CN117054654A - 一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法及试剂盒 - Google Patents

一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于单分子免疫体外诊断技术领域，具体公开了一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1、制备链霉亲和素磁珠工作液；S2、制备生物素化p53抗原偶联蛋白工作液；S3、制备荧光微球‑鼠抗人IgG偶联蛋白工作液。本发明还提供上述制备方法得到的试剂盒。本发明提供的p53抗体试剂盒的制备方法及试剂盒制备方法简单、可顺利转产，可大幅度提高检验实验效率，反应时间短，样本出结果等待时间短，并且测试结果稳定，重复性佳，检出限低，试剂反应性灵敏，对于目标抗体检出率高，对于p53抗体检出的效率高。

Description

一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法及试 剂盒
技术领域
本发明属于单分子免疫体外诊断技术领域，尤其涉及一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法及试剂盒。
背景技术
p53为肿瘤抑制蛋白(也称为p53抗体或p53肿瘤蛋白)，属于最早发现的肿瘤抑制基因(或抑癌基因)之一，能有效调节细胞周期和避免细胞癌变发生，被称为“基因组守护者”。p53抗体在避免癌症发生上扮演着重要的角色，例如细胞凋亡(apoptosis)、基因组稳定性(genetic stability)、抑制血管新生(angiogenesis)，与多种癌症(如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌等)的不良预后相关，所以p53抗体可以作为癌症的诊断生物标志物，检测人体血清p53抗体的表达含量对于癌症的早期诊断具有重要意义。
目前，市面上的p53抗体检测试剂盒较少，并且大多采用传统的酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)，具体是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的催化作用相结合起来的一种实验技术，操作复杂，人工成本较高，对于待测样本最低检出限要求标准较高，无法对浓度低于1ng/ml的样本中的p53抗体进行准确测定，其检测灵敏度多限制在(10-14)-(10-12)mol/L，无法满足早期诊断的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法及试剂盒，以解决上述技术问题。
本发明目的之一在于提供一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用链霉亲和素磁珠制备链霉亲和素磁珠工作液；
S2、制备生物素化p53抗原偶联蛋白工作液：
(1)制备生物素溶液；
(2)透析纯化p53抗原，将p53抗原体积补充至70-130μl；
(3)按照p53抗原和生物素溶液体积比＝1:(10-50)的比例，向p53抗原中加入生物素溶液；
(4)反应得到生物素化p53抗原；
(5)将生物素化p53抗原稀释，得到生物素化p53抗原偶联蛋白工作液；
S3、制备荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液：
(1)清洗羧基修饰的荧光微球；
(2)称取活化剂进行活化；
(3)活化完成后，离心弃上清，清洗荧光微球后，重悬荧光微球；
(4)加入鼠抗人IgG到已活化的荧光微球中反应；
(5)加入BSA封闭液孵育；
(6)封闭结束后，离心弃上清，得到荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液。
优选的，链霉亲和素磁珠工作液，简称：M工作液，浓度为1mg/ml；M工作液作为固相材料可以将免疫复合物吸附到磁珠上。链霉亲和素磁珠工作液包括链霉亲和素磁珠，粒径为1-2μm。
优选的，荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液，简称：R2工作液。荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液包括鼠抗人IgG荧光微球复合物。生物素化p53抗原偶联蛋白工作液，简称：R1工作液。
优选的，鼠抗人IgG荧光微球复合物包括荧光微球和鼠抗人IgG抗体，荧光微球粒径为200-400nm。
优选的，荧光微球材质为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯中的一种或两种以上。
优选的，鼠抗人IgG抗体浓度为1-3mg/ml，优选浓度为1mg/ml，采用鼠源抗人IgG抗体作为检测抗体，与待测样本的人IgG结合效率佳，并且价格便宜。
优选的，生物素溶液的浓度为8-12mM。低于8mM生物素反应的偶联效率低；高于12mM生物素反应的偶联效率没有明显改善，且影响纯化的效率。
本发明目的之二在于提供上述制备方法制备的p53抗体试剂盒，包括链霉亲和素磁珠工作液、生物素化p53抗原偶联蛋白工作液、荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液。
优选的，链霉亲和素磁珠工作液的浓度为0.8-1.5mg/ml。链霉亲和素磁珠工作液浓度高于1.5mg/mL，磁珠用量越多试剂成本较高，且磁珠分散不均匀容易结团进而影响检测结果。当链霉亲和素磁珠工作浓度为1.0mg/mL时，能够进一步提高整个试剂盒的灵敏度和准确度的同时，保证较低的生产成本。当链霉亲和素磁珠工作浓度低于0.8mg/mL时，参与反应的磁珠量就越低，不能完全捕获样本中的目标待测物，检测结果与样本真实值存在较大偏差。
优选的，生物素化p53抗原偶联蛋白工作液的浓度为1-6μg/ml；荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液的浓度为15-25μg/ml。生物素化p53抗原偶联蛋白工作液浓度低于1μg/ml，其有效工作量低，导致高值样本的漏检，生物素化p53抗原偶联蛋白工作液浓度高于6μg/ml，造成生产成本的太高。
荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液的工作浓度与成本、准确度有关，荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液浓度越低，其成本越低；荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液浓度过高可能会造成非特异结合，增加清洗难度，浓度过低，可能造成信号减少，影响准确度和灵敏度。荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液的工作浓度高于6μg/ml时，荧光微球结团严重且严重浪费原料，荧光微球的工作浓度低于1μg/ml时，荧光信号值不能反映样本真实值，检测结果出现偏差。
本发明的有益效果在于：
1、检测时，向待测样本中加入R1工作液和R2工作液进行免疫孵育反应。生物素化p53抗原与样本中的待测p53抗体发生特异性免疫反应，荧光微球-鼠抗人IgG又与待测p53抗体发生特异性免疫反应，形成夹心免疫复合物。链霉亲和素-生物素是自然界中的强非共价结构，可以将带有生物素化标签的夹心免疫复合物从溶液中分离出来，经清洗后，未反应的物质被洗去，没有参与反应的荧光微球不会被荧光计数。将清洗后的磁珠重悬后点入微列阵芯片中，在显微镜下进行荧光信号计数与读值，经校准曲线计算，即可测得p53抗体的表达量。
2、本发明提供的试剂盒的制备方法的工艺简单、可顺利转产，可实现自动化反应，大幅度提高检验实验效率，反应时间短，样本出结果等待时间短，并且测试结果稳定，重复性佳，检出限低，试剂反应性灵敏，对于目标抗体检出率高。
3、本发明采用单分子免疫检测法对p53抗体进行检测，可将待检测分子限制在极小范围内(nL以下)，对检测信号进行绝对计数，将1ng/ml以下的样本检出，实现痕量(可达10-18mol/L)的标志物检测，准确度和灵敏度均大幅度提高。
4、p53抗原和生物素溶液体积比＝1:(10-50)。p53抗原生物素标记物的浓度高，会出现非特异结合，生物素干扰浓度上升以及成本增加问题；p53抗原生物素标记物浓度低，会出现灵敏度降低的问题。p53抗原生物素标记物和鼠抗人IgG荧光微球复合物均能够与p53蛋白抗体的位点结合，链霉亲和素磁珠能够与生物素发生非共价吸附，从而将待测物捕获到磁珠上。
附图说明
图1为实施例1提供的试剂盒的原理；
图2为实施例1拟合的校准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒
1、原理及用途
(1)原理
如图1所示，检测时，向待测样本中加入生物素化p53抗原偶联蛋白工作液和荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液进行免疫孵育反应。生物素化p53抗原与样本中的待测抗体发生特异性免疫反应，荧光微球-鼠抗人IgG又与待测p53抗体发生特异性免疫反应，形成夹心免疫复合物。链霉亲和素-生物素是自然界中的强非共价结构，可以将带有生物素化标签的夹心免疫复合物从溶液中分离出来，经清洗后，未反应的物质被洗去，没有参与反应的荧光微球不会被荧光计数。将清洗后的磁珠重悬后点入微列阵芯片中，在显微镜下进行荧光信号计数与读值，即可得到p53抗体的表达量。
(2)用途
用于检测人体血清p53抗体表达含量。p53蛋白的氨基酸序列可以在NCBI上查询(GenBank:AAC53040.1)；具体为：
2、试剂盒组份
3、试剂盒制备方法
本发明还提供上述采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备M工作液(链霉亲和素磁珠工作液)：
M工作液采用0.8-1.5mg/ml浓度工作，具体是采用链霉亲和素磁珠稀释得到，链霉亲和素磁珠的粒径为1.6μm，磁珠的粒径为1.6μm时，试剂盒的检测灵敏度和准确度最佳。链霉亲和素磁珠的浓度过高会导致信号值过高，造成链霉亲和素磁珠浪费，链霉亲和素磁珠浓度过低会导致信号值过低，试剂盒灵敏度差。
保存时，加入链霉亲和素磁珠的缓冲液，链霉亲和素磁珠的缓冲液可以是磷酸缓冲盐、防腐剂、保护蛋白、表面活性剂等。
本实施例中，M工作液使用1mg/ml浓度，具体可以采用外购的JSR MS160/Streptavidin链霉亲和素磁珠经过PBST清洗后稀释至1mg/ml制得M工作液。以1mg磁珠清洗步骤为例：
取出JSR MS160/Streptavidin链霉亲和素磁珠1mg，该磁珠到货时为100mg/ml母液保存，取出10μl母液，加入PBST溶液990μl，于漩涡振荡器上混匀10s，置于磁分离架上约30s后吸去上清，重复清洗三次后，加入缓冲液1ml，得到1mg/ml M工作液。
S2、制备R1工作液(生物素化p53抗原偶联蛋白工作液)：
(1)溶解生物素纯品成8-12mM的生物素溶液，本实施例中生物素溶液的浓度为10mM，此时的标记效率最高；低于8mM生物素反应的偶联效率低；高于12mM生物素反应的偶联效率没有明显改善，且影响纯化的效率。
(2)以标记20μg的p53抗原为例，从1mg/ml的p53抗原母液中取20μl的p53抗原母液，使用赛默飞厂家的ZebaTM脱盐离心板(7K MWCO)，将p53抗原体积使用碳酸氢钠缓冲液补充体积至70-130μl(超过此范围内的体积无法使用赛默飞厂家的ZebaTM脱盐离心板(7KMWCO)进行纯化)。
本实施例中，将抗原体积使用碳酸氢钠缓冲液补充至70μl，透析纯化20μg p53抗原；收集纯化后的p53抗原体积为70μl。
(3)按照p53抗原和生物素溶液体积比＝1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的比例，向20μg的p53抗原(分子量53KD)中加入10mM生物素溶液约0.755μl。
本实施例中，p53抗原和生物素溶液体积比＝1:20的偶联效率达到最大。
(4)在25℃反应4h后得到生物素化p53抗原；25℃条件比较温和，反应4h所得的生物素标记物反应性较强，延长标记时间不能进一步提高反应性，缩短标记时间将使反应性降低。
(5)使用含有50mM Tris缓冲液的溶液将生物素化p53抗原稀释至1-6μg/ml后，得到R1工作液。生物素化p53抗原偶联蛋白工作液浓度低于1μg/ml，其有效工作量低，导致高值样本的漏检，生物素化p53抗原偶联蛋白工作液浓度高于6μg/ml，造成生产成本的太高。
本实施例中，R1工作液的浓度优选为5μg/ml。
S3、制备R2工作液(荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液)：
(1)使用50mM MES缓冲液清洗1mg羧基修饰的荧光微球三次，使用15000rpm 15min的参数离心。荧光微球粒径范围为200-400nm，本实施例中，荧光微球的粒径为200nm。
本实施例中，荧光微球可以购买自杭州博岳生物，货号为FG0200C。荧光微球的粒径过大会出现比表面积小，包被效率低的问题，荧光微球的粒径过小会出现离心不充分，损耗较大的问题。
荧光微球材质为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯中的一种或两种以上，本实施例中，荧光微球材质的材质为聚苯乙烯。二氧化硅不易溶胀，无法将染料包裹在其内，荧光强度不稳定。聚丙烯酰胺偶联抗体后，其灵敏度能达到0.091ng/mL，但较聚苯乙烯偶联抗体后的灵敏度低。荧光微球表面修饰有羧基、氨基或甲苯磺酰基中的一种或多种，优选修饰有羧基的荧光微球。在荧光微球上修饰羧基，有助于进一步增强信号，进一步提高灵敏度。
采用内部染料包埋方法制备荧光微球，得到的荧光微球发光更加稳定。荧光微球内包裹的染料为荧光素、量子点、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白或上转换纳米粒子。采用荧光素为染料的荧光微球的荧光强度强，能与背景信号分开，有利于在最终结果分析时的信号采集，能显著提高检测的精密度。本实施例中，荧光微球内包裹的染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂，具有高吸收率、优异的荧光量子产率和良好的水溶性，稳定性佳，与蛋白质结合力优良，并且人眼对黄绿色较为敏感，方便观察，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长为520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，在冷暗干燥处也可保存多年。在大量的荧光染料中，FITC由于其高吸收性，出色的荧光量子产率和良好的水溶性而成为最受欢迎的荧光团之一。像其他荧光素衍生物一样，FITC产生可检测的信号，而无需其他试剂进行检测。该功能使FITC在检测蛋白质或抗体的位置和活化，鉴定蛋白质或抗体复合物的形成和构象变化以及监测体内生物过程方面极为灵活。
量子点是一种纳米级别的半导体，通过对量子点施加一定的电场或光压，便会发出特定频率的光，而发出的光的频率会随着这种半导体尺寸的改变而变化，因而通过调节这种纳米半导体的尺寸就可以控制其发出的光的颜色，具体原理是由于这种纳米半导体拥有限制电子和电子空穴(Electron hole)的特性。
稀土元素是化学元素周期表中镧系元素—镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)，钇(Y)和钪(Sc)，共17种元素，均是非常活泼的金属，性质极为相似，常见化合价+3，其水合离子大多有颜色，易形成稳定的配化合物。
稀土螯合物是一些稀土元素Sm3+、Dy3+、Eu3+、Tb3+，尤其是Eu3+、Tb3+同一些有机化合物如β-二酮化合物、菲罗啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物等所形成的螯合物，在紫外光的照射下发出很强的荧光，最主要的特点是激发波长具有配体的特性即随配体的变化而变化，发射光的波长具有镧系元素的性质，即不随配体的变化而变化，有利于多种稀土离子标记进行多分析物同时监测。
荧光蛋白优选为绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)是一种β-桶状蛋白1，由238个氨基酸组成，分子量约为27kDa，激发波长为488nm，并在约507nm处有一个发射峰。GFP从水晶水母Aequorea victoria分离而来，可通过能量转移，将水母发光蛋白通过化学作用发出的蓝色荧光转变为绿色荧光。
上转换纳米颗粒(UCNP)含有无机晶体基质的晶格中有镧系元素、过渡金属或锕系元素掺杂离子，能够在受到低能量的光激发的情况下，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光。
(2)加入10mg/ml的活化剂，在25℃置于旋转混匀仪800rpm/min活化30min。本实施例中，活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，每1mg的荧光微球加入EDC和NHS工作溶液各50μl。使用50mM MES缓冲液溶解EDC和NHS成10mg/ml的工作溶液。
(3)活化完成后，离心(15000rpm 15min)弃上清，加入50mM MES缓冲液1ml清洗荧光微球后，使用20mM HEPES缓冲溶液重悬荧光微球至1ml；
(4)加入0.02mg鼠抗人IgG抗体(1mg/ml的浓度取20μl)到已活化完成的荧光微球，置于旋转混匀仪800rpm/min，25℃反应2h；
(5)加入100μl 20mg/ml的BSA封闭液，于滚轴孵育器上孵育1h，转速800rpm/min。
BSA封闭液配制方法：称取1g的BSA(0.1％牛血清白蛋白)于烧杯中，加入20mM PBS(pH 7.4)搅拌置溶解，倒入容量瓶中定容至1L，置于4℃保存。
(6)封闭结束后，离心15000rpm 15min弃上清，加入1ml的荧光微球标记物保存液，得到浓度范围为15-25μg/ml的R2工作液，本实施例中，R2工作液的浓度为20μg/ml。
荧光微球标记物保存液包括磷酸缓冲盐、防腐剂、保护蛋白、表面活性剂等。
测试时，仅需要将M工作液、R1工作液和R2工作液放入全自动单分子免疫分析仪中，即可完成全自动加试剂和加样本等操作，等待反应时间结束后，仪器进行自动化清洗，清洗后重悬，将反应后的样本点入列阵芯片中，经仪器内部的荧光显微镜拍照后，读出荧光信号值，经校准曲线(图2为实施例1拟合的校准曲线)计算得出待测样本p53抗体浓度。
4、试剂盒检测方法
本发明还提供上述采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
第一步：反应管中加入M工作液20μl，再加入R1工作液50μl，加入待测样本(血清或血浆)10μl。经过孵育后，样本中的p53自身抗体与R1工作液中的p53抗原发生免疫反应，形成抗原-抗体免疫复合物。M组分有链霉亲和素修饰后的磁珠组分，链霉亲和素可以将生物素化p53抗原吸附到磁珠上，形成磁珠-p53抗原-p53自身抗体复合物。通过清洗去除未结合到磁珠上的其他物质。
第二步：反应管中加入R2工作液10μl。经过孵育后，R2工作液的鼠抗人IgG可以与待测物p53自身抗体发生特异性免疫反应，形成磁珠-p53抗原-p53自身抗体-鼠抗人IgG，鼠抗人IgG上标记的有荧光微球，可以在显微镜下进行荧光信号的计数。
第三步：样本中的p53自身抗体的量和荧光信号值有直接关系。测试结果通过校准曲线确定。校准曲线由分析仪通过定标得来。
实验一：p53抗体表达含量测试
对比实施例1提供的试剂盒和杭州凯保罗生物科技有限公司的七种肺癌相关抗体检测试剂盒(酶联免疫法，即传统ELISA试剂盒)测定人体血清p53抗体的表达含量，实验结果如下表1所示：
表1 p53抗体表达含量测试
p53自身抗体的阳性参考值为＞8ng/ml，根据上表1可以看出：
(1)实施例1提供的试剂盒的阳性检出率明显更加优秀，因为有10例样本已经在影像学中拍到肺部结节，本试剂盒能够准确检测出8例样本，而ELISA试剂盒只能检测出5例，故其阳性检出率明显更高。
(2)针对部分低于1ng/ml的低值样本，实施例1提供的试剂盒仍然能够检出数值，灵敏度高，试剂的灵敏度明显优于传统ELISA试剂盒。
(3)采用实施例1提供的试剂盒的测试结果与影像学的相关性更好。
实验二：重复性测试
1、实验设计：选取5支能够覆盖到阴阳及参考值附近的临床血清样本(分别编号为样本41、样本42、样本43、样本44和样本45)，每支样本分别用本试剂盒和杭州凯保罗生物科技有限公司的七种肺癌相关抗体检测试剂盒(酶联免疫法)进行测试，每支样本测试重复10次，计算10次测试的CV值。
2、定值血清进行重复性测试结果如下表2所示：
表2重复性测试
根据表2的实验结果可以看出，实施例1提供的试剂盒测定人体血清p53抗体表达含量更为稳定，可以排除人为操作导致的样本测试异常情况，可以大幅度减少人员操作导致的偏差。针对同一支样本的测值更加稳定，重复性测试的变异系数值更低，说明测试结果更为稳定，样本测试结果的可信度更高。
实施例2-10
实施例2-10与实施例1区别主要如下表3所示：
表3实施例2-10的主要区别
采用实施例2-10的提供的试剂盒测定样本1的人体血清p53抗体的表达含量，实验结果如下表4所示：
表4 p53抗体表达含量测试
组别 样本1的p53抗体表达含量(ng/ml)
实施例2 0.23
实施例3 0.22
实施例4 0.21
实施例5 0.24
实施例6 0.23
实施例7 0.21
实施例8 0.23
实施例9 0.22
实施例10 0.23
根据上表4可以看出：
针对部分低于1ng/ml的低值样本，实施例2-10提供的试剂盒仍然能够检出数值，灵敏度高，试剂的灵敏度明显优于传统ELISA试剂盒。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备链霉亲和素磁珠工作液；
S2、制备生物素化p53抗原偶联蛋白工作液：
(1)制备生物素溶液；
(2)透析纯化p53抗原，将p53抗原体积补充至70-130μl；
(3)按照p53抗原和生物素溶液体积比＝1:(10-50)的比例，向p53抗原中加入生物素溶液；
(4)反应得到生物素化p53抗原；
(5)将生物素化p53抗原稀释，得到生物素化p53抗原偶联蛋白工作液；
S3、制备荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液：
(1)清洗羧基修饰的荧光微球；
(2)称取活化剂进行活化；
(3)活化完成后，离心弃上清，清洗荧光微球后，重悬荧光微球；
(4)加入鼠抗人IgG到已活化的荧光微球中反应；
(5)加入BSA封闭液孵育；
(6)封闭结束后，离心弃上清，得到荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液。
2.根据权利要求1所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，链霉亲和素磁珠工作液包括链霉亲和素磁珠，链霉亲和素磁珠的粒径为1-2μm。
3.根据权利要求1所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液包括鼠抗人IgG荧光微球复合物。
4.根据权利要求3所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，鼠抗人IgG荧光微球复合物包括荧光微球和鼠抗人IgG抗体，荧光微球粒径范围为200-400nm。
5.根据权利要求4所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，荧光微球材质为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯中的一种或两种以上。
6.根据权利要求4所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，鼠抗人IgG抗体浓度为1-3mg/ml。
7.根据权利要求1所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，生物素溶液的浓度为8-12mM。
8.一种根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒，其特征在于，包括链霉亲和素磁珠工作液、生物素化p53抗原偶联蛋白工作液、荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液。
9.根据权利要求8所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒，其特征在于，链霉亲和素磁珠工作液的浓度为0.8-1.5mg/ml。
10.根据权利要求8所述的采用单分子免疫法检测p53抗体试剂盒，其特征在于，生物素化p53抗原偶联蛋白工作液的浓度为1-6μg/ml；荧光微球-鼠抗人IgG偶联蛋白工作液的浓度为15-25μg/ml。
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