CN117017851A

CN117017851A - 一种兰花发酵液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117017851A
Application number: CN202310959175.4A
Authority: CN
Inventors: 方春香
Original assignee: Guangzhou Diewanli Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Diewanli Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-08-01
Filing date: 2023-08-01
Publication date: 2023-11-10

Abstract

本发明提供了一种兰花发酵液及其制备方法和应用，涉及生物发酵技术领域。该兰花发酵液的制备方法包括如下步骤：步骤一、将兰花干燥，粉碎，获得兰花粉末，将所述兰花粉末与培养基混合获得发酵底物；步骤二、将双歧杆菌种子液接种至所述发酵底物中，进行厌氧发酵，获得兰花发酵液。本发明中首次采用双歧杆菌发酵蝴蝶兰，获得了蝴蝶兰发酵液，该发酵液中富含多种抗氧化活性物质、总酚含量和β‑葡聚糖，具有优异的抗氧化和抗衰老性能；本发明中还提供了包含上述蝴蝶兰发酵液的组合物，该组合物体系稳定，见光不易变色，能够长期保存，且安全无刺激。

Description

一种兰花发酵液及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种兰花发酵液及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，以兰科植物制备的兰花提取物广泛应用于化妆品领域，具体包括有多种兰花品种，如蝴蝶兰、文心兰、蕙兰等。研究表明，兰科植物的主要护肤美容活性成分有多糖、酚类、生物碱、有机硫化合物及萜烯类挥发性芳香成分等，具有很好的保湿、抗氧化、抗炎、美白、抗衰老、抑菌、赋香等护肤美容功效。

蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite Rchb.F.)为兰科蝴蝶兰属，原产于亚热带雨林地区，为附生性兰花。蝴蝶兰白色粗大的气根露在叶片周围，除了具有吸收空气中养分的作用外，还有生长和光合作用。新春时节，蝴蝶兰植株从叶腋中抽出长长的花梗，并且开出形如蝴蝶飞舞般的花朵，深受花迷们的青睐，素有“洋兰王后”之称。目前以蝴蝶兰作为原料制备兰花提取物的方法多为醇提或超声波提取等方法，提取方法较为简单，且提取物中的活性物质成分仍有待提高。并且，现有的兰花提取物常存在光照变色等问题。

二裂酵母胞溶物(Bifida ferment lysate)是经双歧杆菌(Bifidobacterium)培养、灭活及分解得到代谢产物、细胞质片段、细胞壁组分及多糖复合体，富含氨基酸、维生素、多肽及矿物质等有多种活性成分，具有捕获自由基、抑制脂质过氧化等生物活性，在改善皮肤微生态与皮肤功能方面具有较好作用，已作为化妆品原料广泛用于相关产品的开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种兰花发酵液及其制备方法和应用，首次采用双歧杆菌对蝴蝶兰进行发酵处理，获得了兼具安全性能和抗氧化性能的化妆品原材料，本发明还提供了含有该兰花发酵液的组合物，该组合物体系稳定性好，见光不易分解，能够长期保存。

一方面，本申请提供了一种兰花发酵液的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一、将兰花干燥，粉碎，获得兰花粉末，将所述兰花粉末与培养基混合获得发酵底物；

步骤二、将双歧杆菌种子液接种至所述发酵底物中，进行厌氧发酵，获得兰花发酵液；所述双歧杆菌为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CICC24935；所述双歧杆菌种子液的OD₆₀₀值为5-6，所述双歧杆菌种子液的接种量为1％-5％。

所述双歧杆菌为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CICC24935，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

优选的，所述双歧杆菌种子液的OD₆₀₀值为5.5，经验证，长双歧杆菌长亚种CICC24935的OD₆₀₀值为5.5时其达到对数生长期，菌株活力较高。

OD₆₀₀指的是种子液在600nm波长处的吸光值。

优选的，所述双歧杆菌种子液的接种量为4％。

所述双歧杆菌种子液的培养方法：将长双歧杆菌长亚种CICC24935接种于MRS固体培养基中，温度为37℃、转速为200rpm、pH为6.8，培养至OD₆₀₀值为5.5，大约培养24h。

优选的，由于兰花材料中的抗氧化活性物质多为生物酶，多数生物酶在高温环境下容易失活，因此，为最大程度保留兰花材料中的抗氧化成分，所述干燥采用20℃-50℃低温干燥。

进一步的，所述厌氧发酵的条件包括：温度为36.5℃-38.5℃，转速为100-200rpm，pH值为5-6，罐压为3×10⁵-4×10⁵Pa，时间为36-48h。

优选的，所述厌氧发酵的条件包括：温度为37.5℃，转速为150rpm，pH值为5，罐压为3.530×10⁵Pa，时间为36h。

在一种优选的实施方式中，所述厌氧发酵过程通过通5％接种量的氮气保持厌氧环境。

进一步的，所述兰花为蝴蝶兰；优选的，所述兰花为盛开期蝴蝶兰的花瓣。

进一步的，所述步骤一中，所述兰花粉末的目数为80-100目；和/或，

所述培养基为MRS液体培养基；优选的，所述兰花粉末与培养基的质量比为1：(5-10)。

优选的，所述步骤一中，所述兰花粉末的目数为90目；和/或，

所述兰花粉末与MRS液体培养基的质量比为1：6。

在一种优选的实施方式中，所述兰花粉末与MRS液体培养基的料液比为1g：6mL。

进一步的，所述制备方法还包括将所述兰花发酵液于1200-1300MPa进行高压匀浆破碎处理，破碎处理完成后进行过滤；优选的，所述破碎处理的温度不高于25℃；更优选的，所述破碎处理的温度为4℃-25℃。

优选的，所述高压匀浆的压力为1300MPa。

更优选的，所述破碎处理进行6个循环。

更优选的，所述过滤为利用50-220nm膜进行过滤，以去除大分子蛋白和微生物，得到无菌滤液。

为最大程度保留兰花发酵液中的抗氧化成分不被高温破坏，所述破碎处理的温度为4℃-25℃。

在一种优选的实施方式中，兰花发酵液的制备方法包括如下步骤：

步骤一、将蝴蝶兰盛开期花瓣清洗干净后20℃-50℃低温干燥，粉碎至80-100目，获得蝴蝶兰粉末，将蝴蝶兰粉末和MRS液体培养基以料液比为1g:5-10mL的比例混合均匀，获得发酵底物；

步骤二、将双歧杆菌种子液(OD₆₀₀值约为5-6)接种到含有发酵底物的发酵罐中，接种量为1％-5％，控制温度在36.5℃-38.5℃，发酵罐转速100-200rpm，控制pH为5-6，发酵过程中通过通接种量为4％-6％的氮气保持厌氧环境，罐压为3×10⁵-4×10⁵Pa，厌氧发酵时长为36-48h；

步骤三、将发酵结束获得的发酵液利用高压匀浆机进行破碎处理，其中匀浆压力1200-1300MPa，破碎处理3-6个循环，破碎过程中控制温度不高于25℃；将高压匀浆处理后的匀浆液利用50-220nm膜进行过滤去除大分子蛋白和微生物，得到无菌滤液，低温储罐保藏使用，即为蝴蝶兰发酵液。

另一方面，本申请提供了一种如上述方法制备的兰花发酵液。

另一方面，本申请提供了一种组合物，所述组合物包括如上述的兰花发酵液；优选的，所述组合物还包括依克多因、透明质酸、三肽-1中的一种或多种；更优选的，所述透明质酸的分子量为5000-10000Da；更优选的，以质量百分比计，所述组合物包括：10％-20％兰花发酵液、5％-10％依克多因、5％-10％透明质酸、5％-10％三肽-1，余量为水。

更优选的，以质量百分比计，所述组合物包括：15％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、10％分子量为5000-10000Da的透明质酸、5％三肽-1，余量为水。

另一方面，本申请还提供了一种包含如上述的兰花发酵液或如上述的组合物的化妆品，所述化妆品的剂型选自乳剂、水剂、油剂、凝胶中的一种。

另一方面，本申请还提供了如上述的兰花发酵液或如上述的组合物或如上述的化妆品在抗氧化、抗衰老和/或美白中的应用。

本发明具有如下有益效果：

1、本申请中首次采用双歧杆菌(长双歧杆菌长亚种CICC24935)发酵蝴蝶兰，获得了蝴蝶兰发酵液，该发酵液中富含多种抗氧化活性物质，并且还含有双歧杆菌经破碎处理后逸出的二裂酵母(双歧杆菌)胞溶物以及经发酵产生的多种活性物质，总酚含量和β-葡聚糖含量高，具有优异的抗氧化性能；

2、本申请中还提供了包含上述蝴蝶兰发酵液的组合物，该组合物体系稳定，见光不易变色，能够长期保存，还具有优异的抗氧化性能和抗老性能，且安全无刺激，能够广泛适应用于化妆品产品的制备和生产中。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

其中，MRS培养基购自北京索莱宝科技有限公司；长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CICC24935和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CICC6208，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；依克多因、透明质酸、三肽-1、购自武汉多普乐生物医药有限公司；洋甘菊萃取物购自上海卓鼎生物技术有限公司。

如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

MRS固体培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH 6.8。

MRS液体培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O0.05g，CaCO₃ 20.0g，蒸馏水1.0L，pH 6.8。

下述蝴蝶兰具体为斑叶蝴蝶兰，购自山东省农业科学院休闲农业研究所。

实施例1蝴蝶兰生长周期与抗氧化能力的关系

目前兰花提取物广泛应用于化妆品领域，多种兰花已被证明具有抗氧化的能力。本申请中以蝴蝶兰为研究对象，探究其具体的抗氧化效果。

具体试验过程包括：将不同生长时期的蝴蝶兰材料清洗干净后，称取蝴蝶兰材料0.1g，加入20mmol/L KH₂PO₄ 5mL，于研钵中研磨成匀浆，10000r/min离心10min，收集上清液。以超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)为抗氧化性能代表指标对上述上清液进行检测。SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法，POD活性测定采用愈创木酚比色法，CAT活性测定采用紫外吸收法，测试结果如表1所示。

表1

如表1结果所示，蝴蝶兰盛开期花瓣和衰老期花瓣中SOD、POD、CAT含量较高，即可以认为其抗氧化能力较好。

实施例2蝴蝶兰发酵实验

在实施例1的优选条件下，本申请对蝴蝶兰进行不同菌种的发酵实验，以期获得具有优良性能的化妆品材料。

具体试验过程包括：将蝴蝶兰材料清洗干净后20℃-50℃低温干燥，粉碎至80-100目，获得蝴蝶兰粉末，将蝴蝶兰粉末和MRS液体培养基以料液比为1g:5-10mL的比例混合均匀，获得发酵底物。采用不同菌种在不同条件下进行厌氧发酵，发酵过程中通过通接种量为4％-6％的氮气保持厌氧环境，罐压为3×10⁵-4×10⁵Pa，完成发酵后测定发酵液中的SOD含量，SOD活性测定方法同实施例1，具体发酵条件和发酵结果如表2所示。利用行业通用的特征显色比色法测定总酚含量，利用苯胺蓝显色法测定β-葡聚糖含量。

表2

如表2结果所示，蝴蝶兰盛开期花瓣经双歧杆菌发酵后能够产生更多的有效物质。

采用双歧杆菌，尤其是长双歧杆菌长亚种CICC24935对蝴蝶兰盛开期花瓣进行发酵有助于植物材料中SOD的析出，进而提升发酵液中的SOD含量，并且发酵过程中还产生了更多的酚类物质和多糖物质(如β-葡聚糖)。已有研究表明，兰科植物中酚类物质也与抗氧化活性相关，而兰科植物中的植物多糖则具有丰富的生物活性，使其具有保湿、防紫外线损伤、治疗痤疮、延缓衰老及美白等功能。

实施例3

步骤一、将蝴蝶兰盛开期花瓣清洗干净后20℃-50℃低温干燥，粉碎至90目，获得蝴蝶兰粉末，将蝴蝶兰粉末和MRS液体培养基以料液比为1g:6mL的比例混合均匀，获得发酵底物；

步骤二、将双歧杆菌种子液(OD₆₀₀值约为5.5)接种到含有发酵底物的发酵罐中，接种量为4％，控制温度在37.5℃，发酵罐转速150rpm，控制pH值为5，发酵过程中通过通5％接种量的氮气保持厌氧环境，罐压3.530×10⁵Pa，厌氧发酵时长为36h；

步骤三、将发酵结束获得的发酵液利用高压匀浆机进行破碎处理，其中匀浆压力1300MPa，破碎处理6个循环，破碎过程中控制温度不高于25℃；将高压匀浆处理后的匀浆液利用50-220nm膜进行过滤去除大分子蛋白和微生物，得到无菌滤液，低温储罐保藏使用，即为蝴蝶兰发酵液。

双歧杆菌种子液的培养方法：将长双歧杆菌长亚种CICC24935接种于MRS固体培养基中，温度为37℃、转速为200rpm、pH为6.8，大约培养24h，培养至OD₆₀₀值为5.5。

本实施例中所得的蝴蝶兰发酵液中富含抗氧化活性物质，并且还含有双歧杆菌经破碎处理后逸出的二裂酵母(双歧杆菌)胞溶物以及经发酵产生的多种活性物质。

实施例4稳定性试验和功效试验

本实施例中采用实施例3中方法获得的蝴蝶兰发酵液作为样品进行实验。实验过程中发现，虽然蝴蝶兰发酵液具有优异的抗氧化活性，但是其稳定性较差且在测试过程中呈现较高的致敏性。

为改善上述问题，本实施例中对蝴蝶兰发酵液进行了复配，获得如下组合物。

组合物1：15％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、10％透明质酸(5000-10000da)、5％三肽-1，余量为水。

组合物2：15％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、10％透明质酸(10000-15000Da)、5％三肽-1，余量为水。

组合物3：15％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、5％三肽-1，余量为水。

组合物4：15％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、10％透明质酸(5000-10000Da)，余量为水。

组合物5：组合物1：15％蝴蝶兰发酵液、10％透明质酸(5000-10000da)、5％三肽-1，余量为水。

组合物6：组合物1：20％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、10％透明质酸(5000-10000Da)、5％三肽-1，余量为水。

组合物7：15％蝴蝶兰发酵液、5％依克多因、10％透明质酸(5000-10000Da)、5％三肽-1，余量为水。

组合物8：15％蝴蝶兰发酵液、10％依克多因、10％透明质酸(5000-10000Da)、5％洋甘菊萃取物，余量为水。

对比例：15％兰花提取物、5％二裂酵母胞溶物、10％依克多因、10％透明质酸(5000-10000Da)、5％三肽-1，余量为水。

空白对照组：100％蝴蝶兰发酵液。

稳定性试验

本实施例中发现蝴蝶兰发酵液具有稳定性差的问题，具体体现在经光照后发酵液容易变色析出。因此本实施例中采用上述组合物进行稳定性实验，分别对每组组合物各进行每日8h光照处理，持续一周，一周后观察每组组合物的稳定性情况，具体观察结果如表3所示。

表3

如表3结果所示，特定分子量的透明质酸有助于增加组合物体系稳定性，且使得光照不容易变色。本实施例中组合物1展现了良好的体系稳定性，见光不易变色且未发现分层情况，能够在阳光下长时间保存，利于产品制作。

功效试验

本实施例中采用上述组合物进行功效性能实验，具体包括：

本实施例中使用上述组合物作为受试物进行斑贴试验，选用符合受试者志愿入选标准的30人作为受试者，其中男15人，女15人，年龄20至59岁，平均年龄45.32±1.03岁。

具体测试方法为选用合格的斑试器材，以封闭性斑贴试验方法，将受试物约0.020g-0.025g受试物置于斑试器内，外用低致敏胶带贴敷于受试者前臂内侧，24h后去除受试物，于去除后0.5h观察皮肤反应，按现行有效的技术规范中皮肤反应分级标准记录其结果，具体标准内容见表4，所得结果见表5。

现行有效的技术规范中皮肤反应分级标准：《化妆品安全技术规范》/(2015年版)第七章2人体斑贴试验(国家食品药品监督管理总局)。

表4皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

表5化妆品人体皮肤斑贴试验结果汇总

由表5中结果可知，以组合物1为受试物时，30例受试者均无不良反应，证明本申请提供的组合物1安全无刺激。

本实施例中，采用实施例1中方法测定上述组合物中的SOD、POD、CAT含量，每组重复测量三次，测量结果取平均值，测定结果如表5所示。

表5

如表5结果可见，本实施例组合物1相比现有的产品含有更多的抗氧化成分，具有更加优异的抗氧化性能。

本实施例中还通过紫外线诱导人皮肤成纤维细胞的体外早衰模型，并检测细胞外基质中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)含量，评估组合物1的抗衰老作用，所得结果见表6。

表6

如表6所示，本实施例中证明了组合物1具有优异的抗衰老效果。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims

1.一种兰花发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵的条件包括：温度为36.5℃-38.5℃，转速为100-200rpm，pH值为5-6，罐压为3×10⁵-4×10⁵Pa，时间为36-48h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述兰花为蝴蝶兰；优选的，所述兰花为盛开期蝴蝶兰的花瓣。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述兰花粉末的目数为80-100目；和/或，

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述兰花发酵液于1200-1300MPa进行高压匀浆破碎处理，破碎处理完成后进行过滤；优选的，所述破碎处理的温度不高于25℃；更优选的，所述破碎处理的温度为4℃-25℃。

6.一种如权利要求1-5任一所述方法制备的兰花发酵液。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-5任一所述的兰花发酵液；优选的，所述组合物还包括依克多因、透明质酸、三肽-1中的一种或多种；更优选的，所述透明质酸的分子量为5000-10000Da；更优选的，以质量百分比计，所述组合物包括：10％-20％兰花发酵液、5％-10％依克多因、5％-10％透明质酸、5％-10％三肽-1，余量为水。

8.一种包含如权利要求6所述的兰花发酵液或如权利要求7所述的组合物的化妆品，其特征在于，所述化妆品的剂型选自乳剂、水剂、油剂、凝胶中的一种。

9.如权利要求6所述的兰花发酵液或如权利要求7所述的组合物或如权利要求8所述的化妆品在抗氧化、抗衰老和/或美白中的应用。