CN109457027A - 家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家族性高胆固醇血症基因检测用的试剂盒，该试剂盒包括同时检测LDLR基因SEQ 1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ 2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ 3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ 4中第558位变异位点和APOB基因SEQ 5中第398位变异位点的特异性引物及二代测序检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过二代测序技术同时检测分析LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因和APOB基因上的变异位点，可快速、低成本的在临床上辅助诊断FH患者。

Description

家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医学和生物技术，具体涉及一种家族性高胆固醇血症基因检测用的试剂盒，该试剂盒可基于二代测序技术同时检测LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因和APOB基因的变异位点，从而在临床上辅助诊断患该疾病的个体。

背景技术

家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia，FH)是一种以血浆低密度脂蛋白胆固醇浓度显著升高为特征的遗传性疾病，其它临床特征表现为总胆固醇(TC)水平显著升高、脂类在皮肤肌腱和动脉处堆积，引起早发性动脉粥样硬化，增加心血管疾病的发生风险，严重者青少年时期可发生冠心病甚至心梗死亡。

家族性高胆固醇血症主要分二种类型：杂合子FH，属于这一类者，子女从父母一方中遗传FH基因；纯合子FH，属于这一类者，子女从父母双方遗传FH基因。在西方国家，普通人群中杂合子FH的患病率在1/200-1/600，有奠基者效应的地区(例如南非、加拿大的魁北克和黎巴嫩等)除外。以往报道的纯合子FH患病率大概是1/100万，目前的患病率可能是之前预测的3倍左右。因此，据估计世界范围内有将近3600万的FH患者，在中国则有将近380万FH患者。

而目前的数据显示，在大多数国家，FH都没有得到充分的诊断和治疗，尤其是在国内，FH没有得到广泛的重视。由于缺乏足够的重视和有效的检测方法，我国FH患者的诊断率较低，目前国内FH的发病率还是未知的。

2016年国际动脉粥样硬化学会(IAS)专家组对严重家族性高胆固醇血症(FH)发布的共识声明指出，高胆固醇血症是动脉粥样硬化心血管疾病的一个独立因素。另外，FH的严重程度与开始治疗的年龄也有关系，晚期治疗的患者具有更高的动脉粥样硬化性心血管疾病风险。英国一项对3382例FH患者长达26年的随访结果提示，管理欠佳的FH患者常有更高的死亡率和心血管事件再发率。基于以上数据，FH患者早期诊断和积极干预十分重要，而基因检测可以帮助FH的早期诊断。因此，开发适用于家族性高胆固醇血症的高通量基因检测试剂盒，将有助于尽早诊断FH患者并对其进行管理和干预治疗，解决临床上一类脂质代谢疾病的辅助诊断难题。

目前，FH的基因检测主要通过一代测序方法，该方法相对比较成熟、全面、读长较长、准确性高，判读结果相对简单；但是它也有不可避免的缺点，如操作相对繁琐不能自动化，测序成本高、通量低，能够检测的突变类型比较单一，对于多位点、大样本病例筛查还是难以完成的。

发明内容

本发明提供一种应用二代测序法的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，可以解决现有技术中的上述缺陷。

本发明的技术方案如下：

一种家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，该试剂盒包括：检测LDLR基因SEQ 1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ 2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ 3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ 4中第558位变异位点和APOB基因SEQ 5中第398位变异位点的特异性引物对。所述特异性引物对可以为引物混合液。

所述的特异性引物对是指针对SEQ 1中第207位变异位点、SEQ 2中第357位变异位点、SEQ 3中第255位变异位点、SEQ 4中第558位变异位点、SEQ 5中第398位变异位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ 1中第207位变异位点的DNA片段、包含SEQ 2中第357位变异位点的DNA片段、包含SEQ 3中第255位变异位点的DNA片段、包含SEQ 4中第558位变异位点的DNA片段、包含SEQ 5中第398位变异位点的DNA片段的引物对。

优选地，所述试剂盒中包含具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的引物对、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示序列的引物对、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的引物对、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的引物对、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示序列的引物对、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示序列的引物对、SEQ ID NO:18和SEQID NO:19所示序列的引物对、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示序列的引物对、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23所示序列的引物对、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示序列的引物对、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示序列的引物对、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示序列的引物对、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示序列的引物对、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33所示序列的引物对、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示序列的引物对、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37所示序列的引物对、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示序列的引物对、SEQID NO:40和SEQ ID NO:41所示序列的引物对、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列的引物对。

本发明的特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。

本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于上述的19对引物。

本发明的试剂盒还包括引物混合液、多重PCR混合液、消化缓冲液、消化酶混合液、终止缓冲液、第2轮PCR混合液、TEBuffer、纯化磁珠。上述各常规成分可直接购买得到。

本发明试剂盒的每一人份还包括：

2μL引物混合液；

2μL多重PCR混合液；

2μL消化缓冲液；

2μL消化酶混合液；

2μL终止缓冲液；

8μL第2轮PCR混合液；

30μL TEBuffer；

95μL纯化磁珠。

本发明的试剂盒中包含的试剂所适用的样品份数可以为一人份、二人份、四人份、八人份、更多人份等等，本发明不对此进行限定，本领域技术人员可根据需求自行选择和设置。

本发明的试剂盒的保存温度为-20℃。

一种上述任一的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒的使用方法，包含以下步骤：

(1)从待检测生物样品中提取基因组DNA样本；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA样本为模板特异性扩增目的片段，构建测序文库，测序文库质量检测，测序文库进行测序，获得测序结果，检测出所述变异位点。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次提供了一种基于二代测序方法检测家族性高胆固醇血症相关基因的试剂盒，该试剂盒可同时检测多个基因、多个突变位点，测序通量和效率大大提高，成本相对降低，检测性价比高；

(2)本发明通过检测受试者是否携带LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因以及APOB基因的致病突变，可以早期筛查受试者是否携带家族性高胆固醇血症基因突变，为分子诊断提供依据，根据突变类型同时结合临床诊断结果，给予受试者不同的干预治疗；

(3)本发明的基因检测试剂盒基于多重PCR技术进行测序文库构建，单管可进行多个片段的扩增。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1是一例高血脂样本LDLR基因SEQ 1中第207位(c.G986A)变异位点的一代测序验证峰图，与本发明实施例的试剂盒检测出来的结果一致；

图2是另一例高血脂样本LDLR基因SEQ 2中第357位(c.C1747T)变异位点的一代测序验证峰图，与本发明实施例的试剂盒检测出来的结果一致；

图3是又一例高血脂样本LDLRAP1基因SEQ 4中第558位(c.T604C)变异位点的一代测序验证峰图，与本发明实施例的试剂盒检测出来的结果一致。

具体实施方式

目前研究认为，FH的发病机制主要为低密度脂蛋白受体基因(LDLR)突变、载脂蛋白B基因(APOB)突变(APOB是LDLR相互作用的配体蛋白)以及枯草溶菌素转化酶9基因(PCSK9)突变引起LDL受体途径功能缺陷，主要为常染色体显性遗传；部分患者为常染色体隐性遗传，机制为低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)功能丧失型突变，导致LDL内化活性降低。

LDLR基因位于19号染色体上(Ch19p13.1-13.3)，共包括18个外显子和17个内含子，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因的外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应:(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子1编码5’端序列及信号肽；(3)外显子2～6编码LDLR配体结合区域；(4)外显子7～14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR O-连接糖链结构域；(6)外显子16和部分外显子17编码跨膜结构域；(7)外显子17其余部分和外显子18编码胞浆区。LDLR为跨膜蛋白，广泛分布于肝脏、动脉壁平滑肌、血管内皮细胞和白细胞，特异结合含APOB和载脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)的脂蛋白进入细胞内进行代谢，可清除血中2/3的LDL。LDLR对胆固醇代谢至关重要，该基因任何部位出现突变均可能致病，根据LDLR蛋白合成与功能为基础，突变可划分为5种类型：第一类突变不表达等位基因，包括启动子序列突变、无义突变、移码突变、剪接突变，这类突变导致细胞不表达LDLR；第二类突变为转运缺陷型等位基因，主要发生在配体结合区域和表皮生长因子前体结构域，虽然能合成受体，但从内质网向高尔基体的转运受到障碍，堆积在内质网中，最终被降解；第三类突变为结合缺陷型等位基因，本型较常见，特点为突变基因编码的异常受体蛋白可以到达细胞表面，但丧失了结合LDL的功能，这类突变同样发生在配体结合区域和表皮生长因子前体结构域；第四类突变为内移缺陷型等位基因，较为罕见，发生在胞浆区域或是跨膜区域，由于编码NPVY序列的密码子发生突变造成，特点是受体能与LDL结合，但不能将其转运到细胞表面并聚集于被覆陷窝；第五类突变为再循环缺陷型等位基因，受体能够结合LDL，也能内移进入细胞，但在溶酶体内不能与LDL分离，受体与配体被同时降解，导致LDLR不能够再循环到细胞表面，这类突变多发生在表皮生长因子前体结构区域。

APOB基因位于2号染色体上(2p23-24)，包括29个外显子和28个内含子，编码的蛋白长4563个氨基酸。APOB是LDL颗粒中主要的载脂蛋白，它可以和LDLR受体结合，APOB蛋白的主要功能是结合和转运脂质，从而介导LDL的降解及清除。APOB基因突变可导致遗传性疾病家族性apoB缺陷症(familial defective apolipoprotein B100FDB)和低β脂蛋白血症，该基因突变同时可引起家族性高胆固醇血症的发生。我国常见该基因突变为Arg3500Trp，但是Arg3500Gln突变更有意义，由于它会造成APOB局部结构紊乱，APOB3500位精氨酸被谷酰胺置换后，改变了位于突变部位附近赖氨酸残基的PK值，使APOB二级结构发生改变，因此影响APOB与受体结合的功能，从而产生受体结合障碍。进一步导致LDL-C的清除障碍，诱发血浆LDL-C升高，最终造成动脉粥样硬化的发生。

PCSK9基因位于1号染色体上(1p34-32)，包含12个外显子和11个内含子，编码含692个氨基酸的糖蛋白，主要在肝脏、小肠中表达。多项研究表明，PCSK9在调节LDL胆固醇代谢中起着重要作用，PCSK9前体裂解后可和LDLR结合，使LDLR不能完成循环通路返回肝细胞表面，而在肝细胞溶酶体内降解，因而它是一个固醇调节类基因。人体中PCSK9有两种突变类型，功能性获得型和功能性缺失型突变，其中功能性获得型突变导致LDLR合成下降，从而下调LDL受体途径，使机体通过LDLR清除胆固醇的作用减弱，导致LDL-C水平升高，从而可能导致家族性高胆固醇血症，引起动脉粥样硬化和心血管疾病。

LDLRAP1基因位于1号染色体上(1p36.11)，包含9个外显子和8个内含子，编码的蛋白长为308个氨基酸，该基因编码的蛋白质是含有磷酸酪氨酸(PTD)结构域的胞质蛋白质，PTD结构域与LDL受体的细胞质尾端相互作用。该基因的突变能够导致LDL受体功能障碍，从而引起家族性高胆固醇血症。

二代测序(NGS)技术具有高通量的特性，能够一次检测多个基因的多个突变位点附近的序列，从而能够同时鉴别出已知和未知的突变类型，节省样本DNA用量，检测性价比高。该方法目前已有较高的精确度和稳定性，具备了进入临床检测的条件。此外，二代测序技术可同时对多个样本多个基因位点进行快速检测，具有较高的精确度和稳定性。因此，开发基于NGS技术的FH基因检测试剂盒，提高检测特异性和准确性，显著降低成本提高经济效益，对解决当前中国人群脂质代谢疾病的预防和及早检测、管理治疗，将起到很大的推动作用。

针对家族性高胆固醇血症相关致病基因LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因和APOB基因上的变异位点，本发明提供一种检测家族性高胆固醇血症相关基因变异位点的试剂盒，具体是一种基于二代测序方法检测家族性高胆固醇血症相关基因的试剂盒。

本发明提供的检测家族性高胆固醇血症相关基因变异位点的试剂盒，在使用时包含以下步骤：

(1)从待检测生物样品中提取基因组DNA样本；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA样本为模板构建测序文库，测序文库质量检测，测序文库进行测序，获得测序结果，检测出所述变异位点。

其中，测序文库是针对所述基因组DNA样本，构建的用于测序的一种样品。

构建测序文库包括特异性扩增目的片段、用磁珠纯化扩增产物、消化非特异片段、纯化产物、第二轮PCR反应添加测序标签、纯化文库等步骤。

测序文库质量检测包括测序文库浓度检测，测序文库片段大小检测。

在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。下列实施例中试剂盒的常规组分、二代测序专用的接头和标签引物均为市售获得。

实施例1

本实施例提供一种检测家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其包括：

包含具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的引物对、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示序列的引物对、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的引物对、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的引物对、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示序列的引物对、SEQID NO:16和SEQ ID NO:17所示序列的引物对、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示序列的引物对、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示序列的引物对、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示序列的引物对、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示序列的引物对、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27所示序列的引物对、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示序列的引物对、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31所示序列的引物对、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示序列的引物对、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示序列的引物对、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37所示序列的引物对、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示序列的引物对、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41所示序列的引物对、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列的引物对。

本实施例的试剂盒为多人份试剂盒，其内还包括每人份如下组分：

2μL引物混合液；

2μL多重PCR混合液；

2μL消化缓冲液；

2μL消化酶混合液；

2μL终止缓冲液；

8μL第2轮PCR混合液；

30μL TEBuffer；

95μL纯化磁珠。

将本发明的试剂盒在-20℃温度下保存。

本实施例的检测试剂盒用于检测家族性高胆固醇血症的方法如下：

步骤1:基因组DNA模板的提取

本发明在南通市第一人民医院收集了8例高血脂散发病例的血样标本，用磁珠法提取人全血样本中的基因组DNA。

步骤2:测序文库构建及测序检测

使用本实施例的可检测家族性高胆固醇血症相关基因的检测试剂盒，本实施例的试剂盒中的混合引物特异地针对检测每个样品中的LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因以及APOB基因的致病突变。

该试剂盒每个病例标本的反应体系为总体积10μL，包含浓度为10ng/μL的基因组DNA模板6μL、引物混合液2μL、多重PCR混合液2μL。置于PCR扩增仪上进行反应，反应条件为：95℃预热10分钟；98℃ 15秒，60℃ 5分钟循环10次。

反应结束后，每管加26μL纯化磁珠纯化PCR产物，纯化后每管加2μL消化缓冲液37℃反应10分钟后马上加2μL终止缓冲液，以去除非特异性产物。然后每管加29μL纯化磁珠再做一次纯化，纯化后产物加入8μL第2轮PCR混合液和二代测序专用的接头和标签引物，混匀后按以下程序进行反应：95℃预热10分钟；98℃ 15秒，60℃ 75秒循环10次。反应结束后，加40μL纯化磁珠纯化，得到测序文库，测序文库进行二代测序，得到测序结果。

步骤3:结果分析

本次实施例中，本试剂盒检测出有3例样本带有所述突变位点，检测结果见下表1；用Sanger一代测序方法对携带突变位点的样本进行测序验证，验证结果见图1-图3。

表1

对比本发明上述实施例的表1测试结果和一代测序验证结果图1-图3，证明本试剂盒检测突变位点的准确性。

以上实施例中所使用的试剂盒为多人份的，试剂盒内所含试剂具体适用的样本的份数，可由本领域技术人员根据需求自行选择和设定，本发明不对此进行限定。

在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

<110>上海星耀医学科技发展有限公司 上海复星长征医学科学有限公司

<120>家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒

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gggttTGGTTGCCATGTCA

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ACGTCTGCAATGACCTTAAGATC

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

GATAGTTTTCCATGCAGGTGGAA

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccatctgttaagtgTGCTTGAAAG

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cccggccTGAAATTTCTTAATTACT

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cccagccTCCTTGAAGTTTTT

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

GTGAAGTTTGGAGTCAACCCA

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

CCTTATCCACTTGTGTGTCTAGATCT

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 15

GTTCATCTTGGCTTGAGTGATCTA

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 16

GTGGCTTACGTACGAGATGC

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 17

gaagaaaaTAGAAATAACTCAGGTCTAAGACC

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 18

CGCTAGACATGTGCTTTCTTTTC

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 19

CCTGACTACACACGTGTTGTC

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

CTTTCTTTTCCTCGGGCTCTG

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

CAGACACCCATCCTGGGAT

<210>22

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

GGCCGTGACAGCCGTTG

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

GCACCCAGAGTGAGTGAGTT

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

GTTTTCAGGCACAGGCTGTTA

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

caccacacCCACAATGTAGAT

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

CCACCGCTAATCACCCCT

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

TGAAAAACCAAGAGGCTCTCC

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

GGTAGAGTACAGCATTGAAGAATTGA

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

GGAGGGTAGTCATAACAGTACTGT

<210>30

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

TAGTTCCTGAATATTCCCGAGAAAGAA

<210>31

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 31

ATACCAAGTCAAAACCTACTGTCTCT

<210>32

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 32

TCAAGGTTCCAGATATCATCAATTTTGG

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 33

CCTCACCTCTTACTTTTCCATTGAG

<210>34

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

CCCTCTAGCTGTAAGTGGTTTTT

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 35

TAGTGAGGCCAACACTTACTTGA

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 36

CAGGGAAATCATGGAAGGAACTG

<210>37

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 37

GCCACACTCCAACGCATATATT

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 38

CTTTTCTTGGTCATTGGAAAGCTC

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 39

CAAATGTCAGCTCTTGTTCAGGT

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

GAAGATGCTGTCTCCTACCAATG

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

GATTCATTCTGGGTCTTTCCAGAG

<210>42

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

GCATGACAAGAACTGAATTTAGATCATTT

<210>43

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

GACAAGAGCTTATGGGATTTCCTAAAG

Claims (8)

1.一种家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：检测LDLR基因SEQ 1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ 2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ 3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ 4中第558位变异位点和APOB基因SEQ 5中第398位变异位点的特异性引物对。

2.如权利要求1所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物对是针对SEQ 1中第207位变异位点、SEQ 2中第357位变异位点、SEQ 3中第255位变异位点、SEQ 4中第558位变异位点、SEQ 5中第398位变异位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ 1中第207位变异位点的DNA片段、包含SEQ 2中第357位变异位点的DNA片段、包含SEQ 3中第255位变异位点的DNA片段、包含SEQ 4中第558位变异位点的DNA片段、包含SEQ 5中第398位变异位点的DNA片段的引物对。

3.如权利要求1或2所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的引物对、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示序列的引物对、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的引物对、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的引物对、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示序列的引物对、SEQID NO:16和SEQ ID NO:17所示序列的引物对、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示序列的引物对、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示序列的引物对、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示序列的引物对、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示序列的引物对、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27所示序列的引物对、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示序列的引物对、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31所示序列的引物对、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示序列的引物对、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示序列的引物对、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37所示序列的引物对、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示序列的引物对、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41所示序列的引物对、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列的引物对。

4.如权利要求1所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物对用常规的合成技术进行合成。

5.如权利要求1所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR混合液、消化缓冲液、终止缓冲液、第2轮PCR混合液、TEBuffer、纯化磁珠。

6.如权利要求1所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每一人份还包括：

2μL引物混合液；

2μL多重PCR混合液；

2μL消化缓冲液；

2μL消化酶混合液；

2μL终止缓冲液；

8μL第2轮PCR混合液；

30μL TEBuffer；

95μL纯化磁珠。

7.如权利要求1所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的保存温度为-20℃。

8.一种权利要求1-7中任一所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)从待检测生物样品中提取基因组DNA样本；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA样本为模板特异性扩增目的片段，构建测序文库，测序文库质量检测，测序文库进行测序，获得测序结果，检测出所述变异位点。