CN117106720A - 一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒、制备方法和应用 - Google Patents

一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒、制备方法和应用，涉及类器官培养技术领域。本发明中提供了一种胆囊癌类器官的制备方法，制备方法包括如下步骤：步骤一、将胆癌囊组织消化后，加入筛选组合物进行筛选培养，离心获得胆囊癌单细胞样品；步骤二、将胆囊癌单细胞样品与基质胶混合，加入培养组合物进行培养，即得胆囊癌类器官；筛选组合物包括二甲基亚硝胺。本申请中首次采用二甲基亚硝胺作为有效成分制备筛选组合物，在胆囊癌类器官培养过程中进行筛选培养，经过该筛选培养的胆囊癌单细胞样品中胆囊癌细胞比例获得大幅提升；本申请中还采用葡萄糖苷酶处理筛选后的胆囊癌单细胞样品，能够有效提升胆囊癌类器官的成功率和稳定性。

Description

一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒、制备方法和应用
技术领域
本申请涉及类器官培养技术领域，尤其涉及一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒、制备方法和应用。
背景技术
胆囊癌是指发生于胆囊(包括胆囊底部、体部、颈部以及胆囊管)的恶性肿瘤。胆囊癌起病隐匿，早期无特异性临床表现，且容易出现淋巴结转移及周围组织浸润，患者确诊时多已至中晚期，能施行手术的患者大概仅有10％，且手术疗效也不甚理想，术后5年生存率仅有5％。并且，在无法手术的患者中，尚无标准的化、放疗方案，目前多以吉西他滨或者氟脲嘧啶作为主要的化疗药物。化疗及放疗的疗效尚未获得能让患者获益的结论。因此，目前关于胆囊癌的病理和防治方法的研究，均面临着严峻的挑战。
类器官是在体外生长的干细胞或器官祖细胞，具有自我更新和形成三维结构的能力，有着与细胞起始器官相似的形态和功能。虽然目前类器官技术在研究界的广泛应用依然处于起步阶段，但是作为一种前沿工具，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补。此外，通过类器官繁殖的干细胞群取代受损或者患病的组织，类器官提供了一种自体和同种异体细胞疗法的可行性，可以预见的是未来这一技术在再生医学领域也将拥有巨大的潜力。但目前，针对胆囊癌的类器官培养方面研究还较少，胆囊癌类器官模型构建成功率也较低，约为20％，与肝癌、卵巢癌、胰腺癌等相比，仍有较大的提升空间。
综上所述，亟需提供一种切实可行的、成功率高、稳定性好、药物敏感性好的胆囊癌类器官模型以及构建方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种成功率高、稳定性好、药物敏感性好的胆囊癌类器官模型及其制备方法和应用。
一方面，本申请提供了一种胆囊癌类器官的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、将胆囊癌组织消化后，加入筛选组合物进行筛选培养，离心获得胆囊癌单细胞样品；
步骤二、将所述胆囊癌单细胞样品与基质胶混合，加入培养组合物进行培养，即得胆囊癌类器官；
所述筛选组合物包括二甲基亚硝胺。
优选的，所述离心转速为200-600xg；更优选的，400xg。
优选的，所述胆囊癌组织可来源于人、小鼠等。
进一步的，所述二甲基亚硝胺为二甲基亚硝胺水溶液，所述二甲基亚硝胺水溶液中二甲基亚硝胺的浓度为1-4μg/kg；优选的，以质量百分比计，筛选组合物中所述二甲基亚硝胺水溶液的加入量为1％-5％。
优选的，所述二甲基亚硝胺水溶液中二甲基亚硝胺的浓度为3μg/kg，筛选组合物中所述二甲基亚硝胺水溶液的加入量为1％。
进一步的，所述步骤一中的筛选培养，培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养时间为8-16h。
优选的，所述步骤一中的筛选培养，培养条件为CO2含量为5％，O2含量为1％，温度为37℃，培养时间为12h。
进一步的，所述步骤一中，还包括洗涤胆囊癌单细胞样品的步骤；优选的，所述洗涤次数为1-2次；优选的，采用培养基进行洗涤。
优选的，所述洗涤次数为2次。
所述培养基可选自能够常规购买获得的类器官培养基。
在一种优选的实施方式中，所述洗涤为：轻柔的使用培养基进行吹打，重悬胆囊癌单细胞样品后，转速为400xg离心。
培养基：20％-60％DMEM/F12、1％-5％胰岛素、1％-5％转铁蛋白、1％-5％人重组表皮生长因子、1％-5％神经营养因子、1％-5％胆囊上皮细胞生长因子、10％-20％酵母提取物、1％-5％青霉素/链霉素、10％-20％MCDB201。
更优选的，培养基：51％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201。
进一步的，所述培养组合物中包括葡萄糖苷酶；优选的，以质量百分比计，所述培养组合物中葡萄糖苷酶的含量为1％-5％。
更优选的，所述培养组合物中葡萄糖苷酶的含量为1％。
更优选的，所述葡萄糖苷酶的酶活力100000-300000U/g。
进一步的，所述胆囊癌单细胞样品与基质胶的质量比为1：(1-2)。
优选的，所述胆囊癌单细胞样品与基质胶的质量比为1：1。
进一步的，所述步骤二中培养，培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养5-10天。
优选的，所述步骤二中培养，培养条件为CO2含量为5％，O2含量为1％，温度为37℃，培养7天。
在一种优选的实施方式中，一种胆囊癌类器官的制备方法包括如下步骤：
步骤一、将肿瘤组织消化后，加入筛选组合物进行筛选培养，筛选培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养8-16h，转速为200-600xg离心，弃上清得到胆囊癌单细胞样品，使用培养基轻柔洗涤1-2次；
步骤二、取所述胆囊癌单细胞样品加入基质胶1:(1-2)混合均匀后，加入培养组合物进行培养，培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养5-10天，获得胆囊癌类器官。
筛选组合物：1％-5％二甲基亚硝胺(二甲基亚硝胺水溶液，浓度为1-4μg/kg)、20％-60％DMEM/F12、1％-5％胰岛素、1％-5％转铁蛋白、1％-5％人重组表皮生长因子、1％-5％神经营养因子、1％-5％胆囊上皮细胞生长因子、10％-20％酵母提取物、1％-5％青霉素/链霉素、10％-20％MCDB201。
培养组合物：1％-5％葡萄糖苷酶、20％-60％DMEM/F12、1％-5％胰岛素、1％-5％转铁蛋白、1％-5％人重组表皮生长因子、1％-5％神经营养因子、1％-5％胆囊上皮细胞生长因子、10％-20％酵母提取物、1％-5％青霉素/链霉素、10％-20％MCDB201。
培养基：20％-60％DMEM/F12、1％-5％胰岛素、1％-5％转铁蛋白、1％-5％人重组表皮生长因子、1％-5％神经营养因子、1％-5％胆囊上皮细胞生长因子、10％-20％酵母提取物、1％-5％青霉素/链霉素、10％-20％MCDB201。
可以理解的是，所述筛选组合物、培养组合物及培养基在使用时能够没过细胞即可，本领域技术人员可根据经验和培养容器大小选择加入量，在此不做过多限制。
目前研究中通常由于胆囊癌标本体积较小，并且胆囊癌类器官的构建绝大多数取材于手术后的肿瘤组织，导致取材内不可避免地含有正常细胞。因此，所取标本内肿瘤细胞的绝对数量明显少于肝癌、卵巢癌等其他实体肿瘤，进而胆囊癌类器官模型制备成功率明显低于肝癌、卵巢癌等其他实体肿瘤类器官。
本申请中首次采用二甲基亚硝胺作为有效成分制备筛选组合物，在胆囊癌类器官培养过程中进行筛选培养，经过该筛选培养的胆囊癌单细胞样品中，胆囊癌细胞比例获得大幅提升。相比现有技术采用流式细胞仪进行分选，该方法简单高效，且不存在荧光标记等问题，可适用于后续多种应用场景中。
本申请中还采用葡萄糖苷酶处理筛选后的胆囊癌单细胞样品，能够有效解决二甲基亚硝胺遗留造成的问题，进一步提升胆囊癌类器官的成功率和稳定性，获得成功率高、敏感性好且对多种胆囊癌治疗药物敏感性好的胆囊癌类器官。
另一方面，本申请中还提供了一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒，所述试剂盒中包括筛选组合物，所述筛选组合物包括二甲基亚硝胺；优选的，所述二甲基亚硝胺为二甲基亚硝胺水溶液，所述二甲基亚硝胺水溶液中二甲基亚硝胺的浓度为1-4μg/kg；更优选的，以质量百分比计，筛选组合物中所述二甲基亚硝胺水溶液的加入量为1％-5％；
更优选的，所述试剂盒中还包括培养组合物；更优选的，所述培养组合物包括葡萄糖苷酶；更优选的，以质量百分比计，所述培养组合物中葡萄糖苷酶的含量为1％-5％；
更优选的，所述筛选组合物和/或培养组合物还包括DMEM/F12、MCDB201、胰岛素、转铁蛋白、人重组表皮生长因子、神经营养因子、胆囊上皮细胞生长因子、酵母提取物、抗生素中的一种或多种；更优选的，以质量百分比计，所述筛选组合物和/或培养组合物中包括20％-60％DMEM/F12、1％-5％胰岛素、1％-5％转铁蛋白、1％-5％人重组表皮生长因子、1％-5％神经营养因子、1-5％胆囊上皮细胞生长因子、10％-20％酵母提取物、1％-5％抗生素、10％-20％MCDB201。
更优选的，所述二甲基亚硝胺水溶液中二甲基亚硝胺的浓度为3μg/kg，筛选组合物中所述二甲基亚硝胺水溶液的加入量为1％。
更优选的，所述培养组合物中葡萄糖苷酶的含量为1％。
更优选的，所述筛选组合物和/或培养组合物中包括50％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％抗生素、16％MCDB201。
更优选的，所述抗生素为青霉素/链霉素。
在一种优选的实施方式中，筛选组合物包括：1％3μg/kg二甲基亚硝胺水溶液、50％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201。
在一种优选的实施方式中，培养组合物包括：1％葡萄糖苷酶、50％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201。
另一方面，本申请还提供了一种上述方法制备的胆囊癌类器官。
另一方面，本申请还提供了上述方法制备的胆囊癌类器官或上述的试剂盒或上述的胆囊癌类器官在非疾病诊断治疗目的的胆囊癌致病机理研究和/或药物测试中的应用。
本发明具有如下有益效果：
1、本申请中首次采用二甲基亚硝胺作为有效成分制备筛选组合物，在胆囊癌类器官培养过程中进行筛选培养，经过该筛选培养的胆囊癌单细胞样品中，胆囊癌细胞比例获得大幅提升，该方法简单高效；
2、本申请中还采用葡萄糖苷酶处理筛选后的胆囊癌单细胞样品，能够有效解决二甲基亚硝胺遗留造成的问题，进一步提升胆囊癌类器官的成功率和稳定性；
3、本申请还提供了一种胆囊癌类器官的制备方法，采用该方法制备的胆囊癌类器官具有较好的稳定性，且该胆囊癌类器官针对多种胆囊癌相关药物，如吉西他滨或者氟脲嘧啶等均有较好的灵敏度，广泛适用于胆囊癌相关病理或药理学研究过程。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
其中，DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、人重组表皮生长因子、神经营养因子、胆囊上皮细胞生长因子、酵母提取物、MCDB201、青霉素/链霉素购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖苷酶(酶活力300000U/g)、中性蛋白酶、过氧化氢酶购自上海麦克林生化科技股份有限公司；二甲基亚硝胺由上海凯茵化工有限公司提供。
如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
肿瘤组织来源：采用人类胆囊癌手术切除后的肿瘤组织作为样本，所有样本和临床信息均在知情同意的情况下获得，本研究是按照“赫尔辛基宣言”进行的。
消化的方法：
先将胆囊癌肿瘤组织用无菌生理盐水冲洗2-3次，切碎成小块，随后用Ⅳ型胶原蛋白消化15-30min，消化成单个肿瘤细胞或少许聚集细胞，使用含10％磷酸盐缓冲溶液的DMEM中止消化，消化后的悬液经100μm的细胞筛过滤，并将过滤液体以400xg离心5min，弃去上清液，获得实验样品以进行下述实验。
实施例1二甲基亚硝胺相关单因素实验
本申请中首次采用二甲基亚硝胺对胆囊癌单细胞样品进行处理，筛选获得适于培养的胆囊癌类器官培养的胆囊癌单细胞样品。
具体培养过程为：将肿瘤组织消化后，培养基中加入不同加入量的二甲基亚硝胺(二甲基亚硝胺水溶液，浓度为3.0μg/kg)对样品进行筛选培养，筛选培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养不同时间，转速为200-600xg离心，弃上清得到胆囊癌单细胞样品，使用培养基轻柔洗涤1-2次；取所述胆囊癌单细胞样品加入等比例的基质胶后，加入培养基进行培养，培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养5-10天，获得胆囊癌类器官。
培养基成分包括1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201，用DMEM/F12补齐至100％。
加入样品时，采用流式细胞仪对单细胞样品中胆囊癌单细胞进行计数，并统计每组同时培养100个样品时的胆囊癌类器官存活率，具体结果如表1所示。
胆囊癌细胞比率＝胆囊癌细胞个数/胆囊癌单细胞样品个数*100％
存活率＝胆囊癌类器官存活数/100*100％
表1
由表1可见，二甲基亚硝胺能够起到筛选胆囊癌单细胞样品的作用，经过筛选处理后的单细胞样品中胆囊癌细胞比率增加，并且该样品在进行胆囊癌类器官培养时，成功率相比未使用二甲基亚硝胺处理组更高。二甲基亚硝胺的优选加入量为1-5％，最佳处理时间范围为8-16h。
但在实际操作过程中，本申请发明人发现，采用二甲基亚硝胺处理后，尽管进行了洗涤操作，但洗涤无法进行过多次，洗涤过多会损伤部分细胞样品。至多进行两次洗涤，但两次洗涤也无法将二甲基亚硝胺残留完全去除，导致在培养过程中二甲基亚硝胺残留在一定程度上影响了胆囊癌类器官的稳定性。
实施例2酶相关单因素实验
在实施例1优选的基础上，本申请发明人推测采用酶物质能够降低二甲基亚硝胺残留造成的影响。因此，为进一步提高胆囊癌类器官的稳定性，本实施例中采用在培养基中加入不同种类的酶在不同条件下对上述优选条件下获得的胆囊癌单细胞样品进行培养处理，并计算其0天(以培养完成日起算)存活率和14天存活率，存活率计算方法同实施例1，具体培养结果如表2所示。
稳定性＝14天存活率/0天存活率*100％
表2
由表2数据可见，采用葡萄糖苷酶处理能够有效解决二甲基亚硝胺残留导致的类器官稳定性差的问题。葡萄糖苷酶的优选范围为1％-5％。
实施例3药物测试实验
试验例1
步骤一、将肿瘤组织消化后，加入筛选组合物进行筛选培养，筛选培养条件为CO2含量为5％，O2含量为1％，温度为37℃，培养12h，转速为400xg离心，弃上清得到胆囊癌单细胞样品，使用培养基轻柔洗涤2次；
步骤二、取所述胆囊癌单细胞样品加入基质胶1:1后，加入培养组合物进行培养，培养条件为CO2含量为5％，O2含量为1％，温度为37℃，培养7天，获得胆囊癌类器官。
筛选组合物：1％二甲基亚硝胺(二甲基亚硝胺水溶液，浓度为3.0μg/kg)、50％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201。
培养组合物：1％葡萄糖苷酶、50％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201。
培养基：51％DMEM/F12、1％胰岛素、5％转铁蛋白、5％人重组表皮生长因子、5％神经营养因子、3％胆囊上皮细胞生长因子、12％酵母提取物、2％青霉素/链霉素、16％MCDB201。
试验例2
本试验例与试验例1的区别仅在于，筛选培养时，以苯并[α]芘代替二甲基亚硝胺。
试验例3
本试验例与试验例1的区别仅在于，筛选培养时，CO2含量为8％。
试验例4
本试验例与试验例1的区别仅在于，筛选培养时，O2含量为3％。
试验例5
本试验例与试验例1的区别仅在于，不进行筛选培养。
试验例6
本试验例与试验例1的区别仅在于，步骤二中CO2含量为8％。
试验例7
本试验例与试验例1的区别仅在于，步骤二中O2含量为3％。
试验例8
本试验例与试验例1的区别仅在于，步骤二中培养11天。
试验例9
本试验例与试验例1的区别仅在于，步骤二中培养4天。
试验例10
本试验例与试验例1的区别仅在于，胆囊癌单细胞样品与基质胶的质量比为1:3。
药物测试实验
本实施例中对试验例1-10方法构建的胆囊癌类器官模型进行药物敏感性筛选，具体为针对吉西他滨和氟脲嘧啶及其组合进行，测试药物的半抑制浓度值IC50(μM)。
具体方法为：将所述胆囊癌类器官模型培养3天，然后给模型用药5天，药物组由3种方案组成，包括吉西他滨、氟脲嘧啶及吉西他滨和氟脲嘧啶(1:1)。每种药物的最高浓度为人体最大峰值血药浓度Cmax(吉西他滨152μM，氟脲嘧啶462μM)。连续1:3稀释，连续9次稀释。使用CellTiter-Glo 3D细胞活力测定法(Promega)测定类器官的活力，半抑制浓度值IC50由细胞活力对药物浓度的影响产生，具体IC50数值如表3所示。
表3
注：/表示最高浓度下细胞抑制率仍低于半抑制率。
综上所述，本申请提供的方法制备的胆囊癌类器官能够对多种药物都呈现出优异的敏感性，能够广泛应用于胆囊癌治疗和病理相关的研究中。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种胆囊癌类器官的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、将胆癌囊组织消化后，加入筛选组合物进行筛选培养，离心获得胆囊癌单细胞样品；
步骤二、将所述胆囊癌单细胞样品与基质胶混合，加入培养组合物进行培养，即得胆囊癌类器官；
所述筛选组合物包括二甲基亚硝胺。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二甲基亚硝胺为二甲基亚硝胺水溶液，所述二甲基亚硝胺水溶液中二甲基亚硝胺的浓度为1-4μg/kg；优选的，以质量百分比计，筛选组合物中所述二甲基亚硝胺水溶液的加入量为1％-5％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的筛选培养，培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养时间为8-16h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，还包括洗涤胆囊癌单细胞样品的步骤；优选的，所述洗涤次数为1-2次；优选的，采用培养基进行洗涤。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养组合物中包括葡萄糖苷酶；优选的，以质量百分比计，所述培养组合物中葡萄糖苷酶的含量为1％-5％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胆囊癌单细胞样品与基质胶的质量比为1：(1-2)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中培养，培养条件为CO2含量为4％-6％，O2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养5-10天。
8.一种用于制备胆囊癌类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括筛选组合物，所述筛选组合物包括二甲基亚硝胺；优选的，所述二甲基亚硝胺为二甲基亚硝胺水溶液，所述二甲基亚硝胺水溶液中二甲基亚硝胺的浓度为1-4μg/kg；更优选的，以质量百分比计，筛选组合物中所述二甲基亚硝胺水溶液的加入量为1％-5％；
更优选的，所述试剂盒中还包括培养组合物；更优选的，所述培养组合物包括葡萄糖苷酶；更优选的，以质量百分比计，所述培养组合物中葡萄糖苷酶的含量为1％-5％；
更优选的，所述筛选组合物和/或培养组合物还包括DMEM/F12、MCDB201、胰岛素、转铁蛋白、人重组表皮生长因子、神经营养因子、胆囊上皮细胞生长因子、酵母提取物、抗生素中的一种或多种；更优选的，以质量百分比计，所述筛选组合物和/或培养组合物中包括20％-60％DMEM/F12、1％-5％胰岛素、1％-5％转铁蛋白、1％-5％人重组表皮生长因子、1％-5％神经营养因子、1％-5％胆囊上皮细胞生长因子、10％-20％酵母提取物、1％-5％抗生素、10％-20％MCDB201。
9.一种如权利要求1-7任一所述方法制备的胆囊癌类器官。
10.如权利要求1-7任一所述方法制备的胆囊癌类器官或如权利要求8所述的试剂盒或如权利要求9所述的胆囊癌类器官在非疾病诊断治疗目的的胆囊癌致病机理研究和/或药物测试中的应用。
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