CN117025413A - 一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用 - Google Patents

一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117025413A
CN117025413A CN202311031142.XA CN202311031142A CN117025413A CN 117025413 A CN117025413 A CN 117025413A CN 202311031142 A CN202311031142 A CN 202311031142A CN 117025413 A CN117025413 A CN 117025413A
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
grifola frondosa
culture medium
yield
mannitol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311031142.XA
Other languages
English (en)
Inventor
韩培培
张婕
陈旎
白慧芬
李梦媛
李健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202311031142.XA priority Critical patent/CN117025413A/zh
Publication of CN117025413A publication Critical patent/CN117025413A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/04—Fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株高产胞外多糖灰树花菌株(Grifola frondosa)，所述菌株的名称为：G5922，分类名称为：灰树花，保藏编号为：CGMCC NO.40600，保藏日期为：2023年6月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明结合诱变育种和原生质体融合的菌株选育技术对灰树花菌株进行基因组重排，筛选出了一株胞外多糖产量为8.54g/L、生物量为3.78g/L、生长速度2.79mm·d‑1的灰树花菌株，较原始菌株各提高了67.75％、44.27％和8.56％。

Description

一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及到利用基因组重排技术获得灰树花融合菌株，尤其是一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用。
背景技术
灰树花属真菌门、非褶菌目多孔科、树花菌属。20世纪80年代初，我国开始规模栽培灰树花，主要产地集中于吉林省长白山区、安徽、福建和浙江等地。灰树花是药食两用菌，含有丰富的营养价值，包括蛋白质、人体需要的氨基酸、碳水化合物以及多种维生素等，在我国传统药草书籍中有记载，灰树花没有毒性，具有健脾益气和消暑等功效。
灰树花多糖早在20世纪就被研究者报道具有显著的抗肿瘤活性，随着研究的逐渐深入，研究者发现了灰树花多糖更多的药理价值，如抗病毒、免疫调节、抗氧化活性和调节血糖血脂水平等。灰树花多糖的医疗效果明显高于其他食药用真菌多糖，还具有用药方便的优势，为此，不断有关于灰树花多糖的提取，其生物活性及药理功能相关研究的报道产生。然而，目前灰树花多糖的产量无法满足其在食品和制药行业的高需求，提高多糖产量的重要性凸显出来。因此，需要筛选一株多糖产量高的灰树花菌株用以满足市场需求。
灰树花是食用真菌，对于食用真菌常用的育种方法主要为驯化育种、杂交育种、诱变育种和原生质体融合育种等。然而野生驯化的灰树花菌种存在着生物转化率低和适应性差等问题，诱变育种技术也存在筛选具有盲目性，筛选工作量非常大的缺点。结合来看，传统的筛选方法时间较长，效果不明显，所以急需一种方法加速筛选工作，对灰树花育种进行研究从而改良菌种。基因组重排技术是结合诱变育种和原生质体融合技术的菌株选育技术，是将诱变处理后的多个正突变菌株进行重排，将菌株突变体库中的菌株制备为原生质体，并且进行多轮递归基因组融合，最终得到性能明显提高的菌种。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产胞外多糖灰树花菌株及其选育方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株高产胞外多糖灰树花菌株(Grifolafrondosa)，所述菌株的名称为：G5922，分类名称为：灰树花，保藏编号为：CGMCC NO.40600，保藏日期为：2023年6月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地，所述菌株由编号为5.404的灰树花原始菌株通过基因组重排技术改造而来，灰树花原始菌株的中文名称为灰树花孔菌，拉丁学名Grifola frondosa，保藏编号为：CGMCCNO.5.404，保藏日期为：1987年12月5日。
如上所述的高产胞外多糖灰树花菌株的选育方法，具体步骤如下：
(1)灰树花菌株的培养：原始灰树花菌株由中国普通微生物菌种保藏中心提供；
切取原始灰树花菌丝体，在平板培养基中活化，然后转移至种子培养基中振荡培养至指数期得到种子液，然后取10％种子液转移至发酵培养基中振荡培养至发酵末期收集菌体；
(2)原生质体制备的优化：步骤(1)得到的种子液收集灰树花菌丝，过滤后，用0.6M甘露醇冲洗，使得灰树花菌丝悬浮于酶解液中，酶解反应，再利用0.6M甘露醇冲洗后重悬于STC缓冲液中，得到原生质体悬液；其中，灰树花菌丝与酶解液的比例mg：mL为100：1；
(3)紫外和常压室温等离子体诱变的优化：将步骤(2)得到的原生质体悬液，分别在紫外灯和常温室压等离子体下进行诱变并以诱变时间作为变量进行优化，然后涂布于再生培养基上进行培养，筛选出胞外多糖高的灰树花菌株，即高产多糖灰树花菌株；
(4)基因组重排：对步骤(3)筛选出的高产多糖灰树花菌株的原生质体进行热灭活和紫外灭活双亲本灭活，优化原生质体热灭活和紫外灭活的时间，然后分别对热灭活和紫外灭活的原生质体以质量比为1:1的比例混合进行融合，离心15min取沉淀，加入0.6M的甘露醇溶液悬浮原生质体，加入PEG融合剂后水浴并对融合条件进行优化，离心取沉淀并利用甘露醇溶液洗涤2次后涂布于再生培养基上，得到第一代菌株F1；
(5)对F1进行生长速度、生物量和胞外多糖的筛选，再进行一轮基因组重排，筛选出胞外多糖更高的优良菌株进行鉴定，得到高产胞外多糖灰树花菌株。
进一步地，所述步骤(1)具体为：
从斜面切取原始灰树花菌丝体，接种在平板培养基中倒置放入28℃培养箱活化15天，转移至种子培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至指数期得到种子液，然后种子液取10％转移至发酵培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至发酵末期收集菌体；
平板培养基的配制方法：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％；其中，马铃薯煮沸的浸出液为：马铃薯加水煮沸30min后得到的滤液；；所述述百分数为质量百分数；
种子培养基的配制方法：葡萄糖4％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O0.05％，VB10.002％；；所述述百分数为质量百分数；
发酵培养基的配制方法：葡萄糖2.2％，蛋白胨0.3％，KH2PO40.12％，MgSO4·7H2O0.08％，VB10.012％；所述述百分数为质量百分数。
进一步地，所述步骤(2)中，所述酶解条件为：酶解温度32℃，于100r/min的摇床中酶解4h；
或者，所述酶解液为2％溶壁酶液配制，具体步骤为：利用0.6mol/L甘露醇溶液溶解0.02g溶壁酶，定容到1mL，0.22μm无菌有机过滤膜，过滤除菌，现配现用；
或者，利用300目尼龙滤网进行过滤。
进一步地，所述步骤(3)中，紫外诱变时间为50-70s，ARTP诱变时间为25-35s。
进一步地，所述再生培养基为甘露醇再生培养基，该甘露醇再生培养基的配制方法为：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％，溶于0.6M的甘露醇中；
其中，马铃薯煮沸的浸出液为：马铃薯加水煮沸30min后得到的滤液。
进一步地，所述步骤(4)中，热灭活的条件是55℃灭活12min，紫外灭活的时间是160s；所述融合条件是：PEG融合剂浓度为35％，pH为7.5，温度为23℃，融合时间为15min。
进一步地，步骤(5)中，对所述的第一代菌株F1进行生长速度、生物量和胞外多糖的筛选，得到第二代菌株F2，再进行一轮上述筛选后，连续转接培养5-10代，得到高产胞外多糖灰树花菌株。
如上所述的高产胞外多糖灰树花菌株在高产胞外多糖中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法为解决灰树花多糖的产量低的问题，改善灰树花菌株现有的筛选方法，加快了对于灰树花菌株的改造进程。本发明结合诱变育种和原生质体融合的菌株选育技术对灰树花菌株进行基因组重排，筛选出了一株胞外多糖产量为8.54g/L、生物量为3.78g/L、生长速度2.79mm·d-1的灰树花菌株，较原始菌株各提高了67.75％、44.27％和8.56％。
2、本发明选育出了灰树花多糖产量高的菌株，遗传稳定性好，平板生长速率较快且菌丝生长茂密，胞外多糖的体外抗氧化能力强。改善了灰树花菌株现有的筛选方法，在灰树花中应用基因组重排技术加快了选育速度。
3、本发明方法以生长速度、生物量以及胞外多糖产量等为筛选条件获得了一株生长性能良好、菌丝浓密、生长速度快、遗传性稳定的基因组重排菌株G5922，对G5922菌株和原始灰树花菌株遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，G5922与原始菌株的相似系数为0.4。
附图说明
图1为本发明方法中基因组重排流程图；
图2为本发明中酶解温度对原生质体产量的影响图；
图3为本发明中酶解时间对灰树花原生质体产量的影响图；
图4为本发明中灰树花原生质体紫外诱变的致死率图；
图5为本发明中灰树花孢子ARTP的诱变致死率图；
图6为本发明中热灭活对灰树花原生质体的影响图；
图7为本发明中紫外灭活对灰树花原生质体的影响图；
图8为本发明中PEG浓度对灰树花原生质体融合率的影响图；
图9为本发明中pH对灰树花原生质体融合率的影响图；
图10为本发明中融合温度对灰树花原生质体融合率的影响图；
图11为本发明中融合时间对灰树花原生质体融合率的影响图；
图12为本发明中原始灰树花菌株和胞外多糖提高菌株G5922的平板培养情况图；
图13为本发明中灰树花菌株SRAP分析的聚类图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一株高产胞外多糖灰树花菌株(Grifolafrondosa)，所述菌株的名称为：G5922，分类名称为：灰树花，保藏编号为：CGMCC NO.40600，保藏日期为：2023年6月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
较优地，所述菌株由编号为5.404的灰树花原始菌株通过基因组重排技术改造而来，灰树花原始菌株的中文名称为灰树花孔菌，拉丁学名Grifola frondosa，保藏编号为：CGMCCNO.5.404，保藏日期为：1987年12月5日。
如上所述的高产胞外多糖灰树花菌株的选育方法，具体步骤如下：
(1)灰树花菌株的培养：原始灰树花菌株由中国普通微生物菌种保藏中心提供；
切取原始灰树花菌丝体，在平板培养基中活化，然后转移至种子培养基中振荡培养至指数期得到种子液，然后取10％种子液转移至发酵培养基中振荡培养至发酵末期收集菌体；
(2)原生质体制备的优化：步骤(1)得到的种子液收集灰树花菌丝，过滤后，用0.6M甘露醇冲洗，使得灰树花菌丝悬浮于酶解液中，酶解反应，再利用0.6M甘露醇冲洗后重悬于STC缓冲液中，得到原生质体悬液；其中，灰树花菌丝与酶解液的比例mg：mL为100：1；
(3)紫外和常压室温等离子体诱变的优化：将步骤(2)得到的原生质体悬液，分别在紫外灯和常温室压等离子体下进行诱变并以诱变时间作为变量进行优化，然后涂布于再生培养基上进行培养，筛选出胞外多糖高的灰树花菌株，即高产多糖灰树花菌株；
(4)基因组重排：对步骤(3)筛选出的高产多糖灰树花菌株的原生质体进行热灭活和紫外灭活双亲本灭活，优化原生质体热灭活和紫外灭活的时间，然后分别对热灭活和紫外灭活的原生质体以质量比为1:1的比例混合进行融合，离心15min取沉淀，加入0.6M的甘露醇溶液悬浮原生质体，加入PEG融合剂后水浴并对融合条件进行优化，离心取沉淀并利用甘露醇溶液洗涤2次后涂布于再生培养基上，得到第一代菌株F1；
(5)对F1进行生长速度、生物量和胞外多糖的筛选，再进行一轮基因组重排，筛选出胞外多糖更高的优良菌株进行鉴定，得到高产胞外多糖灰树花菌株。
较优地，所述步骤(1)具体为：
从斜面切取原始灰树花菌丝体，接种在平板培养基中倒置放入28℃培养箱活化15天，转移至种子培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至指数期得到种子液，然后种子液取10％转移至发酵培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至发酵末期收集菌体；
平板培养基的配制方法：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％；其中，马铃薯煮沸的浸出液为：马铃薯加水煮沸30min后得到的滤液；；所述述百分数为质量百分数；
种子培养基的配制方法：葡萄糖4％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O0.05％，VB10.002％；；所述述百分数为质量百分数；
发酵培养基的配制方法：葡萄糖2.2％，蛋白胨0.3％，KH2PO40.12％，MgSO4·7H2O0.08％，VB10.012％；所述述百分数为质量百分数。
较优地，所述步骤(2)中，所述酶解条件为：酶解温度32℃，于100r/min的摇床中酶解4h；
或者，所述酶解液为2％溶壁酶液配制，具体步骤为：利用0.6mol/L甘露醇溶液溶解0.02g溶壁酶，定容到1mL，0.22μm无菌有机过滤膜，过滤除菌，现配现用；
或者，利用300目尼龙滤网进行过滤。
较优地，所述步骤(3)中，紫外诱变时间为50-70s，ARTP诱变时间为25-35s。
较优地，所述再生培养基为甘露醇再生培养基，该甘露醇再生培养基的配制方法为：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％，溶于0.6M的甘露醇中；
其中，马铃薯煮沸的浸出液为：马铃薯加水煮沸30min后得到的滤液。
较优地，所述步骤(4)中，热灭活的条件是55℃灭活12min，紫外灭活的时间是160s；所述融合条件是：PEG融合剂浓度为35％，pH为7.5，温度为23℃，融合时间为15min。
较优地，步骤(5)中，对所述的第一代菌株F1进行生长速度、生物量和胞外多糖的筛选，得到第二代菌株F2，再进行一轮上述筛选后，连续转接培养5-10代，得到高产胞外多糖灰树花菌株。
如上所述的高产胞外多糖灰树花菌株在高产胞外多糖中的应用。
具体的相关制备及检测如下：
一株高产胞外多糖灰树花菌株(Grifola sp.)，其特征在于：所述菌株的名称为：G5922，分类名称为：灰树花，保藏编号为：CGMCC NO.40600，保藏日期为：2023年6月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体地，所述菌株由编号为5.404的灰树花原始菌株通过基因组重排技术改造而来，灰树花原始菌株的中文名称为灰树花孔菌，拉丁学名Grifola frondosa，保藏编号为：CGMCCNO.5.404，保藏日期为：1987年12月5日。
上述高产胞外多糖灰树花菌株的选育方法，具体步骤如下：
1.灰树花菌株的培养方法：
从斜面切取原始灰树花菌丝体，接种在平板培养基中倒置放入28℃培养箱活化15天，长满板后切1×1cm小块，取4块转移至种子培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至指数期(第6天)得到种子液，然后种子液取10％转移至发酵培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至发酵末期(第8天)收集菌体；
2.培养基配制方法：
平板培养基：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％；
种子培养基：葡萄糖4％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，VB10.002％；
发酵培养基：葡萄糖2.2％，蛋白胨0.3％，KH2PO40.12％，MgSO4·7H2O 0.08％，VB10.012％；
3.溶液配制方法：
甘露醇再生培养基：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％，溶于0.6 M的甘露醇中；
STC缓冲液：1 M山梨醇，10 mM Tris-HCl(pH＝7.5)，25 mM CaCl2，pH自然；
2％溶壁酶(Lywallzyme)配制：利用0.6 mol/L甘露醇溶液溶解0.02 g溶壁酶，定容到1mL，无菌有机过滤膜(0.22μm)过滤除菌(现配现用)。
4.灰树花菌株的基因组重排选育方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)原生质体的制备：
将培养好的种子液，利用300目尼龙滤网进行过滤，收集灰树花菌丝，0.6 M甘露醇冲洗后取适量的菌丝分别悬浮于已配制好的不同的酶解液(表1)中，酶解液配比为100 mg菌丝悬浮于1 mL酶解液中，并分别在26-35℃、100 r/min的摇床中酶解2-5 h。利用脱脂棉除去多余未被酶解的菌丝，利用0.6 M甘露醇冲洗后重悬于STC缓冲液中，利用血球计数板计数，得到原生质体最多的即为最适宜的酶解条件；
从图2、图3可以看出，最适宜的酶解条件为：酶解液由2％溶壁酶配制，酶解温度32℃，并于100 r/min的摇床中酶解4 h。
表1
(2)紫外诱变及其再生
往培养皿中加入1mL稀释至浓度为106个/mL的原生质体悬液，分别在紫外灯下照射0、10、30、60、90、120s。每个平皿取200μL涂布于甘露醇再生培养基上，在28±0.5℃条件下避光培养15d左右，记录菌落数，统计致死率，如图5所示，选择致死率在70％-80％的菌株转接到平板培养基进行保存，即为诱变再生菌株；
其中：A为诱变后灰树花原生质体的再生菌落数，B为诱变前灰树花原生质体的再生菌落数。
统计得出最佳紫外诱变时间为60s。
(3)常温室压等离子体诱变(ARTP)及其再生
ARTP诱变是利用灰树花孢子进行诱变，向平板培养50-60d并且菌丝旺盛的灰树花菌株中，加入适量无菌生理盐水，利用棉签刮扫菌丝表面，制备孢子悬液，并使孢子浓度在105个/mL范围内。取10μL菌悬液涂布于载片上，诱变时间分别设置0、10、20、30、40、50s，平行设置5组，诱变处理结束后，使载片表面的菌悬液与1mL无菌生理盐水混合均匀，取200μL涂于平板培养基中，28℃培养箱中暗培养，记录菌落数，按照(2)中的公式计算每个诱变梯度下的致死率，如图6所示；致死率在80％-90％的菌株转接到平板培养基进行保存，即为诱变再生菌株；
统计得出最佳ARTP诱变时间为30s。
(4)诱变菌株筛选
根据不同诱变方法的致死率，选择最适诱变时间对灰树花菌株进行大量的诱变，诱变的灰树花菌株再生后，在28±0.5℃条件下培养，与原始菌株在平板培养基上进行拮抗实验。将有拮抗反应的诱变菌株再接种于平板培养基上，筛选生长速率快的单菌落作为初筛菌株，把初筛菌株接上种子培养基，在28℃、160r/min的条件下培养5d，再转入发酵培养基，同样的条件下培养7d，发酵结束后，测定菌株的生物量、胞内多糖和胞外多糖的产量，生物量及多糖产量高于原始菌株的诱变菌株选为最终筛选出的变异菌株，用于原生质体融合。
(5)原生质体热灭活
在1.5mL Ep管中移入1mL浓度为106个/mL的灰树花原生质体悬液，分别置于55℃的水浴锅中5、6、7、8、9、10、11、12min，然后吸取200μL，涂布于甘露醇再生培养基上28℃静置黑暗培养15d；
其中：A为灭活后甘露醇再生培养基上的菌落数；B为灭活前甘露醇再生培养基上的菌落数。
如图7所示，观察菌落数，确定灰树花原生质体热灭活最佳时间是12min。
(6)原生质体紫外灭活
将1mL浓度为106个/mL的灰树花原生质体悬液放置于无菌培养皿中，进行紫外灭活，分别照射120、130、140、150、160s，每个平皿取0.2mL涂布于甘露醇再生培养基上，将平板用锡纸包裹进行黑暗避光、在28℃条件下恒温培养15d左右；
将平板从锡纸中取出，观察记录菌落数，如图8所示，从而确定灰树花原生质体紫外灭活最佳时间是160s。
(7)原生质体融合
将诱变中得到的高产多糖灰树花菌株分别制备原生质体，等分为两大组，一组进行加热灭活处理，一组进行紫外照射灭活处理，然后1:1的比例进行混合，取出2mL进行4℃、4000r/min离心15min，取沉淀，加入0.2mL浓度为0.6M的甘露醇溶液悬浮原生质体，然后加入PEG融合剂(浓度20％-40％、pH 6.5-8.5)1.8mL，在不同水浴温度(21-29℃)不同时间(10-35min)融合后，离心取沉淀并利用甘露醇溶液洗涤2次后，重新悬浮于甘露醇溶液中，涂布于甘露醇再生培养基上；
其中：A为融合原生质体甘露醇再生培养基的菌落数；B为灭活亲本甘露醇再生培养基的菌落数；C为原生质体甘露醇再生培养基的融合子菌落数。
如图9-图12所示，观察菌落数，得出单因素实验的最佳融合条件为PEG融合剂浓度为35％，pH为7.5，温度为23℃，融合时间为15min。
(8)生长性能的测定
从平板培养基上将菌株切块接种于新的平板培养基上，28℃避光培养15d左右，记录生长结束的菌落半径，计算菌丝平均生长速度。
其中：A为菌落半径(mm)；B为菌丝生长天数(d)。
在发酵结束后，收集发酵液中的菌丝体于滤纸上，在60℃温度下干燥至恒重，计算菌丝体干重即生物量。
在发酵结束后，取一定体积发酵液，离心取上清，加入4倍体积的95％乙醇，在4℃温度下醇沉12h后，离心取沉淀，加入5倍体积的蒸馏水溶解，然后采用苯酚-硫酸法测各样品中多糖含量。
(9)基因组重排菌株筛选与鉴定
以灰树花原始菌株为对照组，挑取生长速度快、多糖产量高的第一代灰树花融合菌株，做为第一轮基因组重排的亲本，选出四株性能较好的菌株，再进行第二轮基因组重排，最终筛选出在生长速度和多糖产量方面都有所提高的G5922菌株，如表2所示，G5922的生长速度由2.57mm·d-1提高到了2.79mm·d-1，G5922的生物量相较于原始菌株的2.62g/L提高了44.27％，多糖产量提高到了8.54g/L，比原始菌株高67.75％。
表2
菌株 生长速度/(mm·d-1) 生物量(g/L) 胞外多糖(g/L)
WT 2.57±0.05 2.62 5.09
G5922 2.79±0.14 3.78 8.54
本发明高产胞外多糖灰树花菌株菌株的菌落图如图12所示，从图中可以看出，图12是原始菌株和G5922菌株的平板培养基对比图，原始菌株菌丝比较厚实，而基因组重排菌株菌丝较为蓬松，向四周延伸，并且生长速度比原始菌株要快。利用相关序列扩增多态性(Sequence-relatedAmplified Polymorphism，SRAP)对灰树花原始菌株和G5922菌株的遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，如图13所示，菌株G5922与原始菌株的相似系数为0.4，由此可见，基因组重排在诱变的基础上，进一步丰富了原始菌株的遗传基础。
对原始菌株和G5922进行了胞外多糖的提取纯化，将2种粗胞外多糖样品上样至DEAE-650纤维素离子交换柱，首先利用蒸馏水进行洗脱得到中性胞外多糖WT-0M和G5922-0M，然后选择0.2M的NaCl继续洗脱得到酸性胞外多糖WT-0.2M和G5922-0.2M。
如表3所示，重排菌株G5922胞外多糖的分子量比原始菌株WT要低。
表3
样品 保留时间(min) 分子量(kDa)
WT-0M 10.245 1.16×103
WT-0.2M 9.968 1.38×103
G5922-0M 10.729 0.86×103
G5922-0.2M 10.267 1.15×103
通过测定734nm的吸光值来评估抗氧化剂清除ABTS自由基的能力，当多糖浓度达到2.5mg/mL时，WT-0M、WT-0.2M、G5922-0M和G5922-0.2M对ABTS自由基的清除能力分别为70.57％、81.91％、53.55％和83.69％，相比较之下，G5922酸性多糖的ABTS自由基的清除能力比原始菌株强；当多糖浓度达到2.5mg/mL时，WT-0M、WT-0.2M、G5922-0M和G5922-0.2M对羟基自由基的清除率分别为78.25％、94.72％、84.21％和92.63％，G5922中性多糖的ABTS自由基的清除能力比原始菌株强。WT-0M、WT-0.2M、G5922-0M和G5922-0.2M在浓度为2.5mg/mL时对DPPH自由基的清除率分别为84.04％、94.68％、94.33％和96.10％，G5922两种纯化多糖对DPPH自由基的清除能力都比原始菌株强。实验证明，灰树花多糖对于DPPH自由基的清除能力最好，其中基因组重排菌株表现出更好的抗氧化能力。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一株高产胞外多糖灰树花菌株(Grifolafrondosa)，其特征在于：所述菌株的名称为：G5922，分类名称为：灰树花，保藏编号为：CGMCC NO.40600，保藏日期为：2023年6月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的高产胞外多糖灰树花菌株，其特征在于：所述菌株由编号为5.404的灰树花原始菌株通过基因组重排技术改造而来，灰树花原始菌株的中文名称为灰树花孔菌，拉丁学名Grifola frondosa，保藏编号为：CGMCC NO.5.404，保藏日期为：1987年12月5日。
3.如权利要求1或2所述的高产胞外多糖灰树花菌株的选育方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)灰树花菌株的培养：原始灰树花菌株由中国普通微生物菌种保藏中心提供；
切取原始灰树花菌丝体，在平板培养基中活化，然后转移至种子培养基中振荡培养至指数期得到种子液，然后取10％种子液转移至发酵培养基中振荡培养至发酵末期收集菌体；
(2)原生质体制备的优化：步骤(1)得到的种子液收集灰树花菌丝，过滤后，用0.6M甘露醇冲洗，使得灰树花菌丝悬浮于酶解液中，酶解反应，再利用0.6M甘露醇冲洗后重悬于STC缓冲液中，得到原生质体悬液；其中，灰树花菌丝与酶解液的比例mg：mL为100：1；
(3)紫外和常压室温等离子体诱变的优化：将步骤(2)得到的原生质体悬液，分别在紫外灯和常温室压等离子体下进行诱变并以诱变时间作为变量进行优化，然后涂布于再生培养基上进行培养，筛选出胞外多糖高的灰树花菌株，即高产多糖灰树花菌株；
(4)基因组重排：对步骤(3)筛选出的高产多糖灰树花菌株的原生质体进行热灭活和紫外灭活双亲本灭活，优化原生质体热灭活和紫外灭活的时间，然后分别对热灭活和紫外灭活的原生质体以质量比为1:1的比例混合进行融合，离心15min取沉淀，加入0.6M的甘露醇溶液悬浮原生质体，加入PEG融合剂后水浴并对融合条件进行优化，离心取沉淀并利用甘露醇溶液洗涤2次后涂布于再生培养基上，得到第一代菌株F1；
(5)对F1进行生长速度、生物量和胞外多糖的筛选，再进行一轮基因组重排，筛选出胞外多糖更高的优良菌株进行鉴定，得到高产胞外多糖灰树花菌株。
4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：
从斜面切取原始灰树花菌丝体，接种在平板培养基中倒置放入28℃培养箱活化15天，转移至种子培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至指数期得到种子液，然后种子液取10％转移至发酵培养基中28℃、160r/min的条件下摇床振荡培养至发酵末期收集菌体；
平板培养基的配制方法：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％；其中，马铃薯煮沸的浸出液为：马铃薯加水煮沸30min后得到的滤液；；所述述百分数为质量百分数；
种子培养基的配制方法：葡萄糖4％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，VB10.002％；；所述述百分数为质量百分数；
发酵培养基的配制方法：葡萄糖2.2％，蛋白胨0.3％，KH2PO40.12％，MgSO4·7H2O0.08％，VB10.012％；所述述百分数为质量百分数。
5.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述酶解条件为：酶解温度32℃，于100r/min的摇床中酶解4h；
或者，所述酶解液为2％溶壁酶液配制，具体步骤为：利用0.6mol/L甘露醇溶液溶解0.02g溶壁酶，定容到1mL，0.22μm无菌有机过滤膜，过滤除菌，现配现用；
或者，利用300目尼龙滤网进行过滤。
6.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于：所述步骤(3)中，紫外诱变时间为50-70s，ARTP诱变时间为25-35s。
7.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于：所述再生培养基为甘露醇再生培养基，该甘露醇再生培养基的配制方法为：20％马铃薯煮沸的浸出液，葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、KH2PO40.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、VB10.002％、琼脂粉2％，溶于0.6M的甘露醇中；
其中，马铃薯煮沸的浸出液为：马铃薯加水煮沸30min后得到的滤液。
8.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于：所述步骤(4)中，热灭活的条件是55℃灭活12min，紫外灭活的时间是160s；所述融合条件是：PEG融合剂浓度为35％，pH为7.5，温度为23℃，融合时间为15min。
9.根据权利要求3至8任一项所述的选育方法，其特征在于：步骤(5)中，对所述的第一代菌株F1进行生长速度、生物量和胞外多糖的筛选，得到第二代菌株F2，再进行一轮上述筛选后，连续转接培养5-10代，得到高产胞外多糖灰树花菌株。
10.如权利要求1或2所述的高产胞外多糖灰树花菌株在高产胞外多糖中的应用。
CN202311031142.XA 2023-08-16 2023-08-16 一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用 Pending CN117025413A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311031142.XA CN117025413A (zh) 2023-08-16 2023-08-16 一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311031142.XA CN117025413A (zh) 2023-08-16 2023-08-16 一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117025413A true CN117025413A (zh) 2023-11-10

Family

ID=88624156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311031142.XA Pending CN117025413A (zh) 2023-08-16 2023-08-16 一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117025413A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105969674B (zh) 一种富硒地顶孢霉菌株及其应用
CN101440389A (zh) 提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法
CN112852664B (zh) 一种酿酒酵母以及提高酿酒酵母产γ-氨基丁酸的方法
CN101993847B (zh) 一种细菌纤维素菌株
US20230295675A1 (en) Endophytic bacterial strain with high camptothecin yield and use thereof
CN101818123A (zh) 一种不动杆菌及其用途
CN110484478B (zh) 一种枯草芽孢杆菌jz2-1-12及其应用
CN111334440A (zh) 米根霉ch5及其在提取紫芝多糖中的应用
CN106479899B (zh) 一种蛹虫草菌株及其在制备虫草素中的应用
CN117025413A (zh) 一种高产胞外多糖灰树花菌株、方法及应用
CN110801413A (zh) 一种小球藻发酵提取物及其制备方法
CN113046249B (zh) 一株蜡蚧轮枝菌ll-01及其生防应用
CN109161488A (zh) 一株高产虫草素的白囊耙齿菌株及其培养方法
CN112143669B (zh) 一株蓝菌藻及其培养方法和应用
CN101914452B (zh) 石杉碱甲高产菌株tcm-01
CN110699258B (zh) 一种提高小球藻藻细胞生物量的培养方法
CN1177925C (zh) 发酵培养生产虫草素的方法
CN107418922A (zh) 一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法
CN109731015B (zh) 一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂及制备方法
CN108588143B (zh) 一种高效生产发菜胞外多糖的方法
CN113755368A (zh) 一株福建鸡滑液囊支原体及其培养基
CN113025533B (zh) 一株产丁酸的芽孢杆菌菌株筛选及其应用
CN104830695A (zh) 具有诱导丹参毛状根酚酸积累作用的内生菌及其用途
CN116694485B (zh) 一种胶孢炭疽菌及其胞外多糖作为植物免疫诱抗剂的应用
CN115181676B (zh) 一株通过紫外诱变获得的黄伞菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination