CN117018186A - 一种破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，提供了一种体内清除SPP1蛋白制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。通过中和抗体清除全身SPP1蛋白，本发明显著延缓了骨肿瘤动物模型中肿瘤生长，并验证了通过清除SPP1蛋白可以达到预防和治疗骨肿瘤的效果。本发明还提供了一种新的转基因小鼠模型，利用Cre‑loxP方法阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白，从而特异性地将破骨细胞中的SPP1蛋白清除，不会影响到其他组织或器官中SPP1的分泌。这种转基因小鼠模型具有广泛的应用前景和市场价值，可以为骨肿瘤治疗提供重要的理论及实际指导，同时也为SPP1蛋白与肿瘤生长相关性的研究提供有力的动物模型支持。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型的构建方法及应用。
背景技术
SPP1为分泌型焦磷酸蛋白1，是一种具有多种功能的分泌型酸性糖蛋白，最初从矿化的骨基质中分离，参与骨代谢，可介导骨组织细胞与骨基质的连接，又称骨桥素蛋白。在多种组织损伤修复过程中SPP1含量增加，在使用皮肤切口模型同时敲除Spp1基因的小鼠中，观察到基质解体和胶原纤维的直径减小，切口无法得到修复，提示SPP1在创伤修复过程中发挥作用。相似的，在梗阻性肾病后的肾间质纤维化进程中，SPP1也发挥了关键性作用。在心肌梗死的模型中，Spp1基因水平及蛋白水平均出现升高，同时敲除Spp1基因后可见纤维化水平显著下降，说明SPP1参与了心肌纤维化的形成过程。因此，SPP1不仅仅是一个细胞外基质因子，同时也是一个细胞因子，在多种细胞类型中表达，并发挥多种不同功能。清除SPP1蛋白对骨肿瘤的影响尚未见相关报道。
发明内容
为填充现有研究领域中的空白，本发明提供一种清除SPP1蛋白在治疗骨肿瘤中的应用，进而阐明清除SPP1蛋白对骨肿瘤的治疗效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了体内清除SPP1蛋白的制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述体内清除SPP1蛋白制剂包括α-SPP1抗体。
本发明提供了一种利用Cre-loxP方法阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，包括以下步骤：
将携带Cre工具鼠与SPP1floxed小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠；
将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠。
优选的，所述SPP1floxed小鼠包括SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠；所述携带Cre工具鼠包括CtskCre+/-小鼠和/或CtskCre+/+小鼠。
优选的，所述杂交后进行筛选，得到相应基因型小鼠；所述筛选的方法包括对小鼠进行PCR鉴定；用于PCR鉴定的特异性引物包括：用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物。
优选的，用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物包括：第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对包括上游引物P1和下游引物P2；
所述上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第二引物对包括上游引物P3和下游引物P4；
所述上游引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物包括第三引物对；
所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述第三引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第二引物对扩增出条带，第一引物对未扩增出条带，则含有CtskCre+/+基因；
若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第一引物对和第二引物对均扩增出条带，则含有CtskCre+/-基因；
若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第一引物对扩增出条带，第二引物对未扩增出条带，则含有CtskCre-/-基因；
若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度仅为375bp条带，则含有SPP1flox+/+基因；
若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度一条为375bp，一条为313bp，则含有SPP1flox+/-基因；
若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度仅为313bp，则含有SPP1flox-/-基因。
本发明提供了上述技术方案所述构建方法在构建清除破骨细胞SPP1蛋白的转基因小鼠模型中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的骨肿瘤模型在SPP1蛋白清除后评价抗骨肿瘤治疗效果中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了体内清除SPP1蛋白制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。本发明通过向骨肿瘤小鼠模型中注射SPP1蛋白抗体，以清除SPP1蛋白，进一步达到了显著延缓骨肿瘤动物模型中肿瘤生长的目的，进而验证了通过清除SPP1蛋白可以达到治疗骨肿瘤的效果。
进一步地，在中和抗体的基础上，本发明提供了一种利用Cre-loxP方法构建阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，包括以下步骤：将携带Cre工具鼠与SPP1floxed小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠；将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠。
本发明通过特异性敲除破骨细胞中Spp1基因获得破骨细胞SPP1蛋白清除的转基因小鼠模型，进而可以通过建立骨肿瘤小鼠模型，模拟临床骨转移的实际情况，旨在阐明骨肿瘤中破骨细胞异常分泌的SPP1蛋白对骨肿瘤的发生、发展及远处转移的影响，为骨转移基础研究提供理想的动物模型，为临床骨转移治疗提供干预靶点和策略参考。本发明利用Cre-loxP技术删除破骨细胞中SPP1基因，从而特异性地阻断破骨细胞分泌的SPP1蛋白表达，进而特异性地将破骨细胞中的SPP1蛋白清除，不会影响到其他组织或器官中SPP1的分泌。这种转基因小鼠模型在骨肿瘤或骨转移情况下，因破骨细胞异常活跃而变得更为精准，而且模型建立后可稳定遗传，无需重复给药，经济可靠。这种转基因小鼠模型具有广泛的应用前景和市场价值，可以为骨肿瘤治疗提供重要的理论及实际指导，同时也为SPP1蛋白与肿瘤生长相关性的研究提供有力的动物模型支持。
目前，关于SPP1蛋白在抗肿瘤方面的作用及基础研究尚不十分清楚。本发明具有两个部分。第一部分是通过构建骨肿瘤动物模型，使用SPP1中和抗体清除小鼠体内SPP1蛋白，并研究该蛋白对骨肿瘤的影响。实验结果表明，在清除SPP1蛋白后，小鼠的骨肿瘤生长受到明显抑制，提示该蛋白可能促进肿瘤生长，不利于抗肿瘤免疫。清除小鼠体内SPP1蛋白能够对骨肿瘤起到预防和治疗的效果。第二部分，则涉及破骨细胞SPP1蛋白清除的转基因小鼠模型，因为破骨细胞是SPP1蛋白的主要来源，尤其在骨肿瘤或肿瘤骨转移发生后破骨细胞异常活跃。相比之下，本发明提供的转基因小鼠模型更能模拟临床实际情况，稳定遗传，并便于开展后续系列研究，用于阐明SPP1的病理机制，为临床诊疗优化及策略制定提供理想的动物模型。因此，本发明的应用前景非常广阔，有望为抗肿瘤免疫研究提供有力的支持和帮助。
本发明提供的中和抗体虽然能够清除全身SPP1蛋白，但该方法不够特异且需要重复给药才能达到持久清除的效果。相比之下，本发明提供的转基因小鼠具有更高的精准度，可以特异性地清除破骨细胞中的SPP1蛋白，不会影响其他组织或器官中SPP1的分泌。在研究骨肿瘤或骨转移等情况下，该模型更为准确，建立后可稳定遗传，不需要重复给药，更为经济可靠。因此，本发明提供的转基因小鼠模型具有更广泛的应用前景和市场潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为B16骨肿瘤模型中SPP1蛋白删除对肿瘤生长的影响图；
图2为MC38骨肿瘤模型中SPP1蛋白删除对肿瘤生长的影响图；
图3为Ctskcre小鼠F0代构建策略示意图；SPP1floxed小鼠F0代构建策略示意图；
图4为F1代Ctskcre小鼠和SPP1floxed小鼠PCR鉴定表型电泳图，M为1kb DNAmarker；
图5为F2代Ctskcre小鼠和SPP1floxed小鼠PCR鉴定表型电泳和鉴定结果图；
图6为F3代Ctskcre小鼠和SPP1floxed小鼠PCR鉴定表型电泳和鉴定结果图。
具体实施方式
本发明提供了体内清除SPP1蛋白制剂在制备治疗骨肿瘤药物中的应用。
在本发明中，所述清除SPP1蛋白制剂优选包括α-SPP1抗体。在本发明中，所述α-SPP1抗体优选购自于BioXCell，货号优选为BE0373，克隆号为103D6。
本发明通过清除小鼠骨肿瘤模型中的SPP1蛋白，得出清除SPP1蛋白可以显著的延缓骨肿瘤动物模型中肿瘤的生长，进而达到有利于治疗骨肿瘤的效果。
本发明提供了一种利用Cre-loxP方法构建清除破骨细胞SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，包括以下步骤：
将携带Cre工具鼠与SPP1floxed小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠；
将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠。
以下技术方案中，将不同小鼠进行杂交时，优选选取6-8周龄性成熟的健康小鼠进行杂交。本发明优选选取符合条件的小鼠进行杂交。本发明所述选取的条件优选包括：1)体态：体格健壮、体态匀称、四肢有力，无歪头等异常现象；2)被毛：被毛顺滑光亮、紧贴身体不易脱落，无外伤；3)眼睛：眼睛鲜明有神、眼角无分泌物、无白内障眼瞎等异常情况；4)呼吸：鼻孔干净、呼吸正常；5)粪便：肛门干净、粪粒均匀；6)生殖器：当选择好合适的种鼠时，还要观察雄鼠生殖器是否丢失，雌鼠需检查有无双阴道/阴道封闭；7)行为：反应敏捷、行动自然活泼，食欲旺盛，无转圈、呆滞等异常行为。本发明选取的SPP1floxed小鼠和携带Cre工具鼠的雌雄比例雌雄比优选为3:1。本发明上述饲养过程均在SPF级别动物房中进行。
选取得到符合条件的小鼠后，本发明将相应的小鼠进行杂交。进行杂交时，本发明优选将不同小鼠进行合笼；所述合笼的时间优选为傍晚时分至次日凌晨。本发明优选通过检测雌鼠阴栓形成与否，判断是否交配成功。本发明优选将交配成功的雌鼠进行单独饲喂。本发明所述饲喂过程中优选添加足够饲料和水，保证垫料清洁，定期观察小鼠待产情况。
本发明得到子代小鼠后，优选对子代小鼠进行鉴定。本发明优选在子代小鼠离乳后进行鉴定即出生后18～28d，更优选为21d。
本发明将携带Cre工具鼠与SPP1floxed小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠。
本发明对亲本F0小鼠的构建方法或来源没有特殊限定，采用本领域常规构建方法或者购买得到均可。在本发明中，所述F0小鼠可以为购买得到的工具鼠，也可以为工具鼠与野生型小鼠杂交得到的工具鼠。
在本发明中，所述SPP1floxed小鼠优选为在Spp1基因中插入loxP位点；更优选在Spp1基因目的exon 5-8两侧分别插入loxP位点。在本发明中，所述SPP1floxed小鼠优选包括SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠。在本发明中，所述SPP1floxed小鼠优选包括C57BL/6JSmoc-Spp1em1(flox)Smoc小鼠。所述C57BL/6JSmoc-Spp1em1(flox)Smoc小鼠购自于上海南方模式生物科技股份有限公司。
在本发明中，所述携带Cre工具鼠优选在破骨细胞中特异性表达的CtskCre小鼠。在本发明中，所述CtskCre小鼠优选为在内源Ctsk基因插入Cre基因的小鼠。在本发明中，所述Cre基因优选包括2A-Cre-Wpre-polyA共表达结构。在本发明中，所述Cre基因优选插入小鼠内源Ctsk基因3'UTR之前。在本发明中，所述携带Cre工具鼠优选包括CtskCre+/-小鼠和/或CtskCre+/+小鼠。在本发明中，所述CtskCre小鼠优选包括C57BL/6JSmoc-Ctskem1(2A -Cre-Wpre-pA)Smoc小鼠。所述C57BL/6JSmoc-Ctskem1(2A-Cre-Wpre-pA)Smoc小鼠购自于上海南方模式生物科技股份有限公司。
获得SPP1floxed小鼠和携带Cre工具鼠后，本发明优选将SPP1floxed小鼠和携带Cre工具鼠分别进行饲养，更优选为将CtskCre小鼠和SPP1floxed小鼠分别与野生型小鼠进行杂交，扩大工具鼠的规模。
本发明优选将CtskCre小鼠和SPP1floxed小鼠分别与野生型小鼠进行杂交。杂交完成后，本发明优选对子代进行鉴定，筛选携带Cre工具鼠和筛选SPP1floxed小鼠，即为子一代筛选小鼠。
在本发明中，所述鉴定方法优选包括提取小鼠DNA，进行PCR鉴定。本发明优选取小鼠耳组织提取DNA进行PCR鉴定。本发明对提取DNA的方法没有特殊限定采用本领域常规DNA提取方法均可。本发明实施例中提取DNA采用品牌Bimake试剂盒Mouse DirectPCR Kit(ForGenotyping)；所述试剂盒专为小鼠快速基因型鉴定而研制，能够快速从小鼠尾巴、耳朵或者脚趾等组织中释放足量的基因组DNA。
本发明用于PCR鉴定的特异性引物包括：用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物。
本发明用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物优选包括：第一引物对和第二引物对；所述第一引物对优选包括上游引物P1和下游引物P2。在本发明中，所述上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列组成为5’-TCTACCTTCAAAGTGCTGCCATTA-3’；所述下游引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SEQ ID NO.2的核苷酸序列组成为5’-AGAGAAGGGAAGTAGAGTTGTCAC-3’。在本发明中，所述第二引物对优选包括上游引物P3和下游引物P4。在本发明中，所述上游引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列组成为5’-GAGAGCTGGGGAAACAAAG-3’；所述下游引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SEQ ID NO.4的核苷酸序列组成为5’-GGTAGTCCCTCACATCCTCAG-3’。本发明鉴定含Cre的外源基因是否插入时，进行PCR鉴定的程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35循环；72℃终延伸7min。本发明得到PCR产物后，所述PCR产物可于12℃条件下暂存。
本发明用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物优选包括第三引物对。在本发明中，所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5的核苷酸序列组成为5’-GCACACAGAGTTCAGGTCCA-3’；所述第三引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6的核苷酸序列组成为5’-TGAGCTTTTCGGCTACATCC-3’。本发明鉴定外源loxP基因是否插入时，进行PCR鉴定的程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32循环；72℃终延伸5min。本发明得到PCR产物后，所述PCR产物可于12℃条件下暂存。
在本发明中，使用上述第一引物对和第二引物对对小鼠DNA进行PCR鉴定外源Cre基因是否插入时，若仅第一引物对能扩增出442bp条带则说明小鼠为野生型小鼠，没有插入外源Cre基因；若第一引物对能扩增得到442bp条带，第二引物对能扩增得到403bp条带，则说明小鼠为杂合型小鼠，一条染色体中插入外源Cre基因，一条染色体中没有插入外源Cre基因；若仅第二引物对能扩增得到403bp条带，则说明小鼠为纯合子小鼠，两条染色体中均插入外源Cre基因。
在本发明中，使用上述第三引物对对小鼠DNA进行PCR鉴定外源loxP基因是否插入时，若仅能扩增出313bp条带，则说明小鼠为野生型小鼠，没有插入外源loxP基因；若能扩增出313bp条带和375bp条带，则说明小鼠为杂合型小鼠，一条染色体中插入外源loxP基因，一条染色体中没有插入外源loxP基因；若仅能扩增出375bp条带，则说明小鼠为纯合子小鼠，两条染色体中均插入外源loxP基因。
本发明筛选携带Cre工具鼠时，优选提取小鼠DNA后，使用第二引物对进行PCR鉴定。若第二对引物扩增出条带，则为携带Cre工具鼠，所述携带Cre工具鼠优选为CtskCre+/-小鼠。
本发明筛选SPP1floxed小鼠时，优选提取小鼠DNA后，使用第三引物对进行PCR鉴定。若第三引物对扩增出的条带中包括长度为375bp条带，则为SPP1floxed小鼠，所述SPP1floxed小鼠优选为SPP1flox+/-小鼠。
本发明所述SPP1floxed小鼠和携带Cre工具鼠均为SPF级C57BL/6遗传背景。
本发明优选将购买得到的SPP1floxed小鼠、购买得到的携带Cre工具鼠、SPP1floxed小鼠与野生型小鼠杂交得到的子一代小鼠筛选小鼠和携带Cre工具鼠与野生型小鼠杂交得到的子一代小鼠筛选小鼠作为F0代，进行后续杂交。在本发明中，F0代的小鼠基因型优选包括CtskCre+/-小鼠、CtskCre+/+小鼠、SPP1flox+/-小鼠和SPP1flox+/+小鼠。
得到F0代小鼠后，即分别得到携带Cre工具鼠和SPP1floxed小鼠后。
本发明优选将携带Cre工具鼠与携带Cre工具鼠进行杂交，得到F1代携带Cre工具鼠。在本发明中，若CtskCre+/-小鼠与CtskCre+/-小鼠进行杂交，则F1代小鼠产生三种基因型，即CtskCre+/-小鼠、CtskCre+/+小鼠和CtskCre-/-小鼠。在本发明中，若CtskCre+/+小鼠与CtskCre+/-小鼠进行杂交，则F1代小鼠产生二种基因型，即CtskCre+/-小鼠和CtskCre+/+小鼠。在本发明中，若CtskCre+/+小鼠与CtskCre+/+小鼠进行杂交，则F1代小鼠产生一种基因型，即CtskCre+/+小鼠。
得到F1代携带Cre工具鼠后，本发明优选对F1代小鼠进行筛选，得到CtskCre+/+小鼠和/或CtskCre+/-小鼠。本发明所述筛选方法同F0代小鼠携带Cre工具鼠筛选方法，在此不进行赘述。
本发明优选将SPP1floxed小鼠与SPP1floxed小鼠进行杂交，得到F1代SPP1floxed小鼠。在本发明中，若SPP1flox+/-小鼠与SPP1flox+/-小鼠进行杂交，则F1代小鼠产生三种基因型，即SPP1flox+/-小鼠、SPP1flox+/+小鼠和SPP1flox-/-小鼠。在本发明中，若SPP1flox+/-小鼠与SPP1flox +/+小鼠进行杂交，则F1代小鼠产生二种基因型，即SPP1flox+/-小鼠和SPP1flox+/+小鼠。在本发明中，若SPP1flox+/+小鼠与SPP1flox+/+小鼠进行杂交，则F1代小鼠产生一种基因型，即SPP1flox +/+小鼠。
得到F1代SPP1floxed小鼠后，本发明优选对F1代小鼠进行筛选，得到SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠。本发明对F1代进行PCR鉴定的引物的PCR方法同F0代小鼠SPP1floxed小鼠筛选方法，在此不进行赘述。在本发明中，F1代优选对基因型为SPP1flox+/+小鼠进行筛选。本发明对基因型为SPP1flox+/+小鼠进行筛选时优选使用第三引物对对小鼠DNA进行扩增，若扩增仅得到一条带375bp，该位置对应外源基因，说明两条染色体均有插入，对应小鼠基因型为SPP1flox+/+小鼠。本发明优选对基因型为SPP1flox+/-小鼠进行筛选。本发明对基因型为SPP1flox+/-小鼠进行筛选时优选使用第三引物对对小鼠DNA进行扩增，能扩增出313bp条带和375bp条带，所述SPP1floxed小鼠为SPP1flox+/-小鼠。
筛选得到F1代小鼠后，即分别得到F1代携带Cre工具鼠和F1代SPP1floxed小鼠后，本发明将携带Cre工具鼠和SPP1floxed小鼠进行杂交，得到F2代小鼠。
在本发明中，若F1代携带Cre工具鼠基因型为CtskCre+/-小鼠，F1代SPP1floxed小鼠为SPP1flox+/-小鼠，将CtskCre+/-小鼠和SPP1flox+/-小鼠进行杂交，则F2代小鼠优选产生四种基因型小鼠，分别为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠、CtskCre+/-SPP1flox-/-小鼠、CtskCre-/-SPP1flox+/-小鼠和CtskCre-/-SPP1flox-/-小鼠。
在本发明中，若F1代携带Cre工具鼠基因型为CtskCre+/+小鼠，F1代SPP1floxed小鼠基因型为SPP1flox+/-小鼠，将两者进行杂交，则F2代小鼠优选产生二种基因型小鼠，分别为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠和CtskCre+/-SPP1flox-/-小鼠。
在本发明中，若F1代携带Cre工具鼠基因型为CtskCre+/-小鼠，F1代SPP1floxed小鼠基因型为SPP1flox+/+小鼠，将两者进行杂交，则F2代小鼠优选产生二种基因型小鼠，分别为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠和CtskCre-/-SPP1flox+/-小鼠。
在本发明中，若F1代携带Cre工具鼠基因型为CtskCre+/+小鼠，F1代SPP1floxed小鼠基因型为SPP1flox+/+小鼠，将两者进行杂交，则F2代小鼠优选产生一种基因型小鼠，为CtskCre +/-SPP1flox+/-小鼠。
得到F2代小鼠后，本发明优选对F2代小鼠进行筛选。本发明所述筛选优选筛选基因型为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠即为CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠。
本发明进行CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠筛选时，优选采用上技术方案所述PCR方法进行筛选，用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物及PCR方法同上，在此不进行赘述。本发明对CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠的基因型进行鉴定时，优选选取第二引物对能扩增出条带且第三引物对扩增出的条带中包括长度为375bp条带的小鼠，即选择F2代小鼠为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠。
得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠后，本发明将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠。
在本发明中，所述CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠为F2代小鼠。本发明将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到F3代小鼠。
在本发明中，若将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠进行杂交，得到F3代小鼠，则F3代小鼠可能产生四种基因型，分别为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠、CtskCre+/-SPP1flox+/+小鼠、CtskCre-/-SPP1flox+/-小鼠和CtskCre-/-SPP1flox+/+小鼠。
在本发明中，若将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到F3代小鼠，则F3代小鼠可能产生6种基因型，分别为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠、CtskCre+/-SPP1flox+/+小鼠、CtskCre-/-SPP1flox+/-小鼠、CtskCre-/-SPP1flox+/+小鼠、CtskCre+/-SPP1flox-/-小鼠和CtskCre-/-SPP1flox-/-小鼠。
得到F3代小鼠后，本发明优选对F3代小鼠进行筛选。本发明所述筛选优选筛选基因型为CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠即得破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型，即清除破骨细胞中SPP1蛋白的转基因小鼠模型。
本发明进行CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠筛选时，优选采用上技术方案所述PCR方法进行筛选，用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物及PCR方法同上，在此不进行赘述。本发明对CtskCre+/-SPP1flox+/+小鼠的基因型进行鉴定时，优选选取第二引物对能扩增出条带且第三引物对扩增出的条带中仅为长度为375bp条带的小鼠，即为CtskCre+/-SPP1flox+/+小鼠。
本发明提供了上述技术方案所述构建方法在构建破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型中的应用。本发明构建破骨细胞基因删除的转基因小鼠不影响小鼠正常生理活动，可稳定遗传，研究特定基因对骨肿瘤的发生发展影响。
本发明提供了上述技术方案所述构建方法在建立清除破骨细胞中SPP1蛋白骨肿瘤模型中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的骨肿瘤模型在SPP1蛋白清除后评价抗骨肿瘤治疗效果中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
B16骨肿瘤模型中SPP1蛋白删除对肿瘤生长的影响
选用小鼠肿瘤细胞系B16，通过给C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞悬液建立皮下瘤模拟临床原发灶，通过胫骨平台注射肿瘤细胞悬液建立骨肿瘤模拟临床骨肿瘤或肿瘤骨转移的实际情况。
在建立的B16骨肿瘤动物模型中，荷瘤后第10天起通过腹腔给予α-SPP1抗体(BioXCell，BE0373)达到清除小鼠全身SPP1蛋白的目的，作为试验组，对照组给予isotype抗体(BioXCell，BE0366)，并从第10天开始每隔一天监测肿瘤大小。
试验组和对照组小鼠的骨肿瘤大小随时间的变化情况如图1所示。横坐标为接种肿瘤后的观察时间(单位为天)，纵坐标为肿瘤的体积，计算公式为：肿瘤最大径×最小径2×0.5。统计采用非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
由图1可得，清除SPP1蛋白可以显著的延缓骨肿瘤动物模型中肿瘤的生长，同时缩小肿瘤体积，从而起到对骨肿瘤的预防和治疗的效果。
实施例2
MC38骨肿瘤模型中SPP1蛋白删除对肿瘤生长的影响
选用小鼠肿瘤细胞系MC38，通过给C57BL/6小鼠皮下注射肿瘤细胞悬液建立皮下瘤模拟临床原发灶，通过胫骨平台注射肿瘤细胞悬液建立骨肿瘤模拟临床骨肿瘤或肿瘤骨转移的实际情况。
在建立的MC38骨肿瘤动物模型中，荷瘤后第10天起通过腹腔给予α-SPP1抗体(BioXCell，BE0373)达到清除小鼠全身SPP1蛋白的目的，作为试验组，对照组给予isotype抗体(BioXCell，BE0366)，并从第10天开始每隔一天监测肿瘤大小。
试验组和对照组小鼠的骨肿瘤大小随时间的变化情况如图2所示。图2中横坐标为接种肿瘤后的观察时间(单位为天)，纵坐标为肿瘤的体积，计算公式为：肿瘤最大径×最小径2×0.5。统计非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
由图2可得，清除SPP1蛋白可以显著的延缓骨肿瘤动物模型中肿瘤的生长，同时缩小肿瘤体积，从而起到对骨肿瘤的预防和治疗的效果。
实施例3
一种破骨细胞Spp1基因删除的转基因小鼠模型的构建方法，步骤如下：
1.由亲本F0获得F1代小鼠。
1)CtskCre:购自上海南方模式生物科技股份有限公司，品系全名为C57BL/6JSmoc-Ctskem1(2A-Cre-Wpre-pA)Smoc，目录号为NM-KI-190019。
基因ctsk的基本信息：NCBI ID为13038，MGI ID为107823，基因标记破骨细胞，该品系小鼠是将2A-Cre-Wpre-polyA共表达结构插入小鼠内源Ctsk基因3'UTR之前。
2)SPP1floxed：购自上海南方模式生物科技股份有限公司，品系全名为C57BL/6JSmoc-Spp1em1(flox)Smoc，目录号为NM-CKO-210205。
基因SPP1的基本信息：NCBI ID为20750，MGI ID为98389，基因标记视网膜，该品系小鼠是通过在Spp1基因目的exon 5-8两侧分别插入loxP位点。
将CtskCre基因小鼠与SPP1floxed小鼠在SPF级别动物房中分别饲养，选取体态正常，毛色鲜亮，6-8周龄性成熟的健康种鼠，具体标准包括：1)体态：体格健壮、体态匀称、四肢有力，无歪头等异常现象。2)被毛：被毛顺滑光亮、紧贴身体不易脱落，无外伤。3)眼睛：眼睛鲜明有神、眼角无分泌物、无白内障眼瞎等异常情况。4)呼吸：鼻孔干净、呼吸正常。5)粪便：肛门干净、粪粒均匀。6)生殖器：当选择好合适的种鼠时，还要观察雄鼠生殖器是否丢失，雌鼠需检查有无双阴道/阴道封闭。7)行为：反应敏捷、行动自然活泼，食欲旺盛，无转圈、呆滞等异常行为。将2种性别不同的基因小鼠傍晚时分合笼，小鼠雄雌交配比例为1：3。次日清晨检测雌鼠阴栓形成与否，提示交配成功。将交配成功雌鼠单独放置一笼，添加足够饲料和水，保证垫料清洁，定期观察小鼠待产情况。合笼成功后21天左右生产，待幼鼠出生后21天可以离乳，取少量耳朵组织样本用于提取DNA鉴定小鼠基因型。
获得F0代：Cre工具鼠(CtskCre+/-小鼠，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，品系全名为C57BL/6JSmoc-Ctskem1(2A-Cre-Wpre-pA)Smoc，目录号为NM-KI-190019)。SPP1flox+/-小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司，品系全名为C57BL/6JSmoc-Spp1em1(flox)Smoc，目录号为NM-CKO-210205)。以上两种小鼠作为繁殖工具鼠与WT老鼠进行杂交，扩大工具鼠规模，对子代小鼠进行筛选，获得基因型为CtskCre+/-小鼠和基因型为SPP1flox+/-小鼠。其中，基因型为CtskCre+/-小鼠作为携带Cre工具鼠和SPP1flox+/-小鼠作为SPP1floxed小鼠可作为F0代小鼠用于后续杂交。
F1代：将SPP1floxed小鼠和携带SPP1floxed小鼠作为亲本F0进行交配，获得F1代小鼠经筛选，获得SPP1flox+/+小鼠或者SPP1flox+/-小鼠；将携带Cre工具鼠和携带Cre工具鼠作为亲本F0进行交配，获得F1代小鼠经筛选，获得CtskCre+/-小鼠和/或CtskCre+/+小鼠。
F2代：将CtskCre+/-小鼠与SPP1flox+/+小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠，为F2代小鼠；
F3代：将SPP1flox+/+基因小鼠与CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠进行杂交，得到F3代小鼠，筛选得到基因型为CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠，即为破骨细胞Spp1基因删除的目标小鼠模型。
2.子代筛选过程
1)DNA提取方法
取小鼠组织样本，使用品牌Bimake试剂盒Mouse Direct PCR Kit(ForGenotyping)，本试剂盒专为小鼠快速基因型鉴定而研制，能够快速从小鼠尾巴、耳朵或者脚趾等组织中释放足量的基因组DNA。
2)PCR反应体系
(1)采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-TCTACCTTCAAAGTGCTGCCATTA-3’)所述的P1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2(5’-AGAGAAGGGAAGTAGAGTTGTCAC-3’)所述的P2。以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3(5’-GAGAGCTGGGGAAACAAAG-3’)所述的P3和核苷酸序列如SEQ IDNO.4(5’-GGTAGTCCCTCACATCCTCAG-3’)所述的P4对CTSK-Cre基因进行检测。Ctskcre小鼠构建策略示意图如图3中的A所示所示。图3中的A为利用VRISPR/Cas9技术，在ctsk基因8号外显子与终止密码子位点之间定点敲入2A-Cre-Wpre-pA表达框。
由图3中的A和B所示，因为染色体是成对出现的，用P1和P2这1对引物扩增自身基因，P3和P4这1对引物扩增外源插入的Cre基因，综合DNA鉴定结果说明2条染色体的组成，共有以下三种情况：如果只有一条带，即442bp，说明没有外源插入基因，通常表示为-/-；如果有两条带，即442bp和403bp，说明一条染色体携带外源插入基因，另外一条野生型，该染色体是杂合子，表示为+/-；如果只有一条带403bp，该位置对应外源基因，说明两条染色体均有插入，表示为+/+，是纯合子。
CTSK-Cre基因小鼠PCR反应体系如表1所示。
表1 CTSK-Cre基因小鼠PCR反应体系
| 试剂 | 用量(μL) |
| ddH2O | 8 |
| 正向引物 | 0.5 |
| 反向引物 | 0.5 |
| 模板(消化产物) | 1 |
| 2xM-PCROPTIMix | 10 |
CTSK-Cre基因小鼠PCR反应程序如表2所示。
表2 CTSK-Cre基因小鼠PCR反应程序
(2)采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5(5’-GCACACAGAGTTCAGGTCCA-3’)和SEQ IDNO.6(5’-TGAGCTTTTCGGCTACATCC-3’)的上游引物和下游引物对SPP1基因进行检测。SPP1基因上下游引物剪切示意图如图3中的C所示。图3中的C为利用Cas9技术在spp1基因的5号与8号外显子两侧分别插入同方向的loxp同源重组载体。
由图3中的C和D所示，因为染色体是成对出现的，目标区域为Spp1的基因，用P1和P2这2对引物扩增Spp1基因以及中间的loxp，313bp对应野生型Spp1基因，375bp是插入目标区域的Spp1基因，综合DNA鉴定结果说明2条染色体的组成，共有以下三种情况：如果只有一条带，即313bp，说明没有外源loxp基因插入，通常表示为-/-；如果有两条带，即313bp和375bp，说明一条染色体携带外源插入基因，另外一条野生型，该染色体是杂合子，表示为+/-；如果只有一条带375bp,该位置对应外源基因，说明两条染色体均有插入，表示为+/+，是纯合子。
Spp1基因小鼠PCR反应体系如表3所示。
表3 Spp1基因小鼠PCR反应体系
| 试剂 | 用量(μL) |
| ddH2O | 8 |
| 正向引物 | 0.5 |
| 反向引物 | 0.5 |
| 模板(消化产物) | 1 |
| 2xM-PCROPTIMix | 10 |
Spp1基因小鼠PCR反应程序如表4所示。
表4 Spp1基因小鼠PCR反应程序
因为染色体是成对出现的，目标区域为spp1的基因，用第三引物对扩增spp1基因以及中间的loxp，313bp对应spp1基因，375bp是spp1和loxp连接后的基因，综合DNA鉴定结果说明2条染色体的组成，共有以下三种情况：如果只有一条带，即313bp，说明没有外源loxp基因插入，通常表示为-/-；如果有两条带，即313bp和375bp，说明一条染色体携带外源插入基因，另外一条野生型，该染色体是杂合子，表示为+/-；如果只有一条带375bp，该位置对应外源基因，说明两条染色体均有插入，表示为+/+，是纯合子。
基于，CTSK-Cre基因型判断时，引物对(P1，P2)扩增得到的条带的长度为442bp；引物对(P3，P4)扩增得到的条带的长度为403bp，Ctskcre小鼠PCR鉴定表型电泳图如图4所示，其中M为1kb DNAmarker。其中野生型只有引物对(P1，P2)扩增出442bp条带，引物对(P3，P4)无条带；杂合子引物对(P1，P2)扩增出442bp条带，引物对(P3，P4)也扩增出403bp条带；纯合子引物对(P1，P2)无条带，引物对(P3，P4)可扩增出403bp条带。
Spp1基因型判断时，野生型时Spp1引物对只扩增出313bp条带；杂合子时Spp1引物对能扩增出313bp和375bp两条条带；纯合子时Spp1引物对只能扩增出375bp条带。
3.对CtskCre小鼠和SPP1floxed小鼠分别与野生型小鼠进行杂交的子代进行鉴定，确定F0小鼠时，使用第二引物对进行PCR鉴定。若第二对引物扩增出条带，则为携带Cre工具鼠，所述携带Cre工具鼠为CtskCre+/-小鼠。使用第三引物对进行PCR鉴定。若第三引物对扩增出的条带中包括长度为375bp条带，则为SPP1floxed小鼠，所述SPP1floxed小鼠为SPP1flox+/-小鼠。
4.对F1代小鼠进行鉴定时，使用第二引物对进行PCR鉴定。若第二对引物扩增出条带，且第一对引物也扩增出条带，则为携带Cre工具鼠，所述携带Cre工具鼠为CtskCre+/-小鼠。
使用第三引物对进行PCR鉴定。若第三引物对扩增出的条带中仅为长度为375bp条带，则为SPP1floxed小鼠，所述SPP1floxed小鼠为SPP1flox+/+小鼠；若第三引物能扩增出313bp条带和375bp条带，则为SPP1floxed小鼠，所述SPP1floxed小鼠为SPP1flox+/-小鼠。
F1代小鼠PCR鉴定检测结果如图4所示。图4中的A和B为ctsk相关引物检测结果；图4中的C和D为Spp1相关引物检测结果。
5.对F2代小鼠进行鉴定时，选取第二引物对能扩增出条带且第三引物对扩增出的条带中包括长度为375bp条带的小鼠，即为CtskCre+/-SPP1flox+/-小鼠。
F2代小鼠PCR鉴定检测结果如图5所示。图5中的A和B为ctsk相关引物检测结果；图5中的C和D为Spp1相关引物检测结果。
6.对F3代小时进行鉴定时，选取第二引物对能扩增出条带且第三引物对扩增出的条带中仅为长度为375bp条带的小鼠，即为CtskCre+/-SPP1flox+/+小鼠。
F3代小鼠PCR鉴定检测结果如图6所示。图6中的A和B为ctsk相关引物检测结果；图6中的C和D为Spp1相关引物检测结果。
由图6可得，F3代小鼠21、22、23、24、26小鼠经ctsk相关引物扩增后得到442bp和403bp两条带，说明是杂合子，基因型是Cre+/-；经Spp1相关引物扩增后得到375bp一条带，同样说明是纯合子，基因型为Spp1+/+。说明21、22、23、24、26小鼠为破骨细胞中Spp1删除小鼠。
实施例4
一种骨肿瘤小鼠模型的构建方法，步骤如下：
在小鼠模型基础上建立骨肿瘤，得到骨肿瘤小鼠模型。
具体方法为：
准备无菌手术器材，待接种的肿瘤细胞；
给予小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠，确保小鼠麻醉后开始接种；
使用25号针头的1毫升注射器在小鼠胫骨处建立通道；
使用10μL微量注射器缓慢注入肿瘤细胞悬液；
液体凝胶海绵封口，构建得到骨肿瘤小鼠模型。
综上，本发明提供的特异性敲除破骨细胞中Spp1基因获得的骨肿瘤小鼠模型，模拟临床骨转移的实际情况，旨在阐明骨肿瘤中破骨细胞异常分泌的SPP1蛋白对骨肿瘤的发生、发展及远处转移的影响，为骨转移基础研究提供理想的动物模型，为临床骨转移治疗提供干预靶点和策略参考。该模型对于深入阐明骨转移的发生机制，改善临床诊疗方案具有深远的意义。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.体内清除SPP1蛋白的制剂在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述体内清除SPP1蛋白制剂包括α-SPP1抗体。
3.一种利用Cre-loxP方法构建阻断破骨细胞分泌SPP1蛋白的转基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将携带Cre工具鼠与SPP1floxed小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠；
将CtskCre+/-SPP1flox+/-双基因小鼠与SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠进行杂交，得到CtskCre+/-SPP1flox+/+双基因小鼠。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述SPP1floxed小鼠包括SPP1flox+/+小鼠和/或SPP1flox+/-小鼠；所述携带Cre工具鼠包括CtskCre+/-小鼠和/或CtskCre+/+小鼠。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述杂交后进行筛选，得到相应基因型小鼠；所述筛选的方法包括对小鼠进行PCR鉴定；用于PCR鉴定的特异性引物包括：用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物和用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物包括：第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对包括上游引物P1和下游引物P2；
所述上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第二引物对包括上游引物P3和下游引物P4；
所述上游引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，用于鉴定外源loxP基因是否插入的引物包括第三引物对；
所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述第三引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第二引物对扩增出条带，第一引物对未扩增出条带，则含有CtskCre+/+基因；
若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第一引物对和第二引物对均扩增出条带，则含有CtskCre+/-基因；
若用于鉴定含Cre的外源基因是否插入的引物中的第一引物对扩增出条带，第二引物对未扩增出条带，则含有CtskCre-/-基因；
若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度仅为375bp条带，则含有SPP1flox+/+基因；
若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度一条为375bp，一条为313bp，则含有SPP1flox+/-基因；
若用于鉴定外源loxP基因的第三引物对扩增出的条带的长度仅为313bp，则含有SPP1flox-/-基因。
9.权利要求3～8任一项所述构建方法在构建清除破骨细胞中SPP1蛋白的转基因小鼠模型中的应用。
10.权利要求3～8任一项所述构建方法构建得到的骨肿瘤模型在SPP1蛋白清除后评价抗骨肿瘤治疗效果中的应用。
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