CN117070424A - 一株化能自养型盐硫杆菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株化能自养型盐硫杆菌菌株及其应用。该菌株的名称为沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM‑1，保藏号为GDMCC No：63765，于2023年9月1日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。该菌株能在好氧条件下进行还原性硫化物氧化，可用于含还原性硫化物的废水或土壤的处理。
Description
技术领域
本发明属于微生物和环境保护技术领域，特别涉及一株化能自养型盐硫杆菌菌株及其应用。
背景技术
硫的电子排布（1s22s22p63s23p4）构型对应于6个电子和一个空的3d轨道，这使得硫可以在−2到+6之间的任何位置获得氧化态形式，从而形成包括连四硫酸盐在内的多种还原性硫化物（连四硫酸盐（S4O6 2−）、硫代硫酸盐（S2O3 2−）、亚硫酸盐（SO3 2−）、硫化物（S2−）和单质硫（S0））。环境中的含硫物质主要来源于非生物（自然和人为）和生物排放，其中由于人类活动向环境中排放还原性硫化物的总量每年约为2.8×1011Kg，这些人类活动主要为石油炼制、造纸工厂、屠宰场、食品工业、垃圾填埋、沼气处理、煤炭气化和污水处理等工业过程。还原性硫化物普遍具有毒性和腐蚀性，治理环境中的还原性硫化物不仅有利于生态环境的保护而且有利于环境友好型社会的均衡发展。生物脱硫除硫技术最重要的优点是生物处理过程可以在环境温度和大气压强下进行、操作简单、资金和运营成本较低但处理效率高，而且在生态方面较物理、化学法和物理化学法更为清洁，弥补了化学和物理法的高成本和产生不良副产物等缺点。
硫氧化细菌（Sulfur-oxidizing bacteria，SOB）是生物脱硫除硫技术的核心，这类菌株在硫循环的氧化方向发挥重要作用，可以将还原性硫化合物生物氧化为高价态含硫化合物，并在此过程中产生足够的能量用于菌株自身的生长代谢。硫氧化细菌是土壤生态系统中硫酸盐形成的主要原因，这类功能微生物广泛分布于海洋、热液口、土壤、江河、热泉、火山、潮间带沉积物等含还原性硫化物的自然环境中。化能自养型硫氧化细菌中的盐硫杆菌属（Halothiobacillus）菌株在含硫化物废水处理、农业生产、生物法冶金等领域有着广泛的应用。盐硫杆菌属菌株在分类学上隶属于变形菌门γ亚纲，目前分为嗜盐盐硫杆菌（Halothiobacillus haloophilus）、那不勒斯盐硫杆菌（H.neapolitanus）、热液盐硫杆菌（H.hydrothermalis）和凯利盐硫杆菌（H.Kelly）四种。
综上所述，筛选鉴定新型盐硫杆菌属菌株不仅可以扩充盐硫杆菌属细菌的种类和多样性，增加化能自养型硫氧化细菌的应用潜力，对这类功能微生物的研究也将为生态环境治理、资源地球化学循环等提供微生物资源保障。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一株化能自养型盐硫杆菌菌株。
本发明的另一目的在于提供上述化能自养型盐硫杆菌菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株化能自养型盐硫杆菌菌株，名称为沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM-1，保藏号为GDMCC No：63765，于2023年9月1日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。
上述化能自养型盐硫杆菌菌株在氧化还原性硫化物中的应用；优选包括如下步骤：将上述化能自养型盐硫杆菌菌株置于含有还原性硫化物的环境下中生长。
所述的生长为好氧生长。
所述的氧化还原性硫化物是将还原性硫化物氧化为硫酸盐。
所述的还原性硫化物优选为单质硫、硫代硫酸盐和硫化钠中的至少一种。
所述的环境优选为水体和土壤。
所述的生长的温度为20～35 ℃；更优选为25～30 ℃。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的化能自养型盐硫杆菌DCM-1为新种，扩充了盐硫杆菌属菌株的种类和多样性，菌株DCM-1能在好氧条件下对硫化物、单质硫和硫代硫酸盐等还原性硫化物进行生物氧化，即该菌株具有好氧除硫的生物学功能。
附图说明
图1为沉积物盐硫杆菌DCM-1的菌落和细胞形态图；其中，A为菌落形态照片，B为结晶紫染色照片（100×），C为革兰氏染色照片（100×）。
图2为基于沉积物盐硫杆菌DCM-1 16S rDNA的系统发育进化树图。
图3为沉积物盐硫杆菌DCM-1在好氧生长条件下的硫代硫酸盐氧化代谢特性的检测结果图。
图4为沉积物盐硫杆菌DCM-1在好氧生长条件下的硫化钠氧化代谢特性的检测结果图。
图5为沉积物盐硫杆菌DCM-1在好氧生长条件下的单质硫氧化代谢特性的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1化能自养型盐硫杆菌菌株DCM-1的富集、筛选、分离和鉴定
（1）硫氧化细菌的富集：采取正方形5点取样法对珠江广州段水域下游穗石码头位点（S113°41′，N23°05′）采取水体样品（0-100 cm）。环境样品接种于富集筛选无机培养基中，于30℃、150rpm摇床中避光培养120 h后测定硫酸根含量，在此条件下重复转接5-8代，获得稳定的硫氧化细菌菌群。其中，富集筛选无机培养基的成分为：KH2PO4 0.4 g/L、MgCl2 0.12 g/L、NaCl 10 g/L、CaCl2 0.01 g/L、NaHCO3 0.2 g/L、FeCl2 0.005 g/L、Na2S2O3·5H2O2.48 g/L、微量元素溶液（A5）1mL/L，pH调整为6.5-7.0。微量元素溶液（A5）的组成如下：H3BO3 2.86 g/L、ZnSO4·7H2O 0.222 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L、MnCl2·4H2O 1.86 g/L、CuSO4·5H2O 0.079 g/L、CoCl2·6H2O 0.04 g/L，溶剂为去离子水。
（2）单菌落的分离：将获得的富集物利用无菌水进行倍比稀释后接种至富集筛选固体无机培养基（在富集筛选无机培养基基础上加入琼脂15～20g/L）30℃静置避光培养96～168 h后观察到菌落长出，分别挑取具有不同颜色、边缘、和透明度等外观形态的菌落进行进一步分离纯化。通过好氧硫氧化实验进行筛选，具体步骤如下：
好氧硫氧化实验：将单菌落接种至装有50 mL富集筛选无机培养基的100 mL锥形瓶中，于30 ℃、150 rpm摇床中避光培养，每24 h取样测定硫代硫酸根含量、硫酸根含量和细胞数。以硫代硫酸根含量减少、硫酸根含量增加以及细胞数增加为好氧硫氧化实验的判断依据。
经筛选得到一株菌，命名为菌株DCM-1，在好氧硫氧化实验中随着培养时间的延长，硫代硫酸根含量不断降低、硫酸根含量不断升高，与此同时细胞也迅速增殖，在36 h达到1.23×108 CFU/mL。该菌株DCM-1的外观如图1所示，具体形态和生理生化特征的描述见表1。表1数据表明菌株DCM-1可以以硫代硫酸盐、硫化物和单质硫为底物进行生长代谢，并同时以碳酸氢根为生物碳源进行生长；菌株DCM-1不能以甲酸盐、乙酸盐和葡萄糖等有机碳源为碳源和底物进行代谢生长，也不能在有机培养基如LB（Luria-Bertani）培养基和R2A培养基中进行生长。综上所述，菌株DCM-1为化能自养型好氧硫氧化细菌。
表1 DCM-1的具体形态和生理生化特征
备注：“+”：为阳性；“-”：为阴性。在检测可用代谢底物和碳源时，所用的培养基基本同富集筛选无机培养基，区别在于用表中的物质相应替代富集筛选无机培养基中的NaHCO3或Na2S2O3·5H2O；LB（Luria-Bertani）培养基的成分为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH调整为6.5-7.0，溶剂为去离子水；R2A培养基的成分为：胰蛋白胨0.5 g/L、酵母提取物 0.5 g/L、酪蛋白氨基酸 0.5 g/L、MgSO4 0.024 g/L、葡萄糖 0.5 g/L、可溶性淀粉 0.5 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、丙酮酸钠 0.3 g/L，pH调整为至7.1-7.3，溶剂为去离子水。
（3）菌株DCM-1的16SrDNA鉴定：将分离得到的杆状硫氧化细菌接种至富集筛选无机培养基中培养后离心收获菌体，利用TIANampBacteriaDNAKit细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体的基因组DNA，然后以提取的DNA为模板、用16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增。PCR反应体系为：基因组DNA 1 μL、上游引物（10 µmol/L）1μL、下游引物（10 µmol/L）1μL、DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 12.5μL，补足ddH2O至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增得到的PCR产物在4 ℃冰箱保存。PCR产物送至广州金唯智生物科技有限公司进行16S rDNA测序，结果如下所示。
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
测序结果：
CCGTGGTAGCGCCCTCCTTACGGTTAGCTACCTACTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCAATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAAGATCGGCTTTATGGGATTGGCTCCACCTCGCGGTTTGGCTACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCTTTAGAGTTCCCACCCGAAGTGCTGGCAACTAAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTAACGCGTTAGCTCCGTCACCGAAAGGTTGAACCCTCCCGACGACAAGTAGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTACCTCAGCGTCAATGTTGGCCCAGGTGGCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTTCTGATATCTACGCATTTCACCGCTACACCAGAAATTCCGCCACCCTCTACCACATTCGAGTCAACCAGTATCCAATGCAATTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCAGACTTAATTAACCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTTTTCTTTGAGTAACGTCAAACATTGAGACTATTAACCTCAATGCGTTCTTCCTCAACAAAAGTGCTTTACAACCCGCAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGTCCACCCTCTCAGGCCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATCAGACATGGGCTCATCCTGTGGCGCGTGGTCAAAGATCCCACGCTTTGCTCCGAAGAGGTTATGCGGTATTAGCGTTAGTTTCCCAACGGTATCCCCCACCTCAGGGCAGATTCCCATGTATTACTCACCCGTCCGCCACTCGTCAGCGCCCGAAGGCCTGTTACCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
（5）将测序结果在NCBI上进行比对后并用MEGA 11.0.13软件进行Blast比对，运用最大似然法（Maximum-Likelihood）构建系统进化树，进化树拓扑结构经过1000次的引导重复取样检验，系统进化树结果如图2所示。沉积物盐硫杆菌DCM-1隶属于盐硫杆菌属，与Halothiobacillus neapolitanusI20菌株的16S rDNA序列相似性最高，该值为96.74%。根据参考文献（Kook JK, et al. Genome-Based Reclassification of Fusobacteriumnucleatum Subspecies at the Species Level. CurrMicrobiol (2017)74:1137–1147.）所述，16S rDNA基因序列相似度为98.65%可作为两种区分的阈值。因此，基于上述16S rDNA相似度可以判断出菌株DCM-1在分类学上与盐硫杆菌属中现有的种不相同，可以判定为盐硫杆菌属中一新型种。将得到的菌株命名为沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM-1，保藏号为GDMCC No：63765，于2023年9月1日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。
实施例2
沉积物盐硫杆菌DCM-1在含硫代硫酸盐培养液中的好氧代谢特性的检测过程和检测结果如下：
挑取经分离纯化鉴定的沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM-1单菌落接种于富集筛选无机培养基（组成见实施例1，其中硫代硫酸钠浓度为1.580g/L（10mmol/L））中，培养温度为30℃，避光振荡（转速为150rpm）培养，每12 h对pH、细胞数、硫代硫酸根浓度和硫酸根浓度进行时相测定，反应总时长为96 h。
沉积物盐硫杆菌DCM-1在含硫代硫酸盐培养液中的好氧代谢特性如图3所示：从图3中的A中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液pH随时间逐渐降低至2.69左右，36 h后维持稳定；从图3中的B中可以看出，DCM-1菌株细胞数随时间呈现先增后减的趋势，于36 h达到最大细胞数1.23×108CFU/mL；从图3中的C中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液硫代硫酸根离子的浓度随时间迅速降低，36 h后消耗殆尽，硫代硫酸根的消耗速率为0.26 mmol/L·h；从图3中的D中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液硫酸根离子的浓度随时间逐渐增大，84 h后趋于稳定，硫酸根的生成速率为0.24 mmol/L·h，硫酸盐转换率达到100％。
实施例3
沉积物盐硫杆菌DCM-1在含硫化钠培养液中的好氧代谢特性的检测过程和检测结果如下：
挑取经分离纯化鉴定的沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM-1单菌落接种于含硫化钠的培养液（在富集筛选无机培养基基础上，将硫代硫酸钠替换为硫化钠，并加入0.0208 g/L EDTANa4·2H2O（目的在于络合Fe2+，防止硫化钠和FeCl2产生沉淀），其余组成成分不变，具体见实施例1，其中硫化钠浓度为0.48 g/L（2 mmol/L））中，培养温度为30 ℃，避光振荡（转速为150 rpm）培养，每12 h对pH、细胞数、硫离子浓度和硫酸根浓度进行时相测定，反应总时长为72 h。
沉积物盐硫杆菌DCM-1在含硫化钠培养液中的好氧代谢特性如图4所示：从图4中的A中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液pH随时间的延长而呈现不断下降的趋势，36 h后维持稳定于5.96左右；从图4中的B中可以看出，DCM-1菌株细胞数随时间呈现先增后减的趋势，于36 h达到最大细胞数4.7×107 CFU/mL；从图4中的C中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液硫离子的浓度随时间迅速降低，36 h后消耗殆尽，硫化钠的消耗速率为0.05 mmol/L·h；从图4中的D中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液硫酸根离子的浓度随时间逐渐增大，36h后趋于稳定，硫酸根的生成速率为0.05 mmol/L·h，硫酸盐转换率达到91.67％。
实施例4
沉积物盐硫杆菌DCM-1在含单质硫培养液中的好氧代谢特性的检测过程和检测结果如下：
挑取经分离纯化鉴定的沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM-1单菌落接种于含单质硫的培养液（在富集筛选无机培养基基础上，将硫代硫酸钠替换为单质硫，其余组成成分不变，具体见实施例1，其中单质硫浓度为0.064 g/L（2 mmol/L））中，培养温度为30 ℃，避光振荡培养（150 rpm），每天对pH、细胞数和硫酸根浓度进行时相测定，反应总时长为15天。
沉积物盐硫杆菌DCM-1在含单质硫培养液中的好氧代谢特性如图5所示：从图5中的A中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液pH随时间的延长而呈现先增后减的趋势，12天后维持稳定于6.22左右；从图5中的B中可以看出，DCM-1菌株细胞数随时间呈现先增后减的趋势，于11天达到最大细胞数4.27×107 CFU/mL；从图5中的C中可以看出，接种菌株DCM-1的培养液硫酸根离子的浓度随时间逐渐增大，11天后趋于稳定，硫酸根的生成速率为0.13mmol/L·d，硫酸盐转换率98.5％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株化能自养型盐硫杆菌菌株，其特征在于：所述的化能自养型盐硫杆菌菌株的名称为沉积物盐硫杆菌（Halothiobacillus sedimentum）DCM-1，保藏号为GDMCC No：63765，于2023年9月1日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。
2.权利要求1中所述的化能自养型盐硫杆菌菌株在氧化还原性硫化物中的应用。
3.根据权利要求2所述的化能自养型盐硫杆菌菌株在氧化还原性硫化物中的应用，其特征在于包括如下步骤：将权利要求1所述的化能自养型盐硫杆菌菌株置于含有还原性硫化物的环境下生长。
4.根据权利要求3所述的化能自养型盐硫杆菌菌株在氧化还原性硫化物中的应用，其特征在于：
所述的生长为好氧生长；
所述的氧化还原性硫化物是将还原性硫化物氧化为硫酸盐。
5.根据权利要求2或3所述的化能自养型盐硫杆菌菌株在氧化还原性硫化物中的应用，其特征在于：所述的还原性硫化物为单质硫、硫代硫酸钠和硫化钠中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的化能自养型盐硫杆菌菌株在氧化还原性硫化物中的应用，其特征在于：所述的环境为土壤或水体。
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