CN117106821A - 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 - Google Patents
调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117106821A CN117106821A CN202311258875.7A CN202311258875A CN117106821A CN 117106821 A CN117106821 A CN 117106821A CN 202311258875 A CN202311258875 A CN 202311258875A CN 117106821 A CN117106821 A CN 117106821A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- protein
- salt tolerance
- gene
- zmmpkl2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 123
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 131
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 54
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 241000209149 Zea Species 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 claims description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 abstract description 37
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 abstract description 37
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 9
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 9
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 description 4
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 102000001291 MAP Kinase Kinase Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108060006687 MAP kinase kinase kinase Proteins 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000006354 stress signaling Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000009084 Cold Injury Diseases 0.000 description 1
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101150105302 MAPK gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 description 1
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000004380 ashing Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010000 carbonizing Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002595 cold damage Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- -1 cytoskeleton Proteins 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010045262 enhanced cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012908 genetic validation Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用。本发明从玉米中克隆出ZmMPKL2基因，发现其过表达后导致玉米的耐盐性降低，表明ZmMPKL2可能在玉米对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用，进一步对ZmMPKL2基因敲除突变体植株进行耐盐性鉴定，结果表明，ZmMPKL2基因及其编码的ZmMPKL2蛋白可以调控植物的耐盐性，通过降低目的植物中ZmMPKL2蛋白的含量可以显著提高目的植物的耐盐性。本发明为玉米耐盐转基因育种提供潜在的候选基因，对于培育耐盐玉米新品种、促进商业化玉米育种进程具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用。
背景技术
植物固着生长在土壤中，经常面临各种不利的环境条件，如干旱、高温、冷害、土壤盐渍化以及重金属等，严重影响自身的生长发育。为了适应和抵御胁迫因素，植物在长期的进化过程中形成了复杂而精细的逆境信号转导机制。其中，激酶及其催化的蛋白质磷酸化在信号的感知、传递和应答中发挥重要作用。激酶接受到外界信号后，通过磷酸化底物蛋白质使其活性、细胞定位或稳定性等发生改变，从而将外界信号传递至胞内引起应答。
丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)级联系统由MAPKKK、MAPKK和MAPK三级激酶组成，是真核生物中保守的信号传递途径，在植物逆境信号转导中起着重要作用。在信号传递过程中，当外源信号被感知后，MAPKKK、MAPKK和MAPK依次被磷酸化激活将信号向胞内传递，被激活的MAPK磷酸化底物蛋白，包括胞质蛋白、细胞骨架和转录因子等组分，实现胞内信号应答。位于MAPKKK-MAPKK-MAPK级联最后一级的MAPK直接与底物蛋白相互作用，决定了信号的输出方向。已有研究结果显示MAPK在拟南芥、水稻和烟草响应干旱、冷和盐胁迫过程中具有重要调控作用。
玉米是世界上重要的粮食作物之一，在农业和工业生产中占有重要地位，既是人类食品，又是畜禽饲料，也是工业原料。但是，低温、盐渍、干旱和病虫害等各种生物与非生物胁迫严重影响玉米的生长发育和产量。因此，挖掘优异玉米耐逆基因，并利用基因工程等手段提高玉米抗逆性，培育抗逆新品种，已成为我国乃至世界农业持续高效发展的重大课题之一。已有研究表明MAPK级联信号系统也存在于玉米中，只是相对于拟南芥、水稻等植物，玉米MAPK级联研究较少。解析玉米MAPK基因在逆境应答中的作用机制，不仅具有重要的理论意义，对于提高玉米的抗逆性也具有重要的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的耐盐性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：
A1)在调控植物耐盐性中的应用；
A2)在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
A3)在培育耐盐植物中的应用；
A4)在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
A5)在植物耐盐性育种或耐盐植物种质资源改良中的应用；
所述蛋白质名称为ZmMPKL2，可为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述应用中，所述蛋白质可来源于玉米(Zea mays)。
为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)、AviTag标签蛋白、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、GST标签蛋白、SUMO标签蛋白或HA标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ZmMPKL2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ZmMPKL2的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ZmMPKL2且具有蛋白质ZmMPKL2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了与所述蛋白质ZmMPKL2相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)在调控植物耐盐性中的应用；
D2)在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
D3)在培育耐盐植物中的应用；
D4)在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
D5)在植物耐盐性育种或耐盐植物种质资源改良中的应用；
所述生物材料可为下述任一种：
E1)编码所述蛋白质ZmMPKL2的核酸分子；
E2)抑制或降低所述蛋白质ZmMPKL2的编码基因表达的核酸分子；
E3)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的表达盒；
E4)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；
E5)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；
E6)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E4)所述重组载体的重组宿主细胞；
E7)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；
E8)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。
进一步地，E3)所述表达盒、E4)所述重组载体、E5)所述重组微生物、E6)所述重组宿主细胞、E7)所述转基因植物组织和E8)所述转基因植物器官均可表达E1)和/或E2)所述核酸分子。
上述应用中，E1)所述核酸分子可为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
SEQ ID No.1所示的DNA分子可为ZmMPKL2基因的编码序列(CDS)。
SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质ZmMPKL2。
E1)所述核酸分子还可包括在SEQIDNo.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子；E1)所述核酸分子还可包括与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
进一步地，所述E2)可为降低所述ZmMPKL2基因表达量的核酸分子。
E2)所述核酸分子可为sgRNA、microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸。
进一步地，所述sgRNA、microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸用于抑制ZmMPKL2基因的表达。
本领域技术人员熟知，可以利用基因编辑技术抑制ZmMPKL2基因的表达，也可以利用基因敲减(基因敲低，gene knock-down)技术从转录后水平或翻译水平使ZmMPKL2基因表达失活或基因沉默。所述基因敲减技术包括RNA干扰、Morpholino干扰、反义核酸、核酶或显性负抑制突变但不限于此。此外，利用病毒(如慢病毒、腺相关病毒)表达的shRNA或siRNA抑制ZmMPKL2基因的表达，进行ZmMPKL2基因的沉默也是本领域技术人员所熟知的。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。
本发明还提供了一种培育耐盐植物的方法，所述方法可包括降低目的植物中所述蛋白质的含量，得到耐盐性高于所述目的植物的耐盐植物。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质的含量可以是通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量来实现。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活。
本发明所述培育耐盐植物的方法，可包括如下步骤：对目的植物中能够表达ZmMPKL2蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比耐盐性提高。其中，所述对目的植物中能够表达ZmMPKL2蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述目的植物中的表达。所述培育耐盐植物的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。
本发明还提供了一种培育耐盐性降低植物的方法，所述方法可包括提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量可以是通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物来实现。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因可为下述任一种：
H1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
H2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
进一步地，所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、生物射弹(biolistic)方法、电穿孔或in planta技术导入。
本文所述植物可为下述任一种：
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)玉蜀黍属植物。
所述玉蜀黍属植物可为玉米
本文所述调控植物耐盐性可为提高(上调)植物耐盐性或降低(下调)植物耐盐性。
本文中，所述耐盐植物理解为不仅包含将所述ZmMPKL2基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。所述耐盐植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明从玉米B73中克隆出ZmMPKL2基因，发现其过表达后导致玉米的耐盐性降低，表明ZmMPKL2可能在玉米对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用，即ZmMPKL2基因负调控玉米对耐盐的胁迫。通过进一步对ZmMPKL2基因敲除突变体植株的耐盐性鉴定，结果表明，本发明鉴定到的ZmMPKL2基因及其编码的ZmMPKL2蛋白可以调控植物的耐盐性，通过降低目的植物中ZmMPKL2蛋白质的含量(如对ZmMPKL2基因进行基因敲除)可以显著提高目的植物的耐盐性。通过提高目的植物中ZmMPKL2蛋白质的含量(如过表达ZmMPKL2基因)可以显著降低目的植物的耐盐性。
本发明首次发现了ZmMPKL2基因及其编码蛋白在提高玉米耐盐性中的应用，为玉米耐盐转基因育种提供潜在的候选基因。对于培育耐盐玉米新品种、促进商业化玉米育种进程、保证玉米的高产稳产具有重要意义和广泛的应用前景。
附图说明
图1为ZmMPKL2阳性过表达转基因植株鉴定。
图2为ZmMPKL2阳性过表达转基因植株的耐盐性。
图3为ZmMPKL2阳性过表达转基因植株的钠离子、钾离子含量。
图4为ZmMPKL2基因敲除突变体及其敲除植株的耐盐性鉴定。
图5为ZmMPKL2基因敲除植株的钠离子、钾离子含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、ZmMPKL2基因克隆及过表达载体的构建
1、材料的准备与处理
将玉米自交系B73种子灭菌，在黑暗条件下催芽24h后，移到蛭石中培养，萌发后幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗(28℃/22℃)。生长约1周后，将处于三叶期的玉米幼苗进行取材并液氮速冻，-80℃保存。
2、RNA的提取和cDNA的合成
取适量玉米材料在研钵中研磨成粉末，转移至已加入1mL TRIzol试剂的离心管中，涡旋振荡混匀，室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀10s，室温放置5min。12000×g，4℃离心15min，吸取上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。12000×g，4℃离心10min，弃上清液，用70％乙醇清洗沉淀，7500×g，4℃离心5min，弃上清液，沉淀晾干后溶于100μL无菌水，待沉淀全部溶解后测定RNA浓度和纯度。加入3倍体积的无水乙醇和1/10倍体积的3M醋酸钾(pH 5.8)，混匀后置于-80℃至少30min；7500×g，4℃离心5min，弃上清液，用无菌水溶解RNA至所需浓度。
将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒进行cDNA合成。在15μL反应体系中加入2.5μg RNA、2μL Oligod(T)(16T、1μg/μL)、0.5μL RRI(40U/μL)，混匀，首先将反应体系放置于PCR仪器中65℃孵育15min，冰上静置2min，然后向体系中加入3μL 5×M-MLV缓冲液、1.5μLdNTP(10mM)、0.5μL M-MLV(200U/μL)，混匀，放置于PCR仪器中42℃反应90min，95℃变性5min，之后将反转录产物于-20℃冰箱中保存备用。
3、基因克隆
以上述cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：
ZmMPKL2-LP：5’-CATATGGATAGATTCAAGTTGATTAAGG-3’；
ZmMPKL2-RP：5’-ACTAGTTTAGCTGACCAATTTTCTCG-3’。
PCR反应体系(20μL)：ddH2O12.4μL，5×PhusionBuffer-GC4μL，10mMdNTP0.4μL，引物(10μM)各1μL，玉米叶片cDNA1μL，Phusion DNA聚合酶0.2μL。
PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃变性20s、56℃复性30s、72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，PCR产物于4℃保存。
PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到约1.4Kb的PCR产物。将目的条带切胶并使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。将目的片段连接至pBSK载体(addgene)，测序鉴定。经过测序确证克隆片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸，编码序列表中SEQID No.2所示的蛋白质。
将SEQ ID No.1所示的基因命名为ZmMPKL2基因，其编码的蛋白质命名为ZmMPKL2蛋白。ZmMPKL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，ZmMPKL2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
实施例2、ZmMPKL2基因过表达转基因玉米植株的获得与验证
1、重组载体的构建
将上述所得PCR产物经过SmaⅠ酶切，得到的酶切产物与经过同义酶切的pBCXUN载体连接，得到重组载体pBCXUN-ZmMPKL2。pBCXUN载体是将pCXUN(Songbiao Chen,Pattavipha Songkumarn,Jianli Liu,and Guo Liang Wang(2009)AVersatile ZeroBackground T-Vector System for Gene Cloning and Functional Genomics.PlantPhysiology150:1111-1121)载体上XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间的Hyg抗性基因替换为抗除草剂Bar基因(SEQ ID No.3)。经过测序，重组载体pBCXUN-ZmMPKL2为将序列表中SEQ IDNo.1所示的DNA片段插入pBCXUN载体的SmaⅠ位点得到的重组表达载体。
2、重组菌的制备
在100μL GV3101感受态细胞中加入上述质粒(重组载体pBCXUN-ZmMPKL2)2μL，混匀，冰浴30min后液氮中速冻1min，立即置入37℃水浴5min，再放入冰上5min。加入450μL LB液体培养基，28℃、150r·min-1预培养4～6h，6000rpm离心1min，保留100μL上清重悬沉淀，均匀涂布于含100μg·mL-1Kan和50μg·mL-1利福平的LB固体平板上，28℃培养1～2天。
挑取平板上长出的单菌落，进行菌落PCR检测，PCR鉴定引物序列如下：
引物UbiP：5′-TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC-3′，
引物NosR：5′-AGACCGGCAACAGGATTCAATC-3′。
PCR反应条件为：94℃3min；94℃20s，57℃30s，72℃50s，共35个循环；72℃终延伸反应10min，4℃保温保存。
得到1380bp的PCR产物为阳性菌斑。将阳性菌斑接种于含100μg·mL-1Kan和50μg·mL-1Rif的LB液体培养基中，220rpm·min-1培养1-2天，得到阳性克隆菌液。
3、转化
将阳性克隆菌液利用常规的农杆菌介导法转化玉米B73(以下也称为野生型玉米)愈伤组织，得到T1代ZmMPKL2转基因玉米，具体如下：
取人工授粉后的玉米B73幼胚诱导出胚性愈伤组织作为外植体进行转化研究，将胚性愈伤组织放在上述步骤2得到的阳性克隆菌液(OD600＝0.6)中侵染，15min后弃去菌液，用无菌滤纸吸干表面菌液后置于共培养基上，23℃暗培养3天。共培养后，将愈伤组织放在含有除草剂的筛选培养基上继代一次，再去除草剂培养基上继代一次，选出的阳性愈伤组织转至分化筛选培养基上培养，分化出的芽苗转入生根筛选培养基，获得的T1代ZmMPKL2转基因玉米。
T1代ZmMPKL2转基因玉米于当年冬季在海南加代，按单穗播种成株系，长至四叶期后，用0.01％的除草剂均匀喷洒以筛选，每5天喷洒1次，共喷洒3次。存活的植株，取其叶片提取基因组DNA作为模板，用BarFwd/BarRev(PCR扩增中间载体自带的Bar基因)和基因组引物UbiP/ZmMPKL2-RP(上游引物来自载体pBCXUN上，下游引物来自基因ZmMPKL2上)进行PCR鉴定。引物序列如下所示：
BarFwd：5′-CAATCCTCGAGTCTACCATGAGCCCAGAAC-3′，
BarRev：5′-GAATCCTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCA-3′。
UbiP：5′-TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC-3′,
ZmMPKL2-RP：5’-ACTAGTTTAGCTGACCAATTTTCTCG-3’。
其中PCR反应体系如下：20μL PCR反应体系组分如下：10×Buffer 2μL，dNTP(10mM)1μL，上下游引物(10μM)各1.5μL，存活的植株基因组DNA0.5μL，Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O 14μL。
Touch Down PCR反应条件为：94℃3min，第一步94℃20s，57-65℃每个循环降低1℃反应30s，72℃50s，共8个循环；第二步98℃20s，57℃30s，72℃50s，共27个循环；72℃终延伸反应7min，4℃保温保存。
以野生型玉米B73为对照。
对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可以看出，得到目的片段为阳性，且表达量显著高于野生型B73的T1代ZmMPKL2转基因玉米，命名为OE-1和OE-2。
阳性的T1代ZmMPKL2转基因玉米进行加代培养。
实施例3、ZmMPKL2基因过表达玉米植株的耐盐性检测
1、盐胁迫处理
将ZmMPKL2基因过表达株系OE-1和OE-2与对照株系B73进行如下两组处理：第一组为正常生长，用自来水将营养土搅拌均匀，等量土装入直径12cm的塑料花盆中，播种，再将等比例混匀的营养土和河沙覆盖种子，放在14h光照/10h黑暗(22℃/28℃)的条件下培养；第二组用100mM NaCl处理，营养土分别用含100mM NaCl的盐水搅拌均匀，等量土装入直径12cm的塑料花盆中，播种，再将等比例混匀的营养土和河沙覆盖种子，放在14h光照/10h黑暗(22℃/28℃)的条件下培养。以上两组样本生长11天后观察表型，拍照记录；再用剪刀剪取玉米幼苗地上部分，利用天平称取鲜重；将样品装入牛皮袋中，80℃烘干48h至恒重，利用分析天平称取干重。
2、表型检测
如图2所示，可以看出，图2A：正常条件下生长的OE-1和OE-2与对照B73植株无明显差异，NaCl处理条件下的OE-1和OE-2比对照B73矮小羸弱，幼叶最先表现出离子毒害现象，随着盐胁迫程度的加深，叶龄较大的叶片开始失水失绿萎蔫最终干枯死亡(图2B)；其鲜重(图2C)和干重(图2D)较野生型均显著减少40％～60％。ZmMPKL2过表达植株比野生型B73不耐盐胁迫。这些结果表明，过表达ZmMPKL2基因可以显著降低玉米的耐盐性。
3、玉米根部和茎部的钠、钾离子含量测定
剪取上述不同处理下的玉米材料的地上部分，放入牛皮纸袋中，80℃烘干至恒重；将烘干的植物材料剪碎成粉末，分析天平称量并记录干重，将样品装入坩埚中，盖好坩埚盖子；坩埚放入马弗炉，300℃炭化3h，575℃灰化6h，关闭马弗炉，自然冷却过夜，打开马弗炉并取出坩埚；向每个坩埚中加入10mL 1％的盐酸充分溶解样品，利用注射器将样品过滤到10mL离心管中，获得样品母液；使用微波等离子体原子发射光谱仪4100MP-AE测定样品中的钠、钾离子含量。结果如图3所示，可以看出，正常生长条件下，OE-1和OE-2与对照B73相比，Na+含量(图3A)、K+含量(图3B)和Na+/K+比(图3C)无明显差异；在100mM NaCl处理条件下，与对照B73相比，OE-1和OE-2中Na+含量极显著升高(图3A)，K+含量显著降低(图3B)，Na+/K+比显著升高(图3C)。这些结果表明，盐胁迫处理后的ZmMPKL2过表达植株地上部分积累大量Na+，造成较强的离子毒害，打破植物体内的Na+/K+平衡，因此导致植株表现出明显的盐敏感表型，严重抑制了玉米幼苗的生长。
上述结果表明，ZmMPL2基因降低植物耐盐性，ZmMPKL2基因负调控植物耐盐性。
实施例4、ZmMPKL2基因敲除突变体的获得与鉴定
1、ZmMPKL2基因敲除突变体的获得
(1)在玉米EMS突变库MEMD(www.elabcaas.cn/memd)中检索到2个ZmMPKL2提前终止的突变体EMS3-1373dc和EMS3-04a542，分别命名为mpkl2-1和mpkl2-2。
(2)提取玉米叶片基因组，利用突变体各自的特异性引物(见表1)进行PCR扩增目的片段，通过测序峰图确定是纯合突变体。在中国农业大学上庄试验站进行繁种。
表1、ZmMPKL2基因敲除突变体的获得与鉴定
2、ZmMPKL2基因敲除突变体的鉴定
为了从遗传学上反向验证ZmMPKL2在盐胁迫中的生物学功能，我们在玉米EMS突变库MEMD(www.elabcaas.cn/memd)中检索到2个ZmMPKL2提前终止的突变体EMS3-1373dc和EMS3-04a542，依次命名为mpkl2-1和mpkl2-2(图4A)。
ZmMPKL2全长基因序列为5701bp，包含15个外显子和14个内含子，CDS序列有1380bp，编码一个459个氨基酸大小的蛋白肽段。以mpkl2-1和mpkl2-2敲除突变体的基因组为模板，利用各自特异性引物PCR扩增获得目的片段随后进行测序确定，mpkl2-1突变体在第9个外显子的第3808位碱基由G突变为A，导致ZmMPKL2转录提前237个氨基酸终止，mpkl2-1编码的蛋白ZmMPKL2-1包含Ⅰ～Ⅹ10个保守激活功能域、ATP结合位点AVK和TxY活化基序，mpkl2-2则是在第14个外显子的第5307位碱基由C突变为T，导致ZmMPKL2转录提前101个氨基酸终止，mpkl2-2编码的蛋白ZmMPKL2-2包括Ⅰ～Ⅺ11个完整的保守激活功能域、ATP结合位点AVK和TxY活化基序。两者的不同之处在于，ZmMPKL2-2的11个保守功能域完整，而ZmMPKL2-1缺少一个Ⅺ激活功能域；ZmMPKL2-2比ZmMPKL2-1的C端多出136个氨基酸残基组成的蛋白片段，但具体功能未知。
实施例5、ZmMPKL2基因敲除突变体的玉米植株的耐盐性检测
利用突变体材料研究基因功能是常用的生物学手段。与ZmMPKL2过表达植株盐胁迫条件一样做CK和100mM NaCl处理mpkl2敲除突变体。与野生型B73相比，mpkl2-1敲除突变体的抗盐表型并无太大区别，而mpkl2-2突变体抗盐表型却十分明显，mpkl2-1和mpkl2-2突变体的鲜重、干重、地上部分中Na+含量、K+含量和Na+/K+比均显著差异于B73(图4B、C、D，图5)。将盐胁迫条件增加到150mM NaCl再来观察mpkl2突变体的抗盐性。无论是mpkl2-1突变体还是mpkl2-2突变体的抗盐表型较野生型B73都差异明显，鲜重和干重显著增加30％以上，地上部分中Na+含量显著降低约50％，K+含量显著降低，Na+/K+比也降低30％左右(图4B、C、D，图5)。由此说明ZmMPKL2基因敲除后的突变体在盐胁迫条件下能够减少地上部分中Na+的过量积累，一定程度上恢复植物体内的Na+/K+平衡，最终提高玉米幼苗的抗盐能力。可见，敲除ZmMPKL2基因可以显著提高玉米的耐盐性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
A1)在调控植物耐盐性中的应用；
A2)在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
A3)在培育耐盐植物中的应用；
A4)在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
A5)在植物耐盐性育种或耐盐植物种质资源改良中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于玉米。
3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)在调控植物耐盐性中的应用；
D2)在制备调控植物耐盐性的产品中的应用；
D3)在培育耐盐植物中的应用；
D4)在制备培育耐盐植物的产品中的应用；
D5)在植物耐盐性育种或耐盐植物种质资源改良中的应用；
所述生物材料为下述任一种：
E1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
E2)抑制或降低权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
E3)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的表达盒；
E4)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；
E5)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；
E6)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E4)所述重组载体的重组宿主细胞；
E7)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；
E8)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，E1)所述核酸分子为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
5.一种培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述方法包括降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量，得到耐盐性高于所述目的植物的耐盐植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量是通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量来实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活。
8.一种培育耐盐性降低植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量是通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物来实现。
10.根据权利要求1-4中任一所述的应用、权利要求5-7中任一所述的方法，或权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述植物为下述任一种：
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)玉蜀黍属植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311258875.7A CN117106821A (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311258875.7A CN117106821A (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117106821A true CN117106821A (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=88800187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311258875.7A Pending CN117106821A (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117106821A (zh) |
-
2023
- 2023-09-27 CN CN202311258875.7A patent/CN117106821A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110904071B (zh) | Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CN111996181B (zh) | Drk蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 | |
| CN109797157B (zh) | 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用 | |
| CN110066773B (zh) | 玉米ZmMPK11蛋白或其编码基因在调节植物耐逆性中的应用 | |
| CN110643618A (zh) | 小桐子MYB类转录因子JcMYB16基因及其在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN116179589B (zh) | SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实产量中的应用 | |
| CN116120416A (zh) | SlWRKY57基因及其编码蛋白在调控番茄耐盐性中的应用 | |
| CN113621643A (zh) | GhTULP34在调控植物抗非生物逆境胁迫中的应用及调控方法 | |
| CN112322645A (zh) | OsHDA710表观调控因子基因在水稻发育和抗逆中的应用 | |
| CN113234720B (zh) | 小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用 | |
| CN114085854B (zh) | 一种水稻抗旱、耐盐基因OsSKL2及其应用 | |
| CN117264964A (zh) | 小麦TaGSKB蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用 | |
| CN111454966B (zh) | 一种春兰CgWRKY4基因及其应用 | |
| CN117106821A (zh) | 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 | |
| CN113943740A (zh) | 一种可调控烟叶钾含量的NtCHA1基因及其应用 | |
| CN112608938A (zh) | OsAO2基因在控制水稻抗旱性中的应用 | |
| CN105255914A (zh) | 枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及增强植物耐盐碱应用 | |
| WO2006126294A1 (ja) | ムギネ酸鉄錯体選択的トランスポーター遺伝子 | |
| CN113322260B (zh) | 高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用 | |
| CN115044592B (zh) | 一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因ZmADT2及其编码蛋白和应用 | |
| CN115011631B (zh) | 调控玉米苗期抗旱性的蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN108913669A (zh) | 一种抗旱蛋白、分离的核酸分子和应用 | |
| CN112143744B (zh) | OsPLDδ3基因在控制水稻抗旱性中的应用 | |
| CN113173981B (zh) | 毛竹PeDREB3基因及其在植物抗寒性调控中的应用 | |
| CN111454346B (zh) | 一种来源于大麦的参与硝态氮调控的转录因子HvNLP2及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |