CN117003848A - 猫主要过敏原蛋白表达、纯化和组合应用 - Google Patents

猫主要过敏原蛋白表达、纯化和组合应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种猫主要过敏原蛋白表达、纯化和组合应用，通过查找并合成含目的蛋白的过敏原Feld1、Feld4及Feld7蛋白的诱导表达，得到大量表达和纯化的Feld1、Feld4蛋白及Feld7；将纯化蛋白Feld1、Feld4及Feld7组合配苗进行蛋鸡免疫，获取鸡蛋制备卵黄抗体制剂喂养宠物猫，旨在降低猫过敏原的分泌，从而降低人群对猫的过敏反应。本申请用过敏原重组蛋白免疫蛋鸡制备的卵黄抗体拌料喂养猫后，结果显示喂养后比喂养前过敏原减低50％。本发明卵黄抗体使用方法由注射途径变为方便操作的饲喂途径，同时有效降低宠物猫身上的过敏原，为广大爱猫人士带来了极大的福祉。

Description

猫主要过敏原蛋白表达、纯化和组合应用
技术领域
本申请涉及生物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种猫主要过敏原蛋白表达、纯化及组合应用，尤其是涉及到组合物在降低猫过敏原方面的应用。
背景技术
在欧洲和美国，动物过敏的发生频率在过去几十年里一直在上升，这是不可否认的。根据Heinzerling等人2009年对来自14个欧洲国家17个中心的3034名患者进行的一项大型研究，猫类过敏原皮肤点刺试验(SPT)阳性的平均频率为26.3％。猫是世界上最受欢迎和最常见的宠物之一，也是室内过敏原的重要来源。因此，对猫过敏是普遍存在的，在西方人群中发生率为10％-30％。人类IgE识别出的家养猫(Feld)过敏原总数为10种。Feld1、Feld4和Feld7被认为是猫的主要过敏原。Feld1分子量约35-38kDa，它由两个相同的异质二聚体组成，每个18-19kDa，非共价连接，最终形成四聚体。每个二聚体由两条多肽链，链1和链2组成，由三个二硫键共价连接，由两个不同的基因编码。事实上，94％的对猫过敏的患者都有对Feld1特异的IgE。Feld1在皮脂腺、唾液腺、泪腺和肛门腺中产生，存在于唾液、眼泪、皮肤和皮毛中。Feld4脂质运载蛋白，主要存在皮毛，上皮组织和唾液中，据报道指出：Feld4引起的过敏为61-63％，是Feld1之外的另一大过敏原。Fel d 7，一个17.5kDa的脂质运载蛋白。这些过敏原主要分布在猫的的皮屑、唾液、毛发、血清以及尿液中。过敏原主要通过空气从猫传播到环境中，如果被人吸入，可能导致过敏和诱发猫过敏。同时过敏是欧洲和美国最常见的慢性疾病，通常表现为鼻炎、结膜炎和哮喘等慢性疾病，极大影响爱猫人士生活。
目前治疗猫狗过敏的主要方法是过敏原特异性免疫疗法(SIT)。然而，SIT与猫过敏原提取物受到严重副作用的限制，在使用猫过敏原提取物进行特异性免疫治疗的患者中，有41％的患者出现了严重的副作用。因此，有必要提出新的免疫治疗方法，处理猫过敏症状。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种猫主要过敏原蛋白表达、纯化及组合应用，尤其是涉及到组合物在降低猫过敏原方面的应用，以解决目前的问题。
为了实现上述目的，本申请提供了如下技术：
本申请一方面，提出一种猫主要过敏原蛋白表达方法，包括如下步骤：
过敏原蛋白质序列的获取；
通过NCBI查找Feld1、Feld4及Feld7蛋白质序列，，其中Feld1的两个亚单位用GGGGSG连接起来，结果如下：
Feld1:EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLCGGGGGSGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR；
Feld4:HEEENVVRSNIDISKISGEWYSILLASDVKEKIEENGSMRVFVEHIKALDNSSLSFVFHTKENGKCTEIFLVADKTKDGVYTVVYDGYNVFSIVETVYDEYILLHLLNFDKTRPFQLVEFYAREPDVSQKLKEKFVKYCQEHGIVNILDLTEVDRCLQARGSEVAQDSSVE；
Feld7:EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLCGMKALLLAVGLSLITVLQAQDPPASGEDTMAMSGKWYLKAMITDRETSWKKPELVTPMTLTVLEGGNLKAETTLLTNGQCKEVELILEKTSEPKKYTTYGGKRVVYIEPTEVKDHYIFYCEGEMQGEQARMAKLVGRDPESNEEALENFREFLRAKGFNQEIFSPKQSGHGRNPCPPDLGSPLPSCRPPLPRLLPHPSPVPT。
含目的蛋白的质粒BL21细菌的原核诱导表达。
目的蛋白293T细胞真核表达。
Feld1、Feld4及Feld7蛋白的大量表达和纯化。
纯化Feld1、Feld4及Feld7蛋白组合配苗，纯化鉴定好的蛋白按照不同的配比组合配苗。
基于过敏原蛋白进行卵黄抗体的制备方法。
猫主要过敏原Feld1、Feld4及Feld7蛋白表达和纯化。
猫主要过敏原Feld1、Feld4及Feld7在猫中降低过敏原方面的应用。
与现有技术相比较，本申请能够带来如下技术效果：
1、本申请通过查找并合成含目的蛋白的过敏原Feld1和Feld4及Feld7蛋白的诱导表达，得到大量表达和纯化的Feld1和Feld4及Feld7蛋白；将纯化蛋白Feld1和Feld4及Feld7组合配苗进行配苗使用，旨在降低过敏原的分泌，从而降低人群对猫的过敏反应。
2、基于本申请卵黄抗体制剂的使用，用过敏原重组蛋白疫苗免疫蛋鸡获取鸡蛋制备卵黄抗体制剂拌料喂养猫后，采集喂养前和喂养后的唾液中的样本，使用夹心Elisa方法进行检测，结果显示比喂养前过敏原减低50％。
3、本发明卵黄抗体制剂免疫途径由注射途径变为方便操作的饲喂途径，同时有效降低宠物猫身上的过敏原，为广大爱猫人士带来了极大的福祉。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本实施例中，所选用的优选培养菌或者缓冲剂等，仅仅是一种优选实施方案，在同等试验条件下，可以采用同族或者同性质的物质(如生化剂)进行代替。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。
本实施例提供一种猫主要过敏原蛋白表达、纯化及组合应用，该方法制备得到Feld1、Feld4及Feld7蛋白，经组合使用后能够用于减少猫过敏疾病。
实施例1
本申请一方面，提出一种猫主要过敏原蛋白表达方法，包括如下步骤：
过敏原蛋白质序列的获取；
通过NCBI查找Feld1、Feld4及Feld7蛋白质序列，其中Feld1的两个亚单位用GGGGSG连接起，结果如下：
Feld1:EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLCGGGGGSGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR；
Feld4:HEEENVVRSNIDISKISGEWYSILLASDVKEKIEENGSMRVFVEHIKALDNSSLSFVFHTKENGKCTEIFLVADKTKDGVYTVVYDGYNVFSIVETVYDEYILLHLLNFDKTRPFQLVEFYAREPDVSQKLKEKFVKYCQEHGIVNILDLTEVDRCLQARGSEVAQDSSVE；
Feld7:EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLCGMKALLLAVGLSLITVLQAQDPPASGEDTMAMSGKWYLKAMITDRETSWKKPELVTPMTLTVLEGGNLKAETTLLTNGQCKEVELILEKTSEPKKYTTYGGKRVVYIEPTEVKDHYIFYCEGEMQGEQARMAKLVGRDPESNEEALENFREFLRAKGFNQEIFSPKQSGHGRNPCPPDLGSPLPSCRPPLPRLLPHPSPVPT。
接下来进行猫主要过敏原Feld1、Feld4及Feld7原核、真核表达和纯化。
实施例2
含目的蛋白的质粒BL21细菌的原核诱导表达：
首先，制备含所述目的蛋白的过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品。
本实施例，采用BL21细菌作为感受态细菌，以进行含目的蛋白质粒的BL21细菌的诱导表达。诱导表达后，通过SDS-PAGE电泳检测分析蛋白的表达水平，检测蛋白表达的水平，符合预设值则停止表达。
作为本申请的一种可选实施方案，可选地，制备含所述目的蛋白的过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品，并检测样品中蛋白的表达水平，包括：
S20、预置感受态细菌；作为本申请的一种可选实施方案，可选地，所述感受态细菌优选BL21细菌。BL21细菌为本实施例的一种优选感受态菌，在实验允许条件下，还可以采用其他类型的细菌作为感受态细菌，比如大肠杆菌等，本实施例不限制其选择类型。
S21、将质粒转入预置的感受态细菌的细胞中，挑取单克隆菌落，并将所述单克隆菌落接种于预置的培养液中进行培养；作为本申请的一种可选实施方案，可选地，将所述单克隆菌落接种于预置的培养液中进行培养，包括：
预置含有卡那霉素抗性的LB培养液；本处，LB培养液仅仅为其中一选择项；
根据培养条件，将所述单克隆菌落接种于所述LB培养液中进行培养，待菌液OD600值达到0.6～0.8时，加入IPTG诱导剂进行诱导表达；
当菌液诱导表达后达到预设浓度值时，停止培养。
具体的，将优化合成的质粒转入BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中过夜培养，次日以1:100转接入新的含卡那霉素抗性的LB培养液中，于37℃、220r/min摇床震荡培养3h，待菌液OD600值达到0.6～0.8，取1mL菌液作为对照，剩余菌液加入IPTG诱导剂，终工作浓度为1mmol/L。
S22、收集培养后的菌体，并进行提纯预处理，得到含所述目的蛋白的过敏原Feld1和Feld4样品；作为本申请的一种可选实施方案，可选地，收集培养后的菌体，并进行提纯预处理，得到含所述目的蛋白的过敏原Feld1和Feld4样品，包括：
将诱导表达后的菌液进行离心处理，得到菌体并弃去上清液；
向弃去上清液的菌体中加入缓冲剂，用移液器多次吹打菌体进行重悬，重悬后的菌液超声破碎，以菌液变得清澈透亮为准；
超声结束后将菌液以12000rpm离心10min，收集上清液，得到所述含所述目的蛋白的过敏原Feld1和Feld4样品。
具体的，在27℃、220r/min摇床培养4h后以8000rpm离心5min收集菌体，弃去上清后的菌体沉淀加入缓冲液，用移液器多次吹打菌体重悬，重悬后的菌液超声破碎，全程置于冰上操作，超声5s，停顿5s，功率50W，以菌液变得清澈透亮为准，超声结束后将菌液以12000rpm离心10min，收集上清、沉淀制备样品。
S23、用SDS-PAGE电泳检测分析过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品中蛋白的表达水平。
表达水平，由试验人员根据试验要求等进行确定，本实施例不做限定。
过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品诱导表达后，进行扩大培养，获取具有一定量的纯化抗原，用于配苗。
S3、纯化处理后得到Feld1和Feld4及Feld7纯化蛋白。
实施例3
猫主要过敏原293T细胞真核表达：
293T细胞真核表达，具体步骤如下：
1、转染当日，测量细胞密度，取4×107个细胞，以293KT02c培养基稀释至20ml(推荐1:1稀释)。
2、准备DNA-PEI复合物：DNA、PEI试剂和293KT03c培养基在进行以下步骤前需先使其升至室温。准备2000μl(10％的总体积)293KT03c培养基稀释40μg DNA(按照1μg/106cells)和80μl PEI试剂(每1μg DNA需用2μL线性PEI转染试剂)。先加质粒，轻轻混匀，再加PEI转染试剂(使用前轻轻涡旋混匀)，涡旋振荡5s。
3、在室温下静置15min。
4、转染细胞：用移液枪轻轻上下吹吸混合液3次后，直接向摇瓶中加入DNA-PEI复合物并轻轻晃动。
5、在适当的温度、转速和CO2水平下培养细胞(如37℃,120转/分，5％)。
6、转染120h收获蛋白。
实施例4
Feld1、Feld4及Feld7蛋白的大量表达和纯化。
对最佳表达水平的过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品进行培养，达到最佳表达水平。
最佳表达水平，是指试验人员根据试验要求指标，检测分析到的蛋白最佳表达能力，本实施例不做限定。当蛋白诱导表达水平达到最佳值，可以准备进行纯化以及扩大培养，收集Feld1和Feld4纯化蛋白。
作为本申请的一种可选实施方案，可选地，对最佳表达水平的过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品进行培养，纯化处理后得到Feld1和Feld4及Feld7纯化蛋白，包括：
用SDS-PAGE电泳检测分析过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品中蛋白的表达水平，确定所述过敏原Feld1和Feld4及Feld7样品的最佳表达条件；
确定所述过敏原Feld1和Feld4及Feld7的最佳表达条件后，进行扩大培养，将所述上清液用滤膜过滤进行纯化，得到滤液；
将滤液加入层析柱，置于室温结合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流液；将层析柱的液体用洗涤缓冲液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8-10倍柱体积的用量去除杂质蛋白；
最后用洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱层析柱上的蛋白，收集并得到样品纯化处理后的所述Feld1和Feld4及Feld7纯化蛋白；
将所述Feld1和Feld4及Feld7纯化蛋白置于冰上，并用SDS-PAGE电泳检测所述Feld1和Feld4及Feld7及Feld7纯化蛋白的表达水平。
具体实施方案：在确定过敏原Feld1和Feld4的最佳表达条件后，扩大培养，将诱导、超声后的上清用滤膜过滤进行纯化，取Ni亲和层析柱用蒸馏水清洗，并用结合缓冲液平衡多次，然后将滤液加入层析柱后置于室温结合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流穿液；将层析柱的液体用洗涤缓冲液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8-10倍柱体积的用量去除杂蛋白；最后用5～10倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱层析柱上的蛋白，收集的样品均要置于冰上，最后用SDS-PAGE电泳检测。
上述检测值，本处同样不限定。
按照上述方式，得到纯化蛋白Feld1和Feld4及Feld7，可以利用提取的抗原蛋白组合配苗。
组合配苗的配苗要求以及疫苗配套苗剂，由用户自行按照疫苗配置表进行处理。
下面将描述利用该过敏原制备得到的抗体及其应用方案。
实施例5
纯化Feld1、Feld4及Feld7蛋白组合配苗，纯化鉴定好的蛋白按照不同的配比组合配苗。
根据不同表达方式进行配苗。
(1)原核表达配苗，对Feld1、Feld4、Feld7蛋白的配苗条件分别进行了要求，通过该方式组合Feld1和Feld4、Feld7纯化蛋白进行配苗，得到一种疫苗制剂。比如：
备注：(x)中的具体数值由用户进行设定。
(2)293T细胞表达配苗，同理，参见上述方式进行配置疫苗。
本实施例配苗的具体条件，本实施例不做限定，由用户自行设置配苗要求。
实施例6
基于过敏原蛋白进行卵黄抗体的制备方法。
包括如下制备步骤：
采用实施例2所述的疫苗，按照预设免疫接种方案对蛋鸡进行接种；
(1)根据配苗方法，制备为疫苗；
(2)将免疫原接种60日龄高产期商品蛋鸡，首次免疫后21日进行二次免疫；
(3)二次免疫后21日以2倍抗原量进行三次免疫；
(4)三次免疫后21日以3倍抗原进行四次免疫；
(5)四免后每60天根据四免剂量加强免疫；
(6)二免后14天开始每日捡蛋并进行卵黄抗体的制备。
收集蛋鸡产下的鸡蛋，鸡蛋收集后用75％酒精擦拭表面消毒，分离卵黄，充分搅拌均匀；
按照1:3的体积比在1份卵黄液中加入3份体积的PBS缓冲液(PH7.5)，剧烈震荡30S，加入3.5％(W/V)的聚乙二醇(PEG6000)充分搅拌均匀，室温下作用20min；
4℃下12000r/min离心30min，2层滤纸过滤，在滤液中加入8.5％(W/V)的聚乙二醇(PEG-6000)，充分搅拌溶解，室温下作用20min；
4℃下12000r/min离心30min，弃去上清液，在沉淀物中加PBS(pH 7.4)溶液溶解，加12％(W/V)的聚乙二醇(PEG-6000)，室温下作用10min；
4℃下12000r/min离心30min，去上清，沉淀称重，在沉淀物中加入PBS(pH 7.4)溶液溶解，提取得到过敏原重组蛋白卵黄抗体并在-20℃保存。
提取要求：
提取的过敏原重组蛋白卵黄抗体效价不低于1:25600。
冻干后的过敏原重组蛋白卵黄抗体(冻干卵黄抗体)效价不低于1:12800。
卵黄抗体效价的检测：取实施例2的蛋白上样50ug/100ul/孔到96孔微量反应板上，37℃包被1h,；洗板；37℃封闭1h；洗板；将冻干卵黄抗体梯度稀释至51200倍，100ul/孔加到96孔板中，37℃孵育1h；洗板；1：2500孵育羊抗鸡IgG-Fc-HRP(Abbkine,A21080)，37℃，1h；洗板；TMB显色，1MH2SO4终止。读取数值。判断冻干后过敏原重组蛋白卵黄抗体效价为1:12800。
采用上述制备方法，可以得到一种确定抗体效价的过敏原重组蛋白卵黄抗体，可以用于抗体制剂的制备。
实施例7
猫主要过敏原Feld1、Feld4及Feld7在猫中降低过敏原方面的应用。
本实施例，选用粉末喂养的方式进行实施方案，卵黄抗体制剂喂养对象为猫。
利用所述疫苗，制备卵黄抗体；具体见上述实施例3；
制备经过敏原Feld1和Feld4及Feld7免疫后的单克隆抗体；见下述“单克隆抗体提取方案”；
将所述抗体制剂喂养试验体，喂养后利用所述单克隆抗体检测试验体中过敏原的含量变化；见下述“抗体中和方案”。
纯化蛋白Feld1、Feld4及Feld7组合使用的具体实施方案如下：
单克隆抗体制备方案、过敏原Feld1，Feld4及Feld7小鼠单克隆抗体制备
(1)动物免疫：用制备好的蛋白免疫5-8周龄Balb/C小鼠。
(2)抗血清检测:从小鼠尾静脉取少量血，制备抗血清。委托武汉戴安生物公司负责质检多抗，找到具有阳性信号的小鼠。继续正常单抗步骤。
(3)细胞融合：按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HATDMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。
细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。
(4)检测及克隆化：对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HTDMEM培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。
(5)单克隆抗体亚型鉴定:用美国SouthernBiotech的单抗亚型鉴定试剂盒分别测各个上清的亚型。将ELISA鉴定的阳性细胞上清10株进行WB等实验检测结果，筛选到的阳性细胞株，选择10株制备腹水。
(6)腹水制备：将选定的10株阳性杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，获得足量腹水。亚克隆的第3天开始用不完全佐剂对小鼠致敏，致敏后第10天左右将扩大培养好的细胞注射入小鼠腹腔获取腹水。
(7)抗体纯化：将得到的小鼠腹水经ProteinA/G纯化，每只小鼠得到5mg抗体。
(8)单克隆抗体配对：10株单克隆抗体分别进行生物素标记，制备标准曲线，出给配对结果。
抗体中和方案、卵黄抗体中和猫过敏原动物实验
具体：利用所述疫苗，制备卵黄抗体；
制备经过敏原Feld1和Feld4及Feld7免疫后的单克隆抗体；
将所述抗体制剂喂养试验体，喂养后利用所述单克隆抗体检测试验体中过敏原的含量变化。
征集35只猫，按品种分成5组，为实验组和对照组，每组7只，抗体配方直接添加到罐头或者肉类食品上。其中：
实验组1：7只猫，按1mg抗体/2kg体重每天饲喂，连用80日；
实验组2：7只猫，按2mg抗体/2kg体重每天饲喂，连用80日；
实验组3：7只猫，按4mg抗体/2kg体重每天饲喂，连用80日；
实验组4：7只猫，按4mg抗体/2kg体重隔天饲喂，连用80日
对照组5：7只猫，无抗体添加食品
饲喂前连续3天((混样D0)，饲喂过程中第19，20，21日(混样D20)，39，40，41日(混样D40)，59，60，61日(混样D60)，79，80，81日(混样D80)和饲喂后第9，10，11日(混样D90)，以及19，20，21日(混样D100)每只猫分别采集唾液样本，按照实施步骤中方法检测其过敏原含量。
过敏原含量检测、唾液样品中过敏原含量检测
取实验猫卵黄抗体喂养前唾液样品，喂养后唾液样品，使用实施步骤中制备的配套单克隆抗体检测喂养前后实验猫唾液中过敏原的含量变化。
(1)包被一抗：包被一抗(anti-Feld1、anti-Feld4、anti-Feld7),稀释1:5000，100μL/孔，37℃孵育1.5h。
(2)洗板：取出96孔板，弃去液体，加入200μl/孔WashingBuffer，洗板4次，每次静置3min。
(3)封闭：加入200μl/孔封闭液，封膜，37℃孵育1h。
(4)洗板：取出96孔板，弃去液体，加入200μl/孔WashingBuffer，洗板1次，静置3min，甩掉液体后在无纺布上拍干。
(5)加标准品及样品：将样品及标准品用Dilutingbuffer稀释，标准品稀释后的浓度为1000ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31.25ng/ml，15.625ng/ml，0ng/ml；样品稀释1000倍，5000倍，100μL/孔，37℃孵育1.5h。
(6)洗板：重复步骤(2)。
(7)加二抗：二抗(anti-Feld1-biotin、anti-Feld4-biotin、anti-Feld7-biotin)用Dilutingbuffer以1:5000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。
(8)洗板：重复步骤(2)
(9)streptavidin-HRP(索莱宝)稀释1：2500，100μL/孔，37℃孵育1h。
(10)显色：将TMBSubstrate以100μL/孔加入板中，室温避光显色15min。
(11)终止：将1MH2SO4以100μL/孔加入板中，终止反应。
(12)检测：在酶标仪450nm波长处读数。
原核表达过敏原蛋白免疫蛋鸡后，取蛋制备卵黄抗体制剂，喂养实验组前后Feld1检测结果如下(结果显示为平均值)：
293T表达过敏原蛋白免疫蛋鸡后，取蛋制备卵黄抗体制剂，喂养实验组前后Feld1检测结果如下(结果显示为平均值)：
根据检测结果显示，将粉状抗体按2mg抗体与998mg鱼粉混匀喂养，连用80日，采样检测Feld1过敏原含量较用药前降低50％左右。
采用同种检测方法检测Feld4,Feld7过敏原含量较用药前同样降低50％左右。
本发明提供了猫主要过敏原重组蛋白卵黄疫苗喂养猫，减少过敏原方法。经试验证明：用过敏原重组蛋白制备的卵黄疫苗拌料喂养猫后，采集喂养前和喂养后的唾液中的样本，使用夹心Elisa方法，制备的单抗孵育后，结果显示比喂养前过敏原减低50％。
本发明卵黄疫苗由注射途径变为方便操作的饲喂途径，同时有效降低宠物猫身上的过敏原，为广大爱猫人士带来了极大的福祉。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种猫主要过敏原蛋白表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
过敏原蛋白质序列的获取；
通过NCBI查找Feld1、Feld4及Feld7蛋白质序列，其中Feld1的两个亚单位用GGGGSG连接起来，结果如下：
Feld1:EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLCGGGGGSGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR；
Feld4:HEEENVVRSNIDISKISGEWYSILLASDVKEKIEENGSMRVFVEHIKALDNSSLSFVFHTKENGKCTEIFLVADKTKDGVYTVVYDGYNVFSIVETVYDEYILLHLLNFDKTRPFQLVEFYAREPDVSQKLKEKFVKYCQEHGIVNILDLTEVDRCLQARGSEVAQDSSVE；
Feld7:EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLCGMKALLLAVGLSLITVLQAQDPPASGEDTMAMSGKWYLKAMITDRETSWKKPELVTPMTLTVLEGGNLKAETTLLTNGQCKEVELILEKTSEPKKYTTYGGKRVVYIEPTEVKDHYIFYCEGEMQGEQARMAKLVGRDPESNEEALENFREFLRAKGFNQEIFSPKQSGHGRNPCPPDLGSPLPSCRPPLPRLLPHPSPVPT。
2.含权利要求1的目的蛋白的质粒BL21细菌的原核诱导表达。
3.权利要求1的目的蛋白293T细胞真核表达。
4.权利要求1的Feld1、Feld4及Feld7蛋白的大量表达和纯化。
5.权利要求1的纯化Feld1、Feld4及Feld7蛋白组合配苗，纯化鉴定好的蛋白按照不同的配比组合配苗。
6.基于权利要求1的过敏原蛋白进行卵黄抗体的制备方法。
7.猫主要过敏原Feld1、Feld4及Feld7蛋白表达和纯化。
8.权利要求7所述的猫主要过敏原Feld1、Feld4及Feld7在猫中降低过敏原方面的应用。
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