CN117106567A - 液滴式多重pcr实时检测芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种液滴式多重PCR实时检测芯片，包括：试剂进样区(1)，包括水相试剂入口(11)、油相试剂入口(13)和至少一个检测试剂入口(12)；液滴生成区(2)，包括至少一个流动聚焦型通道结构(21)，用于将试剂进样区(1)中的水相试剂、油相试剂生成油包水液滴；液滴储存区(3)，包括至少一个空腔结构(31)，每个流动聚焦型通道结构(21)中的油包水液滴分别进入对应的空腔结构(31)中；油相出口区(4)，包括多个出口(41)，出口(41)设置有滤膜(42)，用于去除多余的油相。本公开还提供一种液滴式多重PCR实时检测芯片的检测方法。本公开的检测芯片及方法可以实现单通道实时荧光并行检测一个样本中的多个靶标，应用范围广泛。
Description
技术领域
本公开涉及液滴微流控芯片技术领域，具体涉及一种液滴式多重PCR实时检测芯片及方法。
背景技术
基于液滴的微流控技术以其微型化、通量高、样本需求小、试剂消耗少、操作简单、检测灵敏度高等优点广泛应用于疾病诊断、药物筛选、环境检测等方面。在平方厘米尺寸的芯片上制作微结构操控液滴生成、融合、分裂、捕获、分选、富集，进行蛋白结晶，DNA分析，酶动力学检测等生物学研究。
当前，对于液滴的检测和分析方式，大多都停留在终点检测。以商用的数字化PCR仪为例，稀释DNA并将其与PCR反应试剂混合，用液滴生成芯片产生大量油包水液滴，使每个液滴中至多包裹一个DNA分子。收集的液滴在PCR仪中进行热循环后再转移到液滴荧光读取设备上进行荧光检测，设定阈值，通过判断液滴的荧光信号，来进行核酸定量、基因变异等研究。此外，在检测过程中，通常由于样本的珍贵性和时间的紧迫性，往往需要对多靶标进行检测。当前数字PCR对于同一个样本的多重检测需要设计多重探针，不同探针带有不同的荧光基团，这不仅需要优化引物探针的使用浓度，这要求设备能够进行多通道荧光检测，大大提高了成本。不仅如此，液滴在转移和PCR热循环过程中不可避免的会破裂、融合，从而影响结果的准确性。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对上述问题，本公开提供了一种液滴式多重PCR实时检测芯片及方法，用于至少部分解决传统对多靶标进行检测方法复杂、结果准确性低等技术问题。
(二)技术方案
本公开一方面提供了一种液滴式多重PCR实时检测芯片，包括：试剂进样区，包括水相试剂入口、油相试剂入口和至少一个检测试剂入口；液滴生成区，包括至少一个流动聚焦型通道结构，用于将试剂进样区中的水相试剂、油相试剂生成油包水液滴；液滴储存区，包括至少一个空腔结构，每个流动聚焦型通道结构中的油包水液滴分别进入对应的空腔结构中，通过固化油相固定液滴位置；油相出口区，包括多个出口，出口设置有滤膜，用于去除多余的油相。
进一步地，水相试剂入口、油相试剂入口和至少一个检测试剂入口中均设有过滤结构，过滤结构为微柱阵列结构，用于拦截杂质。
进一步地，流动聚焦型通道结构为K型通道结构，水相试剂入口和检测试剂入口的通道分别与K型通道结构一侧的通道连接，油相试剂入口的通道分别与K型通道结构上下两端的通道连接；或流动聚焦型通道结构为T型通道结构，水相试剂入口与检测试剂入口的通道汇聚后与T型通道结构下侧的通道连接，油相试剂入口的通道分别与T型通道结构左右两端的通道连接。
进一步地，每个检测试剂入口和/或油相试剂入口与流动聚焦型通道结构之间包括回型流阻区。
进一步地，空腔结构的高度油包水液滴尺寸的两倍，用于储存单层液滴。
进一步地，流动聚焦型通道结构的宽度范围为20～100μm、高度为范围为20～100μm；空腔结构的高度范围为20～200μm。
进一步地，至少一个检测试剂入口中的PCR反应试剂不同，PCR反应试剂包含不同的引物和探针，不同探针的荧光基团相同。
进一步地，滤膜的材料包括疏水性聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯中的一种或多种；油相试剂入口中的油相包括含表面活性剂的光固化油、热固化油中的一种或多种。
进一步地，试剂进样区、液滴生成区、液滴储存区、油相出口区由主体芯片及基片键合而成；主体芯片的材料包括聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、玻璃中的一种或多种；基片的材料包括聚二甲基硅氧烷、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚碳酸酯、玻璃、硅片中的一种或几种。
本公开另一方面提供了一种根据前述液滴式多重PCR实时检测芯片的检测方法，包括：S1，将目标物质、不同PCR反应试剂、油相试剂分别通过水相试剂入口、检测试剂入口、油相试剂入口通入芯片；S2，油相试剂在液滴生成区中将目标物质、PCR反应试剂包裹形成尺寸均一的油包水液滴；S3，油包水液滴进入液滴储存区对应的空腔结构中直至到达空腔结构的边界，停止油包水液滴生成；S4，密封水相试剂入口、检测试剂入口、油相试剂入口和油相出口区，固化油相试剂；S5，将芯片进行PCR扩增，检测实时荧光信号。
(三)有益效果
本公开提供的液滴式多重PCR实时检测芯片及方法，通过多个检测试剂入口、多个对应的空腔结构的设计，集液滴生成和储存于一体，该芯片结合了液滴PCR和原位PCR的优点，即可生成、储存包裹样本液滴，也可固定液滴位置，在芯片上直接进行原位扩增；在不同区域储存的液滴中包含不同的引物和探针，可以特异性检测同一样本中的多个靶标，与传统多重PCR相比，引物和探针设计更简单，PCR反应效率更高，此外，所述的不同探针可以标记同种荧光基团，实现了单通道荧光实时并行检测一个样本中的多个靶标，应用范围广泛；还通过对油相出口区中滤膜的设计，实现了液滴的无损储存，试剂消耗少。
附图说明
图1示意性示出了根据本公开实施例中液滴式多重PCR实时检测芯片的结构示意图；
图2示意性示出了根据本公开实施例中出口处的油相过滤膜的结构示意图；
图3示意性示出了根据本实施例中液滴式多重PCR实时检测芯片的进样及液滴储存图；
图4示意性示出了根据本公开实施例中油包水液滴生成过程的示意图；
图5示意性示出了根据本公开实施例中储存区油包水液滴的结构俯视图；
图6示意性示出了根据本公开实施例中含有四种靶标的单细胞液滴在不同的区域产生PCR荧光的示意图；
附图标记说明：
1-试剂进样区；11-水相试剂入口；12-检测试剂入口；13-油相试剂入口；2-液滴生成区；21-流动聚焦型通道结构；3-液滴储存区；31-空腔结构；4-油相出口区；41-出口；42-滤膜。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
本公开中的各种方位词，比如“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”等只是为了描述的方便，用于描述各部件之间的相对位置关系，而不是用于限定本公开，本公开的产品摆放方式不同可能导致各种方位描述的改变。
为了解决上述问题，需要发展一种液滴式多重PCR实时检测芯片及方法，将生成的液滴储存在芯片上，通过固化油相的方式固化液滴直接进行原位扩增，所产生的荧光信号可实时用单通道检测。
本公开的实施例提供了一种液滴式多重PCR实时检测芯片，请参见图1，包括：试剂进样区1，包括水相试剂入口11、油相试剂入口13和至少一个检测试剂入口12；液滴生成区2，包括至少一个流动聚焦型通道结构21，用于将试剂进样区1中的水相试剂、油相试剂生成油包水液滴；液滴储存区3，包括至少一个空腔结构31，每个流动聚焦型通道结构21中的油包水液滴分别进入对应的空腔结构31中，通过固化油相固定液滴位置；油相出口区4，包括多个出口41，出口41设置有滤膜42，用于去除多余的油相。
试剂进样区1包括一个水相试剂入口11、一个油相试剂入口13和多个检测试剂入口12，水相试剂入口11、检测试剂入口12和油相试剂入口13可以分别设于液滴储存区3的两侧，也可以设于液滴储存区3的一侧，为了使整体结构更加紧凑，优选设于液滴储存区3的两侧(如图1所示)，水相试剂入口11、检测试剂入口12和油相试剂入口13连接的通道在液滴生成区2中汇合，生成油包水液滴。每个检测试剂入口12对应一个流动聚焦型通道结构21，水相试剂入口11、油相试剂入口13对应多个流动聚焦型通道结构21，即每种PCR检测试剂通过不同的检测试剂入口12注入，形成不同的油包水液滴，并进入相应的空腔结构31进行存储。每个检测试剂入口12可以对应一个空腔结构31也可以对应多个空腔结构31，即油包水液滴形成后可进入一个空腔结构31，也可以通过分支进入多个空腔结构31，形成多个空腔结构分区，进行PCR原位扩增后，每个空腔结构分区的荧光检测结果与不同检测试剂入口12注入的PCR检测试剂相对应。每个空腔结构分区可以对应一个出口41，出口41中的滤膜42(如图2所示)为疏水性材料，用于去除多余的油相。
本公开通过多个检测试剂入口12、多个对应的空腔结构31的设计，集液滴生成和储存于一体，设计简单、操作简便、成本低廉，且该芯片结合了液滴PCR和原位PCR的优点，即可生成、储存包裹样本液滴，也可固定液滴位置，在芯片上直接进行原位扩增；还通过对油相出口区4中滤膜42的设计，实现了液滴的无损储存，试剂消耗少。
在上述实施例的基础上，水相试剂入口11、油相试剂入口13和至少一个检测试剂入口12中均设有过滤结构14，过滤结构14为微柱阵列结构，用于拦截杂质。
目标物质、不同PCR反应试剂、油相试剂分别通过水相试剂入口11、检测试剂入口12、油相试剂入口13通入芯片，各类试剂通过过滤结构14后可去除杂质，防止堵塞通道。
在上述实施例的基础上，流动聚焦型通道结构21为K型通道结构，水相试剂入口11和检测试剂入口12的通道分别与K型通道结构一侧的通道连接，油相试剂入口13的通道分别与K型通道结构上下两端的通道连接；或流动聚焦型通道结构21为T型通道结构，水相试剂入口11与检测试剂入口12的通道汇聚后与T型通道结构下侧的通道连接，油相试剂入口13的通道分别与T型通道结构左右两端的通道连接。
图1所示的为K型通道结构，即水相试剂入口11、检测试剂入口12的通道和油相试剂入口13的两条通道在流动聚焦型通道结构21中的同一个点汇聚；而T型通道结构是水相试剂入口11、检测试剂入口12的通道先汇聚成一条通道，再与油相试剂入口13的两条通道在流动聚焦型通道结构21中的一点进行汇聚。如图4所示，汇聚过程中，水相在油相剪切力的作用下，生成油包水液滴，每个微液滴相当于一个“微型反应器”，针对这些微液滴分别进行PCR扩增反应。
在上述实施例的基础上，每个检测试剂入口12和/或油相试剂入口13与流动聚焦型通道结构21之间包括回型流阻区。
回型流阻区可根据需要进行设计，水相试剂入口11与流动聚焦型通道结构21之间也可以包括回型流阻区，该回型流阻区起稳流的作用，有助于稳定通道中液体的流速，形成尺寸均一的油包水液滴。
在上述实施例的基础上，空腔结构31的高度小于油包水液滴尺寸的两倍，用于储存单层液滴，便于检测液滴的荧光信号。
在上述实施例的基础上，流动聚焦型通道结构21的宽度范围为20～100μm、高度为范围为20～100μm；空腔结构31的高度范围为20～200μm。
受所分析的样本的限制，往往需要获得尺寸范围为20～200μm的液滴。通过设计流动聚焦型通道结构21的高度和宽度即可获得与其尺寸相当的液滴，设计空腔结构31的高度，储存单层液滴，进行PCR反应和荧光检测。例如，当水相试剂入口11中加入的是细胞悬液，即对单细胞进行PCR检测时，液滴尺寸为50～200μm；当水相试剂入口11中加入的是核酸时液滴尺寸为20～200μm。
在上述实施例的基础上，至少一个检测试剂入口12中的PCR反应试剂不同，其成分包含DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、引物、探针等。不同检测试剂入口所通入的反应试剂包含不同序列的引物和探针，在适宜温度条件下，引物和探针可特异性地与不同的序列结合，不同探针的荧光基团相同，经过PCR扩增后，含有靶标的液滴产生PCR荧光信号，用单通道荧光即可检测。当水相试剂入口11中加入的时细胞悬液，PCR反应试剂中还包括细胞裂解液，所述细胞裂解液为NP-40细胞裂解液，牛胎血清蛋白(BSA)中的一种或多种。当水相入口11中加入的时核酸时，PCR反应试剂中无需添加细胞裂解液。
本公开可同时实现单通道荧光并行检测一个样本中的多个靶标，应用范围广泛。
在上述实施例的基础上，滤膜42的材料包括疏水性聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)中的一种或多种；油相试剂入口13中的油相包括含表面活性剂的光固化油、热固化油中的一种或多种。
疏水性PTFE、PVDF具有阻碍水相通过而允许油相通过的技术效果，用于制备本公开的滤膜42，能够去除多余的油相并阻止液滴离开液滴储存区3，实现无损的液滴储存。
在上述实施例的基础上，试剂进样区1、液滴生成区2、液滴储存区3、油相出口区4由主体芯片及基片键合而成；主体芯片的材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃共聚物(COC)、玻璃中的一种或多种；基片的材料包括聚二甲基硅氧烷、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物(COP)、聚碳酸酯、玻璃、硅片中的一种或几种。
主体芯片及基片采用耐高温材质，则无需取出所生成的液滴，通过空腔结构31就可以直接进行PCR热循环反应。
本公开还提供了一种根据前述液滴式多重PCR实时检测芯片的检测方法，包括：S1，将目标物质、不同PCR反应试剂、油相试剂分别通过水相试剂入口11、检测试剂入口12、油相试剂入口13通入芯片；S2，油相试剂在液滴生成区2中将目标物质、PCR反应试剂包裹形成尺寸均一的油包水液滴；S3，油包水液滴进入液滴储存区3对应的空腔结构31中直至到达空腔结构31的边界，停止油包水液滴生成；S4，密封水相试剂入口11、检测试剂入口12、油相试剂入口13和油相出口区4，固化油相试剂；S5，将芯片进行PCR扩增，检测荧光信号。
将目标物质、不同PCR反应试剂、油相试剂分别通过各入口通入芯片，在所述液滴生成区2中的流动聚焦型通道结构21处形成尺寸均一的液滴，上述液滴进入液滴储存区域3中对应的空腔结构31，多余的油相经带过滤膜的油相出口区4排出，所有的入口和出口密封后，固化芯片中的油相，固定液滴位置，将芯片放置于PCR仪进行温度循环，PCR扩增过程中产生的荧光信号可用荧光显微镜实时观察，图3、5示意性示出了储存区油包水液滴的结构俯视图。
本公开的液滴式多重PCR实时检测芯片及方法，该芯片设计多个流动聚焦型通道结构和空腔结构，注入不同的反应试剂可以对一个样本进行多重分析；将液滴生成与捕获集成在一起，通过在出口添加疏水滤膜，可以实现无损失液滴储存；并通过固化油相固定液滴位置，在芯片上直接进行原位扩增检测单细胞中的多个DNA片段，所产生的PCR信号用单通道荧光即可检测。
下面通过具体实施方式对本公开作进一步说明。在以下实施例中对上述液滴式多重PCR实时检测芯片及方法进行具体说明。但是，下述实施例仅用于对本公开进行例示，本公开的范围不限于此。
本实施例提供一种多重单细胞PCR检测芯片，如图1所示，包括试剂进样区1、液滴生成区2、液滴储存区3与油相出口区4。试剂进样区1包括一个水相试剂入口11、四个检测试剂入口12以及一个油相试剂入口13，入口处均设有过滤结构14，所述过滤结构为微柱阵列，微柱阵列的最小间距为20μm。试剂通过过滤结构14后可去除杂质，防止堵塞通道。水相试剂和油相试剂经过滤结构14后流入液滴生成区2，水相在油相剪切力的作用下，生成液滴。液滴生成区2的结构为四个流动聚焦型通道结构21，通道的宽度和高度均为50μm。经液滴生成区2生成的液滴经通道均匀流入液滴存储区3，液滴存储区3包含8个空腔结构31，空腔的宽度为1mm，空腔的间隙为0.2mm，可以防止空腔与基片键合时塌陷，每个流动聚焦结构处生成的液滴进入对应的两个空腔，多余油相经通道会合后流向油相出口区4，在油相出口区有4个放置有孔径小于1μm的过滤膜41，可阻止液滴离开储存区，且去除多余的油相，实现高效率的液滴捕获。过滤膜在出口的位置示意图如图2所示。
如图3、4所示，分别向水相试剂入口11中加入细胞悬液，向四个检测试剂入口12中加入含不同引物和探针的PCR反应试剂，向油相试剂入口13中加入含表面活性剂的热固化油，其包含铂催化剂，硅油，乙烯基硅油，聚二甲基硅氧烷(PDMS)。调节水相和油相的流速，在液滴生成区生成单细胞液滴，在油相出口区4抽负压去除多余油相，待液滴到达储存区域边界后，停止液滴生成，密封入口水相试剂入口11、检测试剂入口12、油相试剂入口13和出口41，密封后的芯片放置于PCR仪中进行温度循环，即可固化芯片中的油相，固定液滴位置。如图6所示，由于每个检测试剂入口12注入的引物和探针，可与不同的DNA片特异性结合，且探针带有相同的荧光基团。经过PCR扩增后，含有四种靶标的单细胞液滴在不同的区域产生PCR荧光，其他液滴无PCR荧光，通过单个荧光通道即可进行实时荧光检测。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，包括：
试剂进样区(1)，包括水相试剂入口(11)、油相试剂入口(13)和至少一个检测试剂入口(12)；
液滴生成区(2)，包括至少一个流动聚焦型通道结构(21)，用于将所述试剂进样区(1)中的水相试剂、油相试剂生成油包水液滴；
液滴储存区(3)，包括至少一个空腔结构(31)，每个所述流动聚焦型通道结构(21)中的所述油包水液滴分别进入对应的所述空腔结构(31)中，通过固化油相固定液滴位置；
油相出口区(4)，包括多个出口(41)，所述出口(41)设置有滤膜(42)，用于去除多余的油相。
2.根据权利要求1所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述水相试剂入口(11)、油相试剂入口(13)和至少一个检测试剂入口(12)中均设有过滤结构(14)，所述过滤结构(14)为微柱阵列结构，用于拦截杂质。
3.根据权利要求1所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述流动聚焦型通道结构(21)为K型通道结构，所述水相试剂入口(11)和所述检测试剂入口(12)的通道分别与所述K型通道结构一侧的通道连接，所述油相试剂入口(13)的通道分别与所述K型通道结构上下两端的通道连接；或
所述流动聚焦型通道结构(21)为T型通道结构，所述水相试剂入口(11)与所述检测试剂入口(12)的通道汇聚后与所述T型通道结构下侧的通道连接，所述油相试剂入口(13)的通道分别与所述T型通道结构左右两端的通道连接。
4.根据权利要求3所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，每个所述检测试剂入口(12)和/或油相试剂入口(13)与所述流动聚焦型通道结构(21)之间包括回型流阻区。
5.根据权利要求1所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述空腔结构(31)的高度小于所述油包水液滴尺寸的两倍，用于储存单层液滴。
6.根据权利要求5所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述流动聚焦型通道结构(21)的宽度范围为20～100μm、高度为范围为20～100μm；
所述空腔结构(31)的高度范围为20～200μm。
7.根据权利要求1所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述至少一个检测试剂入口(12)中的PCR反应试剂不同，所述PCR反应试剂包含不同的引物和探针，不同探针的荧光基团相同。
8.根据权利要求1所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述滤膜(42)的材料包括疏水性聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯中的一种或多种；
所述油相试剂入口(13)中的油相包括含表面活性剂的光固化油、热固化油中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的液滴式多重PCR实时检测芯片，其特征在于，所述试剂进样区(1)、液滴生成区(2)、液滴储存区(3)、油相出口区(4)由主体芯片及基片键合而成；
所述主体芯片的材料包括聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、玻璃中的一种或多种；所述基片的材料包括聚二甲基硅氧烷、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚碳酸酯、玻璃、硅片中的一种或几种。
10.一种根据权利要求1～9中任意一项所述的液滴式多重PCR实时检测芯片的检测方法，其特征在于，包括：
S1，将目标物质、不同PCR反应试剂、油相试剂分别通过水相试剂入口(11)、检测试剂入口(12)、油相试剂入口(13)通入芯片；
S2，所述油相试剂在液滴生成区(2)中将所述目标物质、PCR反应试剂包裹形成尺寸均一的油包水液滴；
S3，所述油包水液滴进入液滴储存区(3)对应的空腔结构(31)中直至到达所述空腔结构(31)的边界，停止所述油包水液滴生成；
S4，密封所述水相试剂入口(11)、检测试剂入口(12)、油相试剂入口(13)和油相出口区(4)，固化所述油相试剂；
S5，将所述芯片进行PCR扩增，检测实时荧光信号。
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| CN202210532699.0A CN117106567A (zh) | 2022-05-16 | 2022-05-16 | 液滴式多重pcr实时检测芯片及方法 |
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