CN117106689A - 控制发酵过程的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于发酵至少一种微生物的发酵方法，其中所述发酵方法包括以下步骤：(a)使包含所述至少一种微生物的发酵液在所述发酵反应器中流动；(b)向所述发酵反应器供应碳‑底物，使该气态碳‑底物在所述发酵液中溶解或部分溶解；(c)向所述发酵反应器供应氮‑底物，使该气态氮‑底物在所述发酵液中溶解或部分溶解；和(d)保持发酵液的硝酸盐浓度低于0.035g/l，和/或保持发酵液的硝酸盐浓度低于0.01g硝酸盐/g生物质；其中该至少一种甲烷营养型生物包含至少一种甲烷营养型微生物。

Description

控制发酵过程的方法
本分案申请是基于申请号为202080043136.4，发明名称为“控制发酵过程的方法”的原始中国专利申请的分案申请。
本发明的技术领域
本发明涉及一种发酵方法和改善生物质生产的发酵反应器。具体而言，本发明涉及一种方法和用于发酵甲烷营养型微生物的发酵反应器并严格控制其中硝酸盐的浓度以优化所述发酵方法。
发明背景
在发酵过程中，氮源与碳源一起是微生物生长所必需的。氮源是微生物合成蛋白质、核酸和其他细胞组分所需要的。
根据微生物的酶能力，氮可以作为大量蛋白质来提供，例如豆粕；作为预消化的多肽，如蛋白胨或胰蛋白胨；或者作为氨或硝酸盐。氮源的选择可能是重要的，并且取决于所生产的产品，因为氮源的成本是重要的因素。
即使氮源是微生物生长的必需组分，本领域还已知甲烷营养型微生物对氮负荷高度敏感，这可能受到氮源的形式和氮源的量的影响。
现有技术推测，氨和亚硝酸盐的这种耐受性的差异可能是由于甲烷单加氧酶对例如氨的不同亲和力或亚硝酸盐的毒性作用造成的。
甲烷单加氧酶在甲烷营养型微生物中负责甲烷营养的作用，同时它们对可利用的氮源进行氧化，导致大量共同代谢的副产物。
当生长甲烷营养型微生物时，如荚膜甲基球菌(M.capsulatus)，如果甲烷不是大量过量，即使在低细胞外浓度下，氮源例如氨，容易被荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)的甲烷单加氧酶氧化。
为了从荚膜甲球菌发酵中获得具有成本竞争力的单细胞蛋白(SCP)产品，氨经常被用作发酵的氮源。氨在含水发酵液中的溶解度比可用作碳源的甲烷的溶解度大许多个数量级，使得氨氧化成为真正的问题，即使通过使用适当的反应器设计解决了气液传质的显而易见的直接的问题。
因此，改进的发酵方法和/或发酵反应器将是有利的，特别是，在调节氮源以提高甲烷营养型生物质的生产中，更有效和/或受控的发酵方法和/或发酵反应器将是有利的。
发明概述
因此，本发明的目的涉及改进的发酵方法，用于发酵甲烷营养型微生物，如荚膜甲基球菌。
具体而言，本发明的目的是提供更有效和/或受控的发酵方法和/或发酵反应器，其可通过调节氮源以改善甲烷营养型生物质的生产，以及发酵方法和/或发酵反应器，其通过控制发酵期间供应的氮源水平来解决现有技术的上述问题，从而为微生物例如甲烷营养型微生物的生长提供营养，但同时避免产生甲烷消耗的竞争性抑制剂的水平。
因此，本发明的一个方面涉及用于在发酵反应器中发酵包含至少一种微生物的发酵液的发酵方法，其中该发酵方法包括以下步骤：
a)向所述发酵反应器提供碳-底物，使该碳-底物在发酵液中溶解或部分溶解；
b)向所述发酵反应器提供氮-底物，使该氮-底物在发酵液中溶解或部分溶解；和
c)保持所述发酵液的硝酸盐浓度在0.035g/l以下，和/或保持所述发酵液的硝酸盐浓度在0.01g硝酸盐/g生物质以下；
其中，所述至少一种微生物包括至少一种甲烷营养型微生物。
本发明的另一方面涉及包括回路部分和顶部罐的发酵反应器，所述回路部分包括下流部分，其通过U形部分连接到上流部分，其中所述顶部罐包括：
(i)第一出口，其将顶部罐连接到回路部分的下流部分，并允许存在于顶部罐中的发酵液体从所述顶部罐流入回路部分；
(ii)第一入口，其将顶部罐连接到回路部分的上流部分，并允许存在于回路部分中的发酵液体从回路部分流入顶部罐；
(iii)排气管，其用于从顶部罐排出废气；以及
(iv)目视检查装置。
其中所述发酵反应器还包括：
(v)至少一个用于提供包含铵化合物的底物的入口；以及
(vi)至少一个用于确定发酵液中硝酸盐浓度的传感器；
附图说明
图1显示在中试设备中，生物质产量(实线)随时间降低，而硝酸盐产量(虚线)随时间增加，反之亦然。这一趋势已在实验室试验、中试设备和生产设备中发现。
下面将更详细地描述本发明。
发明详述
因此，本发明的发明人发现，由于提供给发酵过程的氮源既可以作为微生物生长的营养物，例如甲烷营养型微生物，又可以作为甲烷消耗的竞争性抑制剂，例如通过抑制甲烷单加氧酶，氮源的浓度应当被调节和/或控制，以优化甲烷营养型微生物的生物质生产，例如荚膜甲基球菌。
荚膜甲基球菌通过以下反应将氨(NH3)或铵(NH4 +)氧化为亚硝酸盐(NO2 -)，其中所涉及的必要酶是甲烷单加氧酶(MMO)，其能够氧化氨以及甲烷，和羟胺氧化还原酶(HAO)。该反应需要氧。
不受理论束缚，本发明的发明人相信，在自养硝化的第一步骤(K1)中，由甲烷营养型微生物如荚膜甲基球菌产生的亚硝酸盐，通过亚硝酸盐氧化还原酶(NXR)按照以下反应氧化成硝酸盐：
上述反应(K1和K2)和可逆反应的速率在组合上被认为是使用甲烷营养型微生物(例如荚膜甲基球菌)基本上直接由具有非常少的痕量亚硝酸盐的氨形成硝酸盐。
从实验中，本发明的发明人惊奇地发现，应当控制和调节向甲烷营养型微生物(例如荚膜甲基球菌)的发酵中添加氮源(例如氨)，以保持硝酸盐浓度低于一定水平，从而避免生物质成长的减少和/或提供生物质的高成长。
在文本的上下文中，术语“生物质的高成长”涉及高于1g/L的生物质浓度，诸如高于5g/l；例如高于10g/l；诸如高于15g/l；例如高于20g/l；诸如高于25g/l；例如高于30g/l；诸如高于50g/l；例如高于70g/l；诸如在1-100g/l范围内；例如在5-90g/l范围内；诸如在10-80g/l范围内；例如在20-70g/l范围内；诸如在30-65g/l范围内；例如在40-60g/l范围内；诸如在45-55g/l的范围内。
因此，在培养过程中，通过甲烷营养型微生物利如荚膜甲基球菌形成的硝酸盐，例如使用氨作为氮源，可以作为发酵应激的可靠指标，并因此可通过调节硝酸盐浓度的操作来控制发酵过程，例如通过减少发酵反应器中的氮源流量，甚至停止流量至零L/min。
发明人发现，无论以分批、补料分批或连续模式运行发酵过程，这种控制或调节发酵过程的方式对于确保甲烷营养型生物质(例如荚膜甲基球菌)生物质的高生产率可能是至关重要的。
控制和/或调节的效果和重要性已在以下实验室试验、中试规模试验以及生产/工业试验中得到证明。
因此，本发明的发明人惊讶地发现了一种发酵方法和发酵反应器，其可以控制和/或调节氮源以改善甲烷营养型生物质的生产。
在本发明的一个优选实施例中，涉及用于在发酵反应器中发酵包含至少一种微生物的发酵液的发酵方法，其中所述发酵方法包括以下步骤：
d)向所述发酵反应器供应碳-底物，使该气态碳-底物在所述发酵液中溶解或部分溶解；
e)向所述发酵反应器供应氮-底物，使该氮-底物在所述发酵液中溶解或部分溶解；和
f)保持发酵液的硝酸盐浓度低于0.035g/l，和/或保持发酵液的硝酸盐浓度低于0.01g硝酸盐/g生物质；
其中所述至少一种微生物包含至少一种甲烷营养型微生物。
在发酵过程中所述发酵液的硝酸盐浓度可保持在低于0.035g/l；诸如低于0.033g/l；例如低于0.03g/l；诸如低于0.028g/l；例如低于0.025g/l；诸如低于0.022g/l；例如低于0.02g/l；诸如低于0.018g/l；例如低于0.015g/l；诸如低于0.01g/l；例如低于0.005g/l；诸如低于0.01g/l；例如为0g/l。
在本发明的一个实施方案中，在发酵期间，所述发酵液的硝酸盐浓度在0-0.035g/l的范围内；例如在0.001-0.033g/l的范围内；诸如在0.002-0.03g/l的范围内；例如在0.003-0.025g/l的范围内；诸如在0.004-0.02g/l的范围内；例如在0.005-0.015g/l的范围内；诸如在0.007-0.01g/l的范围内。
所述氮源可以是气态的氮-底物或含水的氮-底物。
优选地，所述氮源可选自氨；铵化合物；和/或分子氮。更优选地，所述氮源是氨。
所述铵化合物可选自碳酸铵；氯化铵；硫酸铵；氢氧化铵；和/或硝酸铵。优选地，所述铵化合物是氢氧化铵。
在本发明的一个实施例中，向发酵液供应的氮源的浓度可以低于0.1g/l；例如低于0.09g/l；诸如低于0.08g/l；例如低于0.07g/l；诸如低于0.06g/l；例如低于0.05g/l；诸如0.04g/l；例如低于0.03g/l；诸如低于0.02g/l；例如低于0.01g/l；诸如0.005g/l；例如低于0.001g/l。
在本发明的另一个实施例中，向发酵液供应的氮源的浓度可以在0.001-0.1g/l范围内；诸如在0.005-0.09g/l范围内；例如在0.01-0.08g/l范围内；诸如在0.02-0.075g/l范围内；例如在0.04-0.07g/l范围内；诸如在0.05-0.06g/l的范围内。
在本发明的又一实施例中，向发酵反应器中提供的氮源可以不是硝酸盐。
发酵液中的硝酸盐浓度可取决于生物质浓度。因此，在本发明的一个优选实施例中，发酵液中的硝酸盐浓度可保持在0.01g硝酸盐/g生物质以下；诸如0.008g硝酸盐/g生物质以下；例如0.006g硝酸盐/g生物质以下；诸如0.004g硝酸盐/g生物质以下；例如0.002g硝酸盐/g生物质以下；诸如低于0.001克硝酸盐/克生物质以下；例如0.0005g硝酸盐/g生物质以下；诸如0克硝酸盐/克生物质。硝酸盐浓度的计算基于包含活的甲烷营养型微生物的发酵液。
所述碳底物可优选为气态碳底物。
优选地，所述碳底物可以选自烷烃，优选地，烷烃是C1化合物。甚至更优选地，所述碳底物可以是甲烷、甲醇、天然气、沼气、合成气或其任何组合。甚至更优选地，所述碳底物可以是甲烷。
如上所述，所述碳源和/或氮源(以及添加到发酵液中的其他成分)可以作为气体添加，这需要将这些气体溶解到发酵液中，所述发酵液可以是含水发酵液，可用于微生物，和用于生物质的成长。
总体而言，底物(如碳源和氧源)的传质在行业中是一个挑战，在改善这种传质方面存在着持续的兴趣和努力。WO 2010/069313和/或WO 2003/016460中描述了改善U形回路发酵罐中发酵的方式，其通过引用并入本文。
因此，本发明术语“在发酵液中溶解或部分溶解的”涉及本领域已知的将气态底物从气相转化为水相的挑战，其可用于至少一种微生物。
在本发明的优选实施例中，确定的硝酸盐浓度可以是溶解的硝酸盐浓度。
在本发明的另一实施例中，发酵液的硝酸盐浓度可通过联机分析(an in-l ineanalys is)；通过在线分析(an on-l ine analys is)；或者通过离线(an off-l ine)或旁线分析(at-l ine analys is)确定。优选地，发酵液的硝酸盐浓度可通过联机分析或在线分析来确定。
在本发明的又一个实施例中，发酵液的硝酸盐浓度可通过联机分析或通过在线分析来确定。
在本发明的上下文中，术语“联机分析”涉及可以放置在过程容器或流动材料流中用以进行分析一种或多种所选组分的传感器。
在本发明的上下文中，术语“在线分析”涉及可连接到过程并进行自动取样的传感器。在线分析仪也可称为联机分析仪。
在线分析仪和联机分析允许连续过程控制。
在本发明的上下文中，术语“离线分析”或“旁线分析”可以互换使用，并且涉及一种传感器，其特征在于手动取样，然后进行不连续的样品制备、测量和评估。在采样和利用结果之间的时间内材料特性可能发生改变，因此直接的过程控制可能是不可能的。
在本发明的一个实施例中，可向发酵反应器供应氧底物。优选地，可允许所述氧底物在发酵液中溶解或部分溶解。
在本发明的另一实施例中，可向发酵反应器供应一种或多种营养物；一个或多个pH调节成分和/或水。所述一种或多种营养物；一个或多个pH调节成分和/或水可优选地在发酵液中溶解或部分溶解。
所述发酵可以是分批发酵、补料分批发酵或连续发酵。优选地，所述发酵过程可以是连续发酵过程。
甲烷营养型生物可以优选地是甲烷营养型细菌，例如荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(可与M.capsulatus互换使用)。
所述甲烷营养型细菌可与一种或多种异养细菌共同发酵来提供。
以下异养细菌可特别地用于与荚膜甲基球菌共同发酵；雷尔氏菌属(Ralstoniasp.)；短芽孢杆菌(Bacillus brevi)；土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)；食酸产碱菌(Alcaligenes acidovorans)；Aneurinibacillus danicus和坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)。合适的酵母菌可以选自酵母属(Saccharomyces)和/或念珠菌属(Candida)的种类。
优选的异养细菌选自食酸产碱菌(NCIMB 13287)、Aneurinibacillus danicus(NCIMB 13288)和坚强芽孢杆菌(NCIMB 13289)及其组合。
在本发明的一个实施方案中，甲烷营养型生物可以是基因修饰的甲烷营养型生物和/或异养生物可以是基因修饰的异养生物。
根据本发明的发酵反应器和/或发酵方法可与通过连续培养发酵方法的单细胞蛋白(SCP)生产存在特殊的相关性，例如通过荚膜甲基球菌。
优选的甲烷营养型细菌是甲基球菌科的种类，尤其是荚膜甲基球菌，其利用甲烷或甲醇作为碳源，利用氨、硝酸盐或分子氮作为氮源，进行蛋白质合成。
本发明的优选实施例涉及包括回路部分和顶部罐的发酵反应器，所述回路部分包括下流部分，其通过U形部分连接到上流部分，其中所述顶部罐包括：
(i)第一出口，其将顶部罐连接到回路部分的下流部分，并允许存在于顶部罐中的发酵液体从所述顶部罐流入回路部分；
(ii)第一入口，其将顶部罐连接到回路部分的上流部分，并允许存在于回路部分中的发酵液体从回路部分流入顶部罐；
(iii)排气管，其用于从顶部罐排出废气；以及
(iv)目视检查装置。
其中所述发酵反应器还包括：
(v)至少一个用于提供包含铵化合物的底物的入口；以及
(vi)至少一个用于确定发酵液中硝酸盐浓度的传感器；
所述发酵反应器可优选地包括至少一个被配置和/或被控制以自动调节发酵液中硝酸盐浓度的供给泵。
在本文的上下文中，术语“调节硝酸盐浓度”涉及降低发酵液中硝酸盐浓度或增加发酵液中硝酸盐浓度的行动。优选地，术语“调节硝酸盐浓度”涉及降低硝酸盐浓度的行动。
在本发明的一个实施例中，发酵液中的硝酸盐浓度可通过调节进入发酵罐的氮源流量；调节进入发酵罐的碳源流量；调节氧气流量；调节营养物的流量；或其组合来调节。
回路反应器的U形部分可以将下流部分的下部连接到上流部分的下部。此外，上流部分的上部可以连接到将顶部罐连接到上流部分的上部的第一入口。第一出口可以将顶部罐连接到下流部分的上部。
在本文中，术语“发酵反应器”涉及包括连接到下流部分和上流部分的上端的顶部罐的反应器。所述下流部分和所述上流部分在下端通过U形部分连接。
在本文的上下文中，术语“环管反应器”涉及发酵反应器的具体实例。
本发明的回路部分涉及下流部分、上流部分以及由U形部分形成的上流部分和下流部分下端的连接部分。因此，所述“回路部分”涉及没有顶部罐的发酵反应器。
在本文的上下文中，术语“U形部分”涉及设置在发酵反应器底部或连接上流部分和下流部分的下端的环形反应器底部的弯管。优选地，所述上流部分和所述下流部分垂直或基本垂直。
在本文的上下文中，术语“顶部罐”涉及位于发酵反应器顶部并负责从发酵液中去除废气的容器。优选地，在操作/发酵期间，顶部罐仅部分地填充发酵液。在本发明的一个实施例中，术语“部分地填充发酵液”涉及发酵液与气体之间90:10的比例；诸如80:20的比例；例如70:30的比例；诸如60:40的比例；例如50:50；诸如40:60的比例；例如30:70的比例；诸如20:80的比例；例如10:90的比例。
在本发明的上下文中，“目视检查装置”涉及一个或多个装置，其允许技术人员获得关于顶部罐中发泡特性的直接信息。
在本发明的一个实施例中，所述直接信息可以是关于顶部罐中发泡特性的实时信息。
在本发明的另一个实施例中，顶部罐中的发泡特性可能涉及顶部罐中提供的泡沫密度、泡沫高度和湍流水平。
当发酵液体被迫从上流部分通过第一入口进入顶部罐时，在顶部罐中存在的发酵液体可能提供顶部罐中的湍流。
发泡密度可以表示泡沫中气泡的尺寸。泡沫中的气泡越大，发泡密度越小，kg泡沫/m3越小。泡沫中的气泡越小，发泡密度越大，kg泡沫/m3越大。
在本发明的一个实施例中，所述目视检查装置可以如此安置，使之具有水平或基本水平的检查视图。
在本发明的另一个实施例中，可将目视检查装置安置在顶部罐的侧面，以获得发酵液表面上方和发酵液表面下方的组合视图。
优选地，所述目视检查装置可安置在顶部罐的末端。
更优选地，所述目视检查装置可安置在顶部罐的末端，从而提供从第一入口(或上流部分)到第一出口(或下流部分)的视图。
在本发明的一个实施例中，所述目视检查装置可以是检查孔、照相机或检查孔与照相机的组合。
优选地，所述检查孔可以是视镜。
所述照相机可以是内联照相机(inl ine camera)。
在本发明的一个实施例中，所述顶部罐可以设置有光源，以改善顶部罐内部的目视检查。光源可以提供为允许周围光线进入顶部罐的窗口和/或提供为并入顶部槽中的人造光源。
在本发明的另一实施例中，光源可以作为视镜中的单独特征(例如单独的人造光源)或作为集成特征(例如集成的人造光源)来提供。
除了视觉检查装置之外，顶部罐还可以在顶部罐内设置至少一个泡沫传感器。
为了避免形成过多的泡沫，可以将消泡剂添加到发酵液中。因此，顶部罐可以设置有消泡入口。
在本发明的一个实施例中，发酵反应器，优选是回路部分，包括用于测定发酵液中一种或多种离子种类的含量的离子传感器或分析仪，优选地，所述一种或多种离子种类选自磷酸盐、钙、氢、硝酸盐、亚硝酸盐和/或铵，优选硝酸盐和/或亚硝酸盐。
在本发明的另一个实施例中，回路反应器可以设置有循环泵。
优选地，循环泵可安置于下流部分的上半部分。
在本发明的一个实施例中，发酵反应器可包括流量减少装置。优选地，流量减少装置可安插在第一入口的上游和上流部分的上半部分。
在本发明的另一实施例中，发酵反应器的回路部分可优选地包括一个或多个进气口；一个或多个进水口；和/或一个或多个发酵培养基入口。
所述一个或多个进气口；所述一个或多个进水口；和/或所述一个或多个发酵培养基入口可以由计算机控制。优选地，所述一个或多个进气口；所述一个或多个进水口；和/或所述一个或多个发酵培养基入口可以由计算机基于从一个或多个传感器或分析仪获得的数据来控制。
为了提供改善的发酵条件，气态底物如甲烷在发酵液体中的分布可能是重要的。因此，发酵反应器的回路部分可包括一个或多个用于在发酵液中分配气体的有源装置。
在本发明的一个实施方案中，所述一个或多个用于在发酵液中分配气体的有源装置是用于将气体引入和/或分配到发酵液中的微米或纳米喷射器，和/或安置在反应器的回路部分的动态运动装置，例如动态混合器。
除了动态混合器之外，或作为动态混合器的替代，回路部分可以包括一个或多个非活动混合构件。在本发明的实施例中，所述一个或多个非活动混合构件可以是静态混合器。
除了在顶部储罐中进行适当脱气的重要性外，以节能的方式改善气态底物向液相传质也是重要的，其中气体可用于生物催化剂(例如甲烷营养型生物)。
此外，如前所述，通过改进废气从液相转移到气相(用以从发酵罐去除)来提高废气去除效率也是重要的，优选地在顶部罐中完成。
优选地，可通过在增加的压力下操作回路部分的U形部分来提供这种改进的废气去除效率。
这种与改进的顶部罐气体去除联合的改进的传质可以通过根据本发明的发酵反应器、回路反应器实现，所述反应器包括具有基本垂直的下流部分、基本垂直的上流部分和具有基本水平的连接部分的U形部分的回路部分，所述U形部分用于连接下流部分的下端和上流部分的下端，可以设置在所述回路部分上方并且连接所述下流部分的上端和所述上流部分的上端的顶部罐。
在本发明的一个实施例中，顶部罐的直径可以基本上大于回路部分、下流部分，和/或上流部分的直径。
在本发明的一个实施例中，发酵罐的U形部分可包括一个出口，优选地设置在发酵反应器的顶部罐中或回路部分的U形部分中，用于提取发酵液。
所述发酵反应器可包括一个或多个气体注入点，根据愿望和需求，其位于下流部分、U形部分和/或上流部分。优选地，所述一个或多个气体注入点位于下流部分中。
直接在所述一个或多个气体注入点之后，至少一个有源混合部件和/或至少一个无源混合部件用于分散引入气体到发酵液中。
通过增加U形环路、环路反应器中的压力，可以改善从气相到液相传质的增加。因此，可将第一压力控制装置插入发酵罐的U形部分中，用于相对于发酵罐的第二区域中的压力而言，增加发酵罐中U形部分的至少第一区域中的压力。
在本发明的一个优选实施例中，第一压力控制装置可安插在下流部分的上端，第二压力控制装置可安插在发酵罐的U形部分且当从发酵液的流动方向看时在第一压力控制装置的下游。
所述第一压力控制装置可以是阀(例如市售的阀门类型)、泵(例如螺旋桨泵、凸轮泵或涡轮泵)，或者可以通过注入加压空气或另一种气体例如惰性气体来增加压力。所述第一压力控制装置优选是螺旋桨泵，其也在发酵罐中产生液体循环。
第二和可选的第三压力控制装置可安置在下流部分、上流部分或U形部分中，但优选的是，第二压力控制装置位于上流部分的上半部分。第三可选的压力控制装置优选地被安置于上流部分的上半部分且当从发酵液的流动方向看时在第一压力控制装置的上游。第二和/或第三压力控制装置选自下组装置之中，其包括阀门(例如市售的阀门类型)、静态混合器、旋液分离器、泵(例如螺旋桨泵、叶轮泵或涡轮泵)、压力控制阀、具有孔、喷嘴或喷射口的板或安置在其中的变窄的发酵罐部分的直径或横截面。
在本发明的一个实施例中，可在根据本发明的发酵反应器的U形部分中提供改进的气体底物的传质。
在本发明的另一实施例中，可在根据本发明的发酵反应器的顶部罐中提供废气的去除。
在本发明的一个实施方案中，提供了允许冲洗顶部空间以改善废气去除并降低在发酵物的顶部空间中形成爆炸性气体混合物的风险的装置。
这种冲洗可以通过将气体冲洗装置安置在顶部罐中来实现，如用于在顶部空间添加和/或移除气体的装置。气体冲洗装置可以优选地安置在液面上方，用于产生与发酵罐顶部中的液体流并流、并流或交叉流的冲洗气体的气流。气体添加装置也可置于顶部中的液面下方。替代地或另外地，可通过施加抽吸或真空来降低顶部空间中的压力，从而降低顶部空间中的压力，和/或通过在顶部安装流量调节装置来增加废气去除。本发明还允许用于增加压力的能量被回收再利用。这可以通过将第二和可选的第三压力控制装置连接到制动器或发电机以利用螺旋桨泵降低压力来实现。如果发电机连接至第二和/或第三压力控制装置，可收集应用于该系统的部分能量，从而降低该系统的总能耗。
在本发明的上下文中，术语“冲洗”用于在顶部罐中进行的用于从顶部罐的顶部空间和/或从顶部罐中的发酵液体中除去或辅助除去废气的过程。
根据本发明提供的顶部罐可以设计成容纳发酵罐总体积的1％至99％，但优选地为发酵罐总体积的10％至60％，甚至更优选地为发酵罐总体积的40-50％。在本发明的一个实施例中，顶部罐的体积可以小于U形部分的体积。
所述顶部罐可设置有液体或气体流量调节装置，以协助发酵反应器中的混合或协助从发酵液中释放气泡。气体或液体流量调节装置可以是动态混合器、挡板或静态混合器。
发酵罐的尺寸，即直径和高度，可能根据发酵罐总容积的需要而变化。
在本发明的一个实施例中，根据本发明的发酵反应器可设置有驱动气体的入口，其可引入驱动气体以将液相中的二氧化碳驱动至可分离的废气相。驱动气体的入口可优选地置于顶部罐的上游和/或第一入口的上游。
所述驱动气体，即用于从溶解相置换二氧化碳的气体(通常为氮气，但可选另一种惰性不易燃气体)，可以例如在从基本上垂直的上流区的开端到废气去除区入口的一个或多个点处引入，然而，特别优选地，将在上流区的垂直部分的上部(例如，上部20％，更优选上部10％)和流出区的最平坦(即，最水平)部分的开端之间的一个或多个点处引入。
在本发明的上下文中，术语“驱动气体”用于在回路部分中进行的过程，优选在上流部分的上端中，并且有助于将废气从发酵液中去除到气相中。
在本发明的一个实施例中，发酵反应器包括在顶部罐中用于将冲洗气体引入顶部罐中的入口和在回路部分的上流部分的上端用于引入驱动气体以将废气从发酵液移动到气相中的入口。
本发明的一个优点可以是提供改善添加到发酵反应器中的气态物质的利用。
根据本发明的发酵反应器和/或发酵方法的生产率可以进一步优化，因为循环发酵液体在发酵罐中的循环期间经历交变压力，并且在压力增加的区域中具有增加的底物气体到液相中的传质和溶解度。生产率还可以通过释放气体例如来自循环发酵液的废气来改善，在压力降低的区域，该释放增加。
在本发明的一个实施例中，在发酵反应器的回路部分、第一区域和/或在第一压力控制装置和第二压力控制装置之间增加的压力可以通过施加高于大气压力0.5巴的压力来提供；诸如高于大气压力1巴以上的压力；例如高于大气压力1.5巴的压力；诸如高于大气压力2巴以上的压力；例如高于大气压力2.5巴的压力；诸如高于大气压力3巴以上的压力；例如高于大气压力3.5巴的压力；诸如高于大气压力4巴以上的压力；例如高于大气压力4.5巴的压力；诸如高于大气压力5巴以上的压力；例如高于大气压力5.5巴以上的压力；诸如高于大气压力6巴以上的压力；例如高于大气压力7巴以上的压力。
在本发明的另一个实施例中，在发酵反应器的回路部分、第一区域和/或在第一压力控制装置和第二压力控制装置之间增加的压力可以通过施加高于大气压力0.5-10巴范围内的压力来提供；诸如高于大气压力1-9巴范围内的压力；例如高于大气压力1.5-8巴的压力；诸如高于大气压力2-7巴的压力；例如高于大气压力3-6巴的压力；诸如高于大气压力4-5巴的压力。
在本发明的另一个实施例中，顶部罐中的压力可高于大气压力少于0.5巴；诸如高于大气压力0.25巴；例如高于大气压力0.1巴；诸如约为大气压；例如低于大气压力不到0.75巴；诸如低于大气压力0.5巴；例如低于大气压力0.25巴；诸如低于大气压力0.1巴。
回路反应器的适当修改和关于如何运行这种回路反应器的特性以及所得生物质的加工的进一步细节可以如WO 2010/069313；WO 2000/70014；WO 2003/016460；WO 2018/158319；WO 2018/158322；WO 2018/115042和WO 2017/080987所述，其全部通过引用并入。
适合于获得的生物质以提供各种级分的下游加工的实例可以如WO 2018/115042中所述。
所述传感器可包括生物传感器、电化学传感器，例如基于FIA(flow injectionanalysis流动注射分析)和光学测量的离子敏感电极或传感器，例如分光光度装置。近红外(NIR)探针也可用于测量发酵罐中的发酵液中或细胞中的一些不同成分，例如细胞、氨基酸、甲醇、乙醇和/或不同离子的浓度。发酵反应器还可配备质谱(MS)传感器或电子鼻，用于测定顶部空间中气体和挥发性成分(例如CO2和/或CH4)的浓度。MS传感器或电子鼻可控制施加在发酵罐中的压力和/或添加气体成分，例如甲烷和/或空气/氧气和/或添加气态氨或溶液中的氨/铵。高速照相机可以安装在发酵反应器的U形部分中，优选地与气体注入连接，用于确定培养液中气体的气泡尺寸。气泡尺寸可通过对来自高速照相机的数据进行图像处理来确定。
根据本发明的发酵反应器通常可以如此连续操作模式运行，在清洁和灭菌程序之后，随后是开始阶段，其中将水、必需的营养盐和微生物添加到发酵反应器中。发酵液主要通过第一压力控制装置在发酵反应器中循环。然后可以开始添加气体底物，并开始发酵。当微生物密度达到约0.5-10％的浓度时，最好是1-5％(按干重计)，可从发酵反应器中连续提取发酵液，例如从顶部罐或U形部分中提取，并进行下游处理，例如如WO 2018/115042中所述。
取决于发酵中使用的微生物，可以在以一定的稀释速率添加补充水、含水底物和/或再循环上清液的同时开始提取发酵液。在液体溶液中添加底物组分，添加水，作为提取培养液和底物气体的补充的上清液的再循环，可由接收来自气体传感器和适当计算的数据的计算机来控制，用于提供每个组分的必要量，以获得生物体的最佳生长。
在本发明的实施例中，发酵过程和发酵反应器可以是实验室规模、中试设备和/或生产设备或工业设备。优选地，发酵过程和发酵反应器可以是生产设备或工业设备。
应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。
本发明引用的所有专利和非专利的参考文献通过引用其整体并入本文。
现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1
本实施例证明了发酵液中硝酸盐浓度与生物质成长之间的相关性。
在1LB-Plus生物反应器(Sartorius，DK)中培养荚膜甲基球菌期间测定硝酸盐形成，其中温度保持在42℃，以10RPS-1(每秒转数)搅拌，pH为6.7±0.05，通过内部控制回路来调节冷却夹套水流，马达频率和2M H2SO4或2M NaOH的剂量。使用Visiferm DOECS 120H2光学DO电极(Hamilton，USA)监测溶解的氧(DO)。/>
向生物反应器连续喷洒96.81g·h-1的无菌空气和4.95g·h-1的无菌甲烷(Instrument Methane 3.5，AGA，DK)。
在2NMS培养基(硝酸盐矿物盐培养基)中以分批阶段开始培养荚膜甲基球菌，硝酸盐耗尽后，在AMS培养基(铵盐-矿物盐培养基)上以稳定状态(连续阶段发酵)继续进行。连续培养期间的饲料流速为48.95·10-3Lh-1。在开始任何诱导共代谢的尝试之前，将培养物置于稳定状态。
在固定条件下，在1L发酵罐中进行不同的稳态氨脉冲实验，测定脉冲效应前后的生物量以及硝酸盐浓度。
结果
下表1和表2显示，作为脉冲注入的结果，随着氨浓度的增加，硝酸盐的形成增加。相同的实验持续24小时，在较高浓度的氨脉冲下，生物质突然减少，当硝酸盐仍在反应器内时，生物质几乎接近洗净阶段。
表1和表2：在稳定状态下，在1L反应器中加入不同的氨浓度，并在氨注入前和两个不同时间点(脉冲后2小时(表1)和脉冲后24小时(表2))测量氨、硝酸盐和生物质浓度。
发酵液中高浓度氮源的调节可以通过调节基质流速来解决，以控制过程，从而不形成硝酸盐，同样也不积累亚硝酸盐和/或硝酸盐。在这些调节条件下，荚膜甲基球菌可能会消耗任何过量的硝酸盐，并且发酵液中的氮浓度可能会降低。
如图1所示，在中试设备中也观察到了相同的趋势(过量硝酸盐生产导致生物质减少)。图1显示，随着中试设备中硝酸盐产量的增加，生物质产量正在下降，反之亦然。如表1和表2所述，在生产设备和实验室中也看到了类似的趋势。
参考文献
WO 2010/069313
WO 2000/70014
WO 2003/016460
WO 2018/158319
WO 2018/158322
WO 2018/115042
WO 2017/080987
WO 2018/115042

Claims (13)

1.用于在发酵反应器中发酵包含至少一种微生物的发酵液的发酵方法，其中该发酵方法包括以下步骤：
a)向所述发酵反应器提供碳-底物，使该碳-底物在发酵液中溶解或部分溶解；
b)向所述发酵反应器提供氨，使氨在发酵液中溶解或部分溶解；和
c)保持所述发酵液的硝酸盐浓度在0.035g/l以下，和/或保持所述发酵液的硝酸盐浓度在0.01g硝酸盐/g生物质以下；
其中，所述至少一种微生物包括至少一种甲烷营养型微生物，所述方法包括调节和/或控制氨浓度以优化生物质的生产。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其中在发酵期间，所述发酵液的硝酸盐浓度在0-0.035g/l的范围内；例如在0.001-0.033g/l的范围内；诸如在0.002-0.03g/l的范围内；例如在0.003-0.025g/l的范围内；诸如在0.004-0.02g/l的范围内；例如在0.005-0.015g/l的范围内；诸如在0.007-0.01g/l的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其中所述发酵是分批发酵、补料分批发酵或连续发酵。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其中所述发酵方法是连续发酵方法。
5.包括回路部分和顶部罐的发酵反应器，所述回路部分包括下流部分，其通过U形部分连接到上流部分，其中所述顶部罐包括：
(i)第一出口，其将顶部罐连接到回路部分的下流部分，并允许存在于顶部罐中的发酵液体从所述顶部罐流入回路部分；
(ii)第一入口，其将顶部罐连接到回路部分的上流部分，并允许存在于回路部分中的发酵液体从回路部分流入顶部罐；
(iii)排气管，其用于从顶部罐排出废气；以及
(iv)目视检查装置；
其中所述发酵反应器还包括：
(v)至少一个用于提供包含氨、铵化合物和/或分子氮的氮源的入口；以及
(vi)用于确定发酵液中硝酸盐浓度的至少一个传感器或分析仪；
其中所述至少一个传感器或分析仪包括用于测定发酵液中一种或多种离子种类的含量的离子传感器或分析仪，其中所述一种或多种离子种类选自磷酸根、钙、氢、硝酸根、亚硝酸根和/或铵。
6.根据权利要求5所述的发酵反应器，其中所述发酵反应器包括至少一个被配置和/或被控制以自动调节发酵液中硝酸盐浓度的供给泵。
7.根据权利要求5-6中任一项所述的发酵反应器，其中所述发酵反应器用于甲烷营养型生物的发酵。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的发酵反应器，其中所述发酵反应器的回路部分包括一个或多个进气口；一个或多个进水口；和/或一个或多个发酵培养基入口。
9.根据权利要求8所述的发酵反应器，其中所述一个或多个进气口；所述一个或多个进水口；和/或所述一个或多个发酵培养基入口由计算机基于从所述至少一个传感器或分析仪获得的数据进行控制。
10.根据权利要求5所述的发酵反应器，其中所述目视检查装置选自检查孔、照相机或检查孔与照相机的组合。
11.根据权利要求5所述的发酵反应器，其中所述发酵反应器包括流量减少装置。
12.根据权利要求5所述的发酵反应器，其中所述发酵反应器还包括第一压力控制装置和第二压力控制装置，以及任选地包括第三压力控制装置。
13.根据权利要求12所述的发酵反应器，其中所述第一压力控制装置选自阀、泵如螺旋桨泵、凸轮泵、涡轮泵或喷嘴或喷射口，并且其中所述第二和/或任选地第三压力控制装置选自阀，静态混合器，旋液分离器，泵(例如螺旋桨泵、叶轮泵或涡轮泵)，压力控制阀，具有孔、喷嘴或喷射口的板，或放置它的发酵反应器部分的直径或横截面的变窄。
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