CN102399721A - 一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株hmgs18及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，该菌株的保藏名称为盐硫杆菌HMGS18，分类命名为Halothiobacillus sp.HMGS18，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年11月2日，保藏号为CCTCC NO：M2010290。该菌株具有高效硫化物降解能力，能快速有效的去除受硫化物污染海水中的硫化物，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用；本发明对去除海水养殖环境和海洋环境中硫化物污染具有安全、环保、高效的特点。

Description

一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18及其应用。

背景技术

我国的海水养殖产量一直位居世界第一，是仅次于肉类的优质蛋白质的重要来源，在保证国家海洋食物产出的安全方面也具有至关重要的作用。多年来，我国的海水养殖虽然保持了稳步发展，但养殖过程中产生的有机和无机废物量大，随着养殖“自身污染”效应的长期积累，养殖环境恶化问题日益凸现出来，不但对邻近海域生态环境造成了严重负面影响，反过来又制约了海水养殖生产本身。硫化物是养殖环境的最主要的污染物之一，且对养殖生物有毒害作用，因此，有效去除环境中的硫化物，改善海水养殖环境，不但有利养殖生产，而且对保护海洋环境也有重要意义。

硫氧化菌(Sulfur Oxidizing Bacteria简称SOB)是能氧化元素硫、硫化物、硫代硫酸盐和亚硫酸盐等产生代谢产物硫酸的一类菌。该微生物在工业和环保上具有重要价值，国内外目前主要集中在生物冶金，处理污泥和废水中的重金属，煤炭脱硫，刻蚀以铜及铜合金为材料的基片等方面都有不同程度的应用。研究发现，硫氧化菌能将有机质碳源硫化物沉淀转化为硫酸盐，抑制硫酸盐还原菌的代谢减少硫化物污染，改善海水养殖环境，但目前很少有人将硫氧化细菌有效利用于海水养殖中。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，该菌株能快速有效的去除污染海水中的硫化物，成本低且环保。

本发明的第二个目的在于提供上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株在处理受硫化物污染海水中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种可降解海水中硫化物的菌剂，该菌剂含有上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，能有效去除污染海水中的硫化物。

本发明的最后一个目的在于提供上述菌剂在去除受硫化物污染的海水中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，该菌株的保藏名称为盐硫杆菌HMGS18，分类命名为Halothiobacillus sp.HMGS18，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日期为2010年11月2日，保藏号为CCTCC NO：M2010290。

其中上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18的筛选分离鉴定过程为：取海水鱼类网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用富集基和选择培养基培养后，并分离纯化菌株，根据菌株对硫化物去除能力的强弱，筛选出对硫化物去除能力强的菌株，并最终筛选出一株对硫化物有较强降解能力的菌株，编号为HMGS18，然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株HMGS18经鉴定为盐硫杆菌属，命名为盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18。

本发明的第二个目的在于提供上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在去除受硫化物污染海水中的应用。

本发明的第三个目的是通过如下技术手段来实现的：一种可降解海水中硫化物的菌剂，含有上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18。

该菌剂可以为取经上述分离纯化的盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18单菌落，于活化培养基中扩大培养40-48h得到。

上述活化扩大培养中培养基的组成优选为：MgSO₄·7H₂O 0.1g，Na₂S₂O₃·5H₂O5g，K₂HPO₄ 2.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，陈海水1000mL，PH7.6-8.2，121℃灭菌20min。

本发明的最后一个目的是通过如下技术手段来实现的：上述菌剂在去除受硫化物污染的海水中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得到海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，其具有良好的去除受硫化物污染的海水中硫化物的能力，能在1-7d内有效去除海水中的硫化物(去除率68.8％)，并且该新菌株对海水养殖生物斑节对虾(Penaeus monodon)虾苗和黑鲷(Sparus macrocephalus)仔鱼等海洋常见鱼类没有毒害致病作用；

(2)本发明利用硫氧化细菌将海水中的硫化物转化为硫酸盐是去除硫化物污染的一种经济有效的方法，其能对海水养殖环境中的硫化物污染物进行快速、高效的去除，所以，可用于对海洋环境中硫化物污染的有效治理。

附图说明

图1是实施例2中筛选得到的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18的PCR产物琼脂糖电泳图；

图2是实施例3中筛选得到的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18的电镜图片；

图3是实施例5中的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在高浓度硫化物废水中pH的变化图；

图4是实施例5中的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在高浓度硫化物废水中硫酸盐的变化图；

图5是实施例5中的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在高浓度硫化物废水中硫化物的降解效率图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1 海洋好氧反硝化菌株的筛选方法：

一、材料准备

1、菌源和实验废水

(1)菌源：有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物；

(2)实验废水(高浓度硫化物海水)：Na₂S₂O₃·5H₂O  (硫化物)5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 2.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄·7H₂O0.02g，陈海水1000mL，PH7.6～8.2，121℃灭菌20min。

2、培养基

(1)选择培养基：Na₂S·5H₂O 2g，高纯水1L，121℃灭菌20min；

(2)分离及斜面培养基：MgSO₄·7H₂O 0.1g，Na₂S₂O₃·5H₂O 5g，K₂HPO₄ 2.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，琼脂20g，陈海水1000mL，PH7.6-8.2，121℃灭菌20min；

(3)活化扩大培养基：MgSO₄·7H₂O 0.1g，Na₂S₂O₃·5H₂O 5g，K₂HPO₄ 2.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，陈海水1000mL，PH7.6-8.2，121℃灭菌20min。

3、实验仪器和设备

广东海利电磁式空气压缩机ACO-009E；

苏州安泰超净工作台SW-CJ-1BU；

上海精宏生化培养箱SHP-150；

苏州欧倍振荡培养箱OBS-2F；

德国HYDRO-BIOS-KIEL采泥器；

日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85；

日立H-7650透射电子显微镜；

上海雷磁酸度计PHS-3C；

加热板及滴定仪；

PC818型PCR仪；

电泳仪及电泳槽；

凝胶紫外观测仪等。

二、菌株的分离与筛选

1、菌株的富集

取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层以下5cm处的沉积物放入采样袋，再放入0℃冰盒中带回实验室，取250g沉积物加到2L的富集瓶中，每2天加入1mL选择培养基，并加入适量的纤维棉，在室温条件下间歇曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水。

2、菌株的分离纯化

挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均匀涂布于分离培养基平板上，25-28℃培养2-3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰箱4℃保存。

3、硫氧化细菌的筛选

通过用pH、硫酸盐及硫化物值来衡量菌株对硫化物的降解能力，以硫化物浓度变化表示细菌利用硫化物的降解能力。

取分离纯化得到的菌株于活化扩大培养基中25-28℃振荡培养40-48h，按海水于菌液体积比40-60∶1，接种到含高浓度硫化物的海水中，取不接种菌液的硫化物海水作为空白对照，25-28℃振荡培养，反应时间1-8d。

经过筛选获得一株编号为HMGS18的菌株，即海洋硫氧化菌株HMGS18。

实施例2 海洋硫氧化菌株HMGS18的鉴定

1、对海洋硫氧化菌株HMGS18的鉴定

对海洋硫氧化菌株HMGS18进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。

16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

(1)细菌核DNA的提取：

1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5mL菌液于Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清；

2)加STE(Sodium-Tris-EDTA)缓冲液1.5mL洗涤一次，离心弃上清，再加入0.6mLTE(Tris-EDTA)缓溶液，重悬细菌；

3)加30μL 10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min；

4)加65μL 10％的SDS(十二烷基磺酸钠)，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃水浴2h，至溶液变清；

5)加入等体积酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白质为止；

6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc(pH5.2)；

7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用体积百分含量为70％的乙醇洗涤一次，自然晾干，并将DNA溶于100μL TE溶液中；

8)加入终浓度为50μg/mL的Rnase(RNA酶)，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存备用；

(2)16S rDNA基因的PCR扩增

P1(上游引物)：27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)

P2(下游引物)：1522R(5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′)

在50μL的反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(终浓度为0.5μM)，1μL dNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μL Taq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。

(3)PCR产物的回收

将PCR产物以1％琼脂糖凝胶(质量百分比)进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5mL离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10min后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用体积百分含量为70％的乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。

(4)16S rDNA的部分序列测定和分析

P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；

P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。

加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABIPRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在AppliedBiosystem373 ADNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。

2、16S rDNA序列测定

本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1458bp的扩增带用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。

GGGACAGGGG GGGCTGCCTT AACCATGCAA GTCGAACGGT AACAGGAGAG AGCTTGCTCT    60

CTTGCTGACG AGTGGCGGAC GGGTGAGTAA TACATGGGAA TCTGCCCTGA GGTGGGGGAT    120

AACCTGGGGA AACTCAGGCT AATACCGCAT GATCTCTACG GAGCAAAGTG GGGGACCTTC    180

GGGCCTCACG CCTTGGGATG AGCCCATGTC TGATTAGCTA GTTGGTGGGG TAAGAGCCTA    240

CCAAGGCGAC GATCAGTAGC CGGCCTGAGA GGGTGGACGG CCACACTGGG ACTGAGACAC    300

GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGG ACAATGGGGG CAACCCTGAT    360

CCAGCAATGC CGCGTGTGTG AAGAAGGCCT GCGGGTTGTA AAGCACTTTT ATCGGGGAAG    420

AATAGGTTGT CGCTAATACC GGCAACACTT GACATTACCC GTTGAATAAG CACCGGCTAA    480

CTCCGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGGAG GGTGCGAGCG TTAATCGGAA TTACTGGGCG    540

TAAAGCGTGC GTAGGCGGAA GCTTAAGTCT GATGTGAAAG CCCCGGGCTT AACCTGGGAA    600

TGGCATTGGA AACTGGGTTT CTAGAGTGTG GTAGAGGATA GTGGAATTTC CAGTGTAGCG    660

GTGAAATGCG TAGATATTGG AAAGAACACC GATGGCGAAG GCAGCTATCT GGGCCAACAC    720

TGACGCTGAG GTACGAAAGC GTGGGGAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC    780

CCTAAACGAT GTCGACTTGT CGTTGGGGGA GTTTAGTCCT TCAGTGACGG AGCTAACGCG    840

TTAAGTCGAC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGTTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG    900

CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGATGCAA CGCGAAGAAC CTTACCTGGC    960

CTTGACATCC TCGGAACTTG GCAGAGATGC CTTGGTGCCT TCGGGAACCG AGTGACAGGT    1020

GCTGCATGGC TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC    1080

AACCCTTATT CCTAGTTGCC AGCACTTCGG GTGGGAACTC TAGGGAGACT GCCGGTGACA    1140

AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAGT CATCATGGCC CTTATGGCCA GGGCTACACA    1200

CGTGCTACAA TGGTCGGTCC AATGGGTAGC TAAGCCGCGA GGTGGAGCCA ATCCCTCAAA    1260

GCCGATCTTA GTCCGGATTG CAGTCTGCAA CTCGACTGCA TGAAGTCGGA ATCGCTAGTA    1320

ATCGCAGATC AGCATTGCTG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA    1380

CACCATGGGA GTGGGTTGCA CCAGAAGTGG CTAGTCTAAC CTTCGGGAGG ACGGTCACCA    1440

CGGTGGATTC  CCGTTTGC                                                 1458

实施例3 海洋硫氧化菌株HMGS18菌落形态、生理和生化特征

海洋硫氧化菌株HMGS18菌落形态、生理和生化特征见表1-1；细胞形态见图2。

表1-1海洋硫氧化菌株HMGS18的菌落形态特征以及主要的生理生化特征

备注：“+”：90％以上的菌株为阳性，“-”：90％以上的菌株为阴性。

实施例4 海洋硫氧化菌株HMGS18的鉴定

将海洋硫氧化菌株HMGS18长度为1458bp的16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析，海洋硫氧化菌株HMGS18与盐硫杆菌属(Halothiobacillus sp.)多个菌株的同源性高达99％以上。综合菌株的生理生化及分子鉴定结果，可确定海洋硫氧化菌株HMGS18为盐硫杆菌属(Halothiobacillus sp.)，菌株HMGS18命名为盐硫杆菌(Halothiobacillussp.)HMGS18(即海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18)，查阅有关资料，尚无盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)有关具有降解硫化物能力的研究报道。盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18为新的菌株，已于2010年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：盐硫杆菌(Halothiobacillussp.)HMGS18 CCTCC NO：M2010290，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。

通过分离、筛选的海洋硫氧化菌株HMGS18，其具有较强的硫化物降解能力，拓宽了人们对盐硫杆菌属(Halothiobacillus sp.)在其功能方面的应用研究思路，并为去除受高浓度硫化物污染海水中的硫化物提供了有用的菌源和技术，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用，具有安全、环保和高效的实际应用价值。

实施例5 海洋硫氧化菌株HMGS18的应用

应用实例一：

取经分离纯化的盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，该范围内的任一培养时间段均可，此处为优选，其它时间范围也可以，并不是对培养时间的特别限定，按海水与菌液体积比为40-60∶1，该范围内的任一比例均可，其它比例也可以，此处为优选，并不是对二者用量的特别限定，接种到高浓度硫化物海水中(硫化物浓度为1280mg/L)，培养温度25-28℃，轻微振荡培养(50r·min^-1)，连续监测硫化物海水的pH，反应1-8d。

从图3可以看出，接种盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18菌株的高浓度硫化物海水中，pH值在1-5d有显著的降低，从6.8降到4.5，海水由中性变为酸性，pH值降低是由于细菌大量增殖发生氧化作用使硫代硫酸钠中的硫离子转化为硫酸根离子。盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18菌株在1-5d对硫化物有较强的氧化作用。

应用实例二：

取经分离纯化的盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1，接种到高浓度硫化物海水中(硫化物浓度为1280mg/L)，培养温度25-28℃，轻微振荡培养(50r·min^-1)，连续监测硫化物海水的硫酸盐，反应1-8d。

从图4可以看出，接种盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18菌株的高浓度硫化物海水中，硫酸根离子的浓度随时间逐渐增大，7-8d维持稳定，硫酸盐转换率达62.3％。

应用实例三：

取经分离纯化的盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1制成菌剂，接种到高浓度硫化物海水中(硫化物浓度为1280mg/L)，培养温度25-28℃，轻微振荡培养(50r·min^-1)，连续监测硫化物海水的硫化物，反应1-8d。

从图5可以看出，接种盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18菌株的高浓度硫化物海水中，硫化物浓度随时间迅速降低，在5d以后下降趋势趋于缓慢，硫化物去除率达68.8％。盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18菌株能迅速有效地降低高浓度硫化物海水中的硫化物。

应用实例四：

取经分离纯化的盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18单菌落，于活化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60∶1，接种到装有2L过滤海水的玻璃圆缸中，并以不加菌液的过滤海水为对照，分别放养有40尾体长约1cm的班节对虾(Penaeus monodon)虾苗和20尾体长约3cm的黑鲷(Sparusmacrocephalus)仔鱼，各分3个平行实验组，水温25-28℃，96h后，经统计分析虾苗存活率在77.5％～85％，仔鱼存活率在在77.5％～85％，存活率在实验组与对照组的之间无显著差异。可见，盐硫杆菌(Halothiobacillus sp.)HMGS18对海水养殖生物没有毒害致病作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，其特征是：该菌株的保藏名称为盐硫杆菌HMGS18，分类命名为Halothiobacillus sp.HMGS18，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年11月2日，保藏号为CCTCC NO：M2010290。

2.权利要求1所述的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在处理受硫化物污染的海水中的应用。

3.一种可降解海水中硫化物的菌剂，其特征是：含有权利要求1中所述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18。

4.权利要求3所述菌剂在处理受硫化物污染的海水中的应用。

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