CN117089609A - 检测样本中apob基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症患者的产品的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症患者的产品的应用,APOB基因变异为APOB c.676G>A,APOB蛋白变异为APOB p.A226T。本发明还公开了一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估家族性高胆固醇血症易感性的产品的应用。根据本公开,能够提供新的家族性高胆固醇血症的致病基因位点或家族性高胆固醇血症高风险的突变位点,有助于家族性高胆固醇血症的诊断、治疗与预防。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症患者的产品的应用。
背景技术
家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)是一种常见遗传病,主要以低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平升高为特征,伴有皮肤/腱黄色瘤、脂性角膜以及早发动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)。目前FH的发病率逐年上升,但其就诊率及社会认知度仍较低,早期识别诊断FH并进行干预,可有效预防心血管事件的发生。迄今为止,临床中发现的APOB c.676G>A位点突变在国内外未有研究报道,本研究结合患者的临床资料及基因检测结果,追溯患者家族成员的血脂情况,针对该突变进行功能验证及临床特征分析,探讨该突变位点的致病性及可能的致病机制,从而为寻找FH新的防治措施提供基因学依据。
APOB蛋白是血浆脂蛋白的主要成分,参与脂质的合成、分泌、代谢等多个方面。APOB基因主要编码两种APOB蛋白,即APOB100和APOB48。APOB48在小肠粘膜合成,主要参与合成CM,并将食物来源的TG及胆固醇转运入血。CM在血液中的清除速度快、半衰期短,只有5-10 分钟。因此APOB48在血液中的含量也比较低,约为APOB100的0.1%。一分子CM只含有一分子APOB48,并在血液循环和代谢过程中始终存在于CM中,不转移到其他脂蛋白颗粒上,故APOB48也可作为CM的标志。APOB48表达量的改变,会对脂蛋白的合成产生重要影响,有研究发现,小肠APOB48的合成增加,会使更多的脂肪被运送至肝脏,从而肝脏VLDL的合成也会增加。APOB100主要参与构成VLDL和LDL,由LDL的摄取速度比较慢,因此在大多数个体中,LDL构成了大部分的胆固醇转运颗粒。APOB基因的多态性则可能导致LDL与肝脏细胞上的LDLR结合能力下降,使血浆内的TG和胆固醇清除速率减慢,大量胆固醇堆积在动脉处,从而引发ASCVD。
目前有较多研究对家族性高胆固醇血症的致病机理进行了阐述,但是仍存在未知致病基因位点。进一步研究家族性高胆固醇血症的致病机理,分离出家族性家族性高胆固醇血症的新致病基因变异,对于家族性高胆固醇血症的诊断、治疗与预防具有重要的意义。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成,其目的在于提供一种家族性高胆固醇血症的致病突变位点或家族性高胆固醇血症高风险的突变位点,有助于家族性高胆固醇血症的诊断、治疗与预防。
为此,本公开第一方面提供了一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症患者的产品的应用,其特征在于,所述APOB基因变异为APOBc.676G>A,所述APOB蛋白变异为。本公开中,通过家系研究鉴定出APOB c.676G>A突变(APOB基因的DNA序列编码区第676位碱基鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代,导致APOB蛋白第226位氨基酸由丙氨酸(A)变异为苏氨酸(T),即APOB p.A226T),并通过功能研究证实APOB c.676G>A(APOB p.A226T)突变会影响APOB活性,由此,提供了新的家族性高胆固醇血症的致病基因位点或家族性高胆固醇血症高风险的突变位点,通过检测样本中是否携带APOB c.676G>A(APOB p.A226T)突变,能够辅助筛查家族性高胆固醇血症患者。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述试剂包括用于扩增APOB基因的引物对和/或用于检测所述APOB基因变异的探针。由此,能够通过引物对和/或探针对APOB基因变异c.676G>A进行捕获和/或检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述引物对根据人基因组中APOB基因编码区第676位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到,所述探针根据人基因组中APOB基因编码区第676位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此,引物能够与APOB基因编码区第676位上下游区域的序列结合、探针能够与APOB基因编码区第676位及上下游区域的序列结合,以对该区域进行检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此,能够提供反应底物、催化酶和缓冲液,以便于对APOB c.676G>A进行检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述试剂包括使用以下方法中的至少一种来检测所述APOB蛋白变异的试剂:蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。由此,能够提供试剂来对APOB蛋白变异(也称为氨基酸变异)APOBp.A226T进行检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述试剂包括可识别具有APOB p.A226T突变的APOB蛋白的抗体。由此,能够利用可识别具有APOB p.A226T突变的APOB蛋白的抗体,来对具有APOB p.A226T突变的APOB蛋白进行检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述产品还包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。由此,能够便于对APOB c.676G>A或APOB p.A226T进行检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种,且所述APOB基因变异是指APOB基因的胚系变异,所述APOB蛋白变异是指APOB蛋白的胚系变异。由此,能够通过检测被检测者的外周血、唾液和/或组织样本,对受检者的APOB基因的胚系突变(胚系突变是指在人的胚胎发育期已经携带的变异,身体内每个细胞都携带)进行检测。
在本公开所涉及的应用中,可选地,所述APOB基因变异为杂合突变或纯合突变,所述APOB蛋白变异为杂合突变或纯合突变。
本公开第二方面提供了一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估家族性高胆固醇血症易感性的产品的应用,其特征在于,所述APOB基因变异为APOBc.676G>A,所述APOB蛋白变异为APOB p.A226T。本公开中,通过家系研究鉴定出APOBc.676G>A突变(APOB基因的DNA序列编码区第676位碱基鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代,导致APOB蛋白第226位氨基酸由丙氨酸(A)变异为苏氨酸(T),即APOB p.A226T),并通过功能研究证实APOB c.676G>A(APOB p.A226T)突变会影响APOB活性,由此,提供了新的家族性高胆固醇血症的致病基因位点或家族性高胆固醇血症高风险的突变位点,通过检测样本中是否携带APOB c.676G>A(APOB p.A226T)突变,能够辅助评估家族性高胆固醇血症的易感性。
根据本公开,能够提供一种家族性高胆固醇血症的致病突变位点或家族性高胆固醇血症高风险的突变位点,有助于家族性高胆固醇血症的诊断、治疗与预防。
附图说明
图1为本发明实施例所涉及的先证者的家系图。
图2为本发明实施例所涉及的先证者及其亲属的APOB c.676G>A突变位点验证结果图。
图3为本发明实施例所涉及的先证者及其亲属的INSR c.4028G>A突变位点验证结果图。
图4为本发明实施例所涉及的APOB的蛋白结构图以及在不同物种间的氨基酸序列图。
图5为本发明实施例所涉及的APOB蛋白的三维结构预测图。
图6为本发明实施例所涉及的人胚肾细胞HEK 293T不同倍数下转染结果图。
图7为本发明实施例所涉及的人肝癌细胞HepG2不同倍数下转染结果图。
图8为本发明实施例所涉及的野生型APOB及突变型A226T-APOB的免疫荧光表达图。
图9为本发明实施例所涉及的Ala226Thr-APOB突变的功能研究结果图。
图10为本发明实施例所涉及的Ala226Thr-APOB突变对其他脂肪生成基因的影响图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施方式,所述实施方式的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的,仅用于解释本发明,而不能解释为对本发明的限制。
本领域技术人员可以理解,除非另外定义,这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
在本实施方式中,涉及下述任一种应用:
一种检测样本中APOB基因变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症患者的产品中的应用;
一种检测样本中APOB基因变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症伴急性胰腺炎患者的产品中的应用;
一种检测样本中APOB氨基酸突变的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症患者的产品中的应用;
一种检测样本中APOB氨基酸突变的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症伴急性胰腺炎患者的产品中的应用;
一种检测样本中APOB基因变异的试剂在评估家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用;
一种检测样本中APOB氨基酸突变的试剂在评估家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用。
在本实施方式所涉及的上述应用中,APOB基因变异或APOB氨基酸突变与家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症三种疾病的风险均是相关的,因此,检测APOB基因变异或APOB氨基酸突变的试剂可以用于筛查家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症中的任一种或任意多种疾病的患者,检测APOB基因变异或APOB氨基酸突变的试剂可以用于评估家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症中的任一种或任意多种疾病的易感性。
本发明提供的新的突变位点补充了家族性家族性高胆固醇血症的遗传突变谱,能够有利于对家族性高胆固醇血症患者进行诊断以便于进行治疗,以及对家系中的携带者进行基因诊断以便于进行健康管理,同时能够根据父母双方基因型指导生育,以便于规避致病基因的遗传,指导优生优育。
在本实施方式所涉及的上述试剂中,可以包括对APOB基因变异或APOB氨基酸突变进行检测的试剂。在一些示例中,APOB基因变异为APOB c.676G>A,APOB氨基酸突变(也即APOB蛋白变异)为APOB p.A226T,APOB p.A226T是指APOB蛋白第226位氨基酸由丙氨酸(A)变异为苏氨酸(T)。本实施方式中,通过家系研究鉴定出APOB c.676G>A突变(APOB基因的DNA编码区序列第676位G碱基被A碱基取代,导致APOB蛋白第226位氨基酸由丙氨酸变异为苏氨酸,即APOB p.A226T)。本实施方式还通过功能研究证实APOB c.676G>A(APOBp.A226T)突变会影响APOB活性。在一些示例中,APOB c.676G>A(APOB p.A226T)突变导致APOB活性下降。由此,提供了新的家族性高胆固醇血症的致病基因位点或家族性高胆固醇血症高风险的突变位点,通过检测样本中是否携带APOB c.676G>A(APOB p.A226T)突变,能够辅助筛查家族性高胆固醇血症患者。
在一些示例中,可以使用焦磷酸测序技术、Sanger测序法、NGS测序法、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析、TaqMan探针法中的至少一种对APOB基因变异进行检测。在一些示例中,APOB基因变异可以为APOB c.676G>A。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂可以包括用于扩增APOB基因的引物对和/或用于检测APOB基因变异的探针。由此,能够通过引物对和/或探针对APOB基因变异进行捕获和/或检测。在一些示例中,试剂还可以包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此,能够便于对APOB基因变异进行检测。
在一些示例中,引物对可以根据人基因组中APOB基因编码区第676位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到,探针可以根据人基因组中APOB基因编码区第676位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此,引物能够与APOB基因编码区第676位上下游区域的序列结合、探针能够与APOB基因编码区第676位及上下游区域的序列结合,以对APOBc.676G>A进行检测。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,也可以包括对APOB c.676G>A(APOB p.A226T)以外的其他APOB突变进行检测的试剂。在一些示例中,其他APOB突变可以包括家族性高胆固醇血症目前已知的APOB基因的全部致病突变和疑似致病突变。在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,也可以包括对APOB基因以外的其他与家族性高胆固醇血症相关的基因进行检测的试剂。在一些示例中,与家族性高胆固醇血症相关的基因可以包括APOA2、GHR、GSBS、EPHX2、LDLR、PCSK9、LDLRAP1。由此,能够对家族性高胆固醇血症的相关位点均进行检测,有利于对家族性高胆固醇血症进行一次性的、更加全面的筛查。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,也可以包括对其他疾病相关的基因或蛋白进行检测的试剂。例如,也可以包括期限需要鉴别诊断的疾病(例如家族性合并高脂血症3型)相关的基因或蛋白进行检测的试剂。由此,能够同时对被检测者进行鉴别诊断。例如,也可以包括对相关遗传性代谢病(例如高脂血症、糖尿病)相关的基因或蛋白进行检测的试剂。由此,能够同时对被检测者进行多种疾病的筛查。
所在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,可以包括使用以下方法中的至少一种来检测APOB蛋白变异的试剂:蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。由此,能够对APOB蛋白变异进行检测。在一些示例中,APOB蛋白变异是指APOB p.A226T。在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂也可以包括检测APOBp.A226T变异的蛋白之外的APOB蛋白的试剂。例如也可以包括检测携带其他已知的致病/疑似致病位点的APOB蛋白变异体的试剂。
在一些示例中,蛋白质和肽段的序列分析技术可以包括N末端序列测定的化学方法、Edman法、C末端酶解方法和C末端化学降解法。
在一些示例中,质谱相关的蛋白质检测技术可以包括基质辅助激光解吸电离、飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS)和电子喷雾电离质谱测量法(electro sprayion-ization mass spectrometry,ESI-MS)。
在一些示例中,抗体检测技术可以包括制备可识别不同突变体的抗体法,免疫印迹(如western blot)法和酶联免疫吸附(ELISA)法。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述产品的形式,可以为试剂、试剂套装或试剂盒的形式。在一些示例中,产品还可以包括仪器所组成的系统。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述产品也可以包括对APOB基因变异或APOB氨基酸突变进行检测的仪器所组成的系统。例如,产品可以是由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统,或者是由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统,或者是由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所需要的其他试剂和仪器组成的系统,或者是由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。由此,能够便于对APOB基因或APOB蛋白进行检测。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述产品也可以包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。由此,能够便于进行基因检测或蛋白检测。
在一些示例中,家族性高胆固醇血症患者的临床表现还包括急性胰腺炎和高甘油三酯血症。在一些示例中,家族性高胆固醇血症患者通常伴有急性胰腺炎。因此,本公开提供了新的家族性高胆固醇血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)的致病基因位点或家族性高胆固醇血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)高风险的突变位点,通过检测样本中的APOB c.676G>A突变,能够辅助筛查家族性高胆固醇血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)患者,并能够辅助评估家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性。易感性是指由遗传基础所决定一个个体患病的风险,也可以理解为在相同环境下,不同个体患病的风险。
在一些示例中,在本实施方式所涉及的上述应用中,可以通过检测被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种样本对APOB基因或APOB蛋白进行检测。换言之,所检测的样本可以来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种。
在一些示例中,被检测者可以为普通人群、疑似患有家族性高胆固醇血症的个体或家族性高胆固醇血症高风险人群。在一些示例中,疑似患有家族性高胆固醇血症的个体可以为急性胰腺炎患者、反复性胰腺炎患者、家族性高胆固醇血症患者、高三油甘脂血症患者。在一些示例中,家族性高胆固醇血症高风险人群可以为具有家族性高胆固醇血症家族史的人群,例如至少一名直系家属被确诊为家族性高胆固醇血症的个体。
在一些示例中,可以对样本中的APOB基因的胚系突变进行检测。胚系突变又叫生殖细胞突变,是来源于精子或卵子等生殖细胞所携带的突变。在一些示例中,可以通过提取被检测者的gDNA(基因组DNA)并对基因组DNA进行检测,来获得APOB基因的胚系突变结果。
在一些示例中,可以对APOB基因的编码区的第676位碱基进行检测。进一步地,可以对APOB c.676G>A突变进行检测。换言之,可以检测被检测者是否携带APOB c.676G>A突变。
在一些示例中,被检测者的APOB基因中只要存在一个APOB c.676G>A突变,就可以辅助诊断该被检测者为家族性高胆固醇血症患者。换言之,检测到被检测者的APOB c.676G>A为杂合突变时,可以辅助诊断该被检测者为家族性高胆固醇血症患者。当然,检测到被检测者的APOB c.676G>A为纯合突变时,也可以辅助诊断该被检测者为家族性高胆固醇血症患者。
在本实施方式中,通过APOB c.676G>A这一基因变异作为标志物,能够对家族性高胆固醇血症患者进行筛查,进而提供一种检测样本中APOB基因变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症患者的产品中的应用。同样地,还能提供一种检测样本中APOB基因变异的试剂在制备筛查急性胰腺炎、高甘油三酯血症的产品中、在制备评估家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用。同样的,还能提供一种检测样本中APOB氨基酸突变的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的产品中、在制备评估家族性高胆固醇血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用。
下面,结合实施例进一步对本发明所涉及的上述应用进行详细的解释,但是不应把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[实施例]
临床案例
(1)案例信息
先证者为一女性,“2型糖尿病”病史4年余,因“急性胰腺炎、高脂血症”入院治疗,生化常规提示其总胆固醇(Cho16.5mmol/L)、低密度脂蛋白(LDL-C10.66mmol/L)和甘油三酯(TG23.45mmol/L)水平明显升高。
先证者的母亲在40岁时被诊断为“2型糖尿病”,44岁时被诊断为“急性胰腺炎、高脂血症”,并接受“非诺贝特200mg qn”降脂治疗,既往“乳腺癌”病史,双侧乳腺切除术后。
先证者舅舅在51岁时被诊断为“2型糖尿病、高脂血症”,未接受降脂治疗。
先证者外祖母在58岁时被诊断为“高脂血症、冠心病”,并接受“阿托伐他汀钙10mg qn”降脂治疗。
先证者家系中的其他家族成员无高脂血症病史。
(2)样本检测及结果:
a)采集先证者及相关家族成员的外周血,进行血脂、血糖检测,并行OGTT与胰岛素和C肽释放实验(结果分别见表1和表2)。结果显示,先证者及其母亲、舅舅、外祖母均存在高脂血症及2型糖尿病,先证者外祖父存在2型糖尿病。根据检验结果及先证者家系病史收集结果绘制家系图谱(图1)。
表1 先证者及家庭成员血脂检验结果
注:总胆固醇(Cho)参考值:2.80-6.00 mmol/L;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)参考值:0.80-2.00 mmol/L;低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)参考值:1.00-3.37 mmol/L;甘油三酯(TG)参考值:0.30-1.70 mmol/L;游离脂肪酸(NEFA)参考值:10.0-85.0 umol/dL。
表2 先证者及家系OGTT及胰岛素释放试验和C肽释放试验结果
注:血糖(GLU)空腹参考值:3.90-6.10 mmol/L;C 肽(C-P)空腹参考值:0.81-3.85ng/ml;胰岛素(INS)空腹参考值:3-25 uIU/ml;糖化血红蛋白(HbA1c)参考值:4-6%;平均血糖浓度(eAG)参考值:3.28-7.10 mmol/L。
b)提取先证者的基因组DNA(gDNA)进行全外显子测序(WES),全外显子组测序和序列分析均由北京福君基因生物技术有限公司进行。
检出了三个与患者临床表型高度相关的基因变异:APOB c.676G>A、INSR c.4028G>A和AKT2 c.433G>C(见表3)。
表3 先证者及其亲属基因检测结果
为了确定先证者基因突变的遗传来源,对先证者母亲及父亲进行了相应突变位点验证,结果显示先证者的基因变异来源于母亲。为了进一步确定先证者家系中与高脂血症相关的基因突变,再次对先证者母亲进行了全外显子基因测序,结果也发现了APOB c.676G>A、INSR c.4028G>A以及AKT2 c.433G>C这三个基因的位点突变,与临床表型高度相关。
对先证者母系其他家族成员进行APOB c.676G>A突变位点验证以及INSR c.4028G>A突变位点验证,结果显示先证者及其母亲、舅舅、外祖母均存在APOB c.676G>A位点突变(图2),先证者及其母亲、舅舅、外祖父均存在INSR c.4028G>A位点突变(图3)。
结合先证者家系的疾病史,由于患者的外祖母存在高脂血症及早发冠心病病史,而外祖父无高脂血症病史,故而先证者家系中的高脂血症病史可能与INSR c.4028G>A位点突变无关,因此,推测该家系的高脂血症可能与APOB c.676G>A位点突变存在一定的关联性。APOB(c.676G>A,p.A226T)为错义杂合突变,编码区第676号核苷酸由鸟嘌呤变异为腺嘌呤,导致在226位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸。
本实施例中,所有数据的获取都在符合法律规范、用户同意的基础上上,对数据的合法应用。先证者及家属均同意并且在知情同意书上进行了签字。此外,如未特别指明,本实施例所用试剂或仪器均为市售。
APOB c.676G>A功能研究
(1)保守性分析
为了进一步研究APOB突变对蛋白质功能的功能影响,针对APOB突变对蛋白质结构的影响进行了预测。图4为本发明实施例所涉及的APOB的蛋白结构图以及在不同物种间的氨基酸序列图。
APOB基因存在于人类第2号染色体的短臂末端,基因全长大约 43kb,负责编码4564个氨基酸,是目前已知人体分子量最大的蛋白质。APOB Ala226Thr突变位于APOB基因N端的卵黄皂苷元结构域(图4中的a部分),参与脂质的储存和转运。
根据保守分析,突变APOB p.A226T所在的位置高度保守,多个氨基酸序列比对表明A226在不同物种间是保守的,均为丙氨酸(A)(图4中的b部分)
(2)蛋白三维结构预测分析
使用phyre2服务器,预测野生型APOB48(WT-APOB48)及其突变型APOB48(A226T-APOB48)的三维(3D)结构,并通过与最终结果的直接对比进行全面分析建模。建立WT-APOB48和A226T-APOB48的3D结构模型作为参考模型。此外,使用PyMOL软件查看可视化3D结构。
图5为本发明实施例所涉及的APOB蛋白的三维结构预测图。结果显示,该位点突变导致第226位氨基酸与第684位氨基酸之间增加了一个氢键,影响了蛋白的空间结构域,导致基因的生物学功能发生了改变。综上所述,突变体APOB p.A226T可能会影响APOB的三级结构。
(3)体外活性研究
3-1)细胞培养
人肝癌细胞(HepG2)细胞、人胚肾细胞(HEK 293T)细胞购自中国科学院干细胞库。
细胞复苏
a.超净台提前紫外消毒30分钟,准备好细胞培养瓶、离心管、完全培养基等。水浴锅提前预热至37℃。
b.将细胞冻存管从液氮罐中小心取出,于37℃水浴锅中快速解冻。
c.于超净台中将细胞悬液转移至 15ml 离心管中,加入4ml完全培养基,1000rpm离心3分钟。
d.弃上清,使用 1ml 完全培养基重悬细胞沉淀,吹打混匀。
e.将细胞悬液转移至 T25 培养瓶中,加入4ml完全培养基,缓缓8字摇晃培养瓶至细胞均匀分布后,置于37℃恒温5%CO2培养箱中进行培养。
细胞传代
a.显微镜下观察细胞生长至汇合度达85%以上可进行细胞传代,吸去原有培养基。
b.加入2mlPBS缓冲液进行润洗2遍。
c.吸去PBS缓冲液,加入1ml胰蛋白酶进行消化。
d.消化完全后加入2ml完全培养基终止消化。
e.吹打贴壁细胞,收集细胞悬液转移至15ml离心管中,于离心机中1000rpm离心3分钟。
f.吸去上清保留细胞沉淀,加入3ml完全培养基进行细胞重悬。
g.将重悬后的细胞等分转移至新的培养瓶或培养皿中,加入适量完全培养基,缓缓8字摇晃至细胞均匀分布后,置于37℃恒温5%CO2培养箱中进行培养。
细胞冻存
a.如“细胞传代”步骤a-e。
b.吸去上清保留细胞沉淀,加入 1ml 冻存液,吹打混匀,转移至冻存管中,标记名称、姓名、日期。
c.将冻存管放入冻存盒中,置于-80℃低温冰箱,24 小时后放入液氮罐中长期保存。
3-2)质粒构建
a)pEnCMV-APOB-3×FLAG-SV40-Neo质粒构建
使用高保真DNA聚合酶(Vazyme #P505)按照下述引物分别进行片段扩增:
F1:5'-cttggtaccgagctcggatccATGGACCCGCCGAGGCCC-3'(序列1);
R1:5'-gtgatggaagagaaaCAGATTTGTAGAGTTGATAGTTCCGAG-3'(序列2);
F2:5'-atctgTTTCTCTTCCATCACTTGACCCA-3'(序列3);
R2:5'-gcggaccagttGTACAAGTTGCTGTAGACATTCGTGG-3'(序列4);
F3:5'-aacttgtacAACTGGTCCGCCTCCTACAGT-3'(序列5);
R3:5'-tgctggatatctgcagaattcTATCATATATGTCTGCAGTTGAGATAGTTTT-3'(序列6)。
使用pEnCMV-MCS-3×FLAG-SV40-Ne 双酶切(BamHI/EcoRI,NEB)后进行同源重组(Vazyme #C112)。
b)pCMV-FLAG-APOB-Linker-EGFP质粒构建
使用高保真DNA聚合酶(Vazyme #P505)按照下述引物分别进行片段扩增:
F1:5'-aaggacgacgatgacaagcttATGGACCCGCCGAGGCCC-3'(序列7);
R1:5'-gtgatggaagagaaaCAGATTTGTAGAGTTGATAGTTCCGAG-3'(序列8);
F2:5'-atctgTTTCTCTTCCATCACTTGACCCA-3'(序列9);
R2:5'-gcggaccagttGTACAAGTTGCTGTAGACATTCGTGG-3'(序列10);
F3:5'-aacttgtacAACTGGTCCGCCTCCTACAGT-3'(序列11);
R3:5'-gcttccccctcctccggtaccTATCATATATGTCTGCAGTTGAGATAGTTTT-3'(序列12)。
使用pCMV-FLAG-MCS-Linker-EGFP 双酶切(HindIII/KpnI,NEB)后进行同源重组(Vazyme #C112)。
c)pEnCMV-APOB(A226T)-3×FLAG-SV40-Neo质粒和pCMV-FLAGAPOB(A226T)-Linker-EGFP质粒构建
按照突变试剂盒(Vazyme #C215)的说明进行点突变,引物如下:
F:5'-GCCCACTTaCTCTCATCAAAGGCATGACCCGC-3'(序列13);
R:5'-GATGAGAGtAAGTGGGCTGATGCCTGTGCGGA-3'(序列14)。
d)通过在ABI3730xl测序仪上测序来验证所有构建体。
3-3)质粒转染
a)提前24h调整细胞密度:将HepG2细胞计数后种6孔板,设置分组为CON组(未转染质粒的细胞)、WT组(转染WT-APOB48-Flag 质粒的细胞)、Mut组(转染A226T-APOB48-Flag质粒的细胞)、WT-EGFP组(转染同时表达EGFP和WT-APOB48-Flag质粒的细胞)、Mut-EGFP组(转染同时表达EGFP和A226T-APOB48-Flag质粒的细胞)。使转染前细胞汇合度达到70-90%。
b)(以六孔板中单孔为例)取5ul Lipofectamine™3000溶解于125ul的Opti-MEM,取5ulP3000™及2.5ug质粒溶解于125ul的Opti-MEM,混合质粒溶液及Lipo溶液后于室温静置10min。同时除去种板细胞的原培养基,加入1ml无双抗新鲜培养基及质粒-lipo混合液。
c)观察细胞生长状态,荧光显微镜下显示转染效率达到70%左右时收集细胞进行后续实验。
d)人胚肾细胞(HEK293T)转染步骤同上。
3-3)DAPI染色
a)(以24孔板为例)除去HEK 293T细胞的原培养基,加入1ml多聚甲醛固定液固定10分钟。
b)加入1mlPBS缓冲液润洗2遍,每遍3分钟。
c)吸去PBS缓冲液,加入DAPI试剂100ul,染色15分钟。
d)加入1mlPBS缓冲液润洗3遍,每遍5分钟。
e)取载玻片,滴加10ul抗荧光猝灭封片液,取出24孔板圆形细胞爬片放置于盖玻片上,封片。
3-4)实时PCR
a)细胞RNA的提取(过柱法)
吸净6孔板中的培养基,加入1mlBuffer RL进行消化、裂解10-15分钟。
将裂解后的样本转移至FastPure gDNA-Filter Columns Ⅲ(FastPure gDNA-Filter Columns Ⅲ已放入收集管)中,12000rpm 离心30秒。弃掉FastPure gDNA-FilterColumns Ⅲ,收集滤液。
向滤液中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇,充分混匀。
将混合液全部转移至FastPure RNA Columns Ⅲ(FastPure RNA Columns Ⅲ已放入收集管)中,12000rpm离心30秒,弃滤液。
向FastPure RNA Columns Ⅲ中加入700ul的BufferRW1,12000rpm离心30秒,弃滤液。向FastPure RNA Columns Ⅲ中加入700ulBufferRW2(已加入无水乙醇),12000rpm离心30秒,弃滤液。向FastPure RNA Columns Ⅲ中加入500ulBufferRW2(已加入无水乙醇),12000rpm离心2分钟,小心将吸附柱从收集管中取出,避免接触滤液,导致污染。
小心将吸附柱转移至新的RNase-free Collection Tubes 1.5ml离心管中,向吸附柱中央悬空滴加50ul的RNase-free ddH2O,室温静置1分钟,12000rpm离心1分钟,洗脱RNA,收集滤液。
检测RNA浓度,一部分进行逆转录,剩余部分放于-80℃保存备用。
RNA的浓度和纯度测定:首先使用DEPC水对仪器进行校零,随后用DEPC水再次检测,误差不大即可进行测定。每次加样时需用擦镜纸将仪器擦净。吸取1.5ulRNA提取液用仪器进行检测,要求OD260/OD280在1.8-2.0之间,RNA浓度至少50ng/ul。每个样品至少检测2次,取平均值作为该样品的RNA浓度。
b)mRNA逆转录为cDNA
去除样本DNA
将上述各组分加至100ul的PCR管中,用移液器轻轻吹打混匀,置于RT-PCR仪上,条件设置为42℃,2分钟→4℃,∞。
逆转录反应
将上述各组分同样加至PCR管中,用移液器轻轻吹打混匀,置于RT-PCR仪上,反应条件为37℃,15分钟→85℃,5分钟→4℃,∞。
产物可立即用于qPCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。
c)实时荧光定量PCR(qPCR)
计算体系
将cNDA取出,插入冰盒中,室内避光。
准备96孔PCR板,按照实验设计的副孔数,加入相应体积的SYBR、ddH2O、cDNA和引物,4℃离心混匀后插入冰盒中。
加样完成后戴PE手套盖好封板膜,包上锡箔纸避光,可4℃短期保存。
上机前将96孔板离心1分钟,加入PCR仪中开始扩增反应。
反应时间如下:
通过LC480LightCycler进行实时PCR分析。使用比较方法(2-△△CT)确定相对基因表达。β-actin被用作内标。
3-5)免疫组化
a)RIPA法提取细胞蛋白
将RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂按100:1的比例混匀,弃去6孔板中的培养基,用预冷的PBS缓冲液清洗细胞3遍,每孔加入150uL的裂解液,于冰上裂解10分钟。
标记好1.5ml的EP管,用细胞刮板将裂解后的细胞收集入其中,涡旋振荡,并利用超声波细胞粉碎机粉碎细胞。
将EP管插入冰中,继续裂解20分钟,每隔10分钟振荡一次。
共裂解30分钟后,将EP管置于4℃离心机中12000rpm离心15分钟。
将离心后的上清液移入新的EP管中,一部分用于检测蛋白浓度,剩余部分,加入5×SDS蛋白上样缓冲液,于95℃金属浴上变性15分钟,放-80℃备用。
b)BCA检测蛋白浓度
配制BCA工作液:A液与B液体积比为50:1,混合后放于冰上备用。
将标准品稀释为0.5mg/ml。
制作标准曲线(冰上操作):
在96孔板的标准孔中依次加入不同体积的标准品,然后用PBS缓冲液补齐至20ul,具体如下表:
在待测样品孔中加入2ul待测样品和18ulPBS缓冲液。
在所有孔中各加入200ul预先配好的BCA工作液,于37℃孵育20-30分钟。
利用酶标仪在562nm波长检测各孔吸光度,利用标准曲线蛋白浓度及对应的OD值制作标准曲线,从而根据待测样品孔OD值计算其蛋白浓度。
c)蛋白印记
SDS-PAGE胶的制备:根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度,高分子量蛋白选用低浓度胶,低分子量蛋白选用高浓度胶。根据目的蛋白APOB的分子量选用10%的凝胶。首先将清洗后的制胶板(1.5mm)固定于制胶架上,用双蒸水检查是否漏液。验漏结束后,弃掉双蒸水,按配胶试剂盒说明书配制下层分离胶,即将分离胶溶液和缓冲液各4ml/块混匀,加入80ul/块过硫酸铵溶液促凝,震荡混匀后迅速灌入制胶板中,并加入适量无水乙醇溶液封闭液面,防止气体进入。分离胶凝固后,倒掉无水乙醇,取上层浓缩胶溶液和缓冲液各1ml/块,加入20ul/块过硫酸铵溶液,混匀后迅速灌入板中,灌满后插入1.5mm制胶梳,注意防止气泡产生,凝固后备用。
上样:将-80℃冰箱中的蛋白样品提前置于冰上融化。将配好的胶固定于电泳槽中,加入1×电泳缓冲液,缓慢拔出制胶梳。于两侧先加入4ul蛋白Marker,然后将待测样品依次缓慢加入孔中,避免产生气泡,避免样品溢出。
电泳:将电泳槽盖好,连接电泳仪,调至恒压,首先设定80V,时间约30分钟,待溴酚蓝条带跑过浓缩胶后,电压调至120V继续电泳,待条带跑至凝胶下缘,停止电泳。
转膜:将PVDF膜裁成适当大小的长方形,预先用甲醇激活10-15秒。将转膜夹浸泡于1×转膜液中,按照从正极到负极依次安装转膜夹:海绵、滤纸、PVDF膜、分离胶、滤纸、海绵,避免胶和PVDF膜之间存在气泡,将夹板夹好放于转膜槽中,夹子的黑面对应槽的黑面,夹子的白面对应槽的红面,灌满转膜液后放入冰袋,并将转膜槽置于冰盒内,连接仪器,恒流300mA转膜180分钟。
封闭:转膜完成后,取出PVDF膜,将其完全浸泡于5%脱脂牛奶中,PVDF膜正面朝上,在室温下缓慢摇晃封闭1小时。
一抗孵育:用一抗稀释液将抗体按照1:1000进行稀释(按照说明书稀释抗体),将PVDF膜完全浸于抗体溶液中,于4℃摇床上孵育过夜。
洗膜:第二天,将PVDF膜从一抗溶液中取出,用1×TBST洗膜3次,每次10分钟。
二抗孵育:用5%脱脂牛奶按1:20000比例稀释二抗,将膜完全浸泡其中,于摇床上室温孵育1小时。
洗膜:1×TBST洗膜3次,每次10分钟。
ECL化学发光检测:根据用量取ECL发光液A和B按1:1混匀,发光液避光保存,现配现用,均匀覆盖于膜上,利用全自动化学发光分析仪检测,并用ImageJ软件分析图像灰度值。
3-6)统计分析
用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度分析,对PCR结果及条带灰度值分析采用t检验进行统计比较,所有分析数据均使用Graph pad Prism 9 进行统计及绘图。每个实验需重复三次或以上。代表性的实验结果显示在图中。P﹤0.05被认为差异具有统计学意义。
3-7)检测结果
a)质粒分组转染结果
选择人HEK 293T细胞和HepG2细胞,分别用野生型APOB48(同时表达EGFP基因和WT-APOB48-Flag基因)质粒、突变型APOB48(同时表达EGFP基因和A226T APOB48-Flag基因)质粒对细胞进行转染,稳定转染后的细胞表达明亮的绿色荧光(图6,图7)。对照组未行干预,人HEK 293T细胞和HepG2细胞自发绿色荧光。
注:图6中,a图、b图、c图分别为×40、×100、×400镜下对照组HEK 293T细胞的绿色荧光表达,d图、e图、f图分别为×40、×100、×400镜下转染野生型质粒的HEK 293T细胞的绿色荧光表达,g图、h图、i图分别为×40、×100、×400镜下转染突变型质粒的HEK 293T细胞的绿色荧光表达。图7中,a图、b图、c图分别为×40、×100、×400镜下对照组HepG2细胞的绿色荧光表达,d图、e图、f图分别为×40、×100、×400镜下转染野生型质粒的HepG2细胞的绿色荧光表达,g图、h图、i图分别为×40、×100、×400镜下转染突变型质粒的HepG2细胞的绿色荧光表达。
b)APOB在细胞内的免疫荧光表达
为了验证突变型A226T-APOB的表达位置,选择人HEK 293T细胞,分别用野生型APOB48(同时表达EGFP基因和WT-APOB48-Flag基因)质粒、突变型APOB48(同时表达EGFP基因和A226T-APOB48-Flag基因)质粒对细胞进行转染,48h后进行DAPI染色,通过荧光显微镜观察突变型A226T-APOB的免疫荧光表达位置。结果发现,野生型APOB及突变型A226T-APOB主要定位于细胞质(图8)。
c)Ala226Thr-APOB突变的功能研究
与WT-APOB相比,Ala226Thr-APOB突变在转录水平和蛋白质表达水平上均无明显差异(图9)。图9中,(a)为HEK 293T细胞中WT-APOB和A226T-APOB的RNA表达水平直方图,(b)为HepG2细胞中WT-APOB和A226T-APOB的RNA表达水平直方图,(c)为HEK 293T细胞中WT-APOB和A226TAPOB的蛋白表达,(d)为Flag抗体孵育下,HEK 293T细胞中APOB蛋白的水平直方图,(e)为APOB抗体孵育下,HEK 293T细胞中APOB蛋白的水平直方图,(f)为HepG2细胞中WT-APOB和A226T-APOB的蛋白表达,(g)为APOB抗体孵育下,HepG2细胞中APOB蛋白的水平直方图,n代表实验次数,ns表示与WT-APOB相比,A226T-APOB的表达无统计学意义(p>0.05)。
先前的研究表明,FASN、ACACA、SREBF1、NRIH3、PPARGC1B、LPIN1、PPARA和CPT1A基因参与调控血脂代谢,与APOB基因的功能相关。为了进一步探索A226TAPOB突变的致病原因,选择14种血脂调控基因,包括参与三酰甘油酯(Triacylglycerol,TAG)合成的基因:LPIN1、LPIN2、LPIN3、DGAT1、DGAT2;参与脂肪生成的基因:FASN、ACACA;参与脂肪生成的转录因子:SREBF1、NR1H3、PPARGC1A、PPARGC1B;参与脂肪酸氧化的基因PPARA、CPT1A以及微粒体甘油三酯转移蛋白(MTTP),进一步通过引物设计、q-PCR实验,研究A226T-APOB突变对其他血脂调控基因的影响。
q-PCR结果显示,A226T-APOB突变会导致TAG合成基因(LPIN1、LPIN2、DGAT2)、脂肪生成基因(FASN、ACACA、SREBF1、PPARGC1B)以及脂肪酸氧化基因(CPT1A)的mRNA表达水平升高(图10)。图10中,(a)显示Ala226Thr-APOB突变会导致LPIN1表达升高,**代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.01(p=0.0021);Ala226Thr-APOB突变会导致LPIN2表达升高,**代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.01(p=0.0015);Ala226Thr-APOB突变会导致DAGT2表达升高,*代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.05(p=0.0284);(b)显示Ala226Thr-APOB突变会导致FASN表达升高,*代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.05(p=0.0131);Ala226Thr-APOB突变会导致ACACA表达升高,*代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.05(p=0.0361);Ala226Thr-APOB突变会导致SREBF1表达升高,*代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.05(p=0.0129);Ala226Thr-APOB突变会导致PPARGC1B表达升高,*代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.05(p=0.0468);Ala226Thr-APOB突变会导致CPT1A表达升高,*代表与WT-APOB相比,A226T-APOB突变的p﹤0.05(p=0.0361)。ns表示与WT-APOB相比,A226T-APOB的表达无统计学意义(p>0.05)。
3-8)结论
本研究通过对一个FH家系的临床病史资料收集及基因测序分析,发现了APOB突变位点(c.676G>A,p.A226T),该基因突变与FH临床表型高度相关。通过体外功能研究,证实APOB(c.676G>A,p.A226T)位点突变导致TAG合成基因(LPIN1、LPIN2、DGAT2)和脂肪生成基因(FASN、ACACA、SREBF1、PPARGC1B)的表达水平升高,引起血液循环中胆固醇和甘油三酯增多,与先证者的FH病史和急性胰腺炎的反复发作相关。
综上,根据实施例的上述研究及研究结果显示,APOB c.676G>A突变或APOBp.A226T突变会损害APOB蛋白的功能。APOB c.676G>A突变或APOB p.A226T突变是本实施例中的家族性高胆固醇血症家系的致病突变。本实施例发现的APOB c.676G>A(p.A226T)突变,是家族性家族性高胆固醇血症新的致病基因,且呈常染色体显性遗传。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明,但是可以理解,上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化,这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (10)
1. 一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查家族性高胆固醇血症患者的产品的应用,其特征在于,所述APOB基因变异为APOB c.676G>A,所述APOB蛋白变异为APOB p.A226T。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括用于扩增APOB基因的引物对和/或用于检测所述APOB基因变异的探针。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述引物对根据人基因组中APOB基因编码区第676位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到,所述探针根据人基因组中APOB基因编码区第676位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括使用以下方法中的至少一种来检测所述APOB蛋白变异的试剂:蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。
6. 根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述试剂包括可识别具有APOB p.A226T变异的APOB蛋白的抗体。
7.根据权利要求2或5所述的应用,其特征在于,所述产品还包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种,且所述APOB基因变异是指APOB基因的胚系变异,所述APOB蛋白变异是指APOB蛋白的胚系变异。
9.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述APOB基因变异为杂合突变或纯合突变,所述APOB蛋白变异为杂合突变或纯合突变。
10. 一种检测样本中APOB基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估家族性高胆固醇血症易感性的产品的应用,其特征在于,所述APOB基因变异为APOB c.676G>A,所述APOB蛋白变异为APOB p.A226T。
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