例6铝佐剂制剂的制备方法
1、试剂的配制：
(1)配制0.7％的氯化钠生理盐水：取0.07g的NaCl固体溶于9.930g的水中，而后充分振荡超声5min，使其溶解，再使用220nm的水相滤膜进行过滤，得到10mL的0.7％的氯化钠生理盐水。
(2)氢氧化铝佐剂的稀释：取出3.64g/L的氢氧化铝佐剂母液，缓慢振荡摇匀，而后取出1mL的母液于10mL的已称重的干净样品瓶中，再加入2.64mL的已经配置好的生理盐水，得到3.64mL的1g/L氢氧化铝佐剂分散液。
(3)单磷酸配体溶液的配制：取2mg的实施例2制得的P-OEG16-OMe于样品瓶，而后加入6mL的配置好的生理盐水，振荡使其充分溶解，再使用220nm的滤膜进行过滤得到0.33g/L的P-OEG16-OMe溶液。
2、铝佐剂制剂的制备
(1)控制组：在超净台中，取1g/L的氢氧化铝佐剂分散液0.6mL于干净的样品瓶中，再加入0.6mL的生理盐水，盖上瓶塞，在摇床上，25℃摇晃1小时。
(2)样品组：在超净台中，取样品瓶加入0.6mL的0.33g/L的P-OEG16-OMe生理盐水溶液，再往样品瓶中加入1g/L的氢氧化铝佐剂，使得最终体系的氢氧化铝的浓度为0.5g/L,磷酸配体的浓度依次为0.17g/L，盖上瓶塞，在摇床上，25℃摇晃孵育1h，制得配体：铝佐剂＝1:3三种质量比例的混合溶液。以同样的方式配置P-OEG16-MI、P-OEG16-SI、P-OEG16-OH、P-OEG16-FPBA的配体溶液与氢氧化铝佐剂以1∶3进行混合，分别制备混合溶液。
对上述各组的混合溶液进行稳定性测试：分别在0h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、2d、3d、5d、7d、10d、14d等不同时间点，使用DLS测试六组混合溶液的粒子粒径、Zeta电位的变化，并且拍照记录体系状态。其中Zeta电位的测试，每次取出0.1mL的体系溶液，然后与1.1mL的水混合后，使得NaCl的浓度为10mM，进行测试。稳定性测试结果具体为：
如下表1，使用配体稳定后的铝佐剂的粒径基本都有所增加，考虑是铝佐剂表面包括单一分子量聚乙二醇配体的原因。相较于未使用配体的控制组，如图6，使用配体稳定后的铝佐剂的粒径变化不大，如图7，使用配体稳定后的铝佐剂的Zeta电位变化不大，如图8，使用配体稳定后的铝佐剂的形貌变化不大，如图9，使用配体稳定后的铝佐剂没有聚沉发生。这些结果均表明，本发明所使用的配体起到了稳定作用。
表1
<Dh>/nm
Control 187.44
P-OEG16-OH 189.76
P-OEG16-OMe 179.14
P-OEG16-MI 225
P-OEG16-SI 247.8
P-OEG16-FPBA 259.6
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种铝佐剂制剂，包括：铝佐剂；以及至少一种单一分子量聚乙二醇配体，分别具有如下式(I)～式(III)任一所示的结构：
其中，n为2～400；
X为
R1、R2和R3各自独立地选自下述结构中的任一种：
其中，k为1～50；
L1为单键、
R4各自独立地选自H、卤素中的任一种；
R5各自独立地选自醛基、C1～C10烷酰基、硼酸中的任一种。
2.根据权利要求1所述的铝佐剂制剂，其中，所述铝佐剂与所述单一分子量聚乙二醇配体的质量比为0.1～100。
3.根据权利要求1所述的铝佐剂制剂，其中，所述单一分子量聚乙二醇配体的种类为两种，以0.01～100的质量比进行混合。
4.根据权利要求1所述的铝佐剂制剂，其中，R1、R2和R3各自独立地选自下述结构中的任一种：
5.根据权利要求1所述的铝佐剂制剂，其中，所述单一分子量聚乙二醇配体具有下述结构中的任一种：
6.根据权利要求1所述的铝佐剂制剂，其中，所述铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或无定型羟基磷酸铝；
其中，所述铝佐剂的平均粒径为10nm～20μm。
7.根据权利要求1所述的铝佐剂制剂，其中，所述铝佐剂制剂还包括功能性蛋白、多肽或抗原。
8.一种如权利要求1至7中任一项所述的铝佐剂制剂的制备方法，包括：
将含至少一种单一分子量聚乙二醇配体的溶液和铝佐剂分散液混合，在0～50℃孵育0～48小时，得到所述铝佐剂制剂的混合溶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述铝佐剂分散液为通过将所述铝佐剂分散于生理缓冲液中得到，所述生理缓冲液包括生理盐水或磷酸缓冲液。
10.一种如权利要求1至7中任一项所述的铝佐剂制剂在制备疫苗中的应用。
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