CN117024290A - 一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯l-亮氨酸的方法 - Google Patents

一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯l-亮氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L‑亮氨酸的方法。将L‑亮氨酸发酵液经陶滤、脱色后加入单双硬脂酸甘油酯辅助结晶，进而获得高纯度、高收率的L‑亮氨酸。本发明的方法具有条件温和、操作简便、分离步骤少、清洁生产的特点，减少了L‑亮氨酸在蒸发浓缩过程中存在物料挂壁以及凝聚集现象并提高了L‑亮氨酸的析晶量，使L‑亮氨酸的收率和纯度显著提高。

Description

一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法。
背景技术
L-亮氨酸(L-Leucine)属必需氨基酸，化学式为C6H13NO2，室温下为白色有光泽六面体结晶或白色结晶性粉末。无臭，略有苦味。于145～148℃升华。熔点293～295℃(分解)。微溶于乙醇(0.07％)，不溶于乙醚。用于幼儿特发性高血糖的诊断和治疗。并适用于糖代谢失调、伴有胆汁分泌减少的肝病、贫血、中毒、肌萎缩症、脊髓灰质炎后遗症、神经炎及精神病。
目前，L-亮氨酸生产方法主要是发酵法，发酵法生产的L-亮氨酸发酵液经过提取、蒸发浓缩、离心烘干等步骤才能制成成品。中国专利公布CN109761833A公开了一种L-亮氨酸的分离纯化方法，(1)发酵液加入凝聚剂和絮凝剂，静置，离心得上清液备用；(2)上清液中加入氯化钠和L-亮氨酸晶种，分离析出物；(3)析出物加水溶解，加入活性炭脱色、离心、浓缩，析出晶体；(4)晶体加水溶解，通过离子交换树脂层析，氨水洗脱，得到L-亮氨酸。该法虽然有利于提升亮氨酸的纯度但收率较低，亮氨酸的损失较大。除发酵法外，水解法也是生产L-亮氨酸常见的方法，中国发明专利CN104926670A公布了一种通过酸水解法从植物蛋白中提取L-亮氨酸的方法，该方法以植物蛋白--玉米黄粉，豆粨，棉籽蛋白或桑蚕丝蛋白为原料，生产不受动物源原料限制，另外该发明不适用沉淀剂，而是通过调节pH达到分离L-亮氨酸的目的，从而解决了环境的危害。由于在水解过程中需要加入大量盐酸来调节pH至合适区间，并加入了偏重亚硫酸钠氧化剂，因此需要脱酸以及脱盐处理，增加了生产成本。L-亮氨酸的提取传统的生产工艺普遍采用离子交换工艺，通过离子交换手段去除发酵液中的无机盐。中国专利公告CN102757354A中介绍了利用膜分离与电渗析组合技术从发酵液中除盐的提取分离L-亮氨酸的方法，该方法中将L-亮氨酸发酵液膜过滤液直接经电渗析除盐，因L-亮氨酸膜过滤液中仍含有大量蛋白等杂质，导致电渗析脱盐速率低，且电渗析工艺对膜过滤液无脱色效果。综上，目前仍需一种简单地组合提取方式，提升L-亮氨酸的提取收率及纯度。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，将L-亮氨酸发酵液经陶滤、脱色后加入单双硬脂酸甘油酯辅助结晶，进而获得的高纯度、高收率的L-亮氨酸。
具体为：
S1.将L-亮氨酸发酵液采用陶瓷膜过滤，然后向陶滤清液体系内加其固含量0.3～3％的活性炭进行脱色，收集脱色液，待用；
S2.调节S1中脱色液中pH至7±0.2，然后加入结晶助剂并在60～70℃下浓缩得到析出晶体的浓缩液，过滤收集结晶滤饼和滤液；
S3.向S2中结晶滤饼加入水复溶，过滤收集滤液浓缩进行重结晶，进而获得高收率、高纯度的L-亮氨酸。
所述步骤S1中L-亮氨酸发酵液为黄色短杆菌种子液在复合营养液中培养制备所得。进一步参见，CN201811647345.0一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法中记载方法制备获得。
所述步骤S2中所述结晶助剂为单、双硬脂酸甘油酯，且其加入量为其在脱色液中固含量的100～5000ppm。
所述步骤S2中结晶助剂单、双硬脂酸甘油酯中，单硬脂酸甘油酯质量百分比含量为30～70wt％。
所述步骤S2中浓缩终点为：所析出晶体的浓缩液的总质量为脱色液固含量的2倍。
所述步骤S3复溶是向结晶滤饼中加入其质量40～50倍的水充分溶解。
所述步骤S3中复溶温度为20～70℃，搅拌30min后冷却至室温，待单、双硬脂酸甘油酯完全析出后过滤或离心。
所述步骤S3中所述重结晶浓缩终点为：复溶浓缩液的总质量为复溶液固含量的3.5倍。
本发明所具有的优点：
本发明在亮氨酸脱色后结晶工艺中引入了单、双硬脂酸甘油酯，使其促进亮氨酸成核析出并与亮氨酸形成氢键，析晶终点时其包覆于亮氨酸晶体外围，减少了L-亮氨酸在蒸发浓缩过程中存在物料挂壁以及凝聚集现象，使得蒸发浓缩终点尽可能降低溶剂含量并保持流动性，进而提升亮氨酸的收率及产量。
本发明的方法具有条件温和、操作简便、分离步骤少、清洁生产的特点。
附图说明
图1为本发明实施例提供的脱色液的高效液相色谱图。
图2为本发明实施例提供的2000ppm添加量单、双硬脂酸甘油酯结晶滤饼的高效液相色谱图。
图3为本发明实施例提供的重结晶滤饼高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明利用单、双硬脂酸甘油酯提取纯化L-亮氨酸的方法，促进亮氨酸析晶、且通过氢键作用包覆于亮氨酸晶体外部提升浓缩结晶程度，进而提升了L-亮氨酸的收率。
下述各实施例中原料亮氨酸发酵液是通过黄色短杆菌种子液在复合营养液中培养56h而成；具体，详见CN201811647345.0一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法中记载方法制备获得。
实施例1：亮氨酸发酵液灭活除菌及脱色
取475Kg亮氨酸发酵液升温至60℃，搅拌状态下，保温30min进行灭活处理，控制物料温度低于40℃，压力小于0.65MPa，流速200L/h将发酵液过陶瓷膜进行陶滤，除去菌渣和部分杂质，得到450Kg陶滤清液；然后向收集的陶滤清液中加入369.9g活性炭搅拌脱色1h，向脱色液中逐渐滴加氨水，调节体系pH至6.9，最终得到425Kg脱色液。
表1、陶滤、脱色步骤对L-亮氨酸纯度和收率的影响
(注：其中陶滤步骤的亮氨酸收率＝陶滤清液亮氨酸净质量/发酵液亮氨酸净质量，脱色步骤的亮氨酸收率＝脱色液亮氨酸净质量/陶滤清液亮氨酸净质量)
表1说明：陶滤过程除去大分子菌酶，使得陶滤清液相比于初始发酵液亮氨酸纯度有所提升，但脱色步对亮氨酸纯度影响不大，只是改善了亮氨酸发酵液色度。
实施例2：不同比例单、双硬脂酸甘油酯结晶助剂的提纯效果
取上述收集的脱色液5Kg平均分成五份，均向中加入其固含量2000ppm的单、双硬脂酸甘油酯，但其中单硬脂酸甘油酯的含量分别占单、双硬脂酸甘油总质量的30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％，而后分别于60℃下浓缩至脱色液固含量的2倍，将各析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集各结晶滤饼、滤液。
然后加入结晶滤饼质量40倍的水复溶，室温搅拌30min后使亮氨酸结晶滤饼全部溶解，过滤除去不溶于水的单、双硬脂酸甘油酯，将复溶液浓缩至复溶液固含量的3.5倍，将析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集重结晶滤饼、滤液。
(注：其中，结晶步骤的亮氨酸收率＝结晶滤饼亮氨酸净质量/脱色液亮氨酸净质量；复溶后重结晶步骤的亮氨酸收率＝重结晶滤饼亮氨酸净质量/结晶滤饼亮氨酸净质量)
表2、单、双硬脂酸甘油酯比例对L-亮氨酸纯度和收率的影响
从表2中可以看出当单硬脂酸甘油酯(单甘酯)占单和双硬脂酸甘油总质量的50％时，L-亮氨酸的纯度和收率最优，但总体差异并不大。
实施例3：不同添量单、双硬脂酸甘油酯结晶助剂的提纯效果
取上述收集的脱色液5Kg平均分成五份，分别向其中加入其固含量100ppm、1000ppm、3000ppm、4000ppm、5000ppm的单、双硬脂酸甘油酯(单甘酯含量为50wt％)，而后分别在70℃下浓缩至脱色液中固含量的2倍，浓缩液搅拌30min后过滤，收集各结晶滤饼、滤液。
然后加入结晶滤饼质量40倍的水复溶，70℃搅拌30min后使亮氨酸结晶滤饼全部溶解，冷却至室温后过滤除去不溶于水的单、双硬脂酸甘油酯，将复溶液浓缩至复溶液固含量的3.5倍，将析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集重结晶滤饼、滤液。
对比例1：空白对照实验
取上述收集的脱色液1Kg在70℃下浓缩至脱色液中固含量的3倍，浓缩液搅拌30min后过滤，收集结晶滤饼、滤液。
然后加入结晶滤饼质量40倍的水复溶，70℃搅拌30min后使亮氨酸结晶滤饼全部溶解，将复溶液浓缩至复溶液固含量的3.5倍，将析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集重结晶滤饼、滤液。
对比例2：结晶助剂甘油
取上述收集的脱色液1Kg，向其中加入其固含量2000ppm的甘油，而后在70℃下浓缩至脱色液中固含量的2倍，浓缩液搅拌30min后过滤，收集结晶滤饼、滤液。
然后加入结晶滤饼质量40倍的水复溶，将复溶液浓缩至复溶液固含量的3.5倍，将析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集重结晶滤饼、滤液。
对比例3：结晶助剂蔗糖脂肪酸二酯
取上述收集的脱色液1Kg，向其中加入其固含量2000ppm的蔗糖脂肪酸二酯，而后在70℃下浓缩至脱色液中固含量的2倍，浓缩液搅拌30min后过滤，收集结晶滤饼、滤液。
然后加入结晶滤饼质量40倍的水复溶，70℃搅拌30min后使亮氨酸结晶滤饼全部溶解，冷却至室温后过滤除去不溶于水的蔗糖脂肪酸二酯，将复溶液浓缩至复溶液固含量的3.5倍，将析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集重结晶滤饼、滤液。
对比例4：结晶助剂失水山梨醇脂肪酸酯S-60
取上述收集的脱色液1Kg，向其中加入其固含量2000ppm的失水山梨醇脂肪酸酯S-60，而后在70℃下浓缩至脱色液中固含量的2倍，浓缩液搅拌30min后过滤，收集结晶滤饼、滤液。
然后加入结晶滤饼质量40倍的水复溶，70℃搅拌30min后使亮氨酸结晶滤饼全部溶解，冷却至室温后过滤除去不溶于水的失水山梨醇脂肪酸酯S-60，将复溶液浓缩至复溶液固含量的3.5倍，将析出晶体的浓缩液搅拌30min后过滤，收集重结晶滤饼、滤液。
实施例3与各对比例L-亮氨酸的纯度和收率对比如下表所示：
表3、各实施例与对比例L-亮氨酸的纯度和收率对比
从表中可知，相比空白对照不加结晶助剂实验对照组，添加结晶助剂甘油、蔗糖脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯时，L-亮氨酸的纯度下降，收率有所提升；而以单、双硬脂酸甘油酯为结晶助剂时，L-亮氨酸的纯度和收率都提升，且当单硬脂酸甘油酯含量为50％时，单、双硬脂酸甘油酯的添加量为2000ppm最优。
产生上述现象的原因是：添加结晶助剂后，其与析出的亮氨酸结晶体外部亮氨酸分子具有氢键键合作用，使得亮氨酸析出晶体的流动性增强，加深了对其浓缩的程度，进而提升了亮氨酸提取效果；但如果采用水溶性甘油结晶助剂会使得其残存于亮氨酸分离成品中，故其虽然增加了亮氨酸提纯收率但会影响亮氨酸产品品质，而采用其他非水溶性结晶助剂时，复溶后其部分仍与亮氨酸键合，无法完全解离通过过滤去除，故而均无法产生与单双硬脂酸甘油酯等同的效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.一种利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，将L-亮氨酸发酵液经陶滤、脱色后加入单双硬脂酸甘油酯辅助结晶，进而获得的高纯度、高收率的L-亮氨酸。
2.按权利要求1所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，
S1.将L-亮氨酸发酵液采用陶瓷膜过滤，然后向陶滤清液体系内加其固含量0.3～3％的活性炭进行脱色，收集脱色液，待用；
S2.调节S1中脱色液中pH至7±0.2，然后加入结晶助剂并在60～70℃下浓缩得到析出晶体的浓缩液，过滤收集结晶滤饼和滤液；
S3.向S2中结晶滤饼加入水复溶，过滤收集滤液浓缩进行重结晶，进而获得高收率、高纯度的L-亮氨酸。
3.按权利要求1或2所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中L-亮氨酸发酵液为黄色短杆菌种子液在复合营养液中培养制备所得。
4.按权利要求1或2所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中结晶助剂为单、双硬脂酸甘油酯，且其加入量为脱色液固含量的100～5000ppm。
5.按权利要求4所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中结晶助剂单、双硬脂酸甘油酯中，单硬脂酸甘油酯质量百分比含量为30～70wt％。
6.按权利要求1或2所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中浓缩终点为：所析出晶体的浓缩液的总质量为脱色液固含量的2倍。
7.按权利要求1或2所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S3复溶是向结晶滤饼中加入其质量40～50倍的水充分溶解。
8.按权利要求1或2所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中复溶温度为20～70℃，搅拌30min后冷却至室温，待单、双硬脂酸甘油酯完全析出后过滤或离心。
9.按权利要求1或2所述的利用单、双硬脂酸甘油酯辅助提纯L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中重结晶浓缩终点为：复溶浓缩液的总质量为复溶液固含量的3.5倍。
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