CN117004698A - 双端测序方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种双端测序方法，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有引物的测序芯片中进行扩增，对第一待测模板链进行SBS测序；然后延伸合成获得第二待测模板链；在所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP，然后将所述第二活性基团与位于所述测序芯片表面的第一活性基团进行点击反应，对第二待测模板链进行SBS测序。本发明的双端测序方法，直接在第一待测模板链测序后扩增延伸第二待测模板链，并将第二待测模板链通过化学键固定于固相表面的进行测序，从而简化了生成固定于固相表面的第二待测模板链的流程，减轻了对芯片基材及DNA的损伤，同时能够降低扩增测序成本。
Description
技术领域
本发明属于核酸测序技术领域，特别是涉及一种双端测序方法和试剂盒。
背景技术
近年来核酸测序技术发展迅速，主要有第一代测序技术、第二代测序技术和第三代测序技术，而第四代测序技术也在近几年快速发展。核酸测序技术也逐渐变得更加高通量、低成本及多功能。但目前第二代测序技术在全球测序市场仍占有主要地位。第二代测序技术也称为新一代测序技术NGS，基于大规模平行测序技术(massive parallel analysis，MPS)，业内通常称之为高通量测序技术。它能同时完成测序模板互补链的合成和序列信息的获取。相比第一代测序技术，其成本花费更低，一次检测的量更多，测序周期更短。
目前第二代高通量测序中常用的多核苷酸测序方法包括边合成边测序方法(sequencing by synthesis，SBS)；其主要结合了DNA杂交、聚合酶链式反应等原理和技术，通过涉及引物将待测多核苷酸进行多拷贝，获得待测模板，待测模板链上有特定引物杂交位点，对待测模板处理后杂交上特定引物，通过添加荧光标记的核苷酸后，在聚合酶作用下特定引物3’端得以延伸上与模板链互补的核苷酸，核苷酸3’端同时可做特定阻断基团修饰以使得一次只能延伸一个核苷酸，在确定所延伸核苷酸种类后，再去除其3’端阻断基团和荧光标记基团，得以重新活化并可继续延伸下一个核苷酸，如此循环即可现实对待测链模板链的序列的读取。
双端测序(paired-end)是高通量测序的重要技术之一。是一种对待测核酸链的正链和反向互补链分别进行测序的技术，如专利US10457985B2、WO2008041002、US20060292611、W006135342、W003074734、US20060024681、US7754429B2等都阐述了相关双端测序方法。其中都借助了固相表面扩增的方法来实现，比如桥式扩增就是一种固相表面扩增方法，该方法是在固相表面上固定两种引物，待测多核苷酸则通过表面上固定的引物进行扩增获得待测多核苷酸分子群或簇(cluster)。该簇最终都是共价固定于固相表面的，且能作为测序模板进行SBS测序。
专利CN101663405A中阐述了几种实现双端测序的方法，其方法是在固体支持物表面固定两种带有互不相同酶切位点的引物，通过桥式扩增在固体支持物上获得第一模板链和第二模板链，所述第一模板链和第二模板链都是通过5’端固定于表面的，选择性切除第二模板链留下第一模板链，且第一模板链可与固相表面固定的引物杂交，对第一模板链进行测序后，需要对表面被切除过的引物修复至再具备延伸活性，然后通过修复后的表面引物再次扩增重新获得第二模板链；选择性去除第一模板链后即可进行第二模板链的测序。但是上述双端测序方法存在的缺点在于：其生成第二模板链的流程复杂，不仅需要对表面被切除过的引物修复至再具备延伸活性，而且需要再次扩增多次循环，才能构建第二模板链进行测序；其中的扩增循环中所用的变性试剂一般为碱或者甲酰胺等破坏性强的试剂，该类试剂的多次使用不但影响测序芯片基材导致表面材料的脱落，而且还会损伤DNA，影响测序结果的准确度。
发明内容
基于此，本发明提供了一种双端测序方法，能简化测序流程，并保证测序结果的准确度，减少了扩增处理中强破坏性试剂的使用，同时能够降低扩增测序成本。
本发明的第一方面，是提供了一种双端测序方法，包括以下步骤：
S1，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有固定引物的测序芯片中进行扩增，得到固定于测序芯片表面的待测多核苷酸双链；所述测序芯片表面修饰有第一活性基团，且所述固定引物包括具有互不相同的酶切位点的P5引物和P7引物；
S2，选择性切除待测多核苷酸双链中的所述P5引物延伸的第二待测模板链，留下的所述P7引物延伸的第一待测模板链，然后对第一待测模板链进行第一次测序；
S3，以所述第一待测模板链为模板，复制合成出与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链；
S4，在步骤S3中合成的所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP；将所述第二活性基团与所述第一活性基团进行点击反应，使所述第二待测模板链固定于所述测序芯片表面上；选择性切除所述第一待测模板链，然后对第二待测模板链进行第二次测序。
在其中一些实施例中，步骤S2中，所述第一次测序包括：采用SP1引物对第一待测模板链进行第一次SBS测序，并得到测序链；
步骤S3中包括：以所述第一待测模板链为模板，在所述测序链上进行延伸合成延伸链，获得第二待测模板链，所述第二待测模板链依次由SP1引物、测序链和延伸链组成。
本发明的第二方面，是提供了一种双端测序用试剂盒，包括：
测序芯片，其表面修饰有第一活性基团，且所述测序芯片表面固定有互不相同的酶切位点P5引物和P7引物；
末端修饰试剂，包括TDT末端转移酶和第二活性基团修饰的dNTP，所述TDT末端转移酶用于所述第二活性基团修饰的dNTP的转移，所述第二活性基团用于与所述第一活性基团产生点击反应形成化学链。
现有技术中的双端测序方法，对第一模板链进行测序后，需要对表面被切除过的引物修复至再具备延伸活性，然后通过修复后的表面引物再次扩增重新获得固定在固相表面的第二模板链，才能进行第一模板链的测序。为克服生成固定在固相表面的第二模板链中需要进行修复接头和扩增循环等繁琐的流程的问题；本发明的一种双端测序方法，将第一待测模板链固定在固相表面进行测序，复制合成出未固定在固相表面的第二待测模板链，然后将第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP，通过第二活性基团与测序芯片表面修饰的第一活性基团进行点击反应形成链接，从而将所述第二待测模板链固定于测序芯片表面以进行测序。本发明提出了先复制合成出未固定在固相表面的第二待测模板链，再进行第二待测模板链的固定的测序方法，简化了利用扩增循环手段生成固定于固相表面的第二待测模板链的流程，也减去了修复接头的步骤，简化测序流程，也减少了扩增处理中强破坏性试剂的使用，同时能够降低扩增测序成本，保证测序结果的准确度。
进一步地，本发明在第一待测模板链测序完成后形成的测序链上继续进行延伸合成，得到与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链，即充分利用了测序链，避免使用强破坏性试剂去除测序链导致损伤DNA，从而影响测序结果的准确度，也减少了进一步在测序链上延伸合成的延伸链长度，提高了第二待测模板链的合成效率。
进一步地，本发明利用化学键将第二待测模板链固定在固相表面，并优选为点击反应形成的链接键，其反应条件简单易于控制，且反应有很强的立体选择性，反应快速、反应效率高，副产物无害，且产物对氧气和水不敏感，不会损害DNA，是理想的第二待测模板链通过化学键固定途径。
本发明的一种双端测序用试剂盒，测序流程简单，无需对表面接头修复，也无需在第二待测模板链生成中进行扩增循环，减少了扩增处理中变性试剂的使用，进而减轻了对芯片基材及DNA的损伤，具有较高的测序准确度。
附图说明
图1为本发明的一种双端测序方法中第一待测模板链和第二待测模板链的合成示意图。
图2为本发明的一种双端测序方法中第二待测模板链测序的示意图。
图3为本发明的实施例1中第一待测模板链和第二待测模板链测序相同轮测序的原始信号图；其中，图3的A为第一待测模板链，图3的B为第二待测模板链。
图4为本发明的实施例1中第一待测模板链和第二待测模板链测序信号的basecall分析图；其中，cycle1至cycle75为第一待测模板链75bp测序信号，cycle76至cycle150为第二待测模板链75bp测序信号；线A、C、G和T分别对应A、C、G和T碱基的荧光信号。
图5为本发明的实施例1中第一待测模板链和第二待测模板链的各轮碱基质量分数分布曲线图。
图6为本发明的实施例2中第一待测模板链和第二待测模板链测序相同轮测序的原始信号图；其中，图3的A为第一待测模板链，图3的B为第二待测模板链。
图7为本发明的实施例2中第一待测模板链和第二待测模板链测序信号的basecall分析图；其中，cycle1至cycle75为第一待测模板链75bp测序信号，cycle76至cycle150为第二待测模板链75bp测序信号；线A、C、G和T分别对应A、C、G和T碱基的荧光信号。
图8为本发明的实施例2中第一待测模板链和第二待测模板链的各轮碱基质量分数分布曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
一种双端测序方法，包括以下步骤：
S1，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有固定引物的测序芯片中进行扩增，得到固定于测序芯片表面的待测多核苷酸双链；所述测序芯片表面修饰有第一活性基团，且所述固定引物包括具有互不相同的酶切位点的P5引物和P7引物；
S2，选择性切除待测多核苷酸双链中的所述P5引物延伸的第二待测模板链，留下的所述P7引物延伸的第一待测模板链，然后对第一待测模板链进行第一次测序；
S3，以所述第一待测模板链为模板，复制合成出与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链；
S4，在步骤S3中合成的所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP；将所述第二活性基团与所述第一活性基团进行点击反应，使所述第二待测模板链固定于所述测序芯片表面上；选择性切除所述第一待测模板链，然后对第二待测模板链进行第二次测序。
其中，步骤S1中所述扩增的方式包括但不限于：桥式扩增、环介导的等温扩增、重组酶聚合酶扩增、模板步移扩增等扩增方式中的一种或两种以上组合，优选地，以下实施例中的扩增方式是桥式扩增。
在其中一些实施例中，步骤S2中，第一次测序包括：采用SP1引物对第一待测模板链进行第一次SBS测序，并得到测序链；
步骤S3中包括：以所述第一待测模板链为模板，在所述测序链上进行延伸合成延伸链，获得第二待测模板链，所述第二待测模板链依次由SP1引物、测序链和延伸链组成。
在其中一些实施例中，所述固定引物通过5’端共价固定于测序芯片的表面；和/或，
所述步骤S3中合成的所述第二待测模板链的5’端至3’端依次由SP1引物、测序链和延伸链组成，且所述第二待测模板链通过3’端固定到所述测序芯片表面。
在其中一些实施例中，所述选择性切除第二待测模板链包括：将所述P5引物的酶切位点进行酶切，然后变性洗脱，将与所述第一待测模板链互补杂交的第二待测模板链去除；和/或，
所述选择性切除所述第一待测模板链包括：将所述P7引物的酶切位点进行酶切，然后变性洗脱，将与所述第二待测模板链互补杂交的第一待测模板链去除。
在其中一些实施例中，步骤S4中，在所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP包括：向在步骤S3中合成的所述第二待测模板链加入末端转移酶和修饰第二活性基团的dNTP，使所述第二待测模板链的末端与所述修饰第二活性基团的dNTP连接。
在其中一些实施例中，所述点击反应包括叠氮-炔环加成反应或逆电子需求的Diels-Alder偶联反应。
在其中一些实施例中，所述修饰有第二活性基团的dNTP的结构式如式Ⅰ所示；
其中，所述R1选自叠氮基、1-甲基环丙烯基、C2-C4炔基或C2-C4烯基，Base为碱基。
在其中一些实施例中，所述修饰有第二活性基团的dNTP的结构式如式Ⅱ所示；
其中，所述R2选自1,2,4-三嗪基、1-甲基环丙烯基、反式环辛烯基、叠氮基、C2-C4炔基或C2-C4烯基；R3选自H、C1-C3烷基，Base为碱基。
在其中一些实施例中，所述第一活性基团选自叠氮基、C2-C4炔基、反式环辛烯基、1,2,4,5-四嗪基或1-甲基环丙烯基。
在其中一些实施例中，所述P5包括酶切位点ideoxyU；和/或，所述P7包括酶切位点i8oxodG。
在其中一些实施例中，P5的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；和/或，P7的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
在其中一些实施例中，所述SP1引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，
用于对第二待测模板链进行SBS测序的SP2引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的一种双端测序方法还包括另一种实施方式：
在步骤S2中，选择性切除待测多核苷酸双链中的P7引物延伸的第一待测模板链，留下的所述P5引物延伸的第二待测模板链，然后对第二待测模板链进行第一次测序；同理，后续步骤中，将上述双端测序方法中的第一待测模板链和第二待测模板链的处理顺序进行替换，从而依次实现第二待测模板链和第一待测模板链的测序。
一种双端测序用试剂盒，包括：
测序芯片，其表面修饰有第一活性基团，且所述测序芯片表面固定有互不相同的酶切位点P5引物和P7引物；
末端修饰试剂，包括TDT末端转移酶和第二活性基团修饰的dNTP，所述TDT末端转移酶用于所述第二活性基团修饰的dNTP的转移，所述第二活性基团用于与所述第一活性基团产生点击反应形成化学链以下为具体实施例。
实施例1
1、修饰P5、P7引物的测序芯片制备
1)获取经化学修饰有叠氮基团的测序芯片；
2)设计合成得到P5、P7引物，用3×SSC溶液将P5、P7两种引物配制成浓度各为5uM的引物溶液并通入芯片流动槽，至于55℃烘箱加热反应4小时，两种引物的5’端均带DBCO基团修饰，通过其5’端的DBCO基团与芯片表面的叠氮基团反应进而实现引物固定于芯片表面。其中，
P5引物的碱基序列(SEQ ID NO：1)：
5'-TTTTTTTTAA/ideoxyU/GATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’
P7引物的碱基序列(SEQ ID NO：2)：
5'-TTTTTTTTCAAGCAGAA/i8oxodG/ACGGCATACGAGAT-3’。
3)反应结束后用3×SSC溶液清洗各流道并备用；所获得的测序芯片即可用于后续扩增测序。
2、待测文库在测序芯片上扩增及第一链测序
2.1、实验材料
待测文库构建自大肠杆菌ATCC8739，文库片段长度为450bp，是通过购买市售建库试剂盒(诺唯赞VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V4，#ND610-1)建库获得。
用0.1M NaOH溶液变性待测双链文库后，使用3×SSC缓冲液配置成2pM上样液。
2.2、扩增和测序，如图1所示，步骤包括：
1)模板杂交
将测序芯片和变性后的2pM文库上样液装载到具有温控和微流体等模块的装置进行扩增，如salus pro系统(配套试剂盒)，反应中各试剂均可通过salus pro系统的微流体模块泵入至芯片并通过加热模块设置相应温度以进行反应；
文库(待测的双链模板多核苷酸)通过salus pro系统微流体模块加载到测序芯片上后，先与测序芯片表面固定的引物杂交，杂交完成后通入清洗试剂进行冲洗未杂交的模板。
2)延伸模板互补链
先向测序芯片泵入扩增清洗液，再泵入扩增延伸液(BST聚合酶与dNTP的混合液)，以表面引物进行延伸杂交上的文库模板链，实现将文库信息固定到固相测序芯片表面。
3)桥式扩增
对测序芯片的文库模板链进行等温桥式扩增：系统上设置扩增参数，芯片表面温度恒定为55℃，系统执行“泵入甲酰胺(变性)--泵入扩增清洗液(退火)--泵入扩增延伸液(延伸)”流程，重复30次进行扩增获得待测模板簇(桥式互补链)。
4)第一待测模板链线性化及封闭
线性化：泵入清洗液对测序芯片进行清洗，然后泵入用USER酶配制成的第一线性化试剂，37℃下反应30分钟，反应中USER酶识别并将表面P5引物中修饰的酶切位点ideoxyU切除，此时扩增簇双链中的P5延伸链(第二待测模板链)被切断，并在甲酰胺冲洗后，剩下P7延伸链(第一待测模板链)连接在测序芯片表面；
封闭：同时泵入末端转移酶(TDT)和ddNTP混合液，37℃反应30分钟，可以将表面未使用引物及第一待测模板链的3’末端封闭，防止测序中引入错误信号。
5)第一待测模板链SBS测序
测序引物SP1杂交：向测序芯片泵入甲酰胺洗脱后，随后泵入清洗液清洗，然后泵入测序引物SP1，55℃反应15分钟，杂交完成后泵入清洗液清洗。
SP1引物序列的碱基序列(SEQ ID NO：3)：
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
SBS测序：系统上设置测序读长参数，系统执行“泵入9N突变酶与荧光标记和3’带阻断的dNTP混合液(合成反应)--系统光学模块采集荧光信号(信号采集)--泵入切除试剂切除阻断基团及荧光基团(切除反应)”的流程，重复75次进行第一链测序，测序读长75bp。
3、第二待测模板链生成及测序
如图1和图2所示，步骤包括：
1)第二待测模板链延伸生成
在上述第一待测模板链SBS测序最后一轮完成切除后，泵入扩增清洗液，再泵入扩增延伸液(BST聚合酶与dNTP的混合液)，设置表面温度温度为55℃静置反应8分钟，此时原SP1测序引物生长的测序链得以继续延伸至最后一个碱基，即生成为第二待测模板链。
2)第二待测模板链固定于测序芯片表面
末端引入丁炔基修饰dNTP：当第二待测模板链延伸完成后，泵入末端转移酶(TDT)和3’端带丁炔基修饰的dNTP混合液，37℃反应30min后泵入清洗液，此时的第二待测模板链的3’端为一个带丁炔修饰的dNTP，其结构式如式Ⅲ所示：
第二待测模板链与表面的固定：泵入Cu(I)催化剂，60℃反应60分钟，此时在Cu(I)催化下，上述步骤2)引入的dNTP中的炔基与表面的叠氮基发生环加成(叠氮-炔环加成反应)，从而实现将所生成的第二链3’端固定于测序芯片表面。其中，带丁炔修饰的dNTP结构及与表面的反应式为：
4)第二待测模板链性化
泵入清洗液进行清洗芯片后，泵入用FPG酶配制成的第二线性化试剂，37℃下反应30分钟，反应中FPG酶识别并将表面P7引物中修饰的酶切位点i8oxodG切除，此时扩增簇双链中的P7延伸链(第一待测模板链)被切断，泵入甲酰胺冲洗后，剩下新生成的第二待测模板链连接芯片表面。
5)第二待测模板链SBS测序
测序引物SP2杂交：泵入甲酰胺洗脱，随后泵入清洗液清洗，然后泵入测序引物SP2，55℃反应15分钟，杂交完成后泵入清洗液清洗；
SP2引物序列的碱基序列(SEQ ID NO：4)：
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
SBS测序：系统上设置测序读长参数，系统执行“泵入9N突变酶与荧光标记和3’带阻断的dNTP混合液(合成反应)--系统光学模块采集荧光信号(信号采集)--泵入切除试剂切除阻断基团及荧光基团(切除反应)”的流程，重复75次进行第二链测序,测序读长75bp。
实施例2
1、修饰P5、P7引物的测序芯片制备
1)获取经化学修饰有反式环辛烯(TCO)的测序芯片；
2)用3×SSC溶液将P5、P7两种引物配制成浓度各为5uM的引物溶液并通入芯片流动槽，至于60℃烘箱加热反应1小时，两种引物的5’端均修饰有1,2,4-三嗪修饰，通过其5’端的1,2,4-三嗪修饰与芯片表面的反式环辛烯(TCO)反应进而实现引物固定于芯片表面。
3)反应结束后用3×SSC溶液清洗各流道并备用；所获得的测序芯片即可用于后续扩增测序。
其中P5引物和P7引物与实施例1相同。
2、待测文库在测序芯片上扩增及第一链测序
具体步骤与实施例1对应步骤相同。
3、第二待测模板链生成及测序
如图1和图2所示，步骤包括：
1)第二待测模板链延伸生成
在上述第一待测模板链SBS测序最后一轮完成切除后，泵入扩增清洗液，再泵入扩增延伸液(BST聚合酶与dNTP的混合液)，设置表面温度温度为55℃静置反应8分钟，此时原SP1测序引物生长的测序链得以继续延伸至最后一个碱基，即生成为第二待测模板链。
2)第二待测模板链固定于测序芯片表面
末端引入1,2,4-三嗪修饰dNTP：当第二待测模板链延伸完成后，泵入末端转移酶(TDT)和3’端带1,2,4-三嗪修饰的dNTP混合液，37℃反应30min后泵入清洗液，此时的第二待测模板链的3’端为一个带1,2,4-三嗪修饰的dNTP，其结构式如式Ⅳ所示：
第二待测模板链与表面的固定：设置反应条件60℃反应60分钟，上述步骤2)引入的dNTP中的1,2,4-三嗪与表面的反式环辛烯(TCO)发生逆电子需求的Diels-Alder偶联反应，从而实现将所生成的第二待测模板链的3’端固定于测序芯片表面。其中，带1,2,4-三嗪修饰的dNTP结构及与表面的反应式为：
4)第二待测模板链线性化
泵入清洗液进行清洗芯片后，泵入用FPG酶配制成的第二线性化试剂，37℃下反应30分钟，反应中FPG酶识别并将表面P7引物中修饰的酶切位点i8oxodG切除，此时扩增簇双链中的P7延伸链(第一待测模板链)被切断，泵入甲酰胺冲洗后，剩下新生成的第二待测模板链连接芯片表面。
5)第二待测模板链SBS测序
测序引物SP2杂交：泵入甲酰胺洗脱，随后泵入清洗液清洗，然后泵入测序引物SP2，55℃反应15分钟，杂交完成后泵入清洗液清洗；
SP2引物序列的碱基序列(SEQ ID NO：4)：
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
SBS测序：系统上设置测序读长参数，系统执行“泵入9N突变酶与荧光标记和3’带阻断的dNTP混合液(合成反应)--系统光学模块采集荧光信号(信号采集)--泵入切除试剂切除阻断基团及荧光基团(切除反应)”的流程，重复75次进行第二链测序,测序读长75bp。
实施例3
本实施例与实施例1的不同点在于：
所述测序芯片采用乙炔基修饰的测序芯片；
所述第二待测模板链末端引入叠氮基修饰dNTP，步骤包括：当第二待测模板链延伸完成后，泵入末端转移酶(TDT)和3’端带叠氮基修饰的dNTP混合液，37℃反应30min后泵入清洗液，此时的第二待测模板链的3’端为一个叠氮基修饰的dNTP，其结构式如式Ⅴ所示：
第二待测模板链与表面的固定：泵入Cu(I)催化剂，60℃反应60分钟，此时在Cu(I)催化下，上述步骤2)引入的dNTP中的炔基与表面的叠氮基发生环加成(叠氮-炔环加成反应)，从而实现将所生成的第二链3’端固定于测序芯片表面。其中，带丁炔修饰的dNTP结构及与表面反应式为：
实施例4
本实施例与实施例2的不同点在于：
所述测序芯片采用1,2,4,5-四嗪衍生物修饰的测序芯片；
所述第二待测模板链末端引入1-甲基环丙烯修饰dNTP，步骤包括：当第二待测模板链延伸完成后，泵入末端转移酶(TDT)和3’端带1-甲基环丙烯修饰的dNTP混合液，37℃反应30min后泵入清洗液，此时的第二待测模板链的3’端为一个1-甲基环丙烯修饰的dNTP，其结构式如式Ⅵ所示：
第二待测模板链与表面的固定：设置反应条件60℃反应60分钟，上述步骤2)引入的dNTP中的1-甲基环丙烯与表面的1,2,4,5-四嗪衍生物发生逆电子需求的Diels-Alder偶联反应，从而实现将所生成的第二待测模板链的3’端固定于测序芯片表面。其中，1-甲基环丙烯修饰的dNTP结构及与表面的反应式为：
性能测试
1、测序的准确度实验
将实施例1和实施例2中第一待测模板链SBS测序和第二待测模板链SBS测序所采集到的原始图像用salus Pro系统自带NGS软件进行碱基识别(basecall)，最后获得第一待测模板链测序(Read1)和第二待测模板链测序(Read2)的簇数量(TotalReads)以及碱基质量分数，结果如表1和图3～8所示。
表1第一链和第二链测序结果统计
从图3～5和表1可以看出，本发明的实施例1的双端测序方法中第一待测模板链和第二待测模板链在SBS测序中原始信号的簇形态一致、均一性高(图3)。同时第一待测模板链和第二待测模板链各轮的测序信号相近，其信号值都满足碱基识别的需求(图4)；此外，第一待测模板链和第二待测模板链的碱基质量分数变化趋势一致，且碱基质量分数也相近(图5)；两条链的各碱基含量较接近，Q30百分比分别约为86.8％和86.4％，具有较高的测序的质量，其测序的准确度高
从图6～8和表1可以看出，本发明的实施例2的双端测序方法中第一待测模板链和第二待测模板链在SBS测序中原始信号的簇形态一致、均一性高(图6)。同时第一待测模板链和第二待测模板链各轮的测序信号相近，其信号值都满足碱基识别的需求(图7)；此外，第一待测模板链和第二待测模板链的碱基质量分数变化趋势一致，且碱基质量分数也相近(图8)；两条链的各碱基含量较接近，Q30百分比分别约为86.2％和85.7％，具有较高的测序的质量，其测序的准确度高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种双端测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将待测的双链模板多核苷酸加载于表面固定有固定引物的测序芯片中进行扩增，得到固定于测序芯片表面的待测多核苷酸双链；所述测序芯片表面修饰有第一活性基团，且所述固定引物包括具有互不相同的酶切位点的P5引物和P7引物；
S2，选择性切除待测多核苷酸双链中的所述P5引物延伸的第二待测模板链，留下的所述P7引物延伸的第一待测模板链，然后对第一待测模板链进行第一次测序；
S3，以所述第一待测模板链为模板，复制合成出与所述第一待测模板链互补的第二待测模板链；
S4，在步骤S3中合成的所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP；将所述第二活性基团与所述第一活性基团进行点击反应，使所述第二待测模板链固定于所述测序芯片表面上；选择性切除所述第一待测模板链，然后对第二待测模板链进行第二次测序。
2.根据权利要求1所述的双端测序方法，其特征在于，步骤S2中，所述第一次测序包括：采用SP1引物对第一待测模板链进行第一次SBS测序，并得到测序链；
步骤S3中包括：以所述第一待测模板链为模板，在所述测序链上进行延伸合成延伸链，获得第二待测模板链，所述第二待测模板链依次由SP1引物、测序链和延伸链组成。
3.根据权利要求2所述的双端测序方法，其特征在于，所述固定引物通过5’端共价固定于测序芯片的表面；和/或，
所述步骤S3中合成的所述第二待测模板链的5’端至3’端依次由SP1引物、测序链和延伸链组成，且所述第二待测模板链通过3’端固定到所述测序芯片表面。
4.根据权利要求1所述的双端测序方法，其特征在于，所述选择性切除第二待测模板链包括：将所述P5引物的酶切位点进行酶切，然后变性洗脱，将与所述第一待测模板链互补杂交的第二待测模板链去除；和/或，
所述选择性切除所述第一待测模板链包括：将所述P7引物的酶切位点进行酶切，然后变性洗脱，将与所述第二待测模板链互补杂交的第一待测模板链去除。
5.根据权利要求1所述的双端测序方法，其特征在于，步骤S4中，在所述第二待测模板链的末端连接修饰有第二活性基团的dNTP包括：向在步骤S3中合成的所述第二待测模板链加入末端转移酶和修饰第二活性基团的dNTP，使所述第二待测模板链的末端与所述修饰第二活性基团的dNTP连接。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的双端测序方法，其特征在于，所述点击反应包括叠氮-炔环加成反应或逆电子需求的Diels-Alder偶联反应。
7.根据权利要求6所述的双端测序方法，其特征在于，所述修饰有第二活性基团的dNTP的结构式如式Ⅰ所示；
其中，所述R1选自叠氮基、1-甲基环丙烯基、C2-C4炔基或C2-C4烯基，Base为碱基。
8.根据权利要求6所述的双端测序方法，其特征在于，所述修饰有第二活性基团的dNTP的结构式如式Ⅱ所示；
其中，所述R2选自1,2,4-三嗪基、1-甲基环丙烯基、反式环辛烯基、叠氮基、C2-C4炔基或C2-C4烯基；R3选自H、C1-C3烷基，Base为碱基。
9.根据权利要求6所述的双端测序方法，其特征在于，所述第一活性基团选自叠氮基、C2-C4炔基、反式环辛烯基、1,2,4,5-四嗪基或1-甲基环丙烯基。
10.根据权利要求1所述的双端测序方法，其特征在于，所述P5包括酶切位点ideoxyU；和/或，所述P7包括酶切位点i8oxodG。
11.一种双端测序用试剂盒，其特征在于，包括：
测序芯片，其表面修饰有第一活性基团，且所述测序芯片表面固定有互不相同的酶切位点P5引物和P7引物；
末端修饰试剂，包括TDT末端转移酶和第二活性基团修饰的dNTP，所述TDT末端转移酶用于所述第二活性基团修饰的dNTP的转移，所述第二活性基团用于与所述第一活性基团产生点击反应形成化学链。
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