CN117088978A - 一种抗adpn抗体或其功能性片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及抗ADPN抗体或其功能性片段及其应用。本发明不仅提供了一种与ADPN结合高亲和力的单克隆抗体(野生型),还提供了多种野生序列的突变序列,均能够高效识别天然多聚ADPN,反应性良好,适于在体外诊断中使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种抗ADPN抗体或其功能性片段及其应用。
背景技术
脂联素(Adiponectin,ADPN)是脂肪细胞分泌的具有生物活性的一类激素,由244个氨基酸组成的多肽蛋白,属于补体1q家族,在人体内以3~30μg/ml的浓度出现在循环血液中,约占总血浆蛋白0.05%。ADPN相对分子质量30KD,分为四个结构域:N端的分泌信号序列(aa 1-18)、可变区(aa 19-41)、胶原重复序列样结构域(aa 42-107)和C端的球状结构域(aa 108-244)。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位,和TNF-α的结构相似,脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q结构高度同源。脂联素由脂联素单体组成,脂联素单体连接形成三聚体,4-6个三聚体结合形成高分子结构,脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基,可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白藕联受体一型或二型脂联素受体,进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。并且脂联素单体只存在于脂肪细胞中,形成多聚体后才会被分泌到血浆中。脂联素在血液中存在四种形式,分别为全长的三聚体、六聚体、多聚体(Polymer)及球形脂联素(globular adiopnectin)。
糖尿病是一种以血浆葡萄糖升高为特征的代谢性疾病。糖尿病可以被分成四类,Ⅰ型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病,病因一般是自身免疫缺陷或是遗传所致,临床表现为胰岛β细胞被破坏,导致胰岛素分泌绝对缺乏,患者需要终身注射外源性胰岛素以控制血糖;Ⅱ型糖尿病又称非胰岛素依赖性糖尿病,病因是胰岛胰岛β细胞功能缺陷导致胰岛素分泌减少(或相对减少)或胰岛素抵抗所导致的胰岛素在机体内调控葡萄糖代谢能力下降或两者共同存在;妊娠糖尿病妊娠期间被诊断的糖尿病,妊娠期间产生的大量多种激素可能引起胰岛素抵抗;以及特殊类型糖尿病。其中Ⅱ型糖尿病占到了90%,而ADPN作为Ⅱ型糖尿病早期风险预测新指标,可以有效的在早期就发现是否存在糖尿病,在糖尿病变成不可逆,无法治愈的疾病前进行诊断,可作为早期筛查和体检的标志物。
目前,脂联素的检测方法主要是基于免疫原理的方法学,因为脂联素可以形成多聚体,所以单株抗体即可形成免疫反应。本专利中开发了一株脂联素抗体,能有效的识别人体内各种天然形态的脂联素抗原,可定量检测人体内中脂联素含量,应用于体外多种方法学的定量检测。
发明内容
本发明的目的在于提供抗ADPN抗体或其功能性片段,实现与ADPN蛋白的特异性结合,并最终应用到ADPN的纯化和检测校准品中。
具体如下:
抗ADPN抗体或其功能性片段具有如下互补决定区:
CDR-VH1:G-X1-T-X2-N,其中X1是Y或D,X2是M或N;
CDR-VH2:L-I-X1-P-Y-N-D-X2-T-T-Y-N-Q-X3-F-K-G,其中X1是Q或N,X2是V或I或L,X3是K或W;
CDR-VH3:S-L-V-X1-L-H-Y-X2-Y-F-D-V,其中X1是K或R,X2是K或W;
CDR-VL1:R-A-X1-E-N-I-Y-S-Y-X2-A,其中X1是T或S,X2是I或L;
CDR-VL2:N-X1-K-T-X2-A-E,其中X1是A或V,X2是L或V;和CDR-VL3:Q-X1-H-Y-G-X2-P-F-T,其中X1是H或Q,X2是T或S。
进一步地,所述互补决定区的CDR-VH1的X2是M,CDR-VH2的X1是N,CDR-VH3的X2是W,CDR-VL1的X1是S,CDR-VL2的X2是L,CDR-VL3的X1是H。
本发明所述CDR区段划分采用Kabat算法。
“CDR”在本文中用于指抗体可变序列内的“互补决定区”。重链和轻链的可变区各有3个CDR,从重链或轻链的N端开始。
抗原结合位点可以包括六个CDR(本发明中的CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3、CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3)。包含单个CDR(例如CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3、CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3)的多肽可称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触,其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此,分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。一般而言,CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
本发明的发明人发现,在各互补决定区中的上述突变位点为上述氨基酸残基时,该抗体对ADPN蛋白具有更好的亲和力。
在可选的实施例中,所述CDR-VH1中X1是Y;
在可选的实施例中,所述CDR-VH1中X1是D;
在可选的实施例中,所述CDR-VH1中X2是M;
在可选的实施例中,所述CDR-VH1中X2是N;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X1是Q;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X1是N;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X2是V;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X2是I;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X2是L;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X3是K;
在可选的实施例中,所述CDR-VH2中X3是W;
在可选的实施例中,所述CDR-VH3中X1是K;
在可选的实施例中,所述CDR-VH3中X1是R;
在可选的实施例中,所述CDR-VH3中X2是K;
在可选的实施例中,所述CDR-VH3中X2是W;
在可选的实施例中,所述CDR-VL1中X1是T;
在可选的实施例中,所述CDR-VL1中X1是S;
在可选的实施例中,所述CDR-VL1中X2是I;
在可选的实施例中,所述CDR-VL1中X2是L;
在可选的实施例中,所述CDR-VL2中X1是A;
在可选的实施例中,所述CDR-VL2中X1是V;
在可选的实施例中,所述CDR-VL2中X2是L;
在可选的实施例中,所述CDR-VL2中X2是V;
在可选的实施例中,所述CDR-VL3中X1是H;
在可选的实施例中,所述CDR-VL3中X1是Q;
在可选的实施例中,所述CDR-VL3中X2是T;
在可选的实施例中,所述CDR-VL3中X2是S;
优选的,所述各互补决定区选自如下突变组合中任意一种:
进一步地,所述抗体包括轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L和重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H;所述重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H依次选自SEQ IDNO:1-4;所述轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L依次选自SEQ ID NO:5-8。
进一步地,所述抗体还包含恒定区。
优选的,所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区,优选的,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
优选的,所述功能性片段选自所述抗体的VHH、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
进一步地,所述抗体为标记抗体。
本发明所述“标记抗体”为标记有可被检测的标记物。
术语“抗体”包括各种形式的抗体结构,包括但不限于完整抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠抗体,嵌合抗体或进一步的基因工程抗体,只要保留根据本发明的特征性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分,优选其可变结构域,或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;单链抗体分子;scFv、sc(Fv)2;双抗体;和由抗体片段形成的多特异性抗体。
优选的,所述可被检测的标记物包括但不限于生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物;
优选的,所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、AlexaFluor®系列染料及其衍生物、ATTOTM系列染料、TYE系列染料、量子点和蛋白类染料及其衍生物等;所述酶为催化底物显色的酶所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶;
优选的,所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶;
优选的,所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F;
优选的,所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物;
优选的,所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒;
优选的,所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶;
优选的,所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
另一方面,本发明公开了所述抗ADPN抗体在纯化ADPN蛋白中的用途。
另一方面,本发明公开了所述抗ADPN抗体在检测ADPN抗体试剂盒中作为校准质控的用途。
优选的,所述试剂盒检测的样本选自全血、血清、血浆、尿液或唾液的体液。
附图说明
图1是突变2-25纯化凝胶图;
图2是突变2-25应用于ADPN胶乳比浊法检测的线性效果。
具体实施方式
具体为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试。除非另有说明,否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
如本文所用,术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”及其变体旨在是开放式的不排除附加行为或结构的可能性的过渡性短语、术语或词语。
除非另外指明,否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(AnimalCellCulture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(MethodsinEnzymology)》(学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.);《实验免疫学手册(HandbookofExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(GeneTransferVectorsforMammalianCells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymeraseChainReaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(CurrentProtocolsinImmunology)》(J.E.Coligan等人编,1991),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1 单克隆抗体的制备
A、脂联素(ADPN)的制备
常规重组的ADPN免疫原均为单体,制备出的抗体有可能无法识别人体血液中的多聚状态的脂联素抗体,为此,本专利收集了健康的志愿者的血清,采用外购鼠抗人脂联素单克隆抗体偶联至琼脂糖4B纯化柱中,在PBS的缓冲液平衡后取血清结合过夜,再在用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲进行洗脱,从而纯化出天然的脂联素蛋白,作为免疫原以制备抗体。
B、鼠免疫及抗体检测
挑选5只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,将弗氏完全佐剂与浓度为2 mg/ml的ADPN蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40 μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后,将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化,再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40 μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血,离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。2次免疫后,百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上。筛选血清效价106以上的小鼠,取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。
C、细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆
分离免疫小鼠的淋巴细胞与培养的SP2/0细胞进行PEG1500介导的融合或者进行电融合。融合细胞培养在包含20%FBS血清的HAT-1640培养基中筛选培养。一周之后更换培养基,再培养4天之后取培养上清用于阳性克隆筛选。采用ADPN进行阳性孔筛选。选取ELISA阳性值与细胞数比值较高的孔进行多次亚克隆。用ADPN蛋白包被ELISA板。取亚克隆的培养上清筛选在抗原包被条件下能表现亲和力的单克隆,从中选出亲和力最高的单克隆杂交瘤细胞,最终得到一株能够分泌ADPN单克隆抗体的抗体效价较高的杂交瘤细胞株,命名为37#,其稳定性较好。
D、单克隆抗体的生产纯化
选择两组6-8周BALB/c小鼠,腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向小鼠腹腔内注入0.5ml的细胞37#,细胞数量约1×106。两周之后开始腹水收集。收集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体37#。
E、单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒,按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为:
1、用包被液(0.05 M pH 9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1 μg/mL,按照100 μL/孔加入酶标板,于4℃包被过夜。用含有0.05% Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。
2、用稀释液(1%BSA,0.1%PBST)按照1:1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清,按照100 μL/孔加入酶标板,于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP,IgG1-HRP,IgG2a-HRP,IgG2b-HRP,IgG3-HRP,IgM-HRP,kappa-HRP,lamda-HRP)1:3000稀释。
3、用洗板液3次洗板后每孔加入100 μL稀释的酶标抗体,于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液,约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应,读取OD450吸光值。经过鉴定,抗体37#重链亚型均为IgG1,轻链为Kappa。
根据抗体亚型结果,采用基于RACE技术路线的方法克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞,使用总RNA提取试剂盒获得杂交瘤细胞总RNA,按照Takara公司的SMARTer RACE说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA,并扩增目的抗体全长序列。
实施例2 抗体性能的验证
1、ELISA亲和力测试
利用包被液(0.05 M pH=9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将羊抗鼠稀释至1ug/mL,按照每孔100μL的量加入96孔酶标板,于4℃包被过夜。用含有0.05% Tween-20的PBS缓冲液进行3次洗板。用稀释液(1%BSA,0.1%PBST)将抗体稀释至1ug/mL,按照每孔100 μL的量加入96孔酶标板,于37℃孵育30分钟。用稀释液将生物素标记的ADPN稀释至100 ng/mL,取出37℃孵育的酶标板,进行3次洗板,将准备好的抗体犬C反应蛋白稀释液按150 μL的量加入A行的96孔酶标板,将稀释液按照每孔100 μL的量加入B~H行96孔酶标板中,取A行孔中的抗体稀释液50 uL,从B行依次进行3倍梯度稀释,于37℃孵育30分钟。用稀释液将标记辣根过氧化物酶的亲和素按1:5000稀释,取出酶标板进行3次洗板,按照每孔100 μL的量加入96孔酶标板,于37℃孵育30分钟。取出酶标板进行3次洗板,加入显色液,室温显色3分钟,加入0.5 M硫酸终止反应,在读板仪上读取OD450值。
实施例1中的抗体37#其重链可变区如SEQ ID NO:9所示,其中,重链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下:
CDR-VH1:G-D(X1)-T-M(X2)-N
CDR-VH2:L-I-Q(X1)-P-Y-N-D-V(X2)-T-T-Y-N-Q-W(X3)-F-K-G
CDR-VH3:S-L-V-R(X1)-L-H-Y-K(X2)-Y-F-D-V
其轻链可变区如SEQ ID NO:10所示,其中,轻链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下:
CDR-VL1:R-A-T(X1)-E-N-I-Y-S-Y-L(X2)-A
CDR-VL2:N-V(X1)-K-T-V(X2)-A-E
CDR-VL3:Q-H(X1)-H-Y-G-S(X2)-P-F-T
在抗体37#的基础上,在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变,其中,X1、X2、X3均为突变位点。
表1与抗体活性有关的突变位点
表2抗体活性分析数据
从上表可以看出,突变5的活性效果最佳,因而以突变5作为骨架序列,筛选其他亲和力较好的突变位点,部分结果如下:
表3与抗体亲和力有关的突变位点
ADPN蛋白1500ng/ml包板,测量每个突变OD450的吸光值,结果如下:
表4抗体突变的亲和力测试
可以看出各突变的亲和力均较高。
2、稳定性测定
本发明抗体的浓度1ug/mL,ADPN蛋白的浓度1500 ng/mL。
将抗体在既定缓冲(PBS,0.05%ProClin™300)中进行37℃热加速7天,通过SDS-PAGE及ELISA间接法对加速抗体进行评价,与4℃作对照,鉴定抗体的长期稳定性。另外通过在-20℃进行反复冻融5次,测试结果以4℃的值与加速后的值的偏差显示,测量结果如下:
表5稳定性研究
从上可以看出,突变2-1到突变2-30可以在4℃下稳定保存,在37℃加速0.5个月性质依旧稳定(轻微的反应性下降未影响试剂性能),保证了开瓶使用试剂的性能,从而保证检测结果的准确和稳定。
实施例3 抗体应用研究
A、抗体胶乳比浊法核心原材料
为了验证纯化出的ADPN抗体应用到免疫实验中的效果,本实施例将抗体应用到试剂盒中,本实施例选择胶乳比浊法进行测定。
突变的亲和力均较高,所以应用到免疫检测中的效果可以预估突变2-1到2-30效果相似,鉴于实施例无法穷尽,本实施例选择用突变2-25进行试验。
测定试剂,包括R1,R2和校准质控品,以及赋值临床样本;
所述R1包括:三羟甲基氨基甲烷缓冲液;
所述R2包括:标记有鼠抗人脂联素抗体的胶乳颗粒;
具体操作步骤如下:
1.实验准备:R1、R2工作液各15ml,校准品1ml,脂联素赋值临床样本35例。
2.将各组分分别放入试剂盒内,再将试剂盒放入全自动生化仪EXC800(来自中元汇吉生物技术股份有限公司)中,选择ADPN项目进行实验。
(1)定标实验
表6 定标实验结果
表7 临床对比实验结果
因此,结果如图1(Lane M:Marker;Lane 1:Reducing;Lane 2:Non-Reducing),抗体条带清晰。如表6,表7和图2所示,突变2-25作为ADPN胶乳比浊法的检测中的标记抗体使用,具有良好的线性效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区:
CDR-VH1:G-X1-T-X2-N,其中X1是Y或D,X2是M或N;
CDR-VH2:L-I-X1-P-Y-N-D-X2-T-T-Y-N-Q-X3-F-K-G,其中X1是Q或N,X2是V或I或L,X3是K或W;
CDR-VH3:S-L-V-X1-L-H-Y-X2-Y-F-D-V,其中X1是K或R,X2是K或W;
CDR-VL1:R-A-X1-E-N-I-Y-S-Y-X2-A,其中X1是T或S,X2是I或L;
CDR-VL2:N-X1-K-T-X2-A-E,其中X1是A或V,X2是L或V;
和CDR-VL3:Q-X1-H-Y-G-X2-P-F-T,其中X1是H或Q,X2是T或S。
2.如权利要求1所述的抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述互补决定区的CDR-VH1的X2是M,CDR-VH2的X1是N,CDR-VH3的X2是W,CDR-VL1的X1是S,CDR-VL2的X2是L,CDR-VL3的X1是H。
3.如权利要求1所述的抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述CDR-VH1中X1是Y;
优选的,所述CDR-VH1中X1是D;
优选的,所述CDR-VH1中X2是M;
优选的,所述CDR-VH1中X2是N;
优选的,所述CDR-VH2中X1是Q;
优选的,所述CDR-VH2中X1是N;
优选的,所述CDR-VH2中X2是V;
优选的,所述CDR-VH2中X2是I;
优选的,所述CDR-VH2中X2是L;
优选的,所述CDR-VH2中X3是K;
优选的,所述CDR-VH2中X3是W;
优选的,所述CDR-VH3中X1是K;
优选的,所述CDR-VH3中X1是R;
优选的,所述CDR-VH3中X2是K;
优选的,所述CDR-VH3中X2是W;
优选的,所述CDR-VL1中X1是T;
优选的,所述CDR-VL1中X1是S;
优选的,所述CDR-VL1中X2是I;
优选的,所述CDR-VL1中X2是L;
优选的,所述CDR-VL2中X1是A;
优选的,所述CDR-VL2中X1是V;
优选的,所述CDR-VL2中X2是L;
优选的,所述CDR-VL2中X2是V;
优选的,所述CDR-VL3中X1是H;
优选的,所述CDR-VL3中X1是Q;
优选的,所述CDR-VL3中X2是T;
优选的,所述CDR-VL3中X2是S。
4.如权利要求1-3任意一项所述的抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述各互补决定区选自如下突变组合中任意一种:
5.如权利要求1-4任意一项所述的抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述抗体包括轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L和重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H;所述重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H依次选自SEQ ID NO:1-4;所述轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L依次选自SEQ ID NO:5-8。
6.如权利要求5所述的抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述抗体还包含恒定区;
优选的,所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区,优选的,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
7.如权利要求6所述的抗ADPN抗体或其功能性片段,其特征在于,所述抗体为标记抗体;
优选的,所述标记抗体的标记物包括但不限于生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物;
优选的,所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、AlexaFluor®系列染料及其衍生物、ATTOTM系列染料、TYE系列染料、量子点和蛋白类染料及其衍生物等;
优选的,所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶;
优选的,所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F;
优选的,所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物;
优选的,所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒;
优选的,所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶;
优选的,所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
8.如权利要求1-7任一项所述抗ADPN抗体或其功能性片段在纯化ADPN蛋白中的用途。
9.如权利要求1-7任一项所述抗ADPN抗体或其功能性片段在检测ADPN抗体试剂盒中作为校准质控的用途。
10.如权利要求9所述的用途,其特征在于,所述试剂盒检测的样本选自全血、血清、血浆、尿液或唾液。
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