CN116999562A - 一种整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
一种整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了整合素αv抑制剂联合γ‑分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明研究得出，整合素αv抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂联合用于肿瘤的治疗，两者具有协同作用，不仅可以抑制原位肿瘤生长，还可以显著抑制肿瘤侵袭、远处转移等恶性进展发生，有助于减缓肿瘤进展，提高肿瘤治疗效果，改善患者预后。进一步地，本发明研究得出，整合素αv抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂联合用药可以降低整合素αv胞内段游离结构域产生以及抑制整合素αv经典下游通路激活。整合素αv抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂联合用药在肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
肿瘤(癌)已成为居民健康和生命的主要威胁。而据中国医学科学院赫捷院士团队2022年最新研究报道，发病率前五位的肿瘤，包括肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌及女性乳腺癌，占据了新发癌症数的57.4％。由于肿瘤早期起病隐匿，出现症状并最终明确诊断时，往往已经出现肿瘤远处转移、区域淋巴结转移等情况，不再符合手术局部切除的条件，严重限制了患者的预后。因此，深入解析肿瘤发生、局部侵袭、转移的分子机制，是筛选临床治疗靶点、改善肿瘤患者预后的重要途径。
近年来，大量研究报道了肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)在肿瘤恶性进展中的关键性作用。肿瘤微环境是指肿瘤内部除肿瘤细胞外的基质细胞组分，包括成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等，及细胞外基质。肿瘤细胞通过直接接触、旁分泌细胞因子等途径，与非肿瘤组分相互沟通交流，形成了交错复杂的沟通网络，最终导致了肿瘤进展。
整合素家族(Integrin family)作为一类跨膜二聚体蛋白，是肿瘤细胞感应细胞外信号的关键分子，整合素主要通过结合并识别细胞外基质蛋白发生激活，并向胞内进行信号传导。作为直接介导细胞外-细胞内信号传导的关键分子，已有大量文献报道了整合素在肿瘤存活、增殖、侵袭及转移等多个过程中的关键作用。Alanko团队于2015年发现整合素及其下游信号通路可以促进肿瘤细胞抵抗失巢凋亡，进而促进其发生转移。整合素除在肿瘤细胞表面高表达外，还在多种间质细胞中高表达，如成纤维细胞、血管内皮细胞等，并在微环境纤维化、血管生成、肿瘤穿出血管等过程中发挥关键作用。Handa团队发现，肿瘤细胞可以结合血管内皮细胞表面的整合素αvβ1，进而发生细胞黏附及血管渗漏。基于整合素家族及其相关信号通路在肿瘤进展的各个阶段中的关键作用被大量报道，目前已有大量靶向整合素的临床试验正在进行，在ClinicalTrials.gov网站注册的使用整合素抑制剂治疗肿瘤的临床试验已有70余项。
但是，直到目前为止，这些整合素抑制剂治疗肿瘤的临床试验并不顺利。其中，靶向整合素αv(CD51)的小分子抑制剂西仑吉肽被认为是最具临床治疗潜力的整合素抑制剂明星药物，然而西仑吉肽的III期临床试验也以失败告终。西仑吉肽是由德国化学家Kessler设计的含有RGD序列的小分子环形多肽分子，可以竞争性拮抗整合素αvβ3和αvβ5受体。下图所示为西仑吉肽的分子结构式：
西仑吉肽最早于2000年进入I期临床试验。该试验招募了51名患者恶性胶质瘤患者，探究其安全性。该研究中，西仑吉肽的耐受剂量可达2400mg/m2，其中2例患者症状完全缓解，3例症状部分缓解，4例病情稳定。此后，西仑吉肽顺利通过了II期临床试验并于2008首次进入了多中心的随机对照III期临床试验(CENTRIC EORTC26071-22072，NCT00689221)，用于治疗胶质母细胞瘤患者。然而，该项临床试验于2013年宣告失败：西仑吉肽未能显著改善患者的总生存时间。至今为止，尚无其他靶向整合素的药物在肿瘤治疗的研究中进入III期临床试验。
然而，导致西仑吉肽等这类整合素抑制剂临床应用失败的具体原因尚未明确。因此，寻找有效的方法来改善临床中肿瘤治疗效果具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对现有技术中整合素αv抑制剂在肿瘤临床治疗效果不佳的问题和不足，旨在提供一种整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用，使用整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂用于肿瘤的治疗，两种物质协同发挥治疗效果，对肿瘤具有显著的疗效，含有整合素αv抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的药物可应用于肿瘤的治疗。
本发明的首要目的在于提供整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供γ-分泌酶抑制剂在制备抑制整合素αv跨膜切割产生功能性胞内游离段蛋白的产品中的应用。
本发明的再一目的在于提供γ-分泌酶抑制剂在制备整合素αv抑制剂肿瘤治疗增效剂方面的应用。
本发明的再一目的在于提供一种治疗癌症的药物。
本发明通过以下技术手段实现上述发明目的：
通过大量的研究，本发明得出了以整合素αv及γ-分泌酶作为靶点进行联合治疗，尤其是使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)，可以显著提升整合素αv抑制剂的肿瘤治疗效果，两者药物联用能够发挥协同增效作用，对多种实体肿瘤的恶性进展，包括肿瘤增殖、肿瘤侵袭及远处转移，疗效十分显著。
本发明首先通过体外药敏试验，证实了以整合素αv及γ-分泌酶作为靶点进行联合治疗，可以对多种实体肿瘤产生显著的抑制作用；其中，与单药治疗组对比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以对肿瘤细胞系产生显著的抑制作用，西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)联合用药治疗效果最为显著，两者联合用药具有协同作用。
进一步通过Western blot实验，申请人发现，联合治疗可以显著降低游离的整合素αv胞内段的产生水平。此外，虽然西仑吉肽可以较完全的抑制整合素αv的下游信号通路(包括FAK磷酸化激活和F-肌动蛋白多聚化而当)，但无法完全阻断肿瘤细胞发生上皮-间质转化。在此基础上，进一步加入γ-分泌酶抑制剂尼加司他进行治疗，可以显著的抑制肿瘤细胞发生上皮-间质转化，即抑制了肿瘤侵袭等相关恶性表型发生。
申请人进一步通过裸鼠原位肝癌成瘤实验发现，联合治疗可以显著降低肝脏原位肿瘤中肿瘤细胞的上皮-间质转化进程；此外，联合治疗显著降低了原位肿瘤的肺脏转移水平。
进一步地，申请人通过构建多种来源的实体肿瘤裸鼠皮下荷瘤模型，并进行药物联合治疗后发现，整合素αv抑制剂西仑吉肽与γ-分泌酶抑制剂尼加司他联合治疗可以显著降低肝癌、胰腺癌、结直肠癌、脑胶质瘤的肿瘤体积及重量，西仑吉肽与尼加司他联合治疗不仅可以抑制肿瘤侵袭及转移，还可以对原位肿瘤的生长起到明显抑制作用。此外，西仑吉肽与尼加司他联合治疗在多种实体肿瘤中均具有相似的治疗效果，具有普适性。
综上所述，以整合素αv及γ-分泌酶作为靶点进行联合治疗在实体肿瘤治疗中具有显著疗效。使用整合素αv及γ-分泌酶抑制剂进行联合治疗，不仅可以抑制原位肿瘤生长，还可以显著抑制肿瘤侵袭、远处转移等恶性进展发生，有助于减缓肿瘤进展，提高肿瘤治疗效果，改善患者预后。
基于此，下述技术方案均应在本发明的保护范围内：
本发明提供了整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本申请西仑吉肽与尼加司他联合治疗在多种肿瘤中均具有相似的治疗效果，具有普适性，显然，本申请未述及的其他来源的肿瘤也包含在本申请所述肿瘤范围内。
优选地，所述肿瘤为表达整合素αⅤ的肿瘤。
更优选地，所述表达整合素αⅤ的肿瘤为表达整合素αvβ3或整合素αvβ5的肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括但不限于肝癌、胰腺癌、脑胶质瘤、结直肠癌。
优选地，所述整合素αv抑制剂为整合素αvβ3抑制剂或整合素αvβ5抑制剂。
更优选地，所述整合素αvβ3抑制剂或整合素αvβ5抑制剂为西仑吉肽。
优选地，所述γ-分泌酶抑制剂为尼加司他。
优选地，所述治疗肿瘤为抑制肿瘤生长、抑制肿瘤局部浸润或远处转移。
本发明还提供了γ-分泌酶抑制剂在制备抑制整合素αv跨膜切割产生功能性胞内游离段蛋白的产品中的应用。
本发明还提供了γ-分泌酶抑制剂在制备整合素αv抑制剂肿瘤治疗增效剂方面的应用。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，包含整合素αv抑制剂和γ-分泌酶抑制剂。
优选地，所述整合素αⅤ抑制剂为整合素αvβ3抑制剂或整合素αvβ5抑制剂。
更优选地，所述整合素αvβ3抑制剂或整合素αvβ5抑制剂为西仑吉肽。
优选地，所述γ-分泌酶抑制剂为尼加司他。
优选地，所述肿瘤为表达整合素αⅤ的肿瘤。
更优选地，所述表达整合素αⅤ的肿瘤为表达整合素αvβ3或整合素αvβ5的肿瘤。
优选地，所述治疗肿瘤为抑制肿瘤生长、抑制肿瘤局部浸润或远处转移。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料和载体。
本发明提供的治疗肿瘤的药物可经由任何生理上可接受途径施药，施药途径例如口服、注射等。在本发明提供的实施例中，西仑吉肽的剂型优选为注射剂，尼加司他的剂型优选为口服液。
因此，本发明提供的治疗肿瘤的药物可以制成任何药学上可接受的剂型，药物的剂型要适合不同给药方式，例如混悬剂、糖浆剂、口服液、注射剂或它们的任意形式组合。一般来说，药物有效成分占治疗给药总质量的1～95％。
本发明所述“药学上可接受的”是指该辅料或载体可与药效成分兼容，较佳为能稳定药效成分且对被治疗的个体无害。
当用于实体肿瘤治疗时，本发明药物的剂量、频率须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食等因素。
在实际使用时，可参考下述用药剂量，所述西仑吉肽的用量为1～500mg/kg，每周5～7次给药；所述尼加司他剂量为1～100mg/kg，每周2～3次给药。
更优选的，所述西仑吉肽剂量为75mg/kg，每周5次；所述尼加司他剂量为8mg/kg，每周3次。
探究西仑吉肽对胶质母细胞瘤患者的治疗效果的III期临床试验最终结果表明，西仑吉肽未能达到预期效果，没有改善患者的总体生存率，而且具体失败的原因尚未明确。本申请研究得出，联合使用西仑吉肽和γ-分泌酶抑制剂，如尼加司他(LY3039478)可以显著抑制多种实体肿瘤的生长、侵袭和远处转移，显著改善了西仑吉肽在多种实体肿瘤中的治疗效果，为实体肿瘤治疗提供新的思路。此外，经由一系列体内外实验验证发现，联合治疗疗效增强的主要原因是γ-分泌酶抑制剂抑制了γ-分泌酶介导的整合素αv跨膜切割及游离胞内段的产生；然而整合素αv抑制剂并不抑制这一过程，因此，联合γ-分泌酶抑制剂从机制上解释了西仑吉肽在III期临床试验中失败的原因。这一联合疗法能够有效抑制肿瘤进展，改善肿瘤患者预后，为实体肿瘤治疗提供新的思路。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。整合素αv抑制剂和γ-分泌酶抑制剂联合用于肿瘤的治疗，两者具有协同作用，不仅可以抑制原位肿瘤生长，还可以显著抑制肿瘤侵袭、远处转移等恶性进展发生，有助于减缓肿瘤进展，提高肿瘤治疗效果，改善患者预后。进一步地，本发明研究得出，整合素αv抑制剂和γ-分泌酶抑制剂联合用药可以降低整合素αv胞内段游离结构域产生以及抑制整合素αv经典下游通路激活。整合素αv抑制剂和γ-分泌酶抑制剂联合用药在肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1使用整合素αv抑制剂(Cilengitide，Cyclo(-RGDfK))及γ-分泌酶抑制剂(Avagacestat，Semagacestat，LY3039478)的不同组合联合处理后，对肝癌细胞系MHCC-97H(图1A)、胰腺癌细胞系Panc-1(图1B)、结直肠癌细胞系SW480(图1C)及胶质瘤细胞系U87MG(图1D)存活能力的影响实验结果。
图2为实施例2使用不同剂量的西仑吉肽和尼加司他联合处理后，肝癌细胞系MHCC-97H的存活力(图2A)及利用SynergyFinder网站对联合治疗协同效应进行预测的结果(图2B)。
图3为实施例3使用西仑吉肽和尼加司他联合处理后，肝癌细胞系MHCC-97H整合素αv切割产生游离胞内段的水平。
图4为实施例4使用西仑吉肽和尼加司他联合处理后，肝癌细胞系MHCC-97H中整合素αv下游信号通路的激活水平；其中，图4A为FAK信号通路激活水平；图4B和图4C为F-肌动蛋白多聚化水平及统计。
图5为实施例5使用西仑吉肽和尼加司他联合处理后，肝癌细胞系MHCC-97H的上皮-间质转化相关蛋白表达情况。
图6为实施例6裸鼠肝脏注射肝癌细胞系后，使用西仑吉肽和尼加司他联合治疗，获取小鼠肺脏，裸鼠肺脏进行HE染色检测肺脏转移情况(图6A)及统计(图6B)。
图7为实施例7裸鼠皮下接种肝癌(图7A)、胰腺癌(图7B)、结直肠癌(图7C)、胶质瘤(图7D)细胞系后，使用西仑吉肽和尼加司他联合治疗后移植瘤体积的统计结果。
图8为实施例7裸鼠皮下接种肝癌(图8A)、胰腺癌(图8B)、结直肠癌(图8C)、胶质瘤(图8D)细胞系后，使用西仑吉肽和尼加司他联合治疗后移植瘤重量的统计结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中所用试剂若非特别说明，均为本领域现有常规试剂，均可通过商业渠道购买获得。实施例中未特别说明的实验操作，均为本领域常规操作或是本领域技术人员根据其掌握的现有技术或公知常识所能理解或知晓的。
本发明所使用的部分药物来源如下：
西仑吉肽从Selleck公司购买，药物货号为S6387。
尼加司他从Selleck公司购买，药物货号为S7169。
Cyclo(-RGDfK)从Selleck公司购买，药物货号为S7844。
Avagacestat从Selleck公司购买，药物货号为S1262。
Semagacestat从Selleck公司购买，药物货号为S1594。
实施例1整合素αv抑制剂与γ-分泌酶抑制剂不同组合筛选
本实施例以整合素αv及γ-分泌酶作为靶点进行联合治疗，探究整合素αv抑制剂与γ-分泌酶抑制剂的不同组合对肿瘤的抑制作用。
一、实验方法
使用含10％的小牛血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养；细胞呈贴壁生长，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，用0.25％胰蛋白酶消化并分瓶传代培养。
以不给药和单独给药整合素αv抑制剂(Cilengitide或Cyclo(-RGDfK))作为对照。
按不同药物组合共设置以下实验组：Cilengitide+Avagacestat组、Cilengitide+Semagacestat组、Cilengitide+LY3039478组、Cyclo(-RGDfK)+Avagacestat、Cyclo(-RGDfK)+Semagacestat、Cyclo(-RGDfK)+LY3039478；共6个不同药物组合实验组。
通过整合素αv抑制剂(Cilengitide或Cyclo(-RGDfK))与γ-分泌酶抑制剂(Avagacestat或Semagacestat或LY3039478)的不同组合处理肝癌细胞系MHCC-97H、胰腺癌细胞系Panc-1、结直肠癌细胞系SW480及胶质瘤细胞系U87MG。
具体过程为：取对数生长期细胞用于实验，实验前使用含10％的小牛血清的DMEM培养基换液，将对应药物组合混合后加入细胞培养基使其达到最终浓度。各药物的最终浓度分别为：Cilengitide(1μM)，Cyclo(-RGDfK)(50nM)，Avagacestat(50nM)，Semagacestat(50μM)，LY3039478(1μM)。加药后将细胞放回37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养，48小时后使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega)检测细胞存活力。
二、实验结果
实验结果如图1所示。可见，整合素αv抑制剂与γ-分泌酶抑制剂组合进行联合治疗后，与单药治疗相比，在多种实体肿瘤细胞系中均显示出对肿瘤细胞更强的抑制作用。这其中，以西仑吉肽(Cilengitide)与尼加司他(LY3039478)组合的联合治疗效果最为显著。因此，以下实施例选择西仑吉肽(Cilengitide)与尼加司他(LY3039478)联合用药。
实施例2人来源肝癌细胞系MHCC-97H培养及体外药物抑制试验
一、实验方法
1、人来源肝癌细胞系MHCC-97H培养：
使用含10％的小牛血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养；细胞呈贴壁生长，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，用0.25％胰蛋白酶消化并分瓶传代培养，取对数生长期细胞用于实验；
2、体外药物抑制试验：
使用终浓度不同(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM或30μM)的西仑吉肽(Cilengitide)处理肝癌细胞系MHCC-97H，同时使用终浓度不同(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM或30μM)的尼加司他(LY3039478)或二甲基亚砜(DMSO)联合处理肝癌细胞系MHCC-97H，48小时后使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega)检测细胞存活力。
上述联合处理肝癌细胞系MHCC-97H的具体方法为：
取对数生长期细胞进行实验，加药刺激前使用含10％小牛血清的DMEM培养基进行换液。按照每组使用DMSO、西仑吉肽或尼加司他的终浓度，将药物加入对应组别的细胞培养基中，将细胞放回37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养，48小时后使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega)检测细胞存活力。
3、协同效应预测：
将体外药物抑制试验获得的不同浓度组合处理后的细胞存活水平使用SynergyFinder网站HSA模型进行药物协同分析。
二、实验结果
西仑吉肽与尼加司他在不同浓度水平下联合用药对肝癌细胞系MHCC-97H细胞存活水平影响的实验结果如图2A所示，可见，较西仑吉肽单药抑制相比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以显著抑制肿瘤细胞存活水平。
根据SynergyFinder网站HSA模型预测(结果如图2B所示)，西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)协同指数为17.011，表明西仑吉肽与尼加司他联合用药时具有协同作用。此外，在西仑吉肽(Cilengitide)剂量为1μM或以上剂量、尼加司他(LY3039478)剂量为1μM或以上剂量时(图2B中白框所示剂量组合)，西仑吉肽与尼加司他具有强协同作用。
实施例3体外药物抑制对肝癌细胞系MHCC-97H中整合素αv胞内段游离结构域产生水平的影响
根据实施例2结果，选取具有强协同作用的药物治疗浓度组合：西仑吉肽(Cilengitide)剂量为1μM，尼加司他(LY3039478)剂量为1μM，进行后续实验。
一、实验分组
a、对照组：加入等体积溶剂DMSO；
b、西仑吉肽(Cilengitide)单药治疗组：加入西仑吉肽，终浓度为1μM；
c、尼加司他(LY3039478)单药治疗组：加入尼加司他，终浓度为1μM；
d、西仑吉肽(Cilengitide)和尼加司他(LY3039478)联合用药实验组：加入西仑吉肽和尼加司他，西仑吉肽和尼加司他终浓度均为1μM。
二、实验方法
(1)药物抑制实验
按照上述实验分组，加入相应剂量的药物处理肝癌细胞系MHCC-97H，将细胞放回37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养48小时后进行检测。
(2)细胞总蛋白提取及Western blot实验：
各实验分组药物处理后，弃掉培养液，PBS洗涤，用0.25％胰蛋白酶消化。使用RIPA裂解液(加入磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂)裂解细胞后，4℃、14000g离心15分钟，收集上清，获得细胞总蛋白。
将上述得到细胞总蛋白进行Western blot实验。使用整合素αv羧基端特异性一抗(Millipore ab1930)、GAPDH抗体检测GAPDH水平作为内参蛋白。使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗鼠二抗孵育后，使用Bio-Rad凝胶成像系统显影。
三、实验结果
实验结果如图3所示。可见，与西仑吉肽单药治疗组相比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以显著降低了整合素αv游离胞内段(CD51-ICD)水平。
实施例4体外药物抑制对肝癌细胞系MHCC-97H中整合素αv经典下游通路激活水平的影响
FAK为整合素αv经典下游通路，其主要激活方式为Tyr397位点磷酸化。
一、实验分组
a、对照组：加入等体积溶剂DMSO；
b、西仑吉肽(Cilengitide)单药治疗组：加入西仑吉肽，终浓度为1μM；
c、尼加司他(LY3039478)单药治疗组：加入尼加司他，终浓度为1μM；
d、西仑吉肽(Cilengitide)和尼加司他(LY3039478)联合用药实验组：加入西仑吉肽和尼加司他，西仑吉肽和尼加司他终浓度均为1μM。
二、实验方式
1、药物抑制实验
按照上述实验分组，加入相应剂量的药物处理肝癌细胞系MHCC-97H，将细胞放回37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养48小时后进行检测。
2、使用Western blot检测FAK磷酸化激活水平：
使用西仑吉肽(10μM)及尼加司他(1μM)进行处理后，提取细胞总蛋白，分别使用FAK抗体及FAK(Tyr397)抗体进行标记、并使用GAPDH抗体检测GAPDH水平作为内参蛋白，进一步使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育后进行显影。
3、使用免疫荧光染色检测F-肌动蛋白多聚化水平：
使用西仑吉肽(10μM)及尼加司他(1μM)进行处理后，将细胞进行固定、穿透后，使用鬼笔环肽-进行标记，使用DAPI进行细胞核染色，使用共聚焦显微镜进行拍摄。
三、实验结果
实验结果如图4所示。可见，与西仑吉肽单药治疗组相比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以进一步抑制整合素αv经典下游通路的激活，包括FAK磷酸化激活(图4A)及F-肌动蛋白的多聚化水平(图4B、图4C)。
实施例5体外药物抑制对肝癌细胞系MHCC-97H中上皮-间质转化特异性标记蛋白表达水平的影响
发生上皮-间质转化(Epithelia-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤细胞侵袭、转移能力增强的表现，因此，通过检测上皮-间质转化特异性标记蛋白表达水平可以用于检测肿瘤的侵袭、转移能力。其中，N-cadherin、Vimentin表达水平与肿瘤细胞上皮-间质转化水平呈正相关，而E-cadherin表达水平与瘤细胞上皮-间质转化水平呈负相关。
一、实验分组
a、对照组：加入等体积溶剂DMSO；
b、西仑吉肽(Cilengitide)单药治疗组：加入西仑吉肽，终浓度为1μM；
c、尼加司他(LY3039478)单药治疗组：加入尼加司他，终浓度为1μM；
d、西仑吉肽(Cilengitide)和尼加司他(LY3039478)联合用药实验组：加入西仑吉肽和尼加司他，西仑吉肽和尼加司他终浓度均为1μM。
二、实验方法
(1)药物抑制实验
按照上述实验分组，加入相应剂量的药物处理肝癌细胞系MHCC-97H，将细胞放回37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养48小时后进行检测。
(2)使用Western blot检测上皮-间质转化特异性蛋白表达水平的影响：
使用西仑吉肽(1μM)及尼加司他(1μM)进行处理后，提取细胞总蛋白，分别使用E-cadherin(E-cad)、N-cadherin(N-cad)、Vimentin抗体进行标记，并使用GAPDH抗体检测GAPDH水平作为内参蛋白，二抗孵育后进行显影。
三、实验结果
实验结果如图5所示。可见，与西仑吉肽单药治疗组相比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以显著抑制肿瘤细胞上皮-间质转化水平，即抑制肿瘤的侵袭、转移表型。
实施例6构建小鼠肝脏原位肿瘤荷瘤模型并探究联合治疗对肿瘤细胞转移的影响
一、小鼠肝脏原位肿瘤荷瘤模型的构建：
选取对数生长期肝癌细胞系MHCC-97H，消化后进行计数。将肝癌细胞系MHCC-97H于DMEM培养基中重悬后，进行裸鼠皮下荷瘤。为进一步促进肿瘤细胞成瘤能力，使用人来源肝星型细胞(LX-2)进行共同注射。每只裸鼠注射5×106(MHCC-97H)+5×106(LX-2)/100μL。具体注射过程为：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠后，开腹暴露小鼠肝脏，并进行肝包膜下注射。造模后对小鼠进行观察，3周后进行药物治疗实验。
二、实验分组
a、对照组：加入等体积溶剂DMSO；
b、西仑吉肽(Cilengitide)单药治疗组：加入西仑吉肽；
c、尼加司他(LY3039478)单药治疗组：加入尼加司他；
d、西仑吉肽(Cilengitide)和尼加司他(LY3039478)联合用药实验组：加入西仑吉肽和尼加司他。
三、实验过程
(1)药物实验
按照上述实验分组，给药相应的药物，其中西仑吉肽(Cilengitide)的给药剂量为75mg/kg，每周5次，腹腔注射；尼加司他(LY3039478)的给药剂量为8mg/kg，每周3次，灌胃。3周后处死小鼠并进行灌注获取组织。
(2)HE染色
获取小鼠肺脏进行固定、脱水石蜡包埋及切片。分别使用苏木素、伊红染色后进行封片，统计小鼠肺脏转移灶数量。
四、实验结果
实验结果如图6所示。可见，与西仑吉肽单药治疗组或尼加司他单药治疗组相比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以显著减少肿瘤肺脏转移水平，对肿瘤侵袭、远处转移恶性表型具有显著的抑制作用，具有显著的治疗效果。
实施例7探究西仑吉肽及尼加司他联合治疗对多种实体肿瘤的肿瘤体积、重量的影响
一、构建实体肿瘤皮下荷瘤模型并检测体积、重量：
选取4种不同组织来源的肿瘤细胞系进行实验，包括人来源肝癌细胞系MHCC-97H，人来源胰腺癌细胞系Panc-1，人来源结直肠癌细胞系SW480，人来源脑胶质瘤细胞系U87MG。选取对数生长期肿瘤细胞，消化后进行计数。将肿瘤细胞于DMEM培养基中重悬后，进行裸鼠皮下荷瘤。每只裸鼠注射5×106/100μL。注射后对小鼠进行观察，并使用游标卡尺对肿瘤体积进行检测，计算公式为：V＝π/6×L(长)×W(宽)×H(高)，待肿瘤体积达到30mm3左右后进行药物治疗实验。
二、实验方法
实验共分为四组，分别为：
a、对照组：加入等体积溶剂DMSO；
b、西仑吉肽(Cilengitide)单药治疗组：加入西仑吉肽；
c、尼加司他(LY3039478)单药治疗组：加入尼加司他；
d、西仑吉肽(Cilengitide)和尼加司他(LY3039478)联合用药实验组：加入西仑吉肽和尼加司他。
按照上述实验分组，给药相应的药物，其中西仑吉肽(Cilengitide)的给药剂量为75mg/kg，每周5次，腹腔注射；尼加司他(LY3039478)的给药剂量为8mg/kg，每周3次，灌胃。
每3天检测一次肿瘤体积大小，3周后处死小鼠，并取下皮下肿瘤进行称重及统计。
三、实验结果
实验结果如图7和图8所示；其中，图7为西仑吉肽及尼加司他联合治疗对多种实体肿瘤的肿瘤体积的影响实验结果；图8为西仑吉肽及尼加司他联合治疗对多种实体肿瘤的肿瘤重量的影响实验结果；图7A、图8A为人来源肝癌细胞系MHCC-97H的实验结果，图7B、图8B为人来源胰腺癌细胞系Panc-1实验结果，图7C、图8C为人来源结直肠癌细胞系SW480实验结果，图7D、图8D为人来源脑胶质瘤细胞系U87MG实验结果。
可见，与西仑吉肽单药治疗组或尼加司他单药治疗组相比，联合使用西仑吉肽(Cilengitide)及尼加司他(LY3039478)可以显著抑制肝癌、胰腺癌、结直肠癌及脑胶质瘤皮下荷瘤模型中肿瘤的体积及重量，对多种实体肿瘤的生长具有显著的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.整合素αv抑制剂联合γ-分泌酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为表达整合素αⅤ的肿瘤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达整合素αⅤ的肿瘤为表达整合素αvβ3或整合素αvβ5的肿瘤。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述整合素αv抑制剂为整合素αvβ3抑制剂或整合素αvβ5抑制剂。
5.γ-分泌酶抑制剂在制备抑制整合素αv跨膜切割产生功能性胞内游离段蛋白的产品中的应用。
6.γ-分泌酶抑制剂在制备整合素αv抑制剂肿瘤治疗增效剂方面的应用。
7.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包含整合素αv抑制剂和γ-分泌酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述整合素αⅤ抑制剂为整合素αvβ3抑制剂或整合素αvβ5抑制剂。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述肿瘤为表达整合素αⅤ的肿瘤。
10.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的辅料和载体。
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