CN117120446A - 糖衍生的脂质纳米材料及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及用于治疗癌症、免疫病症和其他预防性和治疗性应用的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月12日提交的美国临时专利申请序列号63/148,755的权益,所述美国临时专利申请的公开内容以引用方式明确并入本文。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R35GM119679下的政府支持产生。政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本公开涉及用于治疗癌症和其他免疫病症的组合物和方法。
背景技术
mRNA的有效递送是mRNA治疗剂施加的关键步骤和挑战。尽管来自正在进行的临床试验的数据有前途,但是mRNA的临床使用需要探索和开发更有效的递送系统。需要用于将mRNA递送至细胞以治疗癌症和其他免疫病症的新型组合物和方法。
发明内容
在一些方面,本文公开了一种具有式I、II或III的化合物:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,R1选自以下:
或它们的盐。
在一些实施方案中,所述化合物是
其中R1是
在一些实施方案中,所述化合物是
其中R1是
在一些方面,本文公开了一种基于脂质的纳米颗粒,所述基于脂质的纳米颗粒包含:根据任何前述方面的化合物,以及包含编码共刺激分子的核酸的重组多核苷酸。
在一些方面,本文公开了一种抗原呈递细胞,所述抗原呈递细胞包含基于脂质的纳米颗粒,所述基于脂质的纳米颗粒包含:根据任何前述方面的化合物,以及包含编码共刺激分子的核酸的重组多核苷酸。
在一些实施方案中,
所述化合物是
其中R1是
在一些实施方案中,共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳糖凝集素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1和LFA3。在一些实施方案中,共刺激分子是CD40。
在一些实施方案中,编码共刺激分子的mRNA包含异源5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施方案中,编码共刺激分子的mRNA包含异源3'非翻译区(3'UTR)。在一些实施方案中,mRNA包含化学修饰的核碱基。在一些实施方案中,所述化学修饰的核碱基是假尿苷。在一些实施方案中,抗原呈递是骨髓来源的树突细胞。
在一些方面,本文公开了一种治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据任何前述方面的抗原呈递细胞和抗体。
在一些实施方案中,所述抗体选自抗CD40抗体、抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体,或它们的组合。
在一些实施方案中,所述抗原呈递细胞和所述抗体瘤内施用。
在一些方面,本文公开了一种治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用:
治疗有效量的根据任何前述方面的基于脂质的纳米颗粒,以及
治疗有效量的根据任何前述方面的抗原呈递细胞。
在一些实施方案中,所述基于脂质的纳米颗粒包含
其中R1是
在一些实施方案中,基于脂质的纳米颗粒包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含编码CD40L的核酸。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图示出了下面描述的几个方面。
图1A至图1C.关闭糖醇衍生的可电离脂质的癌症免疫循环(CIC)和化学合成。a.通过整合脂质纳米颗粒和细胞疗法(CATCH)来关闭CIC的图示。b.糖醇衍生的可电离脂质的代表性合成路线。c.糖醇衍生的可电离脂质的结构(DIS、DIM和LIS系列)。
图2A至图2J.脂质纳米颗粒(LNP)-mRNA制剂的筛选和表征。a.DIS、DIM和LIS LNP在BMDC中的mRNA递送功效。b.不同摩尔比的DIM7 LNP下的每种脂质组分对mRNA递送的效应。c.DIM7LNP正交制剂和优选制剂的相对发光强度。d.不同摩尔比的LIS10LNP下的每种脂质组分对mRNA递送的效应。e.LIS10 LNP正交制剂的相对发光强度。f.优选制剂的表。g.DIM7S LNP的表征,包括大小、PDI、封装效率和ζ电位。h.DIM7S的冷冻-TEM图像(比例尺=50nm)。i.LIS10W LNP的表征,包括大小、PDI、封装效率和ζ电位。j.LIS10W的冷冻TEM图像(比例尺=50nm)。a、b、c、d和e中的数据来自n=3个生物学独立样本。所有数据均表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图3A至图3O.树突细胞激活、脂质纳米颗粒(LNP)诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)、以及对原发肿瘤和再攻击肿瘤的治疗效应。a.树突细胞激活标志物的表达,所述树突细胞激活标志物包括CD80、CD86、MHC-II、IL1-β(原形式)、TNF-α和IL12。b.B16F10肿瘤模型和处理方案的示意图。c、d.随时间推移的肿瘤体积(c)和小鼠存活率(d);n=6或7。e、f.LNP诱导的体外(e)和体内(f)ICD标志物,包括细胞外HMGB1、细胞外ATP和细胞表面钙网蛋白。g.B16F10肿瘤模型和处理方案的示意图。h.随时间推移的小鼠存活率;n=6。i.在皮下(s.c.)肿瘤再攻击后CD40L-LIS10W+CD40-BMDC组中响应小鼠的存活率;n=5或6。j.B16F10肿瘤模型和处理方案的示意图。k.随时间推移的小鼠存活率;n=6。l.CD40L-LIS10W+CD40-BMDC组中响应小鼠在皮下肿瘤再攻击后的存活率;n=5或6。m.B16F10-Luc2肿瘤模型和处理方案的示意图。n.随时间推移的小鼠存活率;n=9。o.在颅内(i.c.)肿瘤再攻击后CD40L-LIS10W+CD40-BMDC组中响应小鼠的存活率;n=5或8。a、e和f中的数据均来自n=3个生物独立样本,并表示为平均值±标准偏差(s.d.)。c中的数据表示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)。通过双尾学生t检验分析a、c、e和f中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析d、h、i、k、l、n和o中的统计显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图4A至图4L.对两种肿瘤或T细胞耗竭模型的治疗效应,以及细胞因子和趋化因子在肿瘤组织和血液中的动态表达。a.B16F10肿瘤模型和处理方案的示意图。b、c.随时间推移单独小鼠的远端肿瘤体积(b)和小鼠存活率(c);n=8或10。d.B16F10-Luc2肿瘤模型和处理方案的示意图。e、f.随时间推移的脑肿瘤体积(e)和小鼠存活率(f);n=10。g.B16F10肿瘤模型和处理方案的示意图。h、i.随时间推移的肿瘤体积(h)和小鼠存活率(i);n=6。j.处理方案和样本收集的示意图。k、l.肿瘤组织(k)和血液(l)中细胞因子和趋化因子的动态表达;n=5。b、e和h中的数据表示为平均值±平均值标准误差。通过双尾学生t检验分析b、e和h中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析c、f和i中的统计显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图5A至图5E.肿瘤组织中的免疫细胞浸润。a.肿瘤组织中的免疫细胞群;n=5。b.肿瘤组织中激活的巨噬细胞和树突细胞的百分比;n=5。c.肿瘤组织中始发态(primed)CD8T细胞的百分比;n=5。d、e.脾脏(d)和血液(e)中效应记忆T细胞和中枢记忆T细胞的百分比;n=5。
图6A至图6B.脂质纳米颗粒(LNP)-mRNA制剂的表征。a.纳米颗粒大小和多分散指数(PDI)。b.截留效率和ζ电位。所有数据均表示为平均值±标准偏差。
图7A至图7F.脂质纳米颗粒(LNP)-mRNA制剂的表征。a.L16(4)4正交表。b.DIM7S的冷冻TEM图像(比例尺=50nm)。c.LIS10W的冷冻TEM图像(比例尺=50nm)。d.电穿孔(Electro)、DIM7和DIM7S对脂质转染胺3000(Lipo 3K)的相对发光强度。e.由DIM7S递送的mRNA的表达动力学。f.BMDC中的CD40表达。d、e和f中的数据均来自n=3个生物学独立样本,并且表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析d、e和f中的统计显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图8.单独小鼠的肿瘤体积;n=6或7。
图9A至图9E.脂质纳米颗粒(LNP)诱导的细胞毒性以及CD40和CD40L的表达。a.在树突细胞中由CD40-DIM7S介导的体内CD40表达;n=5。b.由CD40L-DIM7S和CD40L-LIS10W诱导的体外细胞毒性。c.由CD40L-DIM7S和CD40L-LIS10W介导的B16F10黑素瘤细胞中的体外CD40L表达。d、e.在肿瘤细胞(d)和免疫细胞(e)(包括巨噬细胞、树突细胞、CD8 T细胞和CD4T细胞)中由CD40L-LIS10W介导的体内CD40L表达;n=3或5。b和c中的数据来自n=3个生物学独立样本。所有数据均表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图10A至图10G.单独小鼠的肿瘤体积。a.单独小鼠的原发肿瘤体积;n=6。b.单独小鼠的再攻击皮下肿瘤体积;n=5或6。c、d.随时间推移的肿瘤体积(c)和单独小鼠的原发肿瘤体积(d);n=6。e.单独小鼠的再攻击皮下肿瘤体积;n=5或6。f.单独小鼠的原发肿瘤体积;n=9。g.随时间推移的脑肿瘤体积;n=5或8。c和g中的数据表示为平均值±平均值标准误差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图11A至图11C.单独小鼠的肿瘤体积。a.单独小鼠处理侧上的肿瘤体积;n=8或10。b.单独小鼠处理侧上的肿瘤体积;n=10。c.单独小鼠的肿瘤体积;n=6。
图12.小鼠黑素瘤组织中细胞因子和趋化因子的动态表达;n=5。
图13.小鼠血液中细胞因子和趋化因子的动态表达;n=5。
具体实施方式
本文公开了调节免疫系统以治疗癌症和其他免疫病症的组合物和方法。
现在将详细参考本发明的实施方案,附图和实施例中说明了所述实施方案的示例。然而,本发明可以许多不同形式体现且不应被解释为限于本文所阐述的实施方案。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如本文所用的术语“包含”及其变型与术语“包括”及其变型同义使用,并且是开放的非限制性术语。尽管本文使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方案,但可使用术语“基本上由……组成”和“由……组成”来代替“包含”和“包括”,以提供更加具体的实施方案,并且也做了公开。除非上下文另外清楚地指出,如本公开内容中和所附权利要求书中所使用,单数形式“一(a/an)”、“所述”包括复数个指示对象。
提供以下定义是为了全面理解本说明书中使用的术语。
术语
如本文所用,术语“可以”、“任选地”和“可任选地”可互换使用并且意在包括条件发生的情况以及条件不发生的情况。因此,例如,制剂“可包含赋形剂”的陈述意在包括制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
术语“引发子”或“调节元件”是指位于转录起始上游或下游并且参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以引发转录的区域或序列决定簇。引发子不需要是细菌来源的,例如,来源于病毒或其他生物体的引发子可以用于本文所述的组合物、系统或方法中。术语“调节元件”旨在包括引发子、增强子、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entrysite,IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号,诸如聚腺苷酸化信号和聚U序列)。此类调节元件描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。调节元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调节元件和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节元件(例如,组织特异性调节序列)。组织特异性引发子可以指导主要在所需的感兴趣组织,例如肌肉、神经元、骨骼、皮肤、血液、特定器官(例如肝脏、胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中表达。调节元件也可以以时间依赖性方式,例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式指导表达,其也可能是或可能不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中,载体包含一个或多个pol III引发子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol I引发子)、一个或多个pol II引发子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol II引发子)、一个或多个pol I引发子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol I引发子)、或它们的组合。pol III引发子的示例包括但不限于U6引发子和H1引发子。pol II引发子的示例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)LTR引发子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)引发子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)]、SV40引发子、二氢叶酸还原酶引发子、β-肌动蛋白引发子、磷酸甘油激酶(PGK)引发子和EF1α引发子。术语“调节元件”还涵盖增强子元件,诸如WPRE;CMV增强子;HTLV-I的LTR中的R-U5'区段(Mol.Cell.Biol.,第8(1)卷,第466-472页,1988);SV40增强子;以及兔β-珠蛋白的外显子2与外显子3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,第78(3)卷,第1527-31页,1981)。本领域技术人员将理解,表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所需表达水平等因素。
术语“重组”是指人操纵的核酸(例如多核苷酸)或人操纵的核酸(例如多核苷酸)的拷贝或互补物,或者如果涉及蛋白质(即,“重组蛋白质”),则是指由重组核酸(例如多核苷酸)编码的蛋白质。在实施方案中,包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的引发子的重组表达盒可包括作为人操纵(例如,通过在Sambrook等人,MolecularCloning—ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)中所述的方法进行人操纵)的结果而异源于第二核酸(例如多核苷酸)的引发子。在另一示例中,重组表达盒可包含以核酸(例如多核苷酸)极不可能在自然界中发现的方式组合的核酸(例如多核苷酸)。例如,人操纵的限制性位点或质粒载体序列可以侧接引发子或将引发子与第二核酸(例如多核苷酸)分开。本领域技术人员将认识到核酸(例如多核苷酸)可以以多种方式进行操纵并且不限于以上示例。
术语“表达盒”或“载体”是指核酸构建体,所述核酸构建体当被引入宿主细胞时,分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在实施方案中,包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的引发子的表达盒可包括作为人操纵(例如,通过在Sambrook等人,MolecularCloning—A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)中所述的方法进行人操纵)的结果而异源于第二核酸(例如多核苷酸)的引发子。在一些实施方案中,包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子(或终止序列)的表达盒可包括由于人操纵的结果而与第二核酸(例如多核苷酸)异源的终止子。在一些实施方案中,作为人操纵的结果,表达盒包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作连接的引发子和与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子。在一些实施方案中,表达盒包含内源引发子。在一些实施方案中,表达盒包含内源终止子。在一些实施方案中,表达盒包含合成(或非天然)引发子。在一些实施方案中,表达盒包含合成(或非天然)终止子。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中,术语“同一”或“同一性”百分比是指这样的两个或更多个序列或子序列,所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸为相同的(即,当比较和比对在比较窗口或指定区域内的最大对应时,在该指定区域内约60%同一性,优选61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性),如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查(参见例如,NCBI网站等)测量的。此类序列被称为“基本上相同”。此定义也是指或可应用于测试序列的互补序列。所述定义还包括具有缺失和/或添加的序列,以及具有取代的序列。如下所述,优选算法可以考虑缺口等。优选地,同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上,或更优选地存在于长度为10个至50个氨基酸或20个至50个核苷酸的区域上。如本文所用,氨基酸序列同一性百分比(%)被定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后,候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为了测定序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现,例如,使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。用于测量比对的适当参数,包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法,可以通过已知方法确定。
对于序列比较,通常一个序列作为参考序列,测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入计算机,如果需要,指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。优选地,可使用默认程序参数,或者可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法,其分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402,以及Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高评分序列对(HSP),所述短词当与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足某个正值阈值评分T。T被称为邻近字得分阈值(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。这些初始邻近字命中充当引发搜索以找到含有它们的较长HSP的种子。字命中沿每个序列在两个方向上延伸,直到累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配残基的奖励得分;总是>0)和N(错配残基的惩罚得分;总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列,使用评分矩阵计算累积得分。在以下情况下,字命中在每个方向上的延伸停止:累积比对得分从其最大实现值下降数量X;由于一个或多个负评分残基比对的累积,累积得分变为零或更低;或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11,期望值(E)为10,M=5,N=-4和比较两条链。对于氨基酸序列,BLASTP程序默认使用字长为3,期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=-4和比较两条链。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N)),其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如,如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2,更优选小于约0.01,则认为核酸与参考序列相似。
短语“密码子优化”是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区,是指改变多核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映所选生物体的典型密码子使用而不改变DNA编码的多肽。此类优化包括用一种或多种更频繁地用于选定生物体的基因中的密码子替换至少一种、多于一种或大量的密码子。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时,该核酸是“可操作地连接的”。例如,如果前序列或分泌前导序列的的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白,则它可操作地连接至多肽的DNA;如果引发子或增强子影响序列的转录,则它可操作地连接至编码序列;或者如果核糖体结合位点被定位为有助于翻译,则它可操作地连接至编码序列。通常,“可操作地连接”意指被连接的DNA序列彼此靠近,并且在分泌前导序列的情况下,是连续的并且处于阅读阶段中。然而,可操作地连接的核酸(例如增强子和编码序列)不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果此类位点不存在,则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。在实施方案中,当引发子能够影响(例如相对于不存在引发子的情况进行调节)来自编码序列的蛋白质的表达时,引发子与该编码序列可操作地连接(即,该编码序列处于该引发子的转录控制下)。
术语“核碱基”是指具有沃森/克里克碱基配对功能的核苷酸部分。最常见的天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)具有氢键合功能,所述氢键合功能可将一条核酸链与另一条核酸链以序列特异性方式结合。
如通篇所使用的,“受试者”(或“宿主”)是指个体。因此,“受试者”可包括例如驯养动物(例如猫、狗等)、家畜(例如,牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如,小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)哺乳动物、非人类哺乳动物、灵长类动物、非人类灵长类动物、啮齿动物、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其他动物。受试者可以是哺乳动物,诸如灵长类动物或人。治疗剂的施用可以以对治疗受试者有效的剂量和时间段进行。
如本文所用的术语“约”在涉及诸如量、百分比等的可测量值时,意在涵盖相对于该可测量值的±20%、±10%、±5%或±1%的变化。
如果核酸序列源自外来物种,或者如果来自同一物种,由于人类行为而从其原始形式被修饰时,则该核酸序列与第二核酸序列是“异源的”。例如,与编码序列可操作地连接的异源引发子(或异源5'非翻译区(5'UTR))是指编码序列来自与引发子所来源于的物种不同的物种,或者如果来自相同物种,则编码序列不同于天然存在的等位基因变体(例如,来自不同基因的5'UTR或3'UTR与编码共刺激分子的核酸可操作地连接)。
如本文所用的术语“纳米颗粒”是指这样的粒子或结构,所述粒子或结构与此类使用环境生物相容并充分抵抗被此类使用环境化学和/或物理破坏,使得足够数量的纳米颗粒在递送至施加或治疗部位后保持基本上完整并且所述纳米颗粒的大小在纳米范围内。在一些实施方案中,纳米颗粒的范围通常为约1nm至约1000nm、约50nm至约500nm、约50nm至约350nm、约100nm至约250nm、或约110nm至约150nm。
组合物的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效实现所需治疗结果的量。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的病症或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重的因素而变化。该术语还可以指有效促进所需治疗效应的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如,随时间推移的量)。精确的所需治疗效应将根据待治疗的疾患、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如,治疗剂的效力、制剂中药剂的浓度等),以及本领域普通技术人员理解的各种其他因素而变化。在一些情况下,在数天、数周或数年的时段内向受试者施用多剂量的组合物后,实现了所需的生物或医学反应。
如本文所用,受试者的术语“治疗”或“处理”包括向受试者施用药物以治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高、稳定或影响疾病或病症、或疾病或病症的症状。术语“治疗”和“处理”还可以指减轻症状的严重性和/或频率,消除症状和/或根本原因、以及改善或补救损伤。
如本文所用,术语“预防”受试者的疾病、病症或不希望的生理事件是指预防疾病、病症或不希望的生理事件,或预防疾病、病症或不希望的生理事件的症状。
药剂的“有效量”是指足以提供所需效应的药剂的量。“有效”的药剂的量将因受试者而异,这取决于许多因素,诸如受试者的年龄和一般状况、一种或多种特定药剂等。因此,并不总是可以指定量化的“有效量”。然而,本领域普通技术人员可以使用常规实验确定任何受试者情况下的适当“有效量”。此外,如本文所用,并且除非另外具体说明,否则药剂的“有效量”还可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效果所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重的因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。例如,可每天施用若干分开的剂量,或者剂量可以如由治疗情况的紧急事件所指示按比例减小。
“药学上可接受的”组分可以指在生物学上或其他方面不是非期望的组分,即,该组分可以掺入本发明的药物制剂中并如本文所述施用于受试者而不引起显著的非期望的生物学效应或以有害方式与包含该组分的制剂的其他组分中的任何其他组分相互作用。当关于施用于人类使用时,该术语通常意味着该组分已满足毒理学和制造测试的要求标准,或者该组分包含在美国食品和药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)编制的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)是指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂,并且包括可用于兽医和/或人类药物或治疗用途的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用,术语“载体”涵盖但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于药物制剂的其他物质,并且如本文进一步所述。
“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益生物效应包括治疗效应(例如,治疗病症或其他非期望的生理疾患)和预防效应(例如,预防病症或其他非期望的生理疾患)两者。所述术语还包括本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物,包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时,或当具体辨识出特定药剂时,应理解该术语包括药剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
如本文所用,术语“控释”或“控释药物递送”或“缓释”是指以受控方式从给定剂型中释放或施用药物以实现所需的体内药代动力学特征。“受控”药物递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药物释放动力学的能力。
如本文所用的措辞“并行施用”、“联合施用”、“同时施用”或“同时地施用”是指化合物在同一时间点或紧接着彼此施用。
术语“多肽”是指由单链D-氨基酸或L-氨基酸构成的化合物或通过肽键接合的D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。
术语“抗体”在本文中以广义使用并且包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外,术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物,以及免疫球蛋白分子或其片段的人形式或人源化形式。可以使用本文所述的体外测定或通过类似方法测试抗体的所需活性,在此之后根据已知的临床测试方法测试它们的体内治疗和/或预防活性。有以下五种主要的人免疫球蛋白类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些中的几种可以进一步分为“亚类”(同种型),例如IgG-1、IgG-2、IgG-3,和IgG-4;IgA-1和IgA-2。本领域的技术人员会认识到用于小鼠的可比类别。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即,该群体中的单独抗体是相同的,不同之处在于可能存在于抗体分子的小子集中的可能天然存在的突变。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体以及此类抗体的片段,在所述“嵌合”抗体中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源,而所述链的其余部分与源于其他物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源,只要它们表现出所需的拮抗活性即可。
可以使用任何产生单克隆抗体的工序来制备所公开的单克隆抗体。例如,所公开的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备,所述杂交瘤方法是诸如由Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法。在杂交瘤方法中,通常用免疫剂免疫小鼠或其他合适的宿主动物以诱发产生或能够产生将特异性结合所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者,可以在体外免疫淋巴细胞。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制备。可使用常规工序(例如,通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码所公开的单克隆抗体的DNA并进行测序。抗体或活性抗体片段的文库也可以使用噬菌体展示技术来产生和筛选,所述噬菌体展示技术为例如如在Burton等人的美国专利号5,804,440和Barbas等人的美国专利号6,096,441中所述。
体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术来完成抗体的消化以产生其片段,特别是Fab片段。例如,可以使用木瓜蛋白酶执行消化。木瓜蛋白酶消化的示例描述于1994年12月22日公布的WO 94/29348和美国专利号4,342,566中。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的抗原结合片段,称为Fab片段,每个Fab片段均具有单一抗原结合位点;以及残余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生片段,所述片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
如本文所用,术语“抗体或其抗原结合片段”或“抗体或其片段”包括具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体,以及片段,诸如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv、scFv等,包括杂交片段。因此,提供了保留结合其特异性抗原的能力的抗体片段。例如,保持结合活性的抗体片段被包括在术语“抗体或其抗原结合片段”的含义内。此类抗体和片段可以通过本领域已知的技术制备,并且可以根据实施例中阐述的方法和用于产生抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法来筛选特异性和活性(参见Harlow和Lane.Antibodies,ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988))。
“抗体或其抗原结合片段”的含义中还包括抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物。“抗体或其抗原结合片段”的含义中还包括免疫球蛋白单可变结构域,例如纳米抗体。
片段,无论是否附接至其他序列,也都可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选定修饰,前提条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比,抗体或抗体片段的活性没有显著改变或受损。这些修饰可提供一些附加性质,诸如去除/添加能够二硫键键合的氨基酸、增加所述氨基酸的生物寿命、改变所述氨基酸的分泌特性等。在任何情况下,抗体或抗体片段必须具有生物活性性质,诸如特异性结合其同源抗原。抗体或抗体片段的功能或活性区域可通过进行蛋白质的特定区域的诱变,之后表达和测试所表达的多肽来鉴定。此类方法对于本领域技术人员而言是容易地显而易见的,并且可包括编码抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变。(Zoller,M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354,1992)。
如本文所用,术语“抗体”还可指人抗体和/或人源化抗体。许多非人抗体(例如,源自小鼠、大鼠或兔子的抗体)在人类中具有天然抗原性,并且因此在施用于人类时可引起非期望的免疫响应。因此,在所述方法中使用人抗体或人源化抗体可减少施用于人的抗体引起非期望的免疫响应的机会。
如本文所用的术语“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的聚合物。
如本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体构成的单链聚合物或双链聚合物。
化学定义
如本文所用,术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义方面,可允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、以及芳族和非芳族取代基。说明性取代基包括例如下文所述的那些取代基。对于适当的有机化合物,可允许的取代基可以是一个或多个并且相同或不同。出于本公开的目的,杂原子如氮可具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的满足杂原子的化合价的任何可允许的取代基。本公开不旨在以任何方式受限于有机化合物的可允许的取代基。此外,术语“取代”或“被取代”包括隐含的条件,即这种取代与被取代的原子和取代基的允许化合价一致,并且所述取代产生稳定的化合物,例如不会自发地经历转化(诸如通过重排、环化、消除等)的化合物。
“Z1”、“Z2”、“Z3”和“Z4”在本文中用作通用符号以表示各种具体的取代基。这些符号可以是任何取代基,不限于本文公开的那些,并且当它们在一种情况下被定义为某些取代基时,它们在另一种情况下可以被定义为一些其他取代基。
本文所用的术语“脂族”是指非芳族烃基,并包括支链和非支链的烷基、烯基或炔基。
本文所用的术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基,诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基也可以是取代或未取代的。烷基可被一个或多个基团取代,所述一个或多个基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫氧基、磺酰基、砜、亚砜或硫醇,如下所述。
在整个说明书中,“烷基”通常用于指未取代的烷基和取代的烷基;然而,取代的烷基在本文中还通过确定烷基上的具体取代基而被具体提及。例如,术语“卤代烷基”具体是指被一个或多个卤素(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个烷氧基取代的烷基,如下所述。术语“烷基氨基”具体是指被一个或多个氨基取代的烷基,如下所述等。当在一种情况下使用“烷基”而在另一种情况下使用诸如“烷基醇”的特定术语时,并不意味着暗示术语“烷基”也不指诸如“烷基醇”等的特定术语。
此实践也用于本文所述的其他基团。即,尽管诸如“环烷基”的术语是指未取代的和取代的环烷基部分,但取代的部分可另外在本文中具体指明;例如,特定的取代的环烷基可称为例如“烷基环烷基”。类似地,取代的烷氧基可以具体地称为例如“卤代烷氧基”,特定的取代的烯基可以是例如“烯基醇”等。此外,使用通用术语如“环烷基”和特定术语如“烷基环烷基”的实践并不意味着暗示通用术语也不包括特定术语。
本文所用的术语“烷氧基”是通过单个末端醚键结合的烷基;即,“烷氧基”可被定义为-OZ1,其中Z1是如上定义的烷基。
如本文所用的术语“烯基”是具有含有至少一个碳-碳双键的结构式的2至24个碳原子的烃基。不对称结构如(Z1Z2)C=C(Z3Z4)旨在包括E和Z异构体。这可以在其中存在不对称烯烃的本文结构式中假定,或者它可以由键符号C=C明确表示。烯基可被一个或多个基团取代,所述一个或多个基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫氧基、磺酰基、砜、亚砜或硫醇,如下所述。
如本文所用的术语“炔基”是具有含有至少一个碳-碳三键的结构式的2至24个碳原子的烃基。炔基可被一个或多个基团取代,所述一个或多个基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫氧基、磺酰基、砜、亚砜或硫醇,如下所述。
本文所用的术语“芳基”是含有任何碳基芳族基团的基团,包括但不限于苯、萘、苯基、联苯、苯氧基苯等。术语“杂芳基”被定义为含有芳族基团的基团,所述芳族基团具有至少一个结合在芳族基团的环内的杂原子。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。包括在术语“芳基”中的术语“非杂芳基”定义含有不含杂原子的芳族基团的基团。芳基或杂芳基可被取代或未被取代。芳基或杂芳基可被一个或多个基团取代,所述一个或多个基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫氧基、磺酰基、砜、亚砜或硫醇,如本文所述。术语“联芳基”是特定类型的芳基并且包括在芳基的定义中。联芳基是指经由稠环结构结合在一起(如在萘中)或经由一个或多个碳-碳键连接(如在联苯中)的两个芳基。
本文所用的术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的非芳族碳基环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“杂环烷基”是如上定义的环烷基,其中环的至少一个碳原子被杂原子取代,所述杂原子诸如但不限于氮、氧、硫或磷。环烷基和杂环烷基可被取代或未被取代。环烷基和杂环烷基可被一个或多个基团取代,所述一个或多个基团包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫氧基、磺酰基、砜、亚砜或硫醇,如本文所述。
如本文所用的术语“环烯基”是由至少三个碳原子组成且含有至少一个双键(即C=C)的非芳族碳基环。环烯基的实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。术语“杂环烯基”是如上定义的环烯基的类型,并且包括在术语“环烯基”的含义内,其中环的至少一个碳原子被杂原子取代,所述杂原子诸如但不限于氮、氧、硫或磷。环烯基和杂环烯基可被取代或未被取代。环烯基和杂环烯基可被一个或多个基团取代,所述一个或多个基团包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫氧基、磺酰基、砜、亚砜或硫醇,如本文所述。
术语“环状基团”在本文中用于指芳基、非芳基(即,环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)或两者。环状基团具有一个或多个可被取代或未被取代的环系统。环状基团可含有一个或多个芳基、一个或多个非芳基、或一个或多个芳基和一个或多个非芳基。
本文所用的术语“醛”由式-C(O)H表示。在整个说明书中,“C(O)”或“CO”是C=O的简写符号。
本文所用的术语“胺”或“氨基”由式-NZ1Z2表示,其中Z1和Z2可以各自是如本文所述的取代基,如上述氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“羧酸”由式-C(O)OH表示。本文所用的“羧酸酯”或“羧基”基团由式-C(O)O-表示。
本文所用的术语“酯”由式-OC(O)Z1或-C(O)OZ1表示,其中Z1可以是上述烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“醚”由式Z1OZ2表示,其中Z1和Z2可独立地为上述烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“酮”由式Z1C(O)Z2表示,其中Z1和Z2可独立地为上述烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
本文所用的术语“羟基”由式-OH表示。
本文所用的术语“硝基”由式-NO2表示。
本文所用的术语“甲硅烷基”由式-SiZ1Z2Z3表示,其中Z1、Z2和Z3可独立地为上述氢、烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文使用的术语“磺酰基”是指由式-S(O)2Z1表示的硫氧基,其中Z1可以是上述氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“磺酰氨基”或“磺酰胺”由式-S(O)2NH-表示。
术语“膦酰基”在本文中用于指由式-P(O)(OZ1)2表示的磷氧基,其中Z1可以是上述氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文所用的术语“硫醇”由式-SH表示。
本文所用的术语“硫代”由式-S-表示。
如本文所用,“R1”、“R2”、“R3”、“Rn”等(其中n为某个整数)可独立地具有一种或多种上述基团。例如,如果R1是直链烷基,则烷基的一个氢原子可任选地被羟基、烷氧基、胺基、烷基、卤化物等取代。取决于所选择的基团,第一基团可结合在第二基团内,或者替代地,第一基团可悬垂(即连接)到第二基团。例如,对于短语“包含氨基的烷基”,氨基可结合在烷基的主链内。替代地,氨基可连接到烷基的主链上。所选择的基团的性质将决定第一基团是嵌入还是连接到第二基团。
除非有相反的说明,否则具有仅显示为实线而不是楔形或虚线的化学键的式考虑了每种可能的异构体,例如每种对映异构体、非对映异构体和内消旋化合物,以及异构体的混合物,诸如外消旋或非外消旋混合物。
现在将详细参考所公开的材料、化合物、组合物、制品和方法的具体方面,其实例在所附实施例和附图中示出。
化合物
在一些方面,本文公开了一种具有式I、II或III的化合物:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
在一些实施方案中,R1选自以下:
或其盐。
在一些实施方案中,R1是在一些实施方案中,R1是在一些实施方案中,R1是/>在一些实施方案中,R1是/>在一些实施方案中,R1是在一些实施方案中,R1是在一些实施方案中,R1是在一些实施方案中,R1是在一些实施方案中,R1是/>在一些实施方案中,R1是
在一些实施方案中,所述化合物是
其中R1是
在一些实施方案中,所述化合物是
其中R1是
在一些实施方案中,所述化合物是
其中每个R1是
在一些实施方案中,所述化合物是
其中每个R1是
在一些实施方案中,R1是烷基。在一些实施方案中,R1是烯基。在一些实施方案中,R1是炔基。在一些实施方案中,R1是羟基。在一些实施方案中,R1是酯。在一些实施方案中,R1是醚。在一些实施方案中,R1是碳酸酯。在一些实施方案中,R1是烷基醇。在一些实施方案中,R1是烷基醚。在一些实施方案中,R1是烷基酯。在一些实施方案中,R1是氨基甲酸酯。在一些实施方案中,R1是脲。在一些实施方案中,R1是胍。在一些实施方案中,R1是二硫化物。在一些实施方案中,R1是酰胺。在一些实施方案中,R1是缩醛。在一些实施方案中,R1是缩酮。在一些实施方案中,R1是硫缩酮。在一些实施方案中,R1是三硫化物。在一些实施方案中,R1是肟醚。
在一些实施方案中,每个R1是烷基。在一些实施方案中,每个R1是烯基。在一些实施方案中,每个R1是炔基。在一些实施方案中,每个R1是羟基。在一些实施方案中,每个R1是酯。在一些实施方案中,每个R1是醚。在一些实施方案中,每个R1是碳酸酯。在一些实施方案中,每个R1是烷基醇。在一些实施方案中,每个R1是烷基醚。在一些实施方案中,每个R1是烷基酯。在一些实施方案中,每个R1是氨基甲酸酯。在一些实施方案中,每个R1是脲。在一些实施方案中,每个R1是胍。在一些实施方案中,每个R1是二硫化物。在一些实施方案中,每个R1是酰胺。在一些实施方案中,每个R1是缩醛。在一些实施方案中,每个R1是缩酮。在一些实施方案中,每个R1是硫缩酮。在一些实施方案中,每个R1是三硫化物。在一些实施方案中,每个R1是肟醚。
在一些实施方案中,烷基是支链烷基。在一些实施方案中,烷基是非支链烷基。
在一些实施方案中,烷基是C5烷基。在一些实施方案中,烷基是C6烷基。在一些实施方案中,烷基是C7烷基。在一些实施方案中,烷基是C8烷基。在一些实施方案中,烷基是C9烷基。在一些实施方案中,烷基是C10烷基。在一些实施方案中,烷基是C11烷基。在一些实施方案中,烷基是C12烷基。在一些实施方案中,烷基是C13烷基。在一些实施方案中,烷基是C14烷基。在一些实施方案中,烷基是C15烷基。在一些实施方案中,烷基是C16烷基。在一些实施方案中,烷基是C17烷基。在一些实施方案中,烷基是C18烷基。在一些实施方案中,烷基是C19烷基。
纳米颗粒
在一个方面中,本公开提供了一种纳米颗粒,所述纳米颗粒包含:本文所述的式I、II或III的化合物。
各种式I、II或III的化合物描述于以上化合物小节中。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约1%至约99%的式I、II或III的化合物。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约10%至约80%的式I、II或III的化合物。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约10%至约40%的式I、II或III的化合物。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%或约40%的式I、II或III的化合物。在一个实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约20%的式I、II或III的化合物。
在一些实施方案中,纳米颗粒包含非阳离子脂质。在一些实施方案中,非阳离子脂质作为辅助脂质与脂质相互作用。在一些实施方案中,非阳离子脂质可包括但不限于1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SOPE)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二油酰基-5/7-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)或其组合。在一个实施方案中,非阳离子脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中,非阳离子脂质为1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE),在一个实施方案中,非阳离子脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中,非阳离子脂质为1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SOPE)。虽然在此描述了几种非阳离子脂质,但是附加非阳离子脂质可与本文所公开的化合物组合使用。
在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约10%至约80%的非阳离子脂质。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约10%至约40%的非阳离子脂质。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%或约40%的非阳离子脂质。在一个实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约30%的非阳离子脂质。
在一些实施方案中,纳米颗粒包括聚乙二醇-脂质(PEG-脂质)。掺入PEG-脂质以形成亲水性外层并稳定颗粒。聚乙二醇-脂质的非限制性实例包括PEG改性的脂质如PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油和PEG改性的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括DMG-PEG、DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。在一个实施方案中,聚乙二醇-脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)。在一个实施方案中,聚乙二醇-脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。DMG-PEGXXXX意指1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇-XXXX,其中XXXX表示聚乙二醇部分的分子量,例如DMG-PEG2000或DMG-PEG5000。
在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约0%至约5%的聚乙二醇-脂质。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约0%、约0.25%、约0.5%、约0.75%、约1%、约1.5%、约2%、约3%、约4%或约5%的聚乙二醇-脂质。在一个实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约0.75%的聚乙二醇-脂质。
在一些实施方案中,纳米颗粒包括甾醇。甾醇是本领域技术人员熟知的,通常是指具有环戊烷多氢菲环系统并具有一个或多个OH取代基的那些化合物。甾醇的实例包括但不限于胆固醇、菜油甾醇、麦角甾醇、谷甾醇等。
在一些实施方案中,甾醇选自基于胆固醇的脂质。在一些实施方案中,一种或多种基于胆固醇的脂质选自胆固醇、聚乙二醇化胆固醇、DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪或其组合。
甾醇可用于根据其在细胞膜中的功能调节颗粒渗透性和流动性。在一个实施方案中,甾醇是胆固醇。
在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约25%至约50%的甾醇。在一些实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约25%、约30%、约35%、约40%、约45%或约50%的甾醇。在一个实施方案中,纳米颗粒包含摩尔比为约40%的甾醇。
在一个实施方案中,纳米颗粒进一步包含药剂。在一个实施方案中,纳米颗粒还包含治疗剂。在一个实施方案中,纳米颗粒进一步包含诊断剂。
在一些实施方案中,纳米颗粒包含如图2F中所描述的制剂中的一种制剂。在一些实施方案中,纳米颗粒包含如图2F中所公开的摩尔比的组分(脂质、DOPE、胆固醇和PEG)。在一些实施方案中,纳米颗粒包含如图7A中所描述的制剂中的一种制剂。在一些实施方案中,纳米颗粒包含如图7A中所公开的摩尔比的组分(脂质、DOPE、胆固醇和PEG)。
递送到细胞中的药剂可以是多核苷酸。可根据本文的方法引入的多核苷酸或寡核苷酸包括所有类型的DNA、cDNA和RNA序列。例如,多核苷酸可以是双链DNA、单链DNA、复合DNA、包封DNA、裸RNA、包封RNA、信使RNA(mRNA)、tRNA、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、反义RNA(asRNA)及其组合。多核苷酸还可以是DNA构建体,如表达载体、编码所需基因产物(例如,与其要导入的受试者同源或异源的基因产物)的表达载体等。在一个实施方案中,药剂是mRNA。在一些实施方案中,多核苷酸由纳米颗粒包封。
在一些实施方案中,多核苷酸包含编码共刺激分子的核苷酸。在一些实施方案中,共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳糖凝集素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1和LFA3。在一些实施方案中,共刺激分子是CD40。在一些实施方案中,共刺激分子是CD40L。
共刺激分子的序列包括例如(对于人类序列):ICOS(NCBI参考序列:NM_012092.3)、CD28(NCBI参考序列:NM_006139.4)、CD27(NCBI参考序列:NM_001242.4)、HVEM(NCBI参考序列:NM_003820.3)、LIGHT(NCBI参考序列:NM_003807.4)、CD40L(NCBI参考序列:NM_000074.2)、4-1BB(NCBI参考序列:NM_001561.5)、OX40(NCBI参考序列:NM_003327.4)、DR3(NCBI参考序列:NM_148965.1)、GITR(NCBI参考序列:NM_004195.3)、CD30(GenBank:M83554.1)、SLAM(NCBI参考序列:NM_003037.4)、CD2(NCBI参考序列:NM_001328609.1)、CD226(NCBI参考序列:NM_006566.3)、半乳凝素-9(GenBank:AB040130.2)、TIM1(GenBank:U02082.1)、B7-H2(NCBI参考序列:NM_015259.5)、B7-1(NCBI参考序列:NM_005191.4),B7-2(NCBI参考序列:NM_175862.5),CD70(NCBI参考序列:NM_001252.5)、CD40(NCBI参考序列:NM_001250.5)、4-1BBL(NCBI参考序列:NM_003811.4)、OX40L(NCBI参考序列:NM_003326.5)、TL1A(NCBI参考序列:NM_005118.4)、GITRL(GenBank:AY358868.1)、CD30L(NCBI参考序列:NM_001244.3)、SLAM(GenBank:U33017.1)、CD48(NCBI参考序列:NM_001778.4)、CD58(NCBI参考序列:NM_001779.3)、CD155(NCBI参考序列:NM_006505.5)、CD112(NCBI参考序列:NM_001042724.2)、TIM3(GenBank:AF450242.1)、TIM4(NCBI参考序列:NM_138379.3)、ICAM1(NCBI参考序列:NM_000201.3)。
在一些实施方案中,编码共刺激分子的mRNA包含异源5'非翻译区(5'UTR)。在一些实施方案中,编码共刺激分子的mRNA包含异源3'非翻译区(3'UTR)。
在一些实施方案中,本文所公开的核酸(例如,编码共刺激分子的mRNA)包含至少一种化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中,至少一种化学修饰的核苷酸包含化学修饰的核碱基、化学修饰的核糖、化学修饰的磷酸二酯键、或它们的组合。
在一个实施方案中,至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的核碱基。
在一个实施方案中,化学修饰的核碱基选自5-甲酰胞苷(5fC)、5-甲基胞苷(5meC)、5-甲氧基胞苷(5moC)、5-羟基胞苷(5hoC)、5-羟基甲基胞苷(5hmC)、5-甲酰尿苷(5fU)、5-甲基尿苷(5-meU)、5-甲氧基尿苷(5moU)、5-羧甲基酯尿苷(5camU)、假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(me1Ψ)、N6-甲基腺苷(me6A)、或噻吩鸟苷(thG)。
在一些实施方案中,化学修饰的核碱基是5-甲氧基尿苷(5moU)。在一些实施方案中,化学修饰的核碱基是假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中,化学修饰的核碱基是N1-甲基假尿苷(me1Ψ)。
这些修饰的核碱基的结构如下所示:
在一个实施方案中,至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的核糖。
在一个实施方案中,化学修饰的核糖选自2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-氟(2'-F)、2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯-核酸(2'F-ANA)、4'-S、4'-SFANA、2'-叠氮基、UNA、2'-O-甲氧基-乙基(2'-O-ME)、2'-O-烯丙基、2'-O-乙胺、2'-O-氰乙基、锁核酸(LAN)、亚甲基-cLAN、N-MeO-氨基BNA、或N-MeO-氨基氧基BNA。在一个实施方案中,化学修饰的核糖是2'-O-甲基(2'-O-Me)。在一个实施方案中,化学修饰的核糖是2'-氟(2'-F)。
这些修饰的核糖的结构如下所示:
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在一个实施方案中,至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的磷酸二酯键。
在一个实施方案中,化学修饰的磷酸二酯键选自硫代磷酸酯(phosphorothioate,PS)、硼酸磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphodithioate,PS2)、3',5'-酰胺、N3'-氨基磷酸酯(NP)、磷酸二酯(PO)、或2',5'-磷酸二酯(2',5'-PO)。在一个实施方案中,化学修饰的磷酸二酯键是硫代磷酸酯。
这些修饰的磷酸二酯键的结构如下所示:
抗原呈递细胞
在一些方面,本文公开了一种抗原呈递细胞,所述抗原呈递细胞包含本文所公开的基于脂质的纳米颗粒,所述基于脂质的纳米颗粒包含:根据任何前述方面的化合物,以及包含编码共刺激分子的核酸的重组多核苷酸。
在一些实施方案中,
所述化合物是
其中R1是
在一些实施方案中,共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳糖凝集素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1和LFA3。在一些实施方案中,共刺激分子是CD40。
在一些实施方案中,抗原呈递细胞包括巨噬细胞或树突细胞。
应当理解,本文所用的术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指可以加工和呈递抗原以刺激某些淋巴细胞(例如,T细胞和B细胞)的响应的异源免疫细胞群。经典的APC包括例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。
在本文中应理解,巨噬细胞通常称为吞噬免疫细胞(Meszaros等人,1999)。它们还分泌诸如趋化因子或细胞因子的因子。除了吞噬作用和抗原呈递之外,这些细胞还可以通过各种质膜和分泌分子发挥支持作用(Gordon 1995,BioEssays,,第17卷,第11期),如先前针对成红细胞、肝细胞和神经元所示(Sadahira&Morr,Pathol Int.1999年10月;49(10):841-8.)(Takeishi、Hirano等人,Arch Histol Cytol.1999年12月;62(5):413-22.)(Polazzi、Gianni等人,Glia.2001年12月;36(3):271-80.)。“巨噬细胞”意指表现出通常针对巨噬细胞所述的性质的细胞,所述性质包括吞噬作用、特定细胞表面标志物的表达,诸如CD64、CD14和HLA-DR抗原表达。根据本发明的巨噬细胞可以从组织分离,或优选通过离体分化从血液单核细胞(在本文中也称为“单核细胞源性巨噬细胞”)、骨髓前体细胞(在本文中也称为“骨髓源性巨噬细胞”)或从任何其他可能的前体分离,以及通过使用任何分化方法、前体和本领域技术人员已知的方法分离。因此,在一些实施方案中,巨噬细胞包括骨髓源性巨噬细胞。在一些实施方案中,巨噬细胞包括单核细胞源性巨噬细胞。在一些实施方案中,巨噬细胞包括iPSC源性巨噬细胞。在一些实施方案中,巨噬细胞包括巨噬细胞细胞系,包括例如RAW264.7、THP-1、U937、IC-21、J774A.1、MV-4-11或KG1。
在本文中还应理解,如本文所用的“树突细胞”或“DC”是指一种抗原呈递细胞类型,其通常通过其细胞表面上以下标志物中的一种或多种标志物的表达来鉴定:CD1a、CD1b和CD1c、CD4、CD11c、CD33、CD40、CD80、CD86、CD83和HLA-DR。在一些实施方案中,树突细胞是成熟的DC。在一些实施方案中,树突细胞是不成熟的DC。根据本发明的DC可以从组织分离,或优选通过离体分化从血液单核细胞(在本文中也称为“单核细胞源性树突细胞”)、骨髓前体细胞(在本文中也称为“骨髓源性树突细胞”)或从任何其他可能的前体分离,以及通过使用任何分化方法、前体和本领域技术人员已知的方法分离。因此,在一些实施方案中,树突细胞包括骨髓源性树突细胞。在一些实施方案中,树突细胞包括单核细胞源性树突细胞。在一些实施方案中,树突细胞包括iPSC源性树突细胞。在一些实施方案中,树突细胞是常规树突细胞1(或cDC1、淋巴DC),其通常通过其细胞表面上以下标志物中的一种或多种标志物的表达来鉴定:CD141、CLEC9A和XCR1。在一些实施方案中,树突细胞是常规树突细胞2(或cDC2、髓样细胞DC),其通常通过其细胞表面上以下标志物中的一种或多种标志物的表达来鉴定:CD1c和CD172a。在一些实施方案中,树突细胞是浆细胞样DC(或pDC),其通常通过其细胞表面上以下标志物中的一种或多种标志物的表达来鉴定:CD123、CD303和CD304。
在一些方面,本文公开了在抗原呈递中表达多肽的方法,所述方法包括向抗原呈递细胞施用有效量的本文所公开的纳米颗粒,其中所述纳米颗粒包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含编码所述多肽的核酸。
组合物和方法
在一些方面,本文公开了一种治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所公开的抗原呈递细胞和抗体。
在一些实施方案中,所述抗体选自抗CD40抗体、抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体,或它们的组合。
在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是BMS986178。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是GSK3174998。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是PF-04518600。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是MOXR0916。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是PF-04518600。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是MEDI6383。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是MEDI0562。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是INCAGN01949。在一些实施方案中,特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是InVivoPlus抗小鼠OX40(克隆OX-86)(公司:BioXcell,目录:BP0031)。
特异性结合共刺激分子的其他抗体或其抗原结合片段可包括例如:对于小鼠,InVivoPlus抗小鼠4-1BB(CD137)(克隆LOB12.3)(公司:BioXcell,目录:BP0169)、InVivoPlus抗小鼠CD40(克隆FGK4.5/FGK45)(公司:BioXcell,目录:BP0016-2);对于人,抗人OX40、BMS 986178、GSK3174998、PF-04518600、MOXR0916、PF-04518600、MEDI6383、MEDI0562、INCAGN01949;抗人4-1BB、乌托鲁单抗(Utomilumab)、乌瑞芦单抗(Urelumab);抗人CD40、CP-870893、APX005M、ADC-1013、JNJ-64457107、SEA-CD40、RO7009789。
在一些实施方案中,所述抗原呈递细胞和所述抗体瘤内施用。
在一些方面,本文公开了一种治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用:
治疗有效量的本文所公开的基于脂质的纳米颗粒,和
治疗有效量的本文所公开的抗原呈递细胞。
在一些实施方案中,所述基于脂质的纳米颗粒包含
其中R1是
在一些实施方案中,基于脂质的纳米颗粒包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含编码CD40L的核酸。
在一个方面中,本文所述的方法用于治疗癌症,例如黑素瘤、肺癌(包括肺腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤);乳腺癌(包括腺管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌、浆膜腔乳腺癌);结直肠癌(结肠癌、直肠癌、结直肠腺癌);肛门癌;胰腺癌(包括胰脏腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤);前列腺癌;前列腺腺癌;卵巢癌(卵巢上皮癌或表面上皮间质肿瘤,包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌、性索间质肿瘤);肝和胆管癌(包括肝细胞癌、胆管癌、血管瘤);食管癌(包括食管腺癌和鳞状细胞癌);口腔和口咽部鳞状上皮细胞癌;唾液腺腺样囊性癌;膀胱癌;膀胱肿瘤;子宫肿瘤(包括子宫内膜腺癌、眼部癌、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤、混合苗勒管肿瘤);神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤和其他脑肿瘤;肾癌(包括肾细胞癌、透明细胞癌、威尔姆氏瘤);头颈癌(包括鳞状细胞瘤);胃癌(胃癌、胃腺癌、胃肠道间质瘤);睾丸癌;生殖细胞肿瘤;神经内分泌肿瘤;宫颈癌;胃肠道、乳腺和其他器官的类癌;印戒细胞癌;间叶肿瘤,包括肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假性血管瘤样间质增生、肌纤维母细胞瘤、纤维瘤病、炎性肌纤维母细胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、皮肤癌(包括黑素瘤)、宫颈癌、视网膜母细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、脑癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、软组织癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴管肉瘤、间皮瘤、鳞状细胞癌;表皮样癌、恶性皮肤附件肿瘤、腺癌、肝癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、胆管上皮癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、间变性神经胶质瘤;多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌瘤、恶性副神经节瘤、黑素瘤、默克尔细胞瘤、乳腺叶状囊肉瘤、涎腺癌、胸腺癌和阴道癌等。
实施例
下面叙述了以下实施例以说明根据所公开主题的组合物、方法和结果。这些实施例不旨在包括本文所公开的主题的所有方面,而是旨在阐述代表性方法和结果。这些实施例并不旨在排除对本领域技术人员显而易见的本发明的等同方案和变体。
实施例1.糖衍生的脂质纳米颗粒
有效的癌症免疫疗法取决于癌症免疫循环(CIC)的引发、过程和放大。然而,CIC通常会被肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中的免疫抑制因子阻断,从而导致肿瘤促进、转移和复发。在此,脂质纳米颗粒-mRNA制剂和树突细胞疗法经组合以经由多步充分增强CIC。首先,含有CD40配体(CD40L)mRNA的脂质纳米颗粒诱导肿瘤组织中稳健的免疫原性细胞死亡,从而导致肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)释放和CD40L表达。接着,过表达CD40的树突细胞被过继转移,然后被肿瘤组织中的CD40L分子激活。这促进了促炎细胞因子和趋化因子的分泌,以及树突细胞上共刺激分子的上调,这对于重新编程TME和引发T细胞响应至关重要。在树突细胞将TAA呈递给T细胞后,所有上述逐步事件都有助于增强根除既定的皮肤肿瘤、抑制远端病变并防止肿瘤再攻击的有效癌症特异性T细胞免疫力。总之,这项工作通过整合脂质纳米颗粒和细胞疗法(CATCH)来关闭小鼠黑素瘤模型中的癌症免疫循环(CIC),并促进肿瘤消除和构建长期抗肿瘤免疫力。
简介
免疫疗法的发展已针对癌症治疗的临床结局取得了重大突破。有效的抗肿瘤免疫力取决于适当地激活癌症免疫循环(CIC)1中的一系列响应。首先,垂死的癌细胞会释放肿瘤相关抗原(TAA),所述TAA被诸如树突细胞的抗原呈递细胞(APC)捕获和加工1。接下来,APC将抗原呈递给T细胞,从而导致引发针对TAA的效应T细胞响应1。激活的效应T细胞浸润到肿瘤组织中并介导癌细胞的杀伤1。最后,死亡的癌细胞进一步释放抗原以增加CIC中这些免疫响应的广度和深度1。然而,这些逐步事件通常会受到免疫抑制肿瘤微环境(TME)的抑制,从而导致不可控的肿瘤生长、转移和复发1,2。例如,免疫抑制TME可以抑制树突细胞的募集、浸润和成熟1,2。这会减少树突细胞的细胞因子分泌和对于引发T细胞免疫力至关重要的共刺激因子的表达1,2。
在此,研究了协同诱导癌细胞死亡以释放TAA和改善肿瘤组织中树突细胞的数量和成熟是否有可能适当增强CIC。这可进一步引发全身和记忆抗肿瘤免疫力,从而导致原发肿瘤的根除、肿瘤转移的抑制以及肿瘤复发的预防。免疫原性细胞死亡(ICD)是一种细胞死亡方式,伴随着损伤相关分子模式(DAMP)和TAA的放出3,4。最近的研究已揭示,具有诱导ICD的能力的脂质纳米颗粒(LNP)可以对TME进行重建模,从而导致抗肿瘤免疫力增强5。CD40和CD40配体(CD40L)是一对共刺激分子,属于肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体家族6。树突细胞上的CD40与CD4 T细胞上的CD40L之间的相互作用对于树突细胞成熟至关重要,树突细胞成熟促进促炎性细胞因子分泌和其他共刺激分子上调6。这些在触发CD8 T细胞以发展细胞毒性和记忆响应方面发挥着核心作用6。已在临床试验中研究了一些CD40激动剂抗体6。此外,免疫治疗剂的瘤内(i.t.)施用可以提高原位生物利用度,并由此提高治疗效率7。对应地,经由瘤内注射递送的几种LNP-mRNA制剂和免疫细胞正在进行临床试验7-10。在本研究中,利用含有CD40LmRNA的LNP(CD40L-LNP)来同时诱导肿瘤组织中ICD和CD40L的表达。然后,对过表达CD40的骨髓源性树突细胞(CD40-BMDC)执行瘤内过继转移,这些CD40-BMDC捕获TAA并通过刺激CD40L而变得成熟。这些激活的树突细胞进一步将抗原呈递给T细胞,从而导致引发针对癌细胞的效应T细胞响应(图1A)。
为了测试这个概念,需要将mRNA有效递送到肿瘤细胞和原代树突细胞中。糖醇是在食品行业中广泛用作糖替代品的碳水化合物,其与诸如葡萄糖的常规糖相比,提供甜味、含有更少的热量,并且不会导致血糖飙升11。这些化合物是天然存在的或经由将羰基基团还原为羟基基团而衍生自糖12。特别地,己糖醇,诸如山梨糖醇和甘露糖醇,是六碳糖醇,其可以双重脱水以产生二脱水己糖醇,所述二脱水己糖醇是一系列充当重要的化学支架和起始材料的独特环醚13。因此,设计并合成了三组糖醇衍生的可电离脂质来制备用于mRNA递送的LNP。为了在生物测定中检查这些LNP,选择黑素瘤作为疾病模型。黑素瘤是具有增大发病率的最具侵袭性的皮肤癌之一14。黑素瘤患者死亡的主要原因是广泛的转移,诸如皮肤和脑转移14。因此,本研究中选择两种黑素瘤细胞系来构建小鼠肿瘤模型。在对糖醇衍生的可电离脂质进行全身筛选和表征后,鉴定出了两种对于mRNA递送优选的LNP制剂。一种制剂在黑素瘤肿瘤组织中诱导稳健的ICD,并且同时将CD40L mRNA有效地递送到癌细胞中。与脂质转染胺3000(Lipo 3K)和电穿孔(Electro)相比,另一种制剂在小鼠骨髓源性树突细胞(BMDC)中显示出显著更高的CD40 mRNA递送效率。CD40L-LNP治疗与过继性CD40-BMDC转移的组合在皮下(s.c.)黑素瘤肿瘤模型中导致大于80%的完全响应率。此外,局部治疗使得能够抑制或消除皮肤和脑部肿瘤的转移。重要的是,这些响应小鼠耐皮下再攻击,并且在颅内再攻击后表现出延迟的肿瘤生长。总之,利用两种类型的LNP-mRNA制剂以经由诱导ICD和过继性树突细胞转移来增强CIC。这项工作提出了一种重要的免疫疗法策略,所述免疫疗法策略使得能够广泛有效地治疗原发性肿瘤、肿瘤转移和肿瘤复发。
结果
双脱水己糖醇,诸如异山梨醇和异甘露糖醇,是通过六碳糖醇的双脱水制备的一系列生物源性双环化合物15。它们由具有位于2位和5位的两个仲羟基基团的两个顺式稠合四氢呋喃环构成13。两个羟基基团的不同构型导致对官能化的不同反应活性和空间位阻,从而使二脱水己糖醇成为用于合成药学上重要的化合物和聚合物的通用生物基结构单元16。基于其独特的手性和刚性,分别以山梨糖醇、甘露糖醇和L-山梨糖醇为前体,设计并合成了三组糖醇衍生的可电离脂质(DIS、DIM和LIS)(图1B、图1C)。作为LIS脂质的代表性合成路径(图1B),L-异山梨醇(异山梨醇的对映异构体)是根据先前报道的脱水程序在碳酸二甲酯和乙醇钠存在下从L-山梨糖醇制备的17。然后,L-异山梨醇与丙烯腈进行双重迈克尔加成反应,之后用硼烷还原腈基团,得到核心胺。最后,经由还原性氨基化反应或环氧化物开环反应安装具有不同官能团(诸如羟基(LIS1)、烃(LIS2至LIS6)、酯(LIS7)、碳酸酯(LIS8)和缩醛(LIS9和LIS10))的疏水尾部,以提供对应的可电离脂质。脂质中这些不同的疏水结构域影响LNP的制剂及其与细胞膜的相互作用,从而导致不同的mRNA递送效率。按照类似的合成路径,合成了DIS和DIM脂质,并通过1H核磁共振和质谱法证实了它们的结构(参见方法)。
接下来,配制含有萤火虫荧光素酶(FLuc)mRNA的LNP(FLuc-LNP),并表征其大小、表面电荷和mRNA包封效率(图6A-6C)。通过量化骨髓源性树突细胞(BMDC)的发光强度,概括糖醇衍生的可电离脂质的结构-活性关系。胺核心的手性可影响所配制的LNP的mRNA递送效率。DIS和LIS脂质的胺核心是一对对映异构体,并且它们表现出相似的mRNA递送能力,尤其是DIS-1至8和LIS-1至8)。具有C10烃尾部的脂质比含有其他烃尾部的脂质诱导更有效的mRNA递送。另一方面,DIM系列呈现出不同的趋势。在DIM系列中,DIM-7在mRNA递送方面最有效。在疏水结构域中含有碳酸酯接头(DIS8、DIM8和LIS8)的脂质表现出较弱的Fluc mRNA递送能力。在所有这些LNP中,DIM7和LIS10显示出与其他LNP相比最高的mRNA递送效率,其mRNA递送效率分别是Lipo 3K和Electro的3倍和10倍(图2A)。为了进一步研究DIM7和LIS10的制剂,基于L16(4)4正交表执行正交筛选测定(图7A)。根据DIM7或LIS10的16种正交制剂的发光强度(图2C、图2E),剖析具有不同摩尔比的每种脂质组分对mRNA递送的效应(图2B、图2D)并预测了几种优选的制剂(图2B)。然后,通过与来自正交筛选测定的对应顶级制剂DIM7M和LIS10G进行比较,验证了它们的mRNA递送功效(图2C、图2E)。对于DIM7,优选制剂DIM7S导致分别与顶部正交制剂DIM7M和初始制剂DIM7相比2倍(P<0.001)和3.5倍(P<0.001)高的发光信号(图2C)。对于LIS10,优选制剂LIS10W导致与顶部正交制剂LIS10G相比1.2倍(P<0.0001)高的发光信号并且与初始制剂LIS10相比2.3倍(P<0.0001)高的发光强度(图2E)。制剂DIM7S和制剂LIS10W显示出相似的特性。它们的粒度为约110nm,并且多分散指数(PDI)<0.2(图2G、图2I)。它们的mRNA包封效率约为90%,并且它们是略微带正电的(图2G、图2I)。此外,当通过Cryo-TEM可视化时,它们都表现出球形形态(图2H、图2J、图7B、图7C)。因此,选择制剂DIM7S以将mRNA离体递送至BMDC中以用于以下研究。在相同的mRNA浓度下,制剂DIM7S在mRNA递送方面分别是Lipo 3K和Electro的10倍和30倍(图7D)。在6h至24h的时程,在12h处观察到了制剂DIM7S的最大发光强度(图7E)。显著地,与未处理的BMDC的约17%的CD40表达相比,包封CD40 mRNA的制剂DIM7S(CD40-DIM7S)导致BMDC中大于70%的CD40表达(P<0.0001,图7F)。
树突细胞的激活是CIC中引发T细胞响应的重要步骤1。因此,接下来测试在抗CD40激动剂抗体(CD40 Ab)存在下,CD40过表达是否促进BMDC激活。与PBS、CD40 Ab和CD40-DIM7S处理相比,CD40-DIM7S和CD40 Ab的组合(CD40-DIM7S+CD40 Ab)刺激更高水平的树突细胞激活标志物(图3A),包括CD80(P<0.01)、CD86(P<0.01)、MHC-II(P<0.01)、IL1-β(原形式,P<0.05)、TNF-α(P<0.05)和IL12(P<0.01),表明更强的树突细胞激活能力。为了评价增强的树突细胞激活是否改善体内抗肿瘤效应,在B16F10黑素瘤小鼠模型中每隔一天执行一次瘤内(i.t)注射以用于多重治疗,共4剂(图3B)。处理策略包括各种组合,包括CD40 Ab、CD40-DIM7S、CD40-DIM7S+CD40 Ab、BMDC+CD40 Ab、CD40-BMDC、和CD40-BMDC+CD40Ab。与所有其他处理相比,CD40-BMDC+CD40Ab显著抑制肿瘤生长达5倍至15倍(接种后23天,P<0.05,图3C,图8),并显著延长总存活时间(图3D,P<0.01)。事实上,CD40-DIM7S可以原位工程化树突细胞以增加CD40受体的表达(图9A)。然而,与CD40-BMDC+CD40 Ab相比,CD40-DIM7S+CD40Ab表现出有限的治疗效应(图3C、图3D、图8)。这可能部分归因于免疫抑制TME中缺乏浸润的树突细胞1,2。尽管BMDC+CD40 Ab补充了肿瘤组织中的树突细胞,但BMDC激活不充分可能是较弱的抗肿瘤效应的原因1,2。总之,这些结果揭露了充分的树突细胞浸润、BMDC上的CD40过表达和CD40激动对于CD40-BMDC+CD40 Ab处理的抗肿瘤活性的重要性。
尽管CD40-BMDC+CD40 Ab显示出有前景的抗肿瘤效应,但没有完全根除肿瘤负荷表明CIC的进展不足。作为CIC的初始步骤的癌细胞死亡,使得能够释放TAA,TAA由树突细胞呈递并引发肿瘤特异性T细胞响应1,3-5。此外,临床研究已揭露癌细胞ICD有益于免疫治疗剂的抗肿瘤效应3,4。因此,研究了LNP诱导的癌细胞ICD是否可以促进CD40-BMDC疗法的抗肿瘤效应。还在肿瘤组织中研究了LNP介导的CD40L表达是否可以激活过继转移的CD40-BMDC。因此,CD40L-LNP诱导的癌细胞ICD与过继性CD40-BMDC转移的组合可以有效地增强CIC,并由此消除肿瘤病变(图1A)。在B16F10黑素瘤细胞中研究了含有CD40L mRNA的DIM7S和LIS10W(CD40L-DIM7S和CD40L-LIS10W)的细胞毒性。在18h处理后,LIS10W诱导有效的细胞毒性(85%)(图9B)。因为CD40L-DIM7S和CD40L-LIS10W均在18小时孵育后导致B16F10黑素瘤细胞中几乎100%的CD40L表达(图9C),所以选择LIS10W来评价在B16F10黑素瘤细胞中诱导ICD标志物的能力,所述ICD标志物包括细胞外高迁移率族盒1(HMGB1)、细胞外ATP和细胞表面钙网蛋白。与PBS处理相比,FLuc-LIS10W或CD40L-LIS10W分别体外诱导约1.7倍(P<0.01)、7倍(P<0.001)和45倍(P<0.001)更高水平的细胞外HMGB1、细胞外ATP和细胞表面钙网蛋白(图3E)。一致地,在小鼠B16F10黑素瘤组织中体内观察到了由FLuc-LIS10W或CD40L-LIS10W诱导的ICD(图3F),表明除了mRNA货物以外的LIS10W LNP有助于ICD效应。
由于肿瘤组织中CD40L的表达谱可能影响其生物活性,因此通过流式细胞术在细胞水平上研究了其生物分布。单次注射CD40L-LIS10W导致肿瘤组织中有约15%的CD40L阳性B16F10细胞(图9D)。此外,肿瘤组织中的免疫细胞,包括巨噬细胞、树突细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞,表现出CD40L表达增加约1.5倍至2倍(图9E)。癌细胞和免疫细胞中CD40L的表达均可有助于CD40-BMDC激活18。
为了评价癌细胞ICD和过继CD40-BMDC转移的组合的抗肿瘤效应,在瘤内注射CD40L-LIS10W后18h瘤内施用CD40-BMDC(图3G)。该处理方案的四个剂量导致83%的B16F10荷瘤小鼠中肿瘤完全消退(图3H,图10A),其显著高于CD40-BMDC+CD40 Ab处理(0%,P<0.05)和CD40L-DIM7S+CD40-BMDC处理(17%,P<0.05)。重要的是,CD40L-LIS10W+CD40-BMDC组中的所有响应小鼠对相对胁腹上的B16F10肿瘤再攻击具有抗性(图3I、图10B),表明了出现了抗肿瘤记忆。这些结果强调了ICD在CIC中引发抗肿瘤免疫力方面的关键作用。为了进一步证实这种处理方案中CD40-BMDC和CD40L-介导的激活的功能,进一步研究了另外两个处理组,包括FLuc-LIS10W+CD40-BMDC和CD40L-LIS10W+CD40-DIM7S(图3J)。尽管FLuc-LIS10W和CD40L-LIS10W显示出相似的体内ICD效应(图3F),但是分别与FLuc-LIS10W+CD40-BDMC和CD40L-LIS10W+CD40-DIM7S相比,CD40L-LIS10W+CD40-BDMC将肿瘤生长显著抑制约21倍(P<0.05)和7倍(接种后19天,P<0.05)(图5C、图5D)。此外,在肿瘤接种后45天,CD40L-LIS10W+CD40-BDMC组中83%的小鼠存活,而其他两种处理组中没有小鼠存活(P<0.01,图3K)。另外,在相对胁腹上用B16F10细胞再攻击后,100%的响应小鼠抗继发性肿瘤发展(图3L、图10E)。这些发现暗示单独的ICD处理不足以根除肿瘤病变,强调了树突细胞浸润和激活的重要性。免疫疗法的长期益处需要针对肿瘤复发的抗肿瘤记忆。因此,经由颅内(i.c.)再攻击小鼠模型进一步验证了抗肿瘤记忆的发展(图3M)。在本实验中,使用了另一种含有荧光素酶报告基因的黑素瘤细胞系(B16F10-Luc2),该细胞系有助于经由生物发光成像监测脑肿瘤生长。CD40L-LIS10W+CD40-BDMC处理在肿瘤接种后45天实现了约88%的原发性皮下肿瘤完全消退(图3N、图10F)。值得注意的是,存活的小鼠显示出明显延迟的脑部肿瘤生长(接种后11天,P<0.05,图10G)。此外,与0%的首次试验的对照相比,38%的响应小鼠保持无肿瘤(颅内再攻击后75天,P<0.01,图3O)。这些数据表明从这种局部疗法产生了稳健的抗肿瘤记忆T细胞群。
局部免疫疗法治疗转移性癌症的功效取决于全身抗肿瘤免疫力的发展5,7,10。为了评价这一点,将B16F10细胞接种到每只小鼠的两侧胁腹,之后在一个肿瘤部位上进行CD40L-LIS10W+CD40-BDMC处理(图4A)。所述处理消除了80%的原发肿瘤(图11A)和70%的远端肿瘤(图4B),并且总体存活率为约70%(图4C)。在另一双肿瘤模型(皮肤+脑肿瘤)中,对B16F10-Luc2细胞进行皮下和颅内接种(图4D)。CD40L-LIS10W+CD40-BDMC处理根除80%的皮下肿瘤(图11B)。同时,所述处理明显地抑制脑部肿瘤生长(接种后11天,P<0.001,图4E),并显著延长总体存活时间(P<0.0001,图4F)。总之,这些结果表明局部治疗产生全身抗肿瘤免疫力。
T细胞介导的癌细胞杀伤是根除CIC中肿瘤病变的重要步骤。为了评价CD8和CD4 T细胞对治疗功效的作用,对接受抗CD8、抗CD4或同种型对照Ab的小鼠执行CD40L-LIS10W+CD40-BDMC治疗(图4G)。相对于对照组,CD8或CD4 T细胞的耗竭极大地损害了CD40L-LIS10W+CD40-BDMC处理的肿瘤消退和小鼠存活率(图4H、图4I、图11C)。特别地,相对于CD4 T细胞的耗竭,CD8 T细胞的耗竭导致更显著减弱的治疗功效(图4H、图4I、图11C),表明了CD8T细胞在这种处理中至关重要的作用。
为了揭露CD40L-LIS10W+CD40-BDMC处理方案的潜在作用机制,在第一次注射之后在小鼠黑素瘤组织和血液中使用细胞因子和趋化因子的动态表达(图4J)。在肿瘤组织中,CD40L-LIS10W在6h至24h的时程中在32-plex组中诱发29种细胞因子和趋化因子,诸如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、CCL5和CXCL10(图4K、图12)。此外,在瘤内施用CD40-BDMC后,它们的浓度进一步增加(图4K、图12)。在血液中,大多数细胞因子和趋化因子在注射CD40L-LIS10W后6h上调,而它们的浓度在随后的18h内逐渐下降(图4L、图13)。然而,CD40-BDMC施用在24h至42h的时程中重新刺激许多细胞因子和趋化因子的产生(图4L、图13)。这些数据表明,与单独的CD40L-LIS10W相比,CD40L-LIS10W+CD40-BDMC更好地重新编程免疫抑制性TME,并诱导更强的全身免疫响应。这些炎症细胞因子和趋化因子的上调不仅可以增强免疫细胞的募集和激活,还可以促进免疫记忆的发展。接下来,在CD40L-LIS10W+CD40-BDMC处理后对肿瘤组织中免疫细胞群的变化进行剖析。在本实验中,CD40-BMDC在瘤内注射前通过CellTraceBlue进行标记,这可经由流式细胞术分析区分所施用的树突细胞和内源性树突细胞。处理导致树突细胞、CD8T细胞和CD4 T细胞的大量流入,同时减少肿瘤组织中巨噬细胞和调节性T(Treg)细胞的募集(图5A)。此外,所述处理增强了APC的抗肿瘤表型的百分比,所述APC包括CD80/86+巨噬细胞(P<0.01)和CD80/86+树突细胞(P<0.0001,图5B)。重要的是,所述处理刺激CD8T细胞中Ki-67(P<0.01)、IFN-γ/TNF-α(P<0.0001)和颗粒酶B(P<0.001,图5C)的表达,表明细胞毒性T细胞的产生。还在来自响应小鼠的脾脏和血液中检查记忆T细胞。与首次试验的对照相比,脾脏和血液两者中效应记忆和中枢记忆T细胞的数量显著增加,表明了长期抗肿瘤免疫力的发展。
讨论
免疫抑制性肿瘤微环境(TME)阻断癌症免疫循环(CIC)中的免疫激活,导致不可控的肿瘤生长、转移和复发。为了克服不完全激活,将脂质纳米颗粒(LNP)诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)和树突细胞疗法组合,以经由综合免疫响应来适当增强CIC。合成了糖醇衍生的可电离脂质库,并鉴定出了用于有效mRNA递送的两种优选LNP制剂DIM7S和LIS10W。DIM7S在BMDC中表现出的mRNA递送功效分别是Lipo 3K和Electro的10倍和30倍(图7D)。LIS10W在黑素瘤组织中诱导稳健的ICD(图3F),并将mRNA有效递送至黑素瘤细胞中(图9C、图9D)。对于CD40L-LIS10W+CD40-BMDC处理,首先瘤内施用CD40L-LIS10W以诱导癌细胞死亡。这导致TAA和DAMP(例如,HMGB1、细胞外ATP和细胞表面钙网蛋白)的释放,并同时导致肿瘤组织中的CD40L表达。接下来,将通过CD40-DIM7S离体工程化的CD40-BMDC瘤内过继转移。体外和体内数据均显示,这些激活的树突细胞上调共刺激分子(图3A、图5B)和炎症细胞因子(图3A、图4K、图4L),它们与呈递的TAA一起刺激首次试验的T细胞分化成细胞毒性CD8 T细胞(图5C)。一方面,这有益于T细胞介导的癌细胞杀伤,这是消除CIC中肿瘤病变的重要步骤。另一方面,T细胞引发促进其IFN-γ和TNF-α的产生,这继而激活APC并诱发趋化因子(图4K、图4I),诸如CCL3、CCL4、CCL5和CXCL10的产生。响应于这些趋化因子,将附加的APC和T细胞募集到肿瘤组织中(图5A)。所有这些事件都有助于重编程免疫抑制性TME,并持续放大和扩大CIC,最终导致超过80%的原发性皮肤黑素瘤肿瘤完全消退(图3H、图3K、图3N)。重要的是,增强的CIC有益于脾脏和血液中记忆CD8 T细胞的生成(图5D、图5E),从而在响应小鼠中分别产生近100%和38%的对皮下和颅内黑素瘤再攻击的防护(图3I、图3L、图3O)。最后,这种局部处理预防约70%的远端皮肤肿瘤,并显著消退远端脑肿瘤,表明对转移性癌症的有效抑制。
总之,显示协同诱导癌细胞免疫原性细胞死亡(ICD)和树突细胞激活(癌症免疫循环(CIC)的前两步)可以重编程免疫抑制性TME并促进肿瘤抗原呈递。这种策略导致有效的效应T细胞响应和针对癌症特异性抗原的保护性免疫记忆,这反映于局部肿瘤和远端肿瘤两者的根除以及对肿瘤再攻击的预防。总之,脂质-纳米颗粒-mRNA制剂和树突细胞疗法的组合为癌症免疫疗法提供了重要的平台。
材料和方法
抗体
用于流式细胞术的抗体:CD40-FITC(eBioscience,11040285)、CD40L-FITC(eBioscience,MA516506)、CD80-FITC(eBioscience,11080181)、CD86-PE(eBioscience,12086281)、CD86-FITC(eBioscience,11086281)、MHCII-APC(eBioscience,17532080)、原形式IL-1β-FITC(eBioscience,11711480)、钙网蛋白-Alexa Fluor 647(NovusBiologicals,NBP1-47518AF647)、Ki-67-FITC(eBioscience,11569882)、颗粒酶B-FITC(eBioscience,11889882)、IFNγ-FITC(Biolegend,505806)、TNFα-FITC(eBioscience,11732181)、CD62L-FITC(eBioscience,11-0621-81)、CD44-Alexa Fluor700(eBioscience,56044182)。
用于ELISA的抗体:大鼠抗小鼠IL-12p70(eBioscience,MM121)、大鼠抗小鼠TNFα(eBioscience,14732581)、山羊抗大鼠IgG-HRP(Cell Signaling,7077S)、小鼠抗小鼠HMGB1(eBioscience,MA120338)、山羊抗小鼠IgG-HRP(Abcam,ab7068)。
用于体内的抗体:抗小鼠CD40抗体(CD40 Ab,BioXcell,BP00162)、抗小鼠CD8α(Bioxcell,BE0004-1)、抗小鼠CD4(Bioxcell,BP0003-1)、抗大鼠IgG2b同种型(Bioxcell,BP0090)。
细胞培养
B16F10黑素瘤细胞系获自Jianhua Yu博士实验室(Dr.Jianhua Yu's lab)。B16F10-Luc2黑素瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,ATCC)。将这两种细胞系用含10%胎牛血清(FBS,Gibco,26140079)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(ATCC,302002)在孵育箱中于37℃在5%CO2中培养。小鼠骨髓源性树突细胞(BMDC)是通过改编先前程序获得的19。简而言之,将单核细胞从小鼠骨髓中分离出,并在含有10%FBS、50ng/mL GM-CSF(Shenandoah Biotechnology,20015)和50ng/mL IL4(ShenandoahBiotechnology,20018)的RPMI 1640培养基中培养。在培养8天后,将BMDC用CD11c珠粒(Miltenyi Biotec,130108338)纯化。
流式细胞术门控
门控策略基于先前报道的方法10,19。
B16F10细胞:CD45-
巨噬细胞:CD45+、CD11b+、F4/80+
激活的巨噬细胞:CD45+、CD11b+、F4/80+、CD80+/CD86+
树突细胞:CD45+、CD11b+、CD11c+
激活的树突细胞:CD45+、CD11b+、CD11c+、CD80+/CD86+
CD4 T细胞:CD45+、CD3e+、CD4+、FoxP3-
调控性T细胞:CD45+、CD3e+、CD4+、FoxP3+
CD8 T细胞:CD45+、CD3e+、CD8a+
效应记忆T细胞:CD45+、CD3e+、CD8a+、CD44hi、CD62Llo
中枢记忆T细胞:CD45+、CD3e+、CD8a+、CD44hi、CD62Lhi
激活CD8 T细胞:CD45+、CD3e+、CD8a+、Ki-67+/颗粒酶B+/IFNγ+/TNFα+
mRNA合成
萤火虫荧光素酶(FLuc)、小鼠CD40和小鼠CD40L的线性dsDNA获自Integrated DNATechnologies。pUC19载体用于Golden Gate装配以生成质粒。FLuc、小鼠CD40和小鼠CD40L的mRNA通过先前报道的方法合成20。
脂质纳米颗粒(LNP)的制备和表征
mRNA LNP是通过经由NanoAssemblr(Precision NanoSystems,Canada)混合含有可电离脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的乙醇溶液与含有mRNA的柠檬酸盐溶液来制备的19。大小、多分散指数(PDI)和ζ电位通过NanoZS Zetasizer(Malvern,USA)测量。通过Ribogreen测定检测包封效率。在Glacios Cryo-TEM(Thermo Scientific,USA)上观察形态。
在初步筛选中,新合成的可电离脂质由DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000(脂质:DOPE:胆固醇=20:30:40:0.75,摩尔比)以及FLuc mRNA(脂质:mRNA=10:1,质量比)配制而成21。LNP是基于L16(4)4正交表和预测制剂配制的。脂质转染胺3000/mRNA复合物是基于推荐方案制备的。使用小鼠树突细胞核转染试剂盒(Lonza,VAPA1011)对BMDC执行电穿孔。通过荧光素酶表达测定来确定mRNA递送功效。
CD40和CD40L表达
将约1×106个BMDC接种到6孔板的每个孔中并用2.5μg的CD40-LNP处理12h。将约1×105个B16F10细胞接种到24孔板的每个孔中并用0.25μg的CD40L-LNP处理18h。接下来,用CD40-FITC或CD40L-FITC抗体对细胞进行染色,并通过LSRFortessa流式细胞仪(BectonDickinson,USA)进行分析。
向肿瘤体积为约500mm2的小鼠瘤内注射10μg的FLuc-LNP、CD40-LNP或CD40L-LNP。在6h后,使用小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec,130-096-730)解离肿瘤。通过Ficoll-Paque密度梯度介质(Cytiva,17544602)分离浸润免疫细胞。在基于上述流式细胞术门控方法用抗体组合染色后,通过流式细胞术对细胞进行分析。
树突细胞激活和分析
将过表达CD40的BMDC(CD40-BMDC)与10μg/mL的抗小鼠CD40抗体一起孵育12h。接下来,将一些激活标志物通过CD80、CD86、MHC-II和原形式IL1-β抗体进行染色,并通过流式细胞术进行分析。通过ELISA检测其他激活标志物,包括IL-12和TNF-α。
LNP诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)
ICD标志物是通过改编先前的方法来检测的5。通过MTT测定检查B16F10细胞中LNP的细胞毒性。通过发光ATP检测试剂盒(Abcam,ab113849)测量细胞外ATP。通过ELISA检测细胞外HMGB1水平。通过流式细胞术检测细胞表面钙网蛋白。
肿瘤模型和处理方案
C57BL/6小鼠(雄性和雌性,6-8周)购自Jackson Laboratory,并饲养在俄亥俄州立大学的大学实验动物资源-生物医学研究塔(The University Laboratory AnimalResources-Biomedical Research Towerof The Ohio State University)中。所有小鼠研究均由俄亥俄州立大学动物护理和使用机构委员会(Institutional Animal Care andUse Committee,IACUC)批准,并遵守当地、州和联邦法规。
对于一侧皮下(s.c.)肿瘤模型,将约1×105个B16F10细胞或2×105个B16F10-Luc2皮下注射到小鼠的右胁腹上。在肿瘤接种后第7天,将肿瘤大小为最大直径约0.5cm的小鼠随机化到不同处理组中。对于两侧皮下肿瘤模型,将约1×105个B16F10细胞皮下注射到小鼠的右胁腹上。在右胁腹上肿瘤接种后第5天,将约1×105个B16F10细胞皮下注射到小鼠的左胁腹上。在右胁腹上肿瘤接种后第7天,将肿瘤大小为最大直径约0.5cm的小鼠随机化到不同处理组中。对于皮肤+脑二肿瘤模型,将约2×105个B16F10-Luc2细胞皮下注射到小鼠的右胁腹上。在右胁腹上肿瘤接种后第5天,将约1×104个B16F10-Luc2细胞以3mm的深度颅内(i.c.)注射。注射部位在矢状缝侧面2mm并且在冠状缝前方1mm。在右胁腹上肿瘤接种后第7天,将肿瘤大小为最大直径约0.5cm的小鼠随机化到不同处理组中。对于皮下肿瘤再攻击,在肿瘤接种后第45天,将约1×105个B16F10细胞皮下注射到完全响应小鼠的左胁腹。对于脑肿瘤再攻击,在肿瘤接种后第45天,将约1×104个B16F10-Luc2细胞颅内注射到完全响应的小鼠中。对于T细胞耗竭肿瘤模型,将1×105个B16F10细胞皮下注射到小鼠的右胁腹上。在肿瘤接种后第6天,用抗小鼠CD8α、抗小鼠CD4或抗大鼠IgG2b同种型抗体对小鼠进行腹膜内治疗。每种抗体每3天给予一次,共三个剂量,每次注射200μg。
本研究中的处理方案如下所述。在单次瘤内注射中,CD40 Ab和LNP的剂量分别为50μg和5μg;并且树突细胞的剂量为200万。对于CD40-LNP+CD40 Ab处理,在瘤内注射CD40-LNP后6h瘤内施用CD40 Ab。对于树突细胞+CD40 Ab处理,在瘤内注射树突细胞后1h瘤内施用CD40 Ab。对于CD40-LNP+CD40L-LNP处理,在瘤内注射CD40L-LNP后18h瘤内施用CD40-LNP。对于CD40L-或FLuc-LNP+CD40-BMDC处理,在瘤内注射CD40L-或FLuc-LNP后18h瘤内施用CD40-BMDC。所有这些处理方案包括四个剂量。
本研究中的去除标准如下所述。每2至4天测量一次皮下肿瘤大小并计算为体积(长度×宽度×宽度/2)。当肿瘤的最大直径达到1.6cm或小鼠的体重减轻大于20%时处死小鼠。通过IVIS Lumina II(Caliperlife sciences,USA)监测脑肿瘤大小。如果小鼠表现出驼背姿势、走动和进食困难或体重减轻大于20%,则对它们实施安乐死。
细胞因子和趋化因子的Luminex分析
向肿瘤体积为约500mm2的小鼠瘤内注射一剂CD40L-LNP+CD40-BMDC。在注射后0h至42h的时程收集小鼠肿瘤组织和血清。将肿瘤组织在液氮中冷冻,并在含有蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific,87785)的RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific,89900)中以150mg/ml提取粉碎的组织。将全血收集在容纳有柠檬酸钠的管中,并通过在4℃下离心(10000rpm)5分钟收集血清。将肿瘤裂解物和血清储存于-80℃下。通过小鼠细胞因子/趋化因子探索测定(Eve Technologies,Canada)检测小鼠细胞因子和趋化因子。
免疫细胞群分析和体内激活
将肿瘤体积为约250mm2的小鼠用两剂CD40L-LNP+CD40-BMDC瘤内处理。接下来,收集肿瘤组织并使用小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec,130-096-730)解离。为了剖析免疫细胞群,基于上述流式细胞术门控方法用抗体组合对总细胞进行染色,然后通过流式细胞术对免疫细胞数量进行计数。在本实验中,CD40-BMDC在瘤内注射前通过CellTraceBlue(Invitrogen,C34568)进行标记,这可经由流式细胞术区分所施用的树突细胞和内源性树突细胞。为了评价免疫细胞激活,通过Ficoll-Paque密度梯度介质(Cytiva,17544602)分离浸润免疫细胞。在基于上述流式细胞术门控方法用抗体组合进行染色后,通过流式细胞术检测T细胞激活标志物。
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实施例2.二脱水己糖醇衍生的脂质的化学合成
二脱水己糖醇衍生的可电离脂质的化学结构
醛的合成
在室温(RT)下向多聚甲醛(1.5g,50mmol)在TMSCl(25mL,197mmol)中的悬浮液中滴加1-己醇1(5.1g,50mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。将澄清溶液减压浓缩以得到呈无色油状物的1-氯甲氧基-己烷2,其无需进一步纯化即可直接使用。
将上述氯甲基醚滴加到1,6-己二醇3(11.8g,100mmol)和i-Pr2NEt(17.45mL,100mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌24h,随后通过添加饱和NH4Cl溶液(80mL)猝灭。执行用CH2Cl2(60mL*2次)萃取,并将合并的有机层用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤,并经Na2SO4干燥。将有机相过滤并减压浓缩,将残余物经由硅胶快速色谱(20%EtOAc于己烷中)纯化。获得了6.74g呈无色油状物的4,产率为58.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.65(s,2H),3.63(q,J=6.3Hz,2H),3.51(td,J=6.6,2.9Hz,4H),1.57(dq,J=13.5,6.9Hz,6H),1.41-1.21(m,10H),0.88(t,J=3.6Hz,3H)。HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+C13H28NaO3的计算值为255.1931;实测值为255.1941。
/>
在室温下将(二乙酰氧基碘)苯(0.79g,2.45mmol)添加至4(518mg,2.23mmol)、TEMPO(34.9mg,0.22mmol)和NaHCO3(412mg,4.9mmol)在20mL干DCM中的悬浮液中。将反应混合物搅拌3h并且TLC显示4被完全消耗。然后将混合物用饱和Na2S2O3水溶液(30mL)猝灭并用DCM(3×20mL)萃取。将DCM相合并并用NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤,经Na2SO4干燥,过滤并减压浓缩。将残余物经由硅胶快速色谱(10%EtOAc于己烷中)纯化。获得了510mg的呈无色油状物的5,定量。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ9.76(s,1H),4.64(s,2H),3.51(q,J=6.09Hz,4H),2.43(t,J=7.2Hz,1H),1.7-1.52(m,6H),1.49-1.19(m,8H),0.88(t,J=6.3Hz,3H)。
在30min内在0℃下将6(5.0g,30.4mmol)在DCM(30mL)中的溶液滴加到1,5-己二醇3和TEA(16.9mL,121mmol)在DCM(100mL)中的溶液中。在搅拌3h后,将反应物用50mL水猝灭并用DCM(50mL*3)萃取,然后合并有机相并用水洗涤,经Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物经由硅胶色谱(20%EtOAc于己烷中)纯化。获得了3.2g的呈无色油状物的7,产率为45.3%。1HNMR(300MHz,氯仿-d)δ4.11(td,J=6.6,2.7Hz,4H),3.62(td,J=6.6,3.3Hz,3H),1.72-1.62(m,4H),1.60-1.53(m,2H),1.43-1.33(m,6H),1.33-1.26(m,4H),0.91-0.84(t,J=6.6Hz,3H)。HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+C13H26NaO4的计算值为269.1723;实测值为269.1735。
将BAIB(1.41g,4.38mmol)添加至7(0.98g,3.98mmol)、TEMPO(62.2mg,0.4mmol)和NaHCO3(736mg,8.6mmol)在20mL DCM中的悬浮液中。将反应混合物搅拌3h直至TLC显示A被完全消耗。然后将混合物用饱和Na2S2O3水溶液(30mL)猝灭并用DCM(3×20mL)萃取。将DCM相合并并用NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤,经Na2SO4干燥,过滤并减压浓缩。将残余物经由硅胶快速色谱(10%EtOAc于己烷中)纯化。获得了0.78g呈淡黄色油状物的8,产率为80.2%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ9.77(t,J=1.5Hz,1H),4.13(td,J=6.6,2.7Hz,4H),2.45(td,J=7.2,1.8Hz,2H),1.76-1.58(m,6H),1.48-1.25(m,8H),0.89(t,J=6.6Hz,3H)。
在室温下向乙醛(1.76g,40mmol)在TMSCl(20mL,157mmol)中的溶液中滴加1-己醇1(5.1g,50mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。将澄清溶液减压浓缩以得到呈无色油状物的9,其无需进一步纯化即可直接使用。
将上述氯甲基醚滴加到1,6-己二醇3(9.44g,80mmol)和i-Pr2NEt(13.96mL,80mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌24h,随后通过添加饱和NH4Cl溶液(80mL)猝灭。用CH2Cl2(60mL*2次)进行萃取,并将合并的有机层用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤,并经Na2SO4干燥。将有机相过滤并减压浓缩,将残余物经由硅胶快速色谱法(20%EtOAc的己烷溶液)纯化。获得了3.45g呈无色油状物的10,产率为35.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.64(q,J=5.4Hz,1H),3.68-3.48(m,4H),3.38(dtd,J=9.3,6.6,2.4Hz,2H),1.65-1.47(m,7H),1.43-1.23(m,13H),0.87(t,J=6.6Hz,3H)。HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+C14H30NaO3的计算值为269.2087;实测值为269.2075。
将BAIB(1.77g,5.5mmol)添加至10(1.23g,5.0mmol)、TEMPO(78.2mg,0.5mmol)和NaHCO3(924mg,11.0mmol)在20mL DCM中的悬浮液中。将反应混合物搅拌3h直至TLC显示A被完全消耗。然后将混合物用饱和Na2S2O3水溶液(30mL)猝灭并用DCM(3×20mL)萃取。将DCM相合并并用NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤,经Na2SO4干燥,过滤并减压浓缩。将残余物经由硅胶快速色谱(10%EtOAc于己烷中)纯化。获得了1.0g的呈淡黄色油状物的11,产率为81.8%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ9.78(s,1H),4.66(q,J=5.4Hz,1H),3.57(dq,J=9.2,6.8Hz,2H),3.41(dtd,J=9.8,6.6,3.3Hz,2H),2.45(td,J=7.2,1.8Hz,2H),1.73-1.51(m,6H),1.48-1.25(m,11H),0.990(t,J=6.6Hz,3H)。HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+C13H28NaO3的计算值为255.1931;实测值为255.1941。
糖醇衍生的二胺的合成
向L-异山梨醇(2.0g,10.98mmol)和碳酸二乙酯(DMC)(3.96g,43.9mmol)在12mLMeOH中的溶液中添加EtONa(75mg,1.1mmol),使所得混合物回流48h。然后停止反应,室温冷却,并向所述混合物中添加二乙醚(15mL)。将反应混合物滤过硅藻土垫并蒸发溶剂。最后,通过使用二氯甲烷/甲醇(9:1)作为洗脱剂进行硅胶色谱来纯化产物,获得了1.2g的呈白色固体的所需产物,产率为75%。
1H NMR(400MHz,氧化氘)δ4.68(t,J=4.7Hz,1H),4.52(d,J=4.3Hz,1H),4.43(td,J=6.9,5.0Hz,1H),4.36(d,J=3.2Hz,1H),4.02-3.94(m,2H),3.90(dd,J=10.5,3.2Hz,1H),3.52(dd,J=9.1,7.4Hz,1H).13C NMR(75MHz,氧化氘)δ87.33,81.40,75.46,75.07,71.76,71.09。MS(ESI,m/z):[M+H]+C6H11O4的计算值为147.1;实测值为147.1。
根据先前报道的方法1进行二醇的二氰乙基化。在60℃下,在30min内向二醇(7.3g,50mmol)在叔丁醇和50%NaOH水溶液(2.0g,0.5mol%)中的溶液滴加丙烯腈16(7.96g,150mmol)。反应持续6小时的总时段。经由减压旋转蒸发去除叔丁醇和过量的丙烯腈。将残余物溶解在100mL的DCM中,通过三次水洗去除未反应的异山梨醇和单氰乙基化异山梨醇。将有机相经无水Na2SO4干燥,将溶液过滤,并减压去除溶剂。将残余物通过硅胶色谱(0%-100%己烷于二氯甲烷中)纯化成呈黄色油状物的对应产物。
化合物17:产率70.5%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.60(t,J=4.8Hz,1H),4.42(dt,J=4.4,1.2Hz,1H),4.06(td,J=6.4,4.8Hz,1H),4.02-3.98(m,1H),3.89-3.72(m,4H),3.67-3.60(m,3H),3.47(dd,J=8.8,6.8Hz,1H),2.78-2.72(m,4H)。MS(ESI,m/z):[M+Na]+C12H17N2O4的计算值为275.1002;实测值为275.1007。
化合物18:产率68%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ4.52(dt,J=4.7,2.4Hz,2H),4.07(tdd,J=8.0,3.6,1.6Hz,2H),3.89(dd,J=8.5,6.7Hz,2H),3.79-3.73(m,1H),3.71(d,J=6.1Hz,1H),3.62(ddd,J=9.7,6.5,5.7Hz,2H),3.50(t,J=8.2Hz,2H),2.75(ddd,J=6.6,5.7,1.1Hz,4H)。MS(ESI,m/z):[M+Na]+C12H17N2O4的计算值为275.1;实测值为275.1。
化合物19:产率93%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ4.61(t,J=4.8Hz,1H),4.43(dt,J=4.8,0.9Hz,1H),4.07(td,J=6.6,4.8Hz,1H),4.03-3.97(m,1H),3.90-3.72(m,4H),3.70-3.59(m,3H),3.48(dd,J=8.7,6.6Hz,1H),2.82-2.71(m,4H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ120.07,120.06,86.42,84.49,80.89,80.46,73.44,70.70,65.47,64.54,19.19,19.14。MS(ESI,m/z):[M+Na]+C12H17N2O4的计算值为275.1;实测值为275.0。
根据先前报道的方法合成二胺2。在室温下在1h内向BH3·THF复合物在THF(2.0M,29.7mL,59.4mmol)中的溶液中滴加二腈化合物(3.0g,11.89mmol)在THF(25mL)中的溶液。在添加完成之后,将反应物搅拌48h。然后,小心地添加甲醇(30mL)以猝灭反应物,在此期间剧烈放出氢气。在搅拌3h后,减压去除溶剂,然后添加40mL的THF以溶解残余物,之后滴加盐酸的二乙醚溶液(2.0M,29.7mL),在此之后形成了白色沉淀。然后过滤悬浮液以得到呈白色粉末的粗二胺HCl盐。然后将二胺2HCl盐溶解在去离子水(30mL)中以得到浅黄色溶液。向该溶液中添加新鲜洗涤的Amberlyst A 26-OH(17g)。将所得悬浮液在30℃的超声波浴中超声处理1.5h。将悬浮液滤过硅藻土垫,并用水(3×4mL)彻底洗涤树脂。使用旋转蒸发器将合并的澄清无色溶液蒸发至干(或冻干),以得到呈浅黄色油状液体的延长二胺。
异山梨醇衍生的二胺20:产率70%。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δ4.64(t,J=4.5Hz,1H),4.54-4.45(m,1H),4.11-4.00(m,1H),3.98-3.84(m,4H),3.80-3.69(m,1H),3.66-3.43(m,4H),2.86-2.61(m,4H),1.83-1.67(m,4H)。HRMS(ESI,m/z):[M+H]+C12H25N2O4的计算值为261.1809;实测值为261.1819。
异甘露糖醇衍生的二胺21:产率68%。HRMS(ESI,m/z):[M+H]+C12H25N2O4的计算值为261.1809;实测值为261.1817。
L-异山梨醇衍生的二胺22:产率71%。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.67(t,J=4.4Hz,1H),4.56-4.54(m,1H),4.13-4.10(m,1H),3.98-3.92(m,2H),3.92-3.86(m,2H),3.78-3.68(m,1H),3.68-3.50(m,4H),2.94-2.71(m,4H),1.85-1.73(m,4H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C12H25N2O4的计算值为261.2;实测值为261.2。
β-氨基醇的合成
向二胺(52mg,0.2mmol)在2mL无水EtOH中的溶液中添加环氧化物23(184mg,1.0mmol)。然后将混合物升温至90℃并持续搅拌12h。TLC显示A完全消耗,减压去除EtOH。将残余物经由硅胶色谱(0%-100%的[3%NH4OH、22%MeOH在二氯甲烷中的混合物]的二氯甲烷溶液)纯化,以得到所需产物。
DIS-1:产率61.2%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.66-4.60(m,1H),4.51(d,J=3.9Hz,1H),3.95(qd,J=7.5,3.9Hz,5H),3.88-3.05(m,11H),2.97-2.05(m,12H),1.82-1.60(m,4H),1.50-1.19(m,72H),0.99-0.78(m,12H)。HRMS(ESI,m/z):[M+H]+C60H121N2O8的计算值为997.9118;实测值为997.9118。
DIM-1:产率69.2%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.56(dd,J=4.5,2.7Hz,2H),4.11-3.89(m,4H),3.89-3.49(m,9H),3.49-3.23(m,5H),2.86-2.14(m,12H),1.85-1.65(m,4H),1.50-1.17(m,72H),0.91-0.80(m,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C60H121N2O8的计算值为997.9;实测值为998.0。
LIS-1:产率38.1%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.67-4.61(m,1H),4.55-4.39(m,1H),4.03-3.80(m,5H),3.55(tdd,J=34.4,30.2,12.9,6.2Hz,12H),2.90-2.08(m,12H),1.86-1.61(m,4H),1.47-1.19(m,72H),0.87(t,J=6.5Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C60H121N2O8的计算值为997.9;实测值为998.0。
用于二胺的还原胺化的一般合成程序:向二胺(52mg,0.2mmol)在THF(4mL)中的溶液中添加醛(1.0mmol),将混合物在室温下保持搅拌30min。然后将NaBH(OAc)3(254mg,1.2mmol)添加至上述溶液中,并将所得混合物搅拌12h。添加NaHCO3水溶液(15mL)以猝灭反应。将水溶液用DCM(15mL*3次)萃取,将有机相合并经无水Na2SO4干燥,过滤并减压浓缩。将残余物经由硅胶色谱(0%-100%的[3%NH4OH、22%MeOH在二氯甲烷中的混合物]的二氯甲烷溶液)纯化以得到所需产物。
化合物DIS-2:产率37.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.2Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.02-3.84(m,5H),3.68(dt,J=9.3,6.6Hz,1H),3.62-3.33(m,4H),2.63-2.18(m,12H),1.79-1.60(m,4H),1.49-1.15(m,48H),0.88(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C44H89N2O4的计算值为709.7;实测值为709.9。
化合物DIS-3:产率37.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.2Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.03-3.87(m,5H),3.75-3.62(m,1H),3.62-3.38(m,4H),2.61-2.40(m,4H),2.40-2.25(m,8H),1.76-1.65(m,4H),1.48-1.15(m,64H),0.88((t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C52H105N2O4的计算值为821.8;实测值为821.9。
化合物DIS-4:产率49.3%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.59(t,J=4.5Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.01-3.85(m,5H),3.72-3.65(m,1H),3.62-3.37(m,4H),2.60-2.28(m,12H),1.83-1.55(m,4H),1.48-1.32(m,8H),1.30-1.17(s,72H),0.97-0.74(m,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C60H121N2O4的计算值为933.9321;实测值为933.9320。
化合物DIS-5:产率33.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.2Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.02-3.85(m,5H),3.72-3.64(m,1H),3.62-3.38(m,4H),2.54-2.25(m,12H),1.79-1.61(m,4H),1.50-1.15(m,96H),0.98-0.81(m,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C68H137N2O4的计算值为1046.1;实测值为1046.0。
化合物DIS-6:产率19.1%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.59(t,J=4.2Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.02-3.85(m,5H),3.72-3.65(m,1H),3.63-3.41(m,4H),2.73-2.30(m,12H),1.84-1.65(m,4H),1.50-1.35(m,8H),1.35-1.17(m,104H),0.92-0.80(m,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C76H153N2O4的计算值为1158.2;实测值为1158.2。
化合物DIS-7:产率45.7%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.81(ddd,J=12.4,6.8,5.6Hz,4H),4.59(t,J=4.0Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.02-3.80(m,5H),3.68(dt,J=9.1,6.5Hz,1H),3.70-3.63(m,1H),3.52-3.40(m,3H),2.54-2.39(m,4H),2.35(tt,J=7.2,3.2Hz,8H),2.28(t,J=7.6Hz,8H),1.86-1.41(m,28H),1.41-1.05(m,64H),0.94-0.79(m,24H)。HRMS(ESI,m/z):[M+H]+C80H153N2O12的计算值为1334.1418;实测值为1334.1404。
化合物DIS-8:产率35.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.59(t,J=4.2Hz,1H),4.47(d,J=4.2Hz,1H),4.11(t,J=6.9Hz,16H),4.01-3.86(m,5H),3.74-3.62(m,1H),3.60-3.46(m,4H),2.47-2.30(m,12H),1.77-1.61(m,20H),1.43-1.24(m,48H),1.01-0.79(m,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C64H121N2O16的计算值为1173.9;实测值为1174.0。
化合物DIS-9:产率31.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.66(s,8H),4.60(t,J=4.2Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.01-3.85(m,4H),3.72-3.64(m,1H),3.60-3.38(m,20H),2.60-2.30(m,12H),1.79-1.52(m,20H),1.49-1.22(m,48H),0.95-0.80(m,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C64H129N2O12的计算值为1118.0;实测值为1118.1。
化合物DIS-10:产率54.5%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.65(d,J=5.2Hz,4H),4.58(t,J=4.2Hz,1H),4.47(d,J=4.2Hz,1H),4.02-3.83(m,5H),3.67-3.46(m,12H),3.47-3.30(m,9H),2.53-2.26(m,12H),1.84-1.47(m,30H),1.46-1.14(m,50H),0.86(d,J=6.9Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C68H137N2O12的计算值为1174.0;实测值为1174.2。
化合物DIM-2:产率54.5%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.59-4.49(m,2H),4.11-3.92(m,4H),3.75-3.61(m,4H),3.51(dt,J=9.0,6.6Hz,2H),2.48(td,J=6.9,2.1Hz,4H),2.43-2.33(m,8H),1.76(p,J=6.9Hz,4H),1.50-1.36(m,8H),1.35-1.15(d,J=2.6Hz,40H),0.89(t,J=6.9Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C44H89N2O4的计算值为709.7;实测值为709.8。
化合物DIM-3:产率31.7%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.52(dd,J=3.0,1.2Hz,2H),4.07-3.93(m,4H),3.75-3.58(m,4H),3.49(dt,J=9.0,6.6Hz,2H),2.46(td,J=6.9,1.8Hz,4H),2.41-2.27(m,8H),1.74(p,J=6.9Hz,4H),1.39(p,J=6.8,6.2Hz,8H),1.32-1.15(m,56H),0.87(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C52H105N2O4的计算值为821.8;实测值为821.9。
化合物DIM-4:产率49.3%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.53(dt,J=4.4,2.0Hz,2H),4.08-3.94(m,4H),3.72-3.60(m,4H),3.49(dt,J=9.2,6.8Hz,2H),2.60-2.46(m,4H),2.47-2.30(m,8H),1.76(p,J=7.0Hz,4H),1.49-1.35(m,8H),1.31-1.20(m,72H),0.88(t,J=6.8Hz,12H)。HRMS(ESI,m/z):[M+H]+C60H121N2O4的计算值为933.9321;实测值为933.9321。
化合物DIM-5:产率22.0%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.52(d,J=3.0Hz,2H),4.09-3.93(m,4H),3.75-3.59(m,4H),3.49(dt,J=9.0,6.6Hz,2H),2.46(td,J=6.9,1.8Hz,4H),2.41-2.27(m,8H),1.74(p,J=6.9Hz,4H),1.50-1.15(m,96H),0.88(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C68H137N2O4的计算值为1046.1;实测值为1046.0。
化合物DIM-6:产率37.3%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.55(dd,J=3.3,1.5Hz,2H),4.10-3.93(m,4H),3.74-3.58(m,4H),3.49(dt,J=9.0,6.6Hz,2H),2.46(td,J=6.9,1.8Hz,4H),2.35(dd,J=8.5,6.3Hz,8H),1.74(p,J=6.9Hz,4H),1.45-1.15(m,112H),0.88(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C76H153N2O4的计算值为1158.2;实测值为1158.0。
化合物DIM-7:产率36.0%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.81(p,J=6.4Hz,4H),4.53(d,J=2.8Hz,2H),4.08-3.94(m,4H),3.75-3.60(m,4H),3.48(dt,J=9.0,6.6Hz,2H),2.51(t,J=7.2Hz,4H),2.39(t,J=7.6Hz,8H),2.27(t,J=7.6Hz,8H),1.76(p,J=6.8Hz,4H),1.66-1.46(m,24H),1.45-1.35(m,8H),1.33-1.19(m,56H),0.91-0.82(m,24H)。
化合物DIM-8:产率32.5%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.52(d,J=3.0Hz,2H),4.11(t,J=6.6Hz,15H),4.04-3.91(m,4H),3.74-3.57(m,4H),3.54-3.40(m,2H),2.45(t,J=7.2Hz,4H),2.35(t,J=7.2Hz,8H),1.80-1.60(m,20H),1.46-1.19(m,48H),0.88(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C64H121N2O16的计算值为1173.9;实测值为1174.0。
化合物DIM-9:产率26.2%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.65(s,8H),4.52(d,J=3.6Hz,2H),4.10-3.90(m,4H),3.69-3.61(m,4H),3.53-3.45(m,18H),2.55-2.30(m,12H),1.80-1.65(m,4H),1.56(p,J=6.8Hz,16H),1.49-1.14(m,48H),0.88(t,J=6.8Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C64H129N2O12的计算值为1118.0;实测值为1118.2。
化合物DIM-10:产率29.4%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.64(q,J=5.4Hz,4H),4.51(d,J=3.0Hz,2H),4.10-3.90(m,4H),3.73-3.25(m,22H),2.44(t,J=7.2Hz,4H),2.35(t,J=7.2Hz,8H),1.80-1.65(m,4H),1.54(p,J=6.9Hz,16H),1.45-1.20(m,60H),0.87(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C68H137N2O12的计算值为1174.0;实测值为1174.3。
化合物LIS-2:产率31.0%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.4Hz,1H),4.48(d,J=4.4Hz,1H),4.01-3.88(m,5H),3.68(dt,J=9.2,6.8Hz,1H),3.57(t,J=8.0Hz,1H),3.53-3.45(m,3H),2.55-2.32(m,12H),1.81-1.65(m,4H),1.45-1.35(m,8H),1.33-1.20(s,40H),0.87(t,J=6.8Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C44H89N2O4的计算值为709.7;实测值为709.8。
化合物LIS-3:产率29.2%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.4Hz,1H),4.48(d,J=4.0Hz,1H),4.03-3.86(m,5H),3.69(dt,J=9.4,6.4Hz,1H),3.62-3.45(m,4H),2.77-2.20(m,12H),1.85-1.69(m,4H),1.52-1.36(m,8H),1.35-1.15(s,56H),0.88(t,J=6.4Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C52H105N2O4的计算值为821.8;实测值为822.0。
化合物LIS-4:产率30.3%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.2Hz,1H),4.48(d,J=4.2Hz,1H),4.00-3.85(m,5H),3.68(dt,J=9.0,6.3Hz,1H),3.63-3.43(m,4H),2.55-2.30(m,12H),1.80-1.64(m,4H),1.50-1.15(m,80H),0.87(t,J=6.6Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C60H121N2O4的计算值为933.9;实测值为934.2。
化合物LIS-5:产率30.6%。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.63(t,J=4.2Hz,1H),4.51(d,J=4.2Hz,1H),4.14-3.85(m,5H),3.80-3.65(m,1H),3.64-3.45(m,4H),2.70-2.30(m,12H),1.89-1.62(m,4H),1.55-1.40(m,8H),1.40-1.15(m,88H),0.90(d,J=6.3Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C68H137N2O4的计算值为1046.1;实测值为1046.3。
化合物LIS-6:产率29.4%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.60(t,J=4.4Hz,1H),4.48(d,J=4.4Hz,1H),4.07-3.83(m,5H),3.75-3.65(m,1H),3.62-3.43(m,4H),2.88-2.12(m,12H),1.85-1.65(m,4H),1.55-1.15(m,112H),0.88(t,J=6.8Hz,12H)。
化合物LIS-7:产率20.2%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.80(p,J=6.4Hz,4H),4.59(t,J=4.4Hz,1H),4.47(d,J=4.4Hz,1H),4.08-3.82(m,5H),3.75-3.65(m,1H),3.61-3.42(m,4H),2.58-2.30(m,12H),2.27(t,J=7.6Hz,8H)1.77-1.48(m,28H),1.42-1.18(m,64H),0.92-0.82(m,24H)。MS(ESI,m/z):[M+2H]2+C80H154N2O12的计算值为667.6;实测值为668.0。
化合物LIS-8:产率25.6%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.61(d,J=4.4Hz,1H),4.50(d,J=4.4Hz,1H),4.13(t,J=6.8Hz,16H),4.02-3.90(m,5H),3.75-3.65(m,1H),3.60-3.45(m,4H),2.65-2.28(m,12H),1.80-1.60(m,20H),1.55-1.20(m,48H),0.91(d,J=6.4Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C64H121N2O16的计算值为1173.9;实测值为1174.0。
化合物LIS-9:产率26.4%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.66(s,8H),4.59(t,J=4.0Hz,1H),4.46(d,J=4.0Hz,1H),4.03-3.83(m,4H),3.76-3.63(m,1H),3.60-3.45(m,20H),2.60-2.25(m,12H),1.79-1.22(m,68H),0.89(t,J=6.8Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C64H129N2O12的计算值为1118.0;实测值为1118.0。
化合物LIS-10:产率25.9%。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.65(q,J=5.2Hz,4H),4.59(t,J=4.4Hz,1H),4.47(d,J=4.4Hz,1H),4.03-3.84(m,5H),3.67(dt,J=9.2,6.4Hz,1H),3.61-3.30(m,20H),2.62-2.28(m,12H),1.80-1.63(m,6H),1.60-1.50(m,16H),1.49-1.18(m,58H),0.88(t,J=6.8Hz,12H)。MS(ESI,m/z):[M+H]+C68H137N2O12的计算值为1174.0;实测值为1174.1。
参考文献
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除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文所引用的出版物和它们所引用的材料通过引用具体并入。
本领域技术人员将理解,可对本发明的优选实施方案进行许多改变和修改,并且可在不脱离本发明的精神的情况下进行此类改变和修改。因此,所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有这些等同变化。
Claims (28)
1.一种具有式I、II或III的化合物:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
2.如权利要求1所述的化合物,其中所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
3.如权利要求1所述的化合物,其中所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
4.如权利要求1所述的化合物,其中所述化合物具有下式:
或其盐,其中:
R1独立地选自烷基、烯基、炔基、羟基、酯、醚、碳酸酯、烷基醇、烷基醚、烷基酯、氨基甲酸酯、脲、胍、二硫化物、酰胺、缩醛、缩酮、硫缩酮、三硫化物和肟醚。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物,其中R1选自以下:
6.如权利要求5所述的化合物,其中R1是
7.如权利要求5所述的化合物,其中R1是
8.如权利要求1所述的化合物,其中所述化合物是
其中R1是
9.如权利要求1所述的化合物,其中所述化合物是
其中R1是
10.一种基于脂质的纳米颗粒,其包含:
如权利要求1至9中任一项所述的化合物,和
包含编码共刺激分子的核酸的重组多核苷酸。
11.一种抗原呈递细胞,其包含:
基于脂质的纳米颗粒,所述基于脂质的纳米颗粒包含:
如权利要求1至9中任一项所述的化合物,和
包含编码共刺激分子的核酸的重组多核苷酸。
12.如权利要求11所述的抗原呈递细胞,其中所述化合物是
其中R1是
13.如权利要求11所述的抗原呈递细胞,其中所述化合物是
其中R1是
14.如权利要求11至13中任一项所述的抗原呈递细胞,其中所述共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳糖凝集素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1和LFA3。
15.如权利要求14所述的抗原呈递细胞,其中所述共刺激分子是CD40。
16.如权利要求11至15中任一项所述的组合物,其中编码所述共刺激分子的所述mRNA包含异源5'非翻译区(5'UTR)。
17.如权利要求11至16中任一项所述的组合物,其中编码所述共刺激分子的所述mRNA包含异源3'非翻译区(3'UTR)。
18.如权利要求11至17中任一项所述的组合物,其中所述mRNA包含经化学修饰的核碱基。
19.如权利要求18所述的组合物,其中所述经化学修饰的核碱基是假尿苷。
20.如权利要求11至19中任一项所述的组合物,其中所述抗原呈递是骨髓源性树突细胞。
21.一种治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求11至20中任一项所述的抗原呈递细胞和抗体。
22.如权利要求21所述的方法,其中所述抗体选自抗CD40抗体、抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体,或它们的组合。
23.如权利要求21或22所述的方法,其中所述抗原呈递细胞和所述抗体瘤内施用。
24.如权利要求21至23中任一项所述的方法,其中同时施用所述抗原呈递细胞和所述抗体。
25.一种治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用:
治疗有效量的如权利要求8所述的基于脂质的纳米颗粒,和
治疗有效量的如权利要求11至20中任一项所述的抗原呈递细胞。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述基于脂质的纳米颗粒包含
其中R1是
27.如权利要求25所述的方法,其中所述基于脂质的纳米颗粒包含
其中R1是
28.如权利要求25至27中任一项所述的方法,其中所述基于脂质的纳米颗粒包含重组多核苷酸,所述重组多核苷酸包含编码CD40L的核酸。
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