CN117050957A - 一种β-胡萝卜素合酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种β‑胡萝卜素合酶突变体及其应用。通过在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基础上经过理性设计和酶进化筛选得到的β‑胡萝卜素合酶突变体，相比野生β‑胡萝卜素合酶发生了蛋白质结构和功能的改变，在实际应用时，β‑胡萝卜素合酶突变体的催化活性明显提高，可获得更高的β‑胡萝卜素合成速率，因而获得更高的β‑胡萝卜素产量。同时，进一步地通过对解脂耶式酵母中MVA途径进行强化并导入β‑胡萝卜素合酶基因，构建出更加高产β‑胡萝卜素的重组解脂耶式酵母；为β‑胡萝卜素的生物合成方面提供有力酶及菌株，对于β‑胡萝卜素的生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及β-胡萝卜素合酶突变体及其应用，更具体涉及β-胡萝卜素的生物合成方面的应用。
背景技术
β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族，存在于植物、水果和微生物中，它可以作为维生素原、功能性化妆品、食品着色剂和饲料补充剂，因此被广泛应用于制药、保健品、化妆品和食品工业等领域，是一类具有重要生物功能和商业价值的色素。
目前，β-胡萝卜素主要通过化学合成得到，但考虑到化学品的安全合成问题，以及消费者对天然添加剂、微生物的偏好，利用微生物异源表达合成β-胡萝卜素受到越来越多的关注。
β-胡萝卜素合酶是影响β-胡萝卜素生物合成的关键因素之一。当前挖掘的β-胡萝卜素合酶催化活性低，使β-胡萝卜素微生物合成的应用受到限制。因此，优良β-胡萝卜素合酶获得将对推进β-胡萝卜素生物合成具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种β-胡萝卜素合酶突变体及其应用，以解决现有技术中的β-胡萝卜素合酶活性低的问题。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种β-胡萝卜素合酶突变体，所述β-胡萝卜素合酶突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸突变之一：V428A、Y554A、D409A、D329A、I123A、W188A、N227A、R239A、F303A、K343A、T361A、F387A、K400A、Q418A、I439A、N471A、L465A、E495A、E468A、Y406A、Y406D、Y406E、Y406F、Y406G、Y406H、Y406K、Y406L、Y406M、Y406P、Y406Q、Y406R、Y406S、Y406T、Y406V、Y406W、Y406C、Y406I、Y406N、E468D、E468F、E468G、E468H、E468K、E468L、E468M、E468P、E468Q、E468R、E468S、E468T、E468V、E468N、E468Y、E468C、E468I、E468W、F303D、F303E、F303G、F303H、F303K、F303L、F303M、F303P、F303Q、F303R、F303S、F303N、F303V、F303W、F303Y、F303C、F303I、F303T、N471D、N471E、N471F、N471G、N471H、N471K、N471L、N471M、N471P、N471Q、N471R、N471S、N471V、N471W、N471T、N471C、N471I、N471Y、Y406S+N471M、Y406S+F303C、E468M+N471M、F303C+Y406I、F303C+E468I、Y406L+N471G、Y406L+E468H。
本申请筛选到的上述突变体经过了大量的实验验证，最终证明了该酶催化反应的催化活性显著提高。其中，在一种优选的实施例中，突变体在25℃至35℃的温度下均具有较高的催化活性。在一种优选的实施例中，突变体在100~800rpm的转速下均具有较高的催化活性。
本发明还提供编码上述β-胡萝卜素合酶的核酸。
本发明还提供表达上述β-胡萝卜素合酶的基因工程细胞，其包含编码所述β-胡萝卜素合酶的核酸。
根据本发明的实施方案，所述基因工程细胞是将所述核酸构建表达框，再导入宿主细胞中得到的重组菌株。
本发明也提供了一种产β-胡萝卜素的重组解脂耶式酵母的构建方法，包括：将β-胡萝卜素合酶基因导入解脂耶式酵母，得到产β-胡萝卜素的重组解脂耶式酵母。例如，所述解脂耶式酵母为能够积累β-胡萝卜素合成前体香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的解脂耶式酵母。
本发明进而提供了一种生产β-胡萝卜素的方法，包括培养上述重组解脂耶式酵母，得到发酵产物β-胡萝卜素。
所述培养的温度为25℃至35℃；培养时间为24h至96h；优选地所述培养在搅拌或振荡条件下进行，更优选地震荡转速为250 rpm。
进一步还包括萃取所述β-胡萝卜素的步骤，萃取时向体系中添加萃取剂；萃取剂选自二甲基亚砜和甲醇；优选地所述萃取剂二甲基亚砜的添加含量为1 ml每100微升发酵液，甲醇的添加含量为0.5 ml每100微升发酵液；更优选地于50℃孵育1 h。
本发明通过在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基础上经过理性设计和酶进化筛选得到的β-胡萝卜素合酶突变体，相比野生型β-胡萝卜素合酶发生了蛋白质结构和功能的改变，在实际应用时，β-胡萝卜素合酶突变体的催化效率明显提高，可获得更高的β-胡萝卜素合成速率，因而获得更高的β-胡萝卜素产量。同时，进一步地通过对解脂耶式酵母中MVA途径进行强化并导入β-胡萝卜素合酶基因，构建出更加高产β-胡萝卜素的重组解脂耶式酵母；为β-胡萝卜素的生物合成方面提供有力酶及菌株，对于β-胡萝卜素的生产具有重要意义。
附图说明
图1是酶底物附近氨基酸丙氨酸突变对β-胡萝卜素合成的影响图。
图2是β-胡萝卜素合酶关键位点组合突变对β-胡萝卜素合成的影响图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
下面结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
其中，SEQ ID NO：1的氨基酸序列（来源于Blakeslea trispora）如下：
MLLTYMEVHLYYTLPVLGVLSWLSRPYYTATDALKFKFLTLVAFTTASAWDNYIVYHKAWSYCPTCVTAVIGYVPLEEYMFFIIMTLLTVAFTNLVMRWHLHSFFIRPETPVMQSVLVRLVPITALLITAYKAWHLAVPGKPLFYGSCILWYACPVLALLWFGAGEYMMRRPLAVLVSIALPTLFLCWVDVVAIGAGTWDISLATSTGKFVVPHLPVEEFMFFALINTVLVFGTCAIDRTMAILHLFKNKSPYQRPYQHSKSFLHQILEMTWAFCLPDQVLHSDTFHDLSVSWDILRKASKSFYTASAVFPGDVRQELGVLYAFCRATDDLCDNEQVPVQTRKEQLILTHQFVSDLFGQKTSAPTAIDWDFYNDQLPASCISAFKSFTRLRHVLEAGAIKELLDGYKWDLERRSIRDQEDLRYYSACVASSVGEMCTRIILAHADKPASRQQTQWIIQRAREMGLVLQYTNIARDIVTDSEELGRCYLPQDWLTEKEVALIQGGLAREIGEERLLSLSHRLIYQADELMVVANKGIDKLPSHCQGGVRAACNVYASIGTKLKSYKHHYPSRAHVGNSKRVEIALLSVYNLYTAPIATSSTTHCRQGKMRNLNTI。
本申请根据上述SEQ ID NO：1所示的蛋白序列，进行了密码子优化，具体核酸序列为SEQ ID NO：2：
ATGCTGCTGACCTACATGGAGGTCCACCTGTACTACACCCTGCCCGTCCTGGGCGTCCTGTCTTGGCTGTCCCGACCCTACTACACCGCCACCGACGCCCTGAAGTTCAAGTTCCTGACCCTGGTGGCCTTCACCACCGCCTCCGCTTGGGACAACTACATTGTCTACCACAAGGCCTGGTCCTACTGCCCCACCTGCGTGACCGCCGTCATTGGTTACGTGCCCCTGGAGGAGTACATGTTCTTCATCATTATGACCCTGCTGACCGTGGCCTTCACTAACCTGGTCATGCGATGGCACCTGCACTCTTTCTTCATCCGACCCGAGACCCCCGTGATGCAGTCTGTCCTGGTGCGACTGGTCCCCATCACCGCCCTGCTGATCACCGCCTACAAGGCCTGGCACCTGGCCGTCCCTGGTAAACCCCTGTTCTACGGCTCTTGCATTCTGTGGTACGCCTGCCCCGTGCTGGCCCTTCTGTGGTTCGGCGCTGGCGAGTACATGATGCGACGACCCCTGGCCGTCCTGGTGTCTATTGCCCTGCCCACCCTGTTCCTGTGCTGGGTCGACGTGGTCGCCATTGGCGCCGGAACCTGGGACATCTCCCTGGCTACCTCCACCGGCAAGTTCGTGGTGCCCCACCTGCCCGTGGAGGAGTTCATGTTCTTCGCCCTGATCAACACCGTGCTGGTGTTCGGTACCTGCGCCATCGACCGAACCATGGCCATTCTGCACCTGTTCAAGAACAAGTCCCCCTACCAGCGACCCTACCAGCACTCTAAGTCCTTCCTGCACCAGATCCTGGAGATGACCTGGGCCTTCTGTCTGCCCGACCAGGTCCTGCACTCTGACACCTTCCACGACCTGTCCGTTTCTTGGGACATCCTGCGAAAGGCCTCCAAGTCTTTCTACACCGCCTCTGCCGTCTTCCCCGGCGACGTTCGACAGGAGCTGGGTGTCCTGTACGCCTTCTGCCGAGCCACCGACGACCTGTGCGACAACGAGCAGGTGCCCGTCCAGACCCGAAAGGAGCAGCTGATCCTGACCCACCAGTTCGTGTCCGACCTGTTCGGCCAGAAGACCTCCGCCCCCACCGCTATTGACTGGGACTTCTACAACGACCAGCTGCCCGCCTCCTGCATTTCCGCCTTCAAGTCCTTCACCCGACTGCGACACGTCCTGGAGGCCGGAGCTATTAAGGAGCTGCTGGACGGTTACAAGTGGGACCTGGAGCGACGATCCATTCGAGACCAGGAGGACCTGCGATACTACTCCGCCTGCGTGGCCTCCTCTGTCGGCGAGATGTGCACCCGAATCATTCTGGCCCACGCCGACAAGCCCGCCTCCCGACAGCAGACTCAGTGGATCATCCAGCGAGCCCGAGAGATGGGTCTGGTCCTGCAGTACACCAACATCGCCCGAGACATTGTCACCGACTCCGAGGAGCTGGGCCGATGTTACCTGCCCCAGGACTGGCTGACCGAGAAGGAGGTGGCCCTGATCCAGGGCGGTCTGGCTCGAGAGATTGGCGAGGAGCGACTGCTGTCTCTGTCTCACCGACTGATCTACCAGGCCGACGAGCTGATGGTCGTCGCCAACAAGGGCATTGACAAGCTGCCCTCCCACTGCCAGGGTGGCGTGCGAGCTGCTTGCAACGTCTACGCCTCCATCGGCACCAAGCTGAAGTCCTACAAGCACCACTACCCCTCCCGAGCCCACGTGGGAAACTCTAAGCGAGTGGAGATCGCCCTGCTGTCTGTCTACAACCTGTACACCGCCCCCATTGCCACCTCTTCCACCACCCACTGTCGACAGGGTAAAATGCGAAACCTGAACACCATCTAA。
实施例1：理性设计和进化筛选的具体方法或步骤
本发明采用理性设计和进化筛选的具体方法或步骤如下：
以序列SEQ ID NO：2为模板，设计定点突变引物，利用定点突变手段，获得突变基因；提取酵母基因组DNA为模板，使用基因上下游引物扩增所需启动子PTEFin及终止子Tcyc1片段，得到符合预期大小的片段。利用Overlap PCR技术将以上获得的片段PTEFin，突变基因，Tcyc1进行连接扩增，获得带有目的基因的突变表达框。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。
通过丙氨酸扫描，对V428A、Y554A、D409A、D329A、I123A、W188A、N227A、R239A、F303A、K343A、T361A、F387A、K400A、Q418A、I439A、N471A、L465A、E495A、E468A、Y406A功能进行验证，获得活性大幅改变的突变体后，进一步对Y406、E468、F303、N471采用饱和突变的方式获得更多性能更优的突变体。对获得的优良突变体Y406S、N471M、F303C、E468M、Y406I、E468I、Y406L、N471G、E468H进行组合突变及基于以上数据结合结构进行理性设计筛选，获得酶活力高的突变体。
上述将突变表达框转化至GGPP积累解脂耶式酵母细胞内，进行表达。对细胞进行培养及发酵液中催化产物进行萃取及检测，最终筛选到相关的突变体。
实施例2：β-胡萝卜素合酶丙氨酸突变体功能验证
对CarRP的序列及结构分析，通过底物与酶结构分子对接，筛选底物附近的氨基酸（V428、Y554、D409、D329、I123、W188、N227、R239、F303、K343、T361、F387、K400、Q418、I439、L465、N471、E495、E468、Y406）进行丙氨酸突变及功能验证，以期获得酶催化关键氨基酸残基。
在Delft液体培养基中分别活化酵母工程菌株，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基的100mL三角瓶中，30℃，250 rpm培养2-3天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集菌体细胞备用。
将菌体细胞用DMSO以及甲醇进行菌体细胞的破碎和β-胡萝卜素的萃取，用HPLC检测。用不同浓度的β-胡萝卜素标准品进行定量。结果见图1。结果表明Y406、E468、F303、N471为潜在的酶催化关键氨基酸残基。
实施例3：β-胡萝卜素合酶关键位点饱和突变突变体功能验证
对Y406、E468、F303、N471采用饱和突变的方式以获得更多性能更优的突变体。
在Delft液体培养基中分别活化酵母工程菌株，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250 rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基的100mL三角瓶中，30℃，250 rpm培养2-3天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集菌体细胞备用。
将菌体细胞用DMSO以及甲醇进行菌体细胞的破碎和β-胡萝卜素的萃取，用HPLC检测。用不同浓度的β-胡萝卜素标准品进行定量。结果见表1。
表1
实施例4：β-胡萝卜素合酶关键位点组合突变体功能验证
对以上饱和突变获得的优良突变体Y406S、N471M、F303C、E468M、Y406I、E468I、Y406L、N471G、E468H进行组合突变及基于以上数据结合结构进行理性筛选，获得酶活力提高的突变体。
在Delft液体培养基中分别活化酵母工程菌株，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基的100mL三角瓶中，30℃，250 rpm培养3天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集菌体细胞备用。
将菌体细胞用DMSO以及甲醇进行菌体细胞的破碎和β-胡萝卜素的萃取，用HPLC检测。用不同浓度的β-胡萝卜素标准品进行定量。结果见图2。结果显示，摇瓶发酵三天，Y406L+N471G组合突变的β-胡萝卜素积累量为对照的4.8倍，表明Y406L+N471G组合突变体可以显著提高β-胡萝卜素的合成速率。
从以上研究结果可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过在SEQID NO：1所示的氨基酸序列基础上经过理性设计和几轮的酶进化筛选得到的β-胡萝卜素合酶突变体，相比母本β-胡萝卜素合酶发生了蛋白质结构和功能的改变，在实际应用时，β-胡萝卜素合酶突变体的催化活性得到了极大的提高，适合工业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种β-胡萝卜素合酶突变体，其特征在于，所述β-胡萝卜素合酶突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸突变之一：
V428A、Y554A、D409A、D329A、I123A、W188A、N227A、R239A、F303A、K343A、T361A、F387A、K400A、Q418A、I439A、N471A、L465A、E495A、E468A、Y406A、Y406D、Y406E、Y406F、Y406G、Y406H、Y406K、Y406L、Y406M、Y406P、Y406Q、Y406R、Y406S、Y406T、Y406V、Y406W、Y406C、Y406I、Y406N、E468D、E468F、E468G、E468H、E468K、E468L、E468M、E468P、E468Q、E468R、E468S、E468T、E468V、E468N、E468Y、E468C、E468I、E468W、F303D、F303E、F303G、F303H、F303K、F303L、F303M、F303P、F303Q、F303R、F303S、F303N、F303V、F303W、F303Y、F303C、F303I、F303T、N471D、N471E、N471F、N471G、N471H、N471K、N471L、N471M、N471P、N471Q、N471R、N471S、N471V、N471W、N471T、N471C、N471I、N471Y、Y406S+N471M、Y406S+F303C、E468M+N471M、F303C+Y406I、F303C+E468I、Y406L+N471G、Y406L+E468H。
2.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的β-胡萝卜素合酶突变体。
3.一种重组表达盒或表达载体，其特征在于，所述重组表达盒或表达载体包如有权利要求2所述的核酸。
4.一种重组基因工程细胞，其特征在于，其含有权利要求3所述的重组表达盒或表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组基因工程细胞，其特征在于，为原核细胞或真核细胞。
6.一种生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于：包括发酵培养如权利要求4或5所述重组基因工程细胞，以生产获得β-胡萝卜素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为25℃至35℃；在搅拌或振荡条件下培养24h至96h，震荡转速为250 rpm。
8.根据权利要求6至7任一项所述的方法，其特征在于：进一步还包括萃取所述β-胡萝卜素的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：萃取时向发酵培养得到的培养液中添加萃取剂；萃取剂选自：二甲基亚砜、甲醇。
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