CN117092015A - 一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法，其包括体声波发生模块和计数模块，体声波发生模块用于激发促使特异性细胞的细胞膜发生紊乱的体声波，以使荧光标记物进入特异性细胞内；计数模块包括具有微流控沟道的腔体、光电探头、单片机和激光器，所述腔体上设有与微流控沟道一端连通的鞘液入口和细胞溶液入口，以及与微流控沟道另一端连通的出口；光电探头连接于光纤的一端，且所述光纤另一端朝向微流控沟道；单片机与所述光电探头信号连接，并用于计数及显示计数结果；激光器照向微流控沟道。本申请可以提高细胞检测限和计数精度。
Description
技术领域
本申请涉及细胞计数技术领域，特别涉及一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法。
背景技术
地中海贫血症是一种具有遗传性的因血液紊乱产生轻度或严重的贫血症，严重型的地中海贫血症经常是在早期儿童就能够诊断出来而且终身伴随，通常此类患者需要每月输血2～3次。对患者来说，输注的血液里白细胞越少，越能避免免疫反应，保证输血安全。
目前，医院对血袋中的白细胞数量检测通常采用血细胞分析仪进行。然而，以去白细胞悬浮红细胞为例，残留的白细胞数量通常不会大于2.5*106每单位，即103/mL。但是数量少的白细胞在通常血细胞分析仪中难以计数(最低检测限为108/L)，通常需要进行计数板镜检或者使用流式细胞仪检测，费时费力。因此，一款检测精度更高的快速检测系统能够有效的降低人工成本，促进细胞过滤技术发展，降低病人输血风险。
目前对于细胞检测的方法，电阻抗的检测在检测通量上非常优秀，但是难以满足极低检测限的需求；光散射方法的优势则是在检测限上而非检测速度。在平衡检测限、检测速度和通量之间，仍然需要进行更进一步的优化。
发明内容
本申请实施例提供一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法，以提高细胞检测限和计数精度。
第一方面，提供了一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其包括：
体声波发生模块，其用于激发促使特异性细胞的细胞膜发生紊乱的体声波，以使荧光标记物进入特异性细胞内；
计数模块，其包括：
-具有微流控沟道的腔体，所述腔体上设有与微流控沟道一端连通的鞘液入口和细胞溶液入口，以及与微流控沟道另一端连通的出口；
-光电探头，其连接于光纤的一端，且所述光纤另一端朝向微流控沟道；
-单片机，其与所述光电探头信号连接，并用于计数及显示计数结果；
-激光器，其照向微流控沟道。
一些实施例中，所述体声波发生模块包括压电片以及与压电片连接的声波发生器。
一些实施例中，所述压电片的共振频率为3.26MHz，所述声波发生器发射的正弦波峰-峰电压为28.25V。
一些实施例中，所述激光器上安装有物镜。
一些实施例中，所述光电探头与光纤之间设有滤波片。
一些实施例中，所述鞘液入口有两个，且分设于所述细胞溶液入口两侧。
一些实施例中，所述腔体设于载玻片上。
一些实施例中，所述光电探头与单片机之间连接有控制板。
第二方面，提供了一种基于声学微流控的特异性细胞计数方法，其包括如下步骤：
利用体声波发生模块激发体声波，对细胞溶液处理，以使荧光标记物进入特异性细胞内；
将鞘液和处理后的细胞溶液分别经鞘液入口和细胞溶液入口泵入微流控沟道；
开启激光器，以照向微流控沟道；
利用光电探头，将光纤采集的荧光信号转换为电信号；
利用单片机处理电信号，并将计数结果予以显示。
一些实施例中，所述体声波发生模块处理时间为4min；
和/或，所述鞘液泵入速度为500μl/h，所述细胞溶液泵入速度为100μl/h；
和/或，所述荧光标记物采用碘化丙啶；
和/或，所述光电探头计数阈值144mV，计数时间3ms，计数间隔0ms。
本申请提供的技术方案带来的有益效果包括：
本申请实施例提供了一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法，对于细胞溶液中所包含的多种细胞而言，其刚性并不相同，将细胞溶液与荧光标记物装入容器中，并利用体声波发生模块激发体声波，在体声波的作用下，其中需要进行计数的特异性细胞的细胞膜会发生紊乱，无法起到原本选择性透过的作用，从而将正常无法进入细胞中的荧光标记物吞入细胞内。通过调节声波强度与处理时间从而实现对特定细胞标记。
再将上述处理过的细胞溶液泵入微流控沟道中，利用激光器，激发荧光，光纤将采集的光信号发给光电探头，光电探头将光信号转化成电信号，单片机处理电信号，从而实现被标记的特异性细胞的计数。
相对传统的细胞计数方法，本方法可以在细胞浓度极低的条件下实现计数，大大提高了细胞检测限，提高了计数精度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的体声波发生模块示意图；
图2为本申请实施例提供的计数模块示意图；
图3为本申请实施例提供的腔体示意图；
图4为本申请实施例提供的经过体声波处理前后细胞的冷冻电镜图；
图5为本申请实施例提供的人红细胞与人白细胞在经过体声波处理后对荧光标记物的吞入表现；
图6为本申请实施例提供的光斑大小示意图；
图7为本申请实施例提供的细胞计数装置计出的细胞数量与流式细胞仪检测结果比对图。
图中：1、体声波发生模块；10、压电片；11、声波发生器；2、计数模块；3、腔体；30、微流控沟道；31、鞘液入口；32、细胞溶液入口；33、出口；4、光电探头；5、光纤；6、单片机；7、激光器；8、控制板；9、容器。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
参见图1、图2和图3所示，本申请实施例提供了一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其包括体声波发生模块1和计数模块2，其中，体声波发生模块1用于激发促使特异性细胞的细胞膜发生紊乱的体声波，以使荧光标记物进入特异性细胞内；计数模块2包括腔体3、光电探头4、光纤5、单片机6和激光器7，其中，腔体3具有微流控沟道30，腔体3上设有与微流控沟道30一端连通的鞘液入口31和细胞溶液入口32，以及与微流控沟道30另一端连通的出口33；光电探头4连接于光纤5的一端，且光纤5另一端伸入腔体3，并朝向微流控沟道30；单片机6与光电探头4信号连接，并用于计数及显示计数结果；激光器7发出激光，并照向微流控沟道30。
本申请的原理如下：
对于细胞溶液中所包含的多种细胞而言，其刚性并不相同，将细胞溶液与荧光标记物装入容器9中，并利用体声波发生模块1激发体声波，在体声波的作用下，其中需要进行计数的特异性细胞的细胞膜会发生紊乱，无法起到原本选择性透过的作用，从而将正常无法进入细胞中的荧光标记物吞入细胞内。通过调节声波强度与处理时间从而实现对特定细胞标记。
再将上述处理过的细胞溶液泵入微流控沟道30中，利用激光器7，激发荧光，光纤5将采集的光信号发给光电探头4，光电探头4将光信号转化成电信号，单片机6处理电信号，从而实现被标记的特异性细胞的计数。
相对传统的细胞计数方法，本方法可以在细胞浓度极低的条件下实现计数，大大提高了细胞检测限，提高了计数精度。
本申请利用声波与细胞相互作用和荧光标记，结合微流控平台，创新性地制造出特异性强的细胞计数技术，具有极低的检测限，在生物和医疗领域具有极大的研究价值，以满足临床的成分输血的需求，或者其他分析的需求，同时因制造成本低和操作简单具有普及推广的潜力。
需要说明的是，上述单片机6具有显示屏幕，单片机6对电信号进行处理后，得到计数结果，从而可以利用显示屏幕予以显示。
需要说明的是，上述荧光标记物可以根据实际检测需要确定，比如，作为示例，荧光标记物采用碘化丙啶PI。
需要说明的是，上述光纤5通过提前预埋的孔隙插入腔体3的预定位置，并提前切割平整，清洗干净。
需要说明的是，上述鞘液入口31和细胞溶液入口32可以连接微流泵，以此来控制泵入速度。
需要说明的是，本实施例中腔体3采用有机材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作，具体制作方法为：利用软件绘制微流控沟道30的形状，根据该形状制作掩模板，然后通过紫外光刻技术，将图形显影于硅片，得到该微流控沟道30的硅片模具，随后在硅片模具上浇筑未凝固的PDMS，在75℃的温度下热烘1h凝固，得到该腔体3。
需要说明的是，光电探头4使用京邦公司硅光电倍增管(JPC-1050-TEC)。
为了产生体声波，参见图1所示，体声波发生模块1包括压电片10以及与压电片10连接的声波发生器11。本申请利用血细胞之间细胞膜刚性的差异来构造新型特异性计数模式。向溶液发射体声波，同时在溶液内形成声流，而细胞膜在声场下发生紊乱，细胞膜不再稳定，因此能够把原本不会进入细胞的物质吞入细胞内。
压电片10可以选用现有的成品，比如，作为示例，可以选用压电陶瓷片。其共振频率可以根据实际需要选择，比如，作为示例，共振频率为3MHz左右。进一步地，压电片10的共振频率为3.26MHz。
声波发生器11发射的正弦波峰-峰电压可以根据实际检测需要确定，比如，作为示例，声波发生器11发射的正弦波峰-峰电压为28.25V。
进一步地，激光器7上安装有物镜，通过物镜聚焦，以使激光与微流控沟道30中的细胞溶液同宽。
进一步地，光电探头4与光纤5之间设有滤波片，用于过滤杂光，可以采用590nm长通(LP)滤波片。
进一步地，鞘液入口31有两个，且分设于细胞溶液入口32两侧。
进一步地，腔体3设于载玻片上。
进一步地，光电探头4与单片机6之间连接有控制板8，通过控制板8控制光电探头4工作。
基于上述装置，本申请实施例还提供了一种基于声学微流控的特异性细胞计数方法，其包括如下步骤：
101：利用体声波发生模块1激发体声波，对细胞溶液处理，以使荧光标记物进入特异性细胞内。其中，体声波发生模块1处理时间可以根据实际检测需要确定，比如，作为示例，体声波发生模块1处理时间为4min。
102：将鞘液和处理后的细胞溶液分别经鞘液入口31和细胞溶液入口32泵入微流控沟道30。鞘液泵入速度可以根据实际检测需要确定，比如，作为示例，鞘液泵入速度为500μl/h，细胞溶液泵入速度可以根据实际检测需要确定，比如，作为示例，细胞溶液泵入速度为100μl/h。
103：开启激光器7，以照向微流控沟道30。
104：利用光电探头4，将光纤5采集的荧光信号转换为电信号。光电探头4的计数阈值、计数时间和计数间隔可以根据实际检测需要确定，比如，作为示例，光电探头4计数阈值144mV，计数时间3ms，计数间隔0ms。
105：利用单片机6处理电信号，并将计数结果予以显示。
实施例1：
以人红细胞与人白细胞为例。
如图1所示，压电片10为压电陶瓷片PZT，将有人红细胞与人白细胞的1mL细胞溶液装入容器9中，并置于PZT正上方，并加入荧光标记物碘化丙啶PI。本实施例中，压电陶瓷片的共振频率为3.26MHz，通过焊接导线连接至声波发生器11，声波发生器11发射正弦波峰-峰电压为28.25V，将细胞溶液处理4分钟。
如图4所示，为经过体声波处理前后细胞的冷冻电镜图，人白细胞WBC在体声波处理前细胞膜表面平整光滑，无明显起伏；体声波处理后，细胞膜表面出现大量褶皱。人红细胞RBC在体声波处理前后细胞膜表面无明显变化。
如图5所示，人红细胞与人白细胞在经过体声波处理后对荧光标记物的吞入表现。本实施例中，使用迈瑞公司低中高值三种血液质控品(BC-5D)作为样品，经过体声波处理4分钟后，在荧光倒置显微镜下分别对人白细胞与人红细胞进行荧光计数，从计数结果来看，人白细胞WBC吞入了较多的荧光标记物，而人红细胞RBC吞入的荧光标记物很少，从而验证了本实例的特异选择能力。
其中，透化细胞比率(permeabilized cell rate)为：
其中，参考计数值为质控品厂家提供的参考值，本申请中，参考计数值由迈瑞公司提供的血细胞分析仪用质控物(光学法)参考值表查表获得，比如，后文中计算时，参考计数值为8.00×109/L，PI计数值是将细胞溶液经过体声波处理4分钟后，将细胞溶液在CytoFLEX S流式细胞仪上检测得出；PI计数值获取方法如下：
将准备测试的样品平均分为两份，一份供本申请提供的计数装置计数使用，另一份装载进流式细胞仪中，选择固定时间模式，可以得出通过的细胞总数。打开散点图，划出具有PI荧光的门(Gate，此操作为流式细胞仪规范操作方法)，在统计中会显示出具有PI荧光的占比数，该占比数与通过的细胞总数相乘即为参考计数值。
处理4分钟后，参见图3所示，向两个鞘液入口31中泵送鞘液，中间的细胞溶液入口32泵送经体声波处理4分钟后的细胞溶液。本实施例中，为了使中心流细胞溶液和鞘液形成稳定鞘流包裹形状并使中心流宽度不大于激光器光斑大小，经过反复试验，中心流泵入速度为100μl/h，鞘液泵入速度为500μl/h。
参见图2所示，光纤5通过提前预埋的孔隙插入预定位置，并提前切割平整，清洗干净。本实施例中，使用京邦公司的硅光电倍增管(JPC-1050-TEC)作为光电探头，手持激光器(MGL-S-532，长春新产业光电技术)作为光源，通过物镜聚焦与中心流细胞溶液同宽，光斑直径为62.77μm，参见图6所示光斑大小。
如图7所示，为通过本申请的细胞计数装置计出的细胞数量与流式细胞仪检测结果比对，进行精确度分析。本实施例中，使用本申请的细胞计数装置与美国贝克曼公司CytoFLEXS流式细胞仪检测同一批细胞样品。a)为通过流式细胞仪得出的全血(包括RBC和WBC)的检测结果(为百分比)，此时同时测量了红色荧光和绿色荧光的相对强度。b)为通过流式细胞仪得出的WBC的检测结果(为百分比)，此时只测量的红色荧光的相对强度。c)为使用本申请涉及的计数方法与使用流式细胞仪的计数结果统计比较，样本量n＝3，采用T-test方法检测差异，结果为差异不显著(α＝0.05)。
a)图中，横坐标表示PI荧光(红色荧光)信号相对强度的值，纵坐标表示FITC(绿色荧光)荧光信号相对强度的值。
b)图中，横坐标表示PI荧光(红色荧光)信号相对强度的值，其单位是道数(channel)，是对数(log)。纵坐标是相对细胞数(count)。
c)图中，横坐标为两种计数方法(本申请的计数方法和流式细胞仪方法)，纵坐标为计出的细胞密度值，其中上下条为标准差范围，条形为平均值。
相对于传统的细胞计数方法，本实施例所提供的计数装置及方法，操作速度大大加快，操作难度大大降低。通过多次实验，证实本方案中基于细胞刚性的微流控特异性细胞计数技术的特异性计数精度好，与流式细胞仪相比，细胞计数偏差率在6.47±5.31％。
总之，本申请利用压电陶瓷片产生声流，细胞在声流中受到刺激，细胞膜发生紊乱。以本例中的人白细胞和人红细胞为例，人红细胞由于需要通过毛细血管，细胞膜具有相当小的刚性，与红细胞相比，人白细胞的刚性大于人红细胞，细胞膜更容易发生紊乱，刺激细胞大量吞入周围的物质，因此形成特异性标记。这样的声波处理，不仅具有操作简单、响应迅速等优点，同时又具有特异性标记的优点，因而能对极稀少的细胞进行计数，可应用于医学生物领域。
在本申请的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
需要说明的是，在本申请中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于，其包括：
体声波发生模块(1)，其用于激发促使特异性细胞的细胞膜发生紊乱的体声波，以使荧光标记物进入特异性细胞内；
计数模块(2)，其包括：
-具有微流控沟道(30)的腔体(3)，所述腔体(3)上设有与微流控沟道(30)一端连通的鞘液入口(31)和细胞溶液入口(32)，以及与微流控沟道(30)另一端连通的出口(33)；
-光电探头(4)，其连接于光纤(5)的一端，且所述光纤(5)另一端朝向微流控沟道(30)；
-单片机(6)，其与所述光电探头(4)信号连接，并用于计数及显示计数结果；
-激光器(7)，其照向微流控沟道(30)。
2.如权利要求1所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述体声波发生模块(1)包括压电片(10)以及与压电片(10)连接的声波发生器(11)。
3.如权利要求2所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述压电片(10)的共振频率为3.26MHz，所述声波发生器(11)发射的正弦波峰-峰电压为28.25V。
4.如权利要求1所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述激光器(7)上安装有物镜。
5.如权利要求1所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述光电探头(4)与光纤(5)之间设有滤波片。
6.如权利要求1所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述鞘液入口(31)有两个，且分设于所述细胞溶液入口(32)两侧。
7.如权利要求1所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述腔体(3)设于载玻片上。
8.如权利要求1所述的基于声学微流控的特异性细胞计数装置，其特征在于：所述光电探头(4)与单片机(6)之间连接有控制板(8)。
9.一种基于声学微流控的特异性细胞计数方法，其特征在于，其包括如下步骤：
利用体声波发生模块(1)激发体声波，对细胞溶液处理，以使荧光标记物进入特异性细胞内；
将鞘液和处理后的细胞溶液分别经鞘液入口(31)和细胞溶液入口(32)泵入微流控沟道(30)；
开启激光器(7)，以照向微流控沟道(30)；
利用光电探头(4)，将光纤(5)采集的荧光信号转换为电信号；
利用单片机(6)处理电信号，并将计数结果予以显示。
10.如权利要求9所述的基于声学微流控的特异性细胞计数方法，其特征在于：
所述体声波发生模块(1)处理时间为4min；
和/或，所述鞘液泵入速度为500μl/h，所述细胞溶液泵入速度为100μl/h；
和/或，所述荧光标记物采用碘化丙啶；
和/或，所述光电探头(4)计数阈值144mV，计数时间3ms，计数间隔0ms。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311098319.8A CN117092015A (zh) | 2023-08-29 | 2023-08-29 | 一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311098319.8A CN117092015A (zh) | 2023-08-29 | 2023-08-29 | 一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117092015A true CN117092015A (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=88778144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311098319.8A Pending CN117092015A (zh) | 2023-08-29 | 2023-08-29 | 一种基于声学微流控的特异性细胞计数装置及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117092015A (zh) |
-
2023
- 2023-08-29 CN CN202311098319.8A patent/CN117092015A/zh active Pending
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