CN117074667B - 多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用 - Google Patents

多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能够与从所述患者获得的生物样品接触形成抗原抗体复合物的多肽或其抗体结合片段在制备血管内皮细胞损伤检测试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少二者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白‑A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白‑1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。本申请的血管内皮细胞自身抗体，通过简单的检测血清中的滴度就可以用于诊断血管内皮细胞损伤，具有有非常大的临床应用价值。

Description

多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒领域，特别地涉及多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用。
背景技术
特发性肾病综合征(INS)是儿童最常见的原发性肾小球疾病之一，中国每年约有28000-56000例新发病例。类固醇治疗对大多数患者有效，但约10％～20％的患者对类固醇治疗无效，称为类固醇抵抗性肾病综合征(SRNS)。在INS患者中，8％～35％的患者在诊断5年后发展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)，24％～66％的患者在诊断15年后发展为终末期肾病。然而，迄今为止，INS的发病机制尚未完全阐明。
微小病变病(MCD)是儿童肾病综合征的主要原因，占成人肾病综合征的10-15％。微小病变病患者肾小球在光学显微镜下看起来基本正常，在电子显微镜下可见的唯一组织病理学异常是弥漫性足细胞足突融合消失。因此，一种普遍的观点认为INS的发病机制可能与T细胞的系统性功能障碍有关，选择性T细胞抑制剂如环孢素/他克莫司对部分患者有效。除T细胞外，可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体等循环渗透因子也是可能的致病因素。然而，目前基于上述理论的临床治疗并不能帮助所有患者达到临床缓解。因此，研究人员一直在探索其他可能的病理机制。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了能够与从所述患者获得的生物样品接触形成抗原抗体复合物的多肽或其抗体结合片段在制备血管内皮细胞损伤检测试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少二者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
在一些实施例中，所述多肽或其抗体结合片段为热休克蛋白90β(HSP90AB1)和细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)组合，或者踝蛋白1(TLN1)和桥粒芯糖蛋白1(DSG1)组合，或者踝蛋白1(TLN1)和膜突蛋白(MSN)组合。
在一些实施例中，其中所述血管内皮细胞损伤指示肾病综合征。
在一些实施例中，其中所述肾病综合征是特发性肾病综合征。
在一些实施例中，其中所述特发性肾病综合征是儿童特发性性肾病综合征。
在一些实施例中，其中所述生物样品是血清。
在一些实施例中，其中所述生物样品是没有进行免疫治疗之前患者的生物样品。
在一些实施例中，本发明还提出了能够与从所述患者获得的生物样品接触形成抗原抗体复合物的多肽或其抗体结合片段在制备血管内皮细胞损伤检测试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少三者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
在一些实施例中，其中所述多肽或其抗体结合片段为桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合，或者膜突蛋白(MSN)、肌球蛋白轻链1(MYL1)和踝蛋白1(TLN1)组合，或者α烯醇化酶ENO1、踝蛋白1(TLN1)和热休克蛋白90β(HSP90AB1)组合。
在一些实施例中，本发明还提出了能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物的多肽或抗体结合片段在制备用于相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病特异性检测肾病综合征的试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少二者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
在一些实施例中，本发明还提出了一种用于诊断肾病综合征或者相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病特异性检测肾病综合征的试剂或者试剂盒，包括：多肽或其抗体结合片段，其能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少二者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
血管内皮细胞损伤的金标准是电镜检查。但是电镜检查需要进行肾穿刺，有损伤且价格昂贵，检测时间长，不适合常规应用。本申请的血管内皮细胞自身抗体，通过简单的检测血清中的滴度就可以用于诊断血管内皮细胞损伤，具有非常大的临床应用价值。
附图说明
下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
图1是根据本发明的一个实施例的内皮细胞自身抗体检测；其中图1A-1I为根据本申请一个实施例的INS患者和其他对照组参与者内皮细胞自身抗体的检测；NC表示正常的对照组；HSP表示过敏性紫癜；HSPN表示过敏性紫癜性肾炎；KD表示川崎病；NS表示肾病综合征；图1J-图1K表示根据本申请一个实施例的INS患者内皮细胞自身抗体的变化规律；
图2是根据本发明的一个实施例的9种内皮细胞自身抗体在INS中的诊断价值；其中，图2A为根据本申请一个实施例的抗ENO1抗体的ROC曲线；图2B为根据本申请一个实施例的抗TLN1抗体的ROC曲线；图2C为根据本申请一个实施例的抗FLNA抗体的ROC曲线；图2D为根据本申请一个实施例的抗AHNAK抗体的ROC曲线；图2E为根据本申请一个实施例的抗DSG1抗体的ROC曲线；图2F为根据本申请一个实施例的抗MYL1抗体的ROC曲线；图2G为根据本申请一个实施例的抗HSP90AB1抗体的ROC曲线；图2H为根据本申请一个实施例的抗CKAP4抗体的ROC曲线；图2I为根据本申请一个实施例的抗MSN抗体的ROC曲线；
图3是根据本发明的一个实施例的血管内皮细胞自身抗体灰度值与INS患者的临床情况相关；其中，图3A为根据本申请一个实施例的与缓解前相比，缓解后9种血管内皮细胞自身抗体均显著降低；图3B为根据本申请一个实施例的INS患者缓解前7种血管内皮细胞自身抗体与血清白蛋白呈显著负相关；图3C为根据本申请一个实施例的8种血管内皮细胞自身抗体与INS患者缓解前的国际标准化比率(INR)显著负相关；图3D为根据本申请一个实施例的7种血管内皮细胞自身抗体与INS患者缓解前的血小板数呈显著负相关；
图4是根据本发明的一个实施例的INS患者肾脏内皮损伤；其中，图4A-图4G为根据本申请一个实施例的在电子显微镜下观察INS患者肾活检标本中内皮损伤的7种典型征象；图4H为根据本申请一个实施例的20例INS患者内皮损伤不同征象的模式；图4I为根据本申请一个实施例的人肾免疫荧光显示小穴蛋白-1(绿色)上调，与EHD3(红色)共定位；
图5是根据本发明的一个实施例的体外抗ENO1抗体的作用；其中，图5A-图5C为根据本申请一个实施例的同型对照抗体与抗ENO1抗体、同型对照抗体和正常兔血清与抗ENO1抗体和正常兔血清、抗ENO1抗体阳性血清与抗ENO1抗体阳性血清经ENO1蛋白预处理后Eahy926细胞的肌动蛋白骨架变化和分离；图5D-图5F为根据本申请一个实施例的同型对照抗体处理Eahy926细胞上清中凝血调节蛋白的水平与抗ENO1抗体、同型对照抗体正常兔血清与抗ENO1抗体正常兔血清、抗ENO1抗体血清与ENO1蛋白预处理的抗ENO1血清的差异；
图6是根据本发明的一个实施例的注射抗体的小鼠肾脏组织学(HE染色、PAS染色和Masson染色)；
图7是根据本发明的一个实施例的电镜下可见注射抗ENO1抗体的小鼠内皮细胞和足细胞损伤；其中，图7A为根据本申请一个实施例的抗ENO1抗体注射小鼠的肾小球内皮细胞中可以观察到自噬体；图7B为根据本申请一个实施例的抗ENO1抗体治疗小鼠的足细胞中可以观察到线粒体损伤；图7C-图7D为根据本申请一个实施例的抗ENO1抗体注射小鼠的足细胞可以观察到足细胞的足突融合，但同种型抗体注射小鼠没有；以及
图8是根据本发明的一个实施例的一种或几种抗体组合使用时的敏感度和特异性图谱；其中图8A-图8I为抗体单独使用时的敏感度和特异性图谱；图8J-图8M为2种抗体组合使用时的敏感度和特异性图谱；图8N-图8Q为3种抗体组合使用时的敏感度和特异性图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑或者电性的改变。
本文出现的名词具有以下含义：
本文所说“肾病综合征”、“NS”是指由于肾小球滤过膜对血浆蛋白通透性增高、大量血浆蛋白自尿中丢失而导致一系列病理生理改变的一种临床综合征,以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和水肿为其主要临床特点。
本文所说“特发性肾病综合征”、“INS”是一类病因不明，由于肾小球滤过膜通透性增加，使得血浆蛋白滤出增多，引起大量蛋白尿，并由此引发一系列以足细胞病变为特征的临床综合征。这类患儿临床上常常表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症等特征。
本文所说“多肽或其片段”是指用于检测同一疾病的2个或2个以上的多肽指标的组合。其中，多肽或其抗体结合片段选自：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
其中，α烯醇化酶蛋白(ENO1)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.1所示；踝蛋白1(TLN1)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.2所示；细丝蛋白-A(FLNA)抗体结合片段序列如SEQID NO.3所示；桥粒联结蛋白(AHNAK)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.4所示；桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.5所示；肌球蛋白轻链1(MYL1)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.6所示；热休克蛋白90β(HSP90AB1)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.7所示；细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.8所示；膜突蛋白(MSN)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.9所示。
当使用上述多肽或其抗体结合片段检测血管内皮细胞损伤时，其可与从患者处获得的生物样品接触，形成抗原抗体复合物。其中，抗原抗体复合物包括抗ENO1-IgG抗体复合物、抗TLN1-IgG抗体复合物、抗FLNA-IgG抗体复合物、抗AHNAK-IgG抗体复合物、抗DSG1-IgG抗体复合物、抗MYL1-IgG抗体复合物、抗HSP90AB1-IgG抗体复合物、抗CKAP4-IgG抗体复合物、抗MSN-IgG抗体复合物。
本文所说“同型对照抗体”是指从同品种同年龄未经蛋白免疫的兔子血清提取的IgG抗体，用做对照组。
本文所说“HE染色”是指苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
本文所说“Masson染色”又称马松染色，是显示组织中纤维的主要方法之一,是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。该法染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关,分子的大小由分子量来体现,小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织；而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。然而,淡绿或苯胺蓝的分子量都很大,因此Masson染色后肌纤维呈红色,胶原纤维呈绿色或蓝色,主要用于区分胶原纤维和肌纤维。
本文所说“PAS染色”是指即Periodic Acid-Schiff stain，又称过碘酸雪夫染色。在组织学上，主要用来检测组织中的糖类。过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。PAS阳性为红色，细胞核蓝色。
2021年，发明人团队首次提出了自身免疫性足细胞病的概念，得到了广泛的认可。最近，Watts等人在儿童和成人MCD患者血清中发现了抗肾小球细胞粘附分子受体(Nephrin)自身抗体，这也为发明人的创新理论提供了强有力的证据。此外，局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)患者移植后血清中抗肾素自身抗体的存在进一步支持了发明人的观点。足细胞蛋白Crb2免疫诱导的新型特发性肾病综合征小鼠模型为足细胞自身抗体在INS发病过程中的作用提供了直接证据。
足细胞自身抗体被认为是肾小球足细胞损伤的重要原因。然而，从解剖学角度来看，循环足细胞自身抗体与足细胞之间存在肾小球内皮屏障。除非肾小球内皮细胞完整性受损，否则足细胞自身抗体无法到达足细胞。
发明人通过一系列的试验发现，INS患儿血清中存在多种抗血管内皮细胞的自身抗体。抗血管内皮细胞的自身抗体导致肾小球内皮细胞损伤，从而引起循环足细胞自身抗体与足细胞之间内皮屏障的破坏。这是引起肾小球内皮细胞损伤的重要原因。而发明人发现的多种抗血管内皮细胞的自身抗体及其组合能够用于诊断内皮细胞的损伤并且进一步诊断INS。
本申请提出了能够与从所述患者获得的生物样品接触形成抗原抗体复合物的多肽或其抗体结合片段在制备血管内皮细胞损伤检测试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述多肽或其抗体结合片段选自以下群组中：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
在一些实施例中，可以单独使用上述9种多肽或者抗体结合片段中的任一种检测血管内皮细胞损伤。在一些实施例中，还可以将上述9种多肽或者抗体结合片段中的至少二者组合使用。
进一步地，在一些实施例中，当将上述9种多肽或者抗体结合片段中的二者组合使用时，踝蛋白1(TLN1)和桥粒芯糖蛋白1(DSG1)组合时敏感度最高，达到88.2；细丝蛋白A(FLNA)和桥粒芯糖蛋白蛋白1(DSG1)组合时灵敏度略低，为70.6，其它的9中多肽或者抗体结合片段的任两者组合时，灵敏度介于二者之间，此处不再列举。另外，在一些实施例中，当将踝蛋白1(TLN1)和膜突蛋白(MSN)组合使用时，特异度最高，可达85.7，其他任两者组合时的特异度也均在57.1以上。
在一些实施例中，当将将上述9种多肽或者抗体结合片段中的三者组合使用时，桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合，或者膜突蛋白(MSN)、肌球蛋白轻链1(MYL1)和踝蛋白1(TLN1)组合使用时灵敏度都较高，为76.5；细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、桥粒芯糖蛋白1(DSG1)和细丝蛋白A(FLNA)组合使用时灵敏度略低，为64.7，其它的9中多肽或者抗体结合片段的任三者组合时，灵敏度介于二者之间，此处不再列举。另外，在一些实施例中，桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合，或者膜突蛋白(MSN)、肌球蛋白轻链1(MYL1)和踝蛋白1(TLN1)组合使用时，特异度最高，可达85.7，其他任三者组合时的特异度也均在64.3以上。
在一些实施例中，当使用上述9种多肽或者抗体结合片段中的至少四者组合时，其组合中基本已包含本申请列举的两两组合或三者组合，此处不再列举。
本申请进一步提出了能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物的多肽或抗体结合片段在制备用于相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病特异性检测肾病综合征的试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少二者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
本申请进一步提出了一种用于诊断肾病综合征或者相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病特异性检测肾病综合征的试剂或者试剂盒，包括：多肽或其抗体结合片段，其能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物；其中，所述多肽或其抗体结合片段包括选自以下群组中的至少二者：α烯醇化酶蛋白(ENO1)、踝蛋白1(TLN1)、细丝蛋白-A(FLNA)、桥粒联结蛋白(AHNAK)、桥粒芯糖蛋白-1(DSG1)、肌球蛋白轻链1(MYL1)、热休克蛋白90β(HSP90AB1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、膜突蛋白(MSN)。
在一些实施例中，本申请所说的上述多肽或者抗体结合片段表达于血管内皮细胞，其抗体复合体的滴度可指示血管内皮细胞损伤。进一步地，该指征血管内皮细胞损伤可指示肾病综合征。在一些实施例中，该肾病综合征是特发性肾病综合征。进一步地，该特发性肾病综合征是儿童特发性性肾病综合征。
在一些实施例中，使用上述9种多肽或者其抗体结合片段中的一者或多者检测血管内皮细胞损伤时，先获取患者的生物样本，该生物样品可以是患者的血清，且该生物样品是没有进行免疫治疗之前患者的生物样品。在一些实施例中，可以检测生物样本中抗原抗体复合体的滴度，检测血管内皮细胞损伤，进一步检测肾病综合征。
本申请将通过以下实施例对发明内容加以说明。在本申请中，共招募了149名INS患者，对照组分为4组:1组为体检的100名健康儿童(正常对照，NC)，另外3组为患有过敏性紫癜(HSP)、过敏性紫癜肾炎(HSPN)、川崎病(KD)等其他与血管炎相关疾病的儿童各100名。收集儿童血清，在-20℃保存，直至使用。
实施例1:INS患儿和对照组患儿血清血管内皮自身抗体的检测
利用蛋白质芯片检测INS患者和对照组参与者血清中血管内皮细胞自身抗体滴度。蛋白质芯片的生产和使用遵循以下描述：
细胞培养和蛋白提取：huvec衍生细胞株EAhy926购自中国科学院细胞库。Eahy926细胞在添加10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM中培养。然后用无菌PBS清洗Eahy926细胞，收获，并在含有30mm Tris-HCl,8M尿素，4％CHAPS和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(#ab65621；Abcam，稀释1:200)在冰上。接下来，样品在4摄氏度下12000g离心30分钟。然后收集上清液备用。总蛋白浓度使用双辛酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(PierceTM，Thermo)测定。
双向电泳和免疫印迹：根据制造商说明，使用二维电泳系统(etanTMIPGphor 3TM，GE Healthcare)对EAhy926蛋白提取物进行二维电泳。将25μl总蛋白(100μg)分别装入13cm、pH为3-10的IPG条带(GE Healthcare)中进行等电聚焦作为一维电泳。从一维电泳中得到的凝胶条在二维中通过sds电泳进一步分离。将分离的蛋白质电泳转移到PVDF膜上。阻塞的细胞膜在4℃下与1:200稀释的血清孵育过夜，其中20例来自肾病综合征患者，10例来自健康对照组。用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育，然后用增强的化学发光检测试剂孵育。最后使用Bio-Rad成像仪对膜进行成像，并使用PD Quest软件进行分析。
简单地说，自身抗原被标记在硝化纤维膜上，并用牛血清白蛋白密封溶液将其堵塞。固定于聚氯乙烯检测板槽内后，将血清加入检测板。洗涤后，用生物素偶联的抗人IgG进行检测。阵列使用5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸(BCIP)/硝基蓝四氮唑氯化铵(NBT)衬底清洗和显影，并使用平板扫描仪(canscan 9000Mark II,Canon)在2400dpi下扫描。
如图1A-图1I所示，INS患者中9种血管内皮细胞自身抗体的浓度均高于对照组。如图1J的结果显示，在INS患者中，抗ENO1抗体的阳性率最高(51.01％)，其他鉴定出的血管内皮细胞自身抗体阳性率如下：踝蛋白1血管内皮细胞自身抗体(抗-TLN1抗体)，50.34％；细丝蛋白-A血管内皮细胞自身抗体(抗-FLNA抗体)，48.32％；桥粒联结蛋白(抗AHNAK抗体)，45.64％；桥粒芯糖蛋白-1血管内皮细胞自身抗体(抗DSG1抗体)，42.95％；肌球蛋白轻链1血管内皮细胞自身抗体(抗MYL1抗体)，42.28％；热休克蛋白90-β血管内皮细胞自身抗体(抗HSP90AB1抗体)，40.27％；细胞骨架相关蛋白4血管内皮细胞自身抗体(抗CKAP4抗体)，38.93％；膜突蛋白血管内皮细胞自身抗体(抗-MSN抗体)，31.54％。如图1K所示，在所有INS患者中，仅有11％的9种血管内皮自身抗体均为阴性。换句话说，本研究中89％的INS患者至少有一种血管内皮自身抗体阳性。
然后，发明人对INS患者和对照组受试者血清中血管内皮细胞自身抗体的灰度值进行ROC分析，并计算ROC曲线下面积(ROC-auc)。结果显示，所有9种确定的血管内皮自身抗体都能很容易地将INS患者与对照组区分开来，其AUC均大于0.7(图2)。其中，α烯醇化酶血管内皮细胞自身抗体(抗-ENO1抗体)的ROC曲线在INS患者与对照组之间的区别最强(AUC为0.806)。
实施例2：循环血管内皮自身抗体与INS患者的病情及凝血功能有关
血管内皮细胞自身抗体的体内致病性检测：发明人通过尾静脉注射抗ENO1抗体到BALB/c小鼠(n＝5)，研究了抗ENO1抗体的致病性。为了控制注射的同型抗体的半衰期短，抗ENO1抗体在24小时间隔两次注射每种抗体200μg。每24小时使用代谢笼监测蛋白尿的发展情况，持续7天。5只BALB/c小鼠注射同型对照IgG，剂量与对照组相同。第7天采集肾脏。制备组织切片(5μm厚)，用苏木素和伊红(H&E)、周期性酸-希夫染色(PAS)或马松三色染色(Masson’strichrome染色)进行组织形态、损伤和纤维化的组织学评估。按照标准程序进行电子显微镜分析。将肾脏固定在4％缓冲的多聚甲醛中，然后在0.1M碳酸钠缓冲液中加入1％锇酸，然后用1％乙酸铀酰染色并包埋在环氧树脂中。切下超薄切片，用甲醇中的醋酸铀酰对照，然后用柠檬酸铅对照。显微照片是用透射电子显微镜生成的。
血管内皮细胞自身抗体体外致病性检测：发明人通过三种比较方法检测了血管内皮细胞自身抗体的体外致病性。第一个比较是先用抗ENO1抗体或兔同型IgG处理EAhy926细胞2小时，未处理的细胞作为空白对照。光镜下观察Eahy926细胞的形态。细胞内阴茎素染色可见肌动蛋白骨架。细胞凋亡检测使用市售试剂盒(#556547,BD Biosciences)进行。为了进行比较，EAhy926细胞分别用兔血清或兔血清和抗ENO1抗体进行处理。为了进行比较，INS患者的抗ENO1抗体阳性血清首先与相应的重组蛋白在37℃的潮湿培养箱中混合30分钟。然后用INS患者血管内皮细胞自身抗体阳性血清或血清-重组蛋白复合物处理EAhy926细胞。后两种比较方法检测处理后的细胞形态、细胞骨架蛋白F-actin的结构变化以及培养基上清中凝血调节蛋白的水平。
统计分析：正态分布的测量数据用平均值±标准差表示，非正态分布的测量数据用中位数和四分位差表示。对于配对比较，我们使用配对t检验或Wilcoxon配对配对符号排序检验。采用线性回归和Pearson系数表征血管内皮细胞自身抗体与其他变量的相关性。P<0.05定义为有统计学意义。所有统计分析均采用GraphPad Prism 9.0版软件进行。
比较INS患者在不同疾病状态(缓解前和缓解后)血管内皮细胞自身抗体水平，以确认INS患者的内皮损伤。如图3A及表1所示，所有9种血管内皮细胞自身抗体在缓解后都显著降低。在INS患者中经常观察到高凝。因此，发明人对INS患者缓解前循环血管内皮自身抗体滴度与凝血功能相关实验室检测结果进行相关性分析。如图3B所示，在INS患者中，有7种血管内皮细胞自身抗体与血清白蛋白和INR呈显著负相关，其中抗CKAP4抗体与白蛋白相关性最好(R＝-0.42,p<0.001)；如图3C所示，抗MYL1抗体与INR相关性最好(R＝-0.30,p＝0.004)。此外，如图3D所示，8种血管内皮细胞自身抗体与INS患者的血小板数呈显著正相关，其中抗DSG1抗体与血小板数的相关性最好(R＝0.37,p<0.001)。
表1受试者特征
实施例3：INS患者肾脏有肾小球内皮损伤征象
为了确认INS患者是否存在肾小球内皮损伤，发明人对20例患者的肾活检样本进行了聚焦内皮的电子显微镜检查。如图4A-图4G所示，共观察到7种内皮损伤征象，分别为内皮细胞增生(图4A)、免疫复合物沉积(内皮下)(图4B)、内皮细胞肿胀或空泡变性(图4C)、内皮细胞间隙变宽(图4D)、内皮细胞线粒体肿胀(图4E)、蜂窝状结构(图4F)、内皮细胞渗透丧失(图4G)。在本发明中，内皮细胞肿胀或空泡变性、线粒体肿胀是肾小球内皮损伤最常见的征象，每种征象的阳性率均为85％(如图4H所示)。值得注意的是，如图4I所示，除内皮开窗融合外，所有20例INS患者至少还表现出一种肾小球内皮损伤的其他征候。人肾组织免疫荧光也显示了内皮损伤的迹象，其中微囊蛋白-1(Caveolin-1)的表达上调。
实施例4：抗ENO1抗体对EAhy926细胞的影响
为了确定血管内皮细胞自身抗体患者是否具有致病作用，发明人检测了抗ENO1抗体对EAhy926细胞的作用，因为本发明中抗ENO1抗体在INS患者中阳性率最高。如图5A-图5D所示，与同型对照抗体处理的细胞相比，抗ENO1抗体处理的EAhy926细胞的脱离率更高，细胞骨架破坏表现为肌动蛋白-应力纤维消失，而不是更高水平的血栓调节蛋白。如图5E所示，与正常兔血清和同型对照抗体相比，正常兔血清和抗ENO1抗体处理的EAhy926细胞上清液中凝血调节蛋白的水平显著高于正常兔血清和同型对照抗体。如图5F所示，在ENO1重组蛋白处理的抗ENO1抗体+血清中，细胞培养上清中的血栓调节蛋白浓度明显低于未处理的血清。抗体引起的这种损伤在血清的存在下可以增强，并且可以通过将抗体与相应的重组蛋白预孵育来减弱。
实施例5：注射经鉴定的血管内皮自身抗体可引起BALB/c小鼠内皮细胞和足细胞损伤
如图6所示，向BALB/c小鼠注射抗-ENO1抗体。HE染色、Masson染色、PAS染色均未见注射抗体小鼠肾脏出现明显病理变化。然而，在小鼠肾小球内皮细胞中观察到自噬体，说明识别的血管内皮自身抗体可能对肾小球内皮细胞造成损伤(如图7A-图7D所示)。如图7A-图7D所示，除了在肾小球内皮细胞中观察到自噬体外，足细胞也有损伤的迹象，SEM和TEM均显示足突局部融合；此外，还可以观察到线粒体的一些改变，包括不规则形状、空泡化和嵴断裂。
实施例6:INS患者血清血管内皮自身抗体对内皮细胞损伤的诊断效率
申请人将筛选得到的潜在自身抗原蛋白固定在蛋白芯片上，以肾病综合征患者血清作为一抗，经过二抗，酶工作液，底物溶液的孵育后通过扫描仪读数，得到蛋白芯片每个抗原蛋白对应的灰度值，灰度值即自身抗体在血清中的相对含量。通过INS患者肾组织切片电镜下内皮细胞损伤的有无，将INS患者分为内皮细胞损伤组和内皮细胞无损伤组，根据血清中内皮细胞自身抗体浓度进行ROC分析，获得AUC值、敏感度和特异度。
如图8A-图8Q及表2所示，发明人对INS患者和对照组受试者血清中血管内皮细胞自身抗体的灰度值进行ROC分析，并计算ROC曲线下面积(ROC-auc)。结果如图8A-图8Q所示，所有9种确定的多肽单独无论单独使用还是其中两者以上组合使用，都能很容易地将INS患者诊断出来，其AUC均大于0.5。其中，桥粒芯糖蛋白1+膜突蛋白+踝蛋白1组合、α烯醇化酶+踝蛋白1+热休克蛋白90β组合、膜突蛋白+肌球蛋白轻链1+踝蛋白1组合或者踝蛋白1+桥粒芯糖蛋白1组合的ROC曲线在INS患者之间的诊断效率更高，最高AUC为0.811。
表2
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

Claims (5)

1.能够与从患者获得的生物样品接触形成抗原抗体复合物的多肽或其抗体结合片段在制备血管内皮细胞损伤检测试剂或试剂盒方面的用途；
其中所述多肽或其抗体结合片段为桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合；
其中所述血管内皮细胞损伤指示儿童特发性肾病综合征；所述生物样品是血清。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品是没有进行免疫治疗之前患者的生物样品。
3.能够与从患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物的多肽或抗体结合片段在制备用于相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病特异性检测肾病综合征的试剂或试剂盒方面的用途；
其中所述多肽或其抗体结合片段为桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合；
其中所述肾病综合征是儿童特发性肾病综合征；所述生物样品是血清。
4.一种用于诊断肾病综合征的试剂或者试剂盒，包括：多肽或其抗体结合片段，其能够与从患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物；
其中所述多肽或其抗体结合片段为桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合；
其中所述肾病综合征是儿童特发性肾病综合征；所述生物样品是血清。
5.一种相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病特异性检测肾病综合征的试剂或者试剂盒，包括：多肽或其抗体结合片段，其能够与从患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物；
其中所述多肽或其抗体结合片段为桥粒芯糖蛋白1(DSG1)、膜突蛋白(MSN)和踝蛋白1(TLN1)组合；
其中所述肾病综合征是儿童特发性肾病综合征；所述生物样品是血清。
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