CN116997661A - 方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物的方法，其中鼠尾草酸减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性。本发明还涉及通过该方法可获得的组合物和含有所述组合物的制剂，以及减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性的方法。

Description

方法

发明领域

本发明涉及一种制备包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物的方法，其中鼠尾草酸减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性。本发明还涉及通过该方法可获得的组合物和含有所述组合物的制剂，以及减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性的方法。

背景技术

视黄醇是化妆品中主要的抗衰老活性物质之一。然而，这种分子并不稳定，因此需要抗氧化保护。通常，这是通过使用合成抗氧化剂：丁羟基茴香醚(BHA)和/或丁化羟基甲苯(BHT)或其他抗氧化剂，如生育酚或醋酸生育酚。然而，尽管BHA和BHT的使用在化妆品监管中得到授权，但关于它们的毒性和作为内分泌干扰物的作用，仍存在科学争论(https://www.febea.fr/fr/baseingredient/bht)。

这导致公众对能够稳定和/或防止视黄醇氧化的人工抗氧化剂的天然替代品的需求增加。

为此，可以使用香料或植物汁、植物提取物或植物产品作为抗氧化剂。使用此类提取物或化合物的一个优点是，与抗氧化剂如丁羟基茴香醚(BHA)和丁化羟基甲苯(BHT)相比，它们被认为是天然成分。然而，香料和植物汁或提取物或其他源自香料/植物的产品可能含有使其加入的成分/制剂可能褪色或着色的成分，这可能对消费者不利。

几种不同的植物材料，例如水果、蔬菜、作物、草药和香料，已被研究为抗氧化化合物的潜在来源。抗氧化化合物通常存在于植物材料中，因为它们在帮助植物生长和发育方面很重要。

然而，天然植物材料的抗氧化功效差异很大。有鉴于此，预测哪种植物材料或植物提取物能够提供足够的稳定/抗氧化活性并不是一件简单的事情。

此外，在某些情况下，提供足够的稳定/抗氧化活性所需的植物材料或植物提取物的量可能被证明是不经济的，或者由于监管和立法限制，其水平可能是不可接受的。

视黄醇不仅可以通过化学合成获得，还可以使用生物技术(例如通过生物转化或生物合成，包括例如发酵步骤)获得。使用生物技术方法包括生物转化和/或生物合成(例如通过生物转化或生物合成，包括例如在培养基中的发酵步骤)获得的视黄醇通常被称为“生物视黄醇”。

为此，US2022/017878A1描述了使用合适的微生物生产生物视黄醇的方法。这种方法通常包括在包含油的培养基中培养能够提供视黄醇的微生物，使得视黄醇聚积在油中。US2022/017878A1关于生物视黄醇的生产的公开内容通过引用并入本文。

视黄醇的氧化可能在其合成过程中已经发生，也可能发生在生物转化或生物合成过程中。因此，有必要稳定已经在培养基和/或油中的新生生物视黄醇。

本发明试图通过用天然成分代替传统上用于稳定和/或防止视黄醇氧化的合成抗氧化剂来解决这个问题，所述天然成分例如在鼠尾草酸中高度滴定的迷迭香提取物。

鼠尾草酸是一种存在于唇形科植物中的半日花烷型二萜，例如迷迭香(Rosmarinus officinalis)和普通鼠尾草(Salvia officinalis)；Hossain等人，2010年；等人，2015年)。

虽然鼠尾草酸的潜在抗氧化活性已被充分证明，但其确切的作用机制尚未得到广泛研究。特别是，人们对鼠尾草酸与不同活性氧(ROS)或脂质自由基的相互作用知之甚少。

此外，在大多数研究中，体外氧化是通过长期和人工加热处理产生的，因此很难将结果外推到植物的体内情况。令人惊讶的是，鼠尾草酸在植物叶片中的作用很少受到关注，而且这种化合物在植物中的生物学作用还没有得到确认。

鼠尾草酸在地中海半灌木迷迭香的叶子中含量非常高，高达干重的百分之几(Munné-Bosch和Alegre，2001；del等人，2003年；Luis和Johnson，2005年)。鼠尾草酸的生物合成和聚积仅发生在枝尖的迷迭香幼叶中，二萜分子在叶片发育和衰老过程中被部分消耗(Hidalgo等人，1998；Brückner等人，2014；/>等人，2015)。除了鼠尾草酸，在迷迭香叶中还可以检测到含量较低的酚类二萜，包括鼠尾草酸的主要氧化产物鼠尾草酚。后一种化合物通过非酶反应由鼠尾草酸自发产生，其抗氧化活性很少得到研究(Aruoma等人，1992；曾等人，2001年)。田间种植的迷迭香植物中的二萜含量表现出季节性变化，并有因环境胁迫而损失鼠尾草酸的趋势(Luis和Johnson，2005)。特别是，发现在自然条件下，迷迭香叶中的鼠尾草酸浓度在夏季高温和低降水率下降低，同时氧化衍生物增加，这表明细胞氧化应激伴随着鼠尾草酸的消耗(Munné-Bosch等人，1999；Munné-Bosch和Alegre，2003年)。鼠尾草酸和鼠尾草酚仅在光合绿色组织(叶片、萼片和花瓣)中聚积，并定位在叶绿体中(Munné-Bosch和Alegre，2001)，尽管也有报道称鼠尾草酸的合成存在于腺毛体中(Brückner等人，2014)。

发明内容

制备本发明组合物的方法

本发明人出人意料地发现，即使在视黄醇的合成过程中，尤其是使用生物技术，鼠尾草酸也可以减少或防止视黄醇氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性。

因此，在第一方面，本发明提供了一种制备包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物的方法。该方法包括在包含油的培养基中培养能够提供视黄醇的微生物的步骤，使得视黄醇在油中聚积，其中将鼠尾草酸添加到培养基中。

该方法在下文中被称为本发明的方法。

针对本发明的一个方面描述的具体和优选实施方案也适用于本发明的其他方面。

当我们使用术语“基本上由...组成”时，我们的意思是所描述的组合物、提取物或汁液必须含有所列成分，也可能含有少量(例如，至多2重量％，或至多1重量％或至多0.1重量％或至多0.01％)的其他成分，前提是任何其他成分都不会影响组合物、提取物或汁液的性质。当我们使用术语“由...组成”时，我们的意思是所描述的成分必须仅含有所列成分。这些术语可以以类似的方式应用于过程、方法和用途。

在整个申请中，术语“包括”或“包含”可替换为“由...组成”。

本文中使用的术语“约”，例如当涉及可测量值(例如组合物或反应混合物中特定组分的重量的量)时，指的是特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或特别是±0.1％的变化。

视黄醇具有如式1所示的式：

在本发明的方法中制备的视黄醇可以以反式和/或顺式异构体的形式存在。如本文所用，术语“视黄醇”旨在包括视黄醇的反式和/或顺式形式。

在本发明的方法和组合物中，优选至少90％的视黄醇是反式视黄醇，例如至少95％或至少99％或99.5％的视黄醇是反式视黄醇。例如，在本发明的方法和组合物中，约90％至约99.5％的视黄醇是反式视黄醇。

本文中使用的术语“视黄醇”也旨在涵盖视黄醇的衍生物，例如酯衍生物。例如，视黄醇衍生物可包括但不限于：棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、亚油酸视黄酯、油酸视黄酯、米糠酸视黄酯、大豆油酸视黄酯和牛油酸视黄酯、视黄醛及其混合物。

在本发明的方法中，视黄醇通过生物技术获得(例如通过生物转化或生物合成，包括例如发酵步骤)。可供选择地或另外，它也可以通过化学合成获得。

能够提供视黄醇的微生物在本领域中通常是已知的。例如，在US 2022/017878A1中描述了此类微生物。

如本文所用，术语“发酵”是指微生物在生长培养基中的大量生长，目的是生产天然产物(例如视黄醇)。

如本文所用，术语“生物转化”是指一种酶催化过程，其中中间体或前体转化为目标最终产物(例如视黄醇)

如本文所用，术语“生物合成”是指在活体生物(例如微生物)中，底物(例如碳底物)转化为更复杂的产物(例如视黄醇)的多步酶催化过程。

在整个公开内容中，术语“培养”和“发酵”可互换使用。

在本发明的方法中，产生的视黄醇是生物视黄醇。

本发明方法中使用的油可以是任何油，但通常是从植物和/或动物获得或可获得的油。例如，所述油可以包含一种或多种植物油或菜油，所述植物油或菜油选自椰子油、棕榈油、棉籽油、小麦胚芽油、大豆油、芝麻油、橄榄油、玉米油、低芥酸菜籽油、葵花油(例如，中油酸葵花油和/或高油酸葵花油和/或有机葵花油和/或向日葵籽油)、红花油、花生油、亚麻籽油、葡萄籽油和菜籽油、植物油及其混合物。优选地，所述油是葵花油。

如本领域技术人员所理解的，如本文所使用，术语“从...可获得”是指例如通过化学合成或酶促生产从植物可获得，或者从植物中可分离，或者从替代来源可获得提取物。而本文中使用的术语“获得”是指提取物直接来源于植物来源。

在本发明的方法中，鼠尾草酸可以以提取物的形式提供，所述提取物从选自唇形科的至少一种植物，例如迷迭香和/或鼠尾草获得或可获得。

从选自唇形科的至少一种植物，例如迷迭香和/或鼠尾草获得或可获得的提取物可以是液体或固体的形式。通常，提取物可以是固体的形式，即粉末。

本文中所有提及的从唇形科植物(例如迷迭香和/或鼠尾草)获得或可获得的提取物通常是指从唇形科植物的叶子获得或可获得的提取物。叶子在提取之前可能已经被干燥和/或研磨。唇形科提取物可经除臭和/或脱色。例如，唇形科提取物可能已经去除了所有的挥发性油化合物。

在一些方面，选自唇形科的至少一种植物将仅使用水从相应的植物中提取。例如，选自唇形科的至少一种植物可能已经仅用水提取。这种提取物可以称为水提取物。

在某些方面，用于提供提取物的水可以是酸性的。例如，用于提供提取物的水的pH可以为约1至约6，或约2至约4，例如pH 3。这种提取物可以称为酸性水提取物。

在其他方面中，选自唇形科的至少一种植物可能已经用醇(例如乙醇)从相应的植物中提取。例如，选自唇形科的至少一种植物可能已经仅用醇提取，例如仅用乙醇提取。这种提取物可以称为醇提取物，例如乙醇提取物。

在其他方面，选自唇形科的至少一种植物可能已经用醇和水的混合物例如乙醇和水从相应的植物中提取。例如，选自唇形科的至少一种植物可能已经用醇和水的混合物例如乙醇和水提取。这种提取物可以称为水醇提取物，例如水乙醇提取物。

在其他方面，选自唇形科的至少一种植物可能已经用不是醇的有机溶剂例如丙酮从相应的植物中提取。例如，选自唇形科的至少一种植物可能已经用有机溶剂例如丙酮提取。这种提取物可以称为有机提取物或丙酮提取物。

为了避免疑问，除非上下文另有指示，否则为本发明的给定方面、特征或参数所指示的优选项、选项、特定特征等应当被认为是与为本发明的相同或其它方面、特征和参数所指示的任何和所有其它优选项、选项、特定特征等相结合而公开的。

从唇形科植物获得或可获得的提取物包含鼠尾草酸。例如，从唇形科植物获得或可获得的提取物可包含提取物的至少1重量％的鼠尾草酸。例如，从唇形科植物获得或可获得的提取物可包含提取物的约1％至约95重量％的鼠尾草酸，例如约2.5％至约90重量％，约5％至约85重量％，约10％至约80重量％，约15％至约60重量％，约20％至约50重量％，约25％至约40重量％，例如约1％至约30重量％，约5％至约20重量％，约10％至约15重量％或约1％至5重量％，例如提取物的约15％至约30重量％，或提取物的约40％至约65重量％。例如，从迷迭香获得或可获得的提取物中的鼠尾草酸含量可为迷迭香提取物的至少约20重量％。

从唇形科植物获得或可获得的提取物还可包含鼠尾草酚和12-O-甲基鼠尾草酸。例如，从唇形科植物获得或可获得的提取物可包含或含有约2％至约10％的鼠尾草酚和约2％至约10重量％的12-O-甲基鼠尾草酸。

如本领域技术人员所理解的，所需提取物的量将取决于提取物中存在的鼠尾草酸的浓度以及拟用于本发明的方法和组合物中的鼠尾草酸的量。例如，在提取物包含按提取物重量计50％的鼠尾草酸的情况下，需要使用1％的提取物以在培养基中获得0.5％的浓度。

除非本文另有说明，否则列出的重量百分比是基于提取物的总重量，例如干提取物的总重量。

可以在任何合适的时间点将鼠尾草酸加入培养基中。

在一个实施方案中，在培养开始时和/或在培养过程中将鼠尾草酸加入培养基中。

鼠尾草酸可以单独或与其他组分组合加入培养基中，例如与油一起，特别是与培养基中使用的(部分)油(例如葵花油)一起加入培养基中。

在加入培养基之前，可以在油或其他合适的稀释剂或溶剂(或其混合物)中稀释鼠尾草酸。这种油或稀释剂或溶剂应与培养中使用的其他成分相容，特别是微生物、视黄醇和视黄醇前体和衍生物，以及培养基和油。

例如，可以在与培养基中提供的油相同的油中稀释鼠尾草酸。在这种情况下，部分或全部油可以与鼠尾草酸一起提供。

有利地，鼠尾草酸以对微生物无毒的量加入。

可以通过在培养阶段测试不同浓度的鼠尾草酸对微生物的影响来确定鼠尾草酸对于微生物的潜在毒性。这种测试是本领域技术人员的常规工作。

油的温度可以为约40℃至约60℃，例如约45℃至约55℃。

然后可以搅动或搅拌油、视黄醇和鼠尾草酸的混合物(例如作为生物反应器中微生物培养物的一部分)，直到视黄醇与鼠尾草酸已经溶解并聚积在油中。

一旦发酵步骤完成，然后可过滤混合物(例如去除生物质和其他颗粒物质)，并在相分离后倾析，以回收含视黄醇的油。

制备本发明组合物的方法包括在形成生物视黄醇的过程中(例如，在发酵过程中)加入鼠尾草酸(和任选的其他附加抗氧化剂)。

例如，可以在培养能够提供视黄醇的微生物的过程中(例如，在发酵过程中)加入鼠尾草酸(例如，以从唇形科的至少一种植物获得或可获得的提取物的形式)。

因此，本发明进一步提供了一种制备本发明组合物的方法，其中该方法包括任意顺序的以下步骤：

(i)在包含油的培养基中培养/发酵能够提供视黄醇的微生物，使得视黄醇聚积在油中；

(ii)向培养基(例如，在培养/发酵步骤(i)开始时和/或过程中)加入鼠尾草酸(例如，以从唇形科的至少一种植物获得或可获得的提取物的形式)；以及任选地

(iii)分离视黄醇(例如生物视黄醇)和/或鼠尾草酸和/或油。

该方法可任选地包括向组合物中加入额外的抗氧化剂。这可以在步骤(i)至(iii)中的任何一个期间添加。

优选地，在本发明的方法中不添加合成抗氧化剂。

微生物的性质不受限制，只要它是能够产生视黄醇的微生物即可；但具体地，它可以是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可以对微生物进行基因改性以优化视黄醇的产生。合适的微生物的实例描述于US2022/017878 A1中，其公开内容通过引用并入本文。

本领域已知，视黄醇可以由微生物培养物(例如，在生物反应器(也称为发酵器)中)产生，该方法包括培养产生视黄醇的微生物细胞以从培养基中回收，该生物反应器包含水相和提取相。微生物细胞在生物反应器中的水相中生长，并且可以在分批培养、连续培养或半连续培养中培养。水相通常包含合适的细胞培养基，并且可以进一步包括用于产生次级代谢产物的前体分子。在一些实施方案中，将碳底物加入培养物中以产生目标视黄醇产物。

本领域技术人员可以根据所选择的微生物容易地调整和使用培养/发酵过程。

在本发明的方法中，步骤(i)可以在生物反应器中的培养基中进行。

用于培养/发酵微生物的培养基和其他培养条件可以是没有特别限制的任何培养基，只要它是用于培养普通微生物的培养基即可。在含有氨基酸和/或维生素的常规培养基中，可以在需氧条件下控制温度、pH、搅拌条件等进行培养。

在培养/发酵步骤中，可以使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)调节pH，以提供5.5至7.5、5.5至7.0或6.0至7.5的pH。例如，pH可以是6.9。

为了保持需氧状态，可以向培养物中注入氧气或含氧气体，或者可以在不注入气体的情况下注入氮气、氢气或二氧化碳气体以保持厌氧和微需氧状态。

温度可保持在约20℃至约45℃或约25℃至40℃，特别是约27℃至31℃，更特别是约30.2℃。

在培养/发酵步骤中培养器/生物反应器的运行转速(rpm)可为约50至约300rpm，例如约50至250rpm，或约100至约300rpm，例如约200至300rpm。

术语“培养基”或“生物培养基”是指用于培养微生物的培养基。

产生视黄醇的微生物在其中生长的生物反应器包含培养基，该培养基具有水相，该水相包括作为碳源的糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖浆、淀粉和纤维素)，和含有脂肪(例如但不限于油，例如椰子油、棕榈油、棉籽油、小麦胚芽油、大豆油、芝麻油、橄榄油、玉米油、低芥酸菜籽油、葵花油(例如中油酸葵花油和/或高油酸葵花油、和/或有机葵花油和/或葵花籽油)、红花油、花生油、亚麻籽油、葡萄籽油、和菜籽油、植物油(botanical oil)和/或其混合物，优选葵花油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)、有机酸(例如乙酸)及其混合物。

氮源包括含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浸泡液、豆粕和尿素)、无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)及其混合物。

磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、上述的含钠盐及其混合物可以用作磷源。

培养基还可以含有必需的促生长物质，例如其他金属盐(例如硫酸镁或铁硫酸盐)、氨基酸和维生素。

用于培养/发酵产生视黄醇的微生物的培养基可以含有选自酵母提取物、蛋白胨、大豆和葡萄糖的一种或多种营养物质。

酵母提取物可以以适当的量包含在培养基中。例如，基于100重量份的总培养基，其量为约1至约4重量份，例如约1.5至约4重量份，或约2至约4重量份。

蛋白胨可以以适当的量包含在培养基中。例如，基于100重量份的总培养基，约0.5至约4重量份，例如约1至约4重量份，或约1.5至约4重量份。

大豆可以以适当的量包含在培养基中。例如，基于100重量份的总培养基，约0.5至约4重量份，例如约1至约4重量份，或约1.5至约4重量份。

葡萄糖可以以适当的量包含在培养基中。例如，基于100重量份的总培养基，约1至约3重量份，例如约1至2.5重量份，或约1.5至约3重量份。

产生的视黄醇被分泌到培养基中。

如上所述，生物反应器包含水相和提取相。提取物可以包括油，例如葵花油。提取相油可以在培养/发酵开始时存在于生物反应器中，或者可以在适当的时间点添加到生物反应器，例如在培养/发酵至少约1小时之后，或者在培养/发酵至少约2小时或在培养/发酵至少约5小时之后。

提取相中的油可以包括鼠尾草酸(即以从至少一种选自唇形科的植物获得或可获得的提取物的形式)，或者可以在适当的时间点将鼠尾草酸添加到油中。

因此，本发明提供了一种获得本发明组合物的方法，该方法包括：

(i)在包含油的培养基中培养/发酵能够提供视黄醇的微生物(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，以使视黄醇在油中聚积(任选地包含鼠尾草酸(例如，以从选自唇形科的至少一种植物获得或可获得的提取物的形式))；

(ii)如果尚未存在，则向培养基中加入鼠尾草酸(以从选自唇形科的至少一种植物获得或可获得的提取物的形式)；以及可选地

(iii)分离视黄醇(生物视黄醇)和/或鼠尾草酸和/或油。

提取相中的油可以包含一种或多种植物油或菜油，其选自下述的一种或多种：椰子油、棕榈油、棉籽油、小麦胚芽油、大豆油、芝麻油、橄榄油、玉米油、低芥酸菜籽油、葵花油(例如中油酸葵花油和/或高油酸葵花油和/或有机葵花油和/或葵花籽油)、红花油、花生油、亚麻籽油、葡萄籽油、和菜籽油及其混合物。优选地，该油是葵花油。

如果需要其他的抗氧化剂，例如BHT、BHA和/或生育酚，可以在任何步骤添加这些。例如，它们可以在加入鼠尾草酸的同时加入。

从该方法中分离视黄醇(例如，生物视黄醇)和/或鼠尾草酸和/或油的步骤可以通过本领域已知的任何手段实现。

回收视黄醇的步骤还可以根据需要包括分离过程和/或纯化步骤。

因此，本发明可以提供从本发明的方法可获得或获得的组合物，其包含视黄醇(例如生物视黄醇)，优选为液体形式，例如油性液体(例如葵花油中的生物视黄醇)和鼠尾草酸(例如组合物重量的至少0.5％的鼠尾草酸)。

从本发明的方法可获得或获得的组合物优选为化妆品组合物。

本发明的方法可以进一步包括将包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物配制成制剂或产品的步骤。

优选地，该制剂/产品是化妆品制剂/产品，更优选地是抗衰老制剂/产品。

组合物

本发明人出人意料地发现，包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物可以减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性。

因此，本发明提供了一种包含视黄醇、油和鼠尾草酸(例如组合物重量的至少0.5％的鼠尾草酸)的组合物。

此类组合物在下文中被称为“本发明的组合物”。

通常，本发明的组合物可以是液体的形式，例如油性液体。

本发明的组合物可以包含液体形式例如油性液体的视黄醇和鼠尾草酸(例如组合物重量的至少0.5％的鼠尾草酸)。

在本发明的组合物中，鼠尾草酸的量可以为组合物的约0.1％至约10重量％，例如组合物的约0.5％至约7重量％或约2％至约5重量％。

可供选择地，本发明的组合物可以由视黄醇、油和鼠尾草酸组成或基本上由视黄醇、油和鼠尾草酸组成。

任选地，本发明的组合物可以包含上文定义的视黄醇、油和鼠尾草酸的组合和载体、由上文定义的视黄醇、油和鼠尾草酸的组合和载体组成或基本上由上文定义的视黄醇、油和鼠尾草酸的组合和载体组成。

液体载体的实例是糖浆、植物油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何缓释材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡混合。

如本文所用，术语“载体”可指天然产物或源自天然、经过转化或改性使其不同于其来源的天然产物的产物。

优选地，视黄醇是如上所定义的生物视黄醇的形式。

如上所述，鼠尾草酸可以以提取物的形式提供，所述提取物从选自唇形科的至少一种植物，例如迷迭香和/或鼠尾草获得或可获得。

在本发明的组合物中使用的合适的油也在上文定义。

本发明组合物中存在的视黄醇的存在量可以为组合物的约20％至约80重量％，例如组合物的约30％至约70重量％，优选组合物的约40％至约60重量％或组合物的约40％至约50重量％。

本发明组合物中存在的油的存在量可以为组合物的约30％至约70重量％，例如组合物的约35％至约60重量％。

本发明的组合物可进一步包含额外的抗氧化剂。例如，本发明的组合物可以包含BHT和/或BHA和/或生育酚。

因此，本发明还可以提供一种组合物，其包含视黄醇(优选生物视黄醇)、油(优选葵花油)、鼠尾草酸(优选以从唇形科植物获得或可获得的提取物的形式)以及进一步的BHT和/或BHA和/或生育酚。优选地，本发明的组合物不包含任何合成抗氧化剂。

如果存在，额外的抗氧化剂的存在量可以为组合物的约1％至约5重量％，例如组合物的约2％至约4重量％。

例如，本发明的组合物可以包含：

-约40％至约60％视黄醇(特别是生物视黄醇，任选地其中约90％至约99％的视黄醇是反式视黄醇)；

-约0.5％至约7％的鼠尾草酸(任选地，其中鼠尾草酸为从唇形科植物获得或可获得的提取物的形式)；

-约30％至约70％的油(任选地，其中所述油为葵花油)；以及任选地

-约1％至约5％的额外抗氧化剂(任选地，其中所述额外抗氧化剂为BHT、BHA、生育酚或其混合物)。

在本发明的组合物中，优选组合物不包含某些组分。例如，组合物可能优选不包含视黄酸，因为这表明组合物中存在的视黄醇不是氧化稳定的。

因此，本发明还可以提供如先前定义的组合物，其中所述组合物包含按组合物重量计小于5％的视黄酸，例如按组合物重量计小于约1％的视黄酸，或按组合物重量计小于约0.5％的视黄酸。优选地，本发明的组合物不包含视黄酸。

在本发明的组合物中，优选组合物不包含某些组分，例如视黄醇异构体(例如9-顺式视黄醇和/或13-顺式视黄醇)。例如，如果存在视黄醇异构体，则优选组合物包含小于或等于5％的这些视黄醇异构体。

如上所述，本发明人出人意料地发现，在包含视黄醇、油和鼠尾草酸，例如生物视黄醇(液体形式，例如油性液体)和鼠尾草酸的本发明的组合物中，视黄醇的氧化被减少或阻止，和/或视黄醇的氧化稳定性得到增强。

在一个实施方案中，该组合物包含视黄醇、油和鼠尾草酸，其中鼠尾草酸为如上所述的水乙醇迷迭香和/或鼠尾草叶提取物的形式。或者，也可以使用通常用于提取迷迭香和/或鼠尾草的其他提取溶剂或溶剂混合物，例如丙酮或丙酮混合物。

因此，本发明提供了如先前定义的组合物(优选抗氧化剂组合物)，其中该组合物减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性。

如本文所用，术语“减少或防止视黄醇的氧化”是指在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，少于约10％的存在于组合物中的视黄醇被氧化为视黄醛和/或视黄酸。例如，在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，少于约5％的存在于组合物中的视黄醇被氧化为视黄醛和/或视黄酸，或少于1％或少于0.5％的存在于组合物中的视黄醇被氧化为视黄醛和/或视黄酸。

如本文所用，术语“增强视黄醇的氧化稳定性”是指在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，至少90％的存在于组合物中的视黄醇仍是视黄醇的形式。例如，在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，超过95％的存在于组合物中的视黄醇仍是视黄醇的形式，或超过99％或99.5％的存在于组合物中的视黄醇仍是视黄醇的形式。

制剂和产品

本发明的组合物可以掺入到制剂/产品中，例如营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品。

因此，本发明提供了一种包含本发明的组合物的制剂。例如，本发明可以提供包含本发明的组合物的化妆品组合物。

本发明还提供了一种包含本发明的组合物的产品。例如，本发明可以提供包含本发明的组合物的化妆产品。

“化妆品”是指用于与人体外部(表皮、毛发系统、指甲、嘴唇和外生殖器官)或牙齿和口腔粘膜接触的任何物质或混合物，其唯一或主要目的是清洁它们、使它们变香、改变它们的外观、保护它们、使它们保持良好状态、校正体臭和/或其组合。

“物质”是指处于自然状态或通过任何制造工艺获得的化学元素及其化合物，包括保持其稳定性所需的任何添加剂和所用工艺产生的任何杂质，但不包括在不影响物质稳定性或改变其组成的情况下可分离的任何溶剂。

“混合物”是指由两种或两种以上物质组成的混合物或溶液。

本发明还提供本发明的组合物在营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品中的用途。

此类制剂或产品在下文中称为“本发明的制剂或产品”。

营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品可任选地进一步包含药学/兽医/化妆品(包括化妆品活性)成分，例如赋形剂、载体及其混合物。

“化妆品”或“化妆品活性成分”是指任何和所有天然的、天然存在的、天然相同的、人工合成生产的、生物合成生产的、可持续的、可再生的和/或可生物降解的化合物、成分、中间体、分子、物质、原料或产品，单独或作为化合物、成分、中间体、分子、物质、原料或产品的混合物的一部分，掺合物、组合物、制剂(包括但不限于皮肤保湿剂、乳膏、香脂、精华液、油、眼部化妆品、面部化妆品、洗发产品、免洗型护发产品、染发剂(包括但不限于天然染发剂)和/或它们的组合)、成品和相关技术，包括但不限于例如掺入到化妆品制剂中的组分(例如但不限于天然着色剂、防腐剂、乳化剂、抗氧化剂等，其对例如对皮肤、头发、头皮等没有活性，但在成品的制剂中发挥作用)、递送系统、销售辅助(例如，应用于半透明制剂的彩色中性球)和制备与其相关的任何物质的方法，其可用于/用于/旨在用于:

-通过在人体或动物体上摩擦、倾倒、喷洒、喷雾或以其它方式直接施用，和/或通过与人体或动物体的各种外部和/或表面部分(包括但不限于皮肤、毛发、体毛、毛发系统、头皮、指甲、嘴唇、外生殖器、牙齿、口腔和/或鼻粘膜等)接触施用；和/或间接施用到人体或动物体上，例如作为织物的一部分施用或作为施用到织物上的递送装置(例如胶囊)或递送系统(例如共混物或制剂)的一部分施用到织物上；和/或

-清洁、护理、冷却、美容、调理、治疗、舒缓、纹理化、提高吸引力、保护、维持、改善、增强、更改和/或改变人体或动物体的外部和/或表面(例如但不限于头皮)或人体或动物的美学外观；和/或为了主要清洁或调香，或保护或保持良好状态，或对抗体味，或通过提供皮肤的镇静、愈合、修复或新生、水合作用来改变或纠正或修复皮肤、口腔粘膜、头皮或头发的不平衡状态，或者为了缓解、润滑、润湿、调理、愈合、消毒、缓解、纠正和/或补救干燥、刺激、损伤或疲劳状态，和/或为了纠正色素沉着障碍或提供头皮屑、痤疮、刺激和/或炎症等的非药物预防和治疗和/或重新平衡皮肤表面上的细菌菌群(例如微生物组)(例如，通过提高皮肤表面上有益细菌菌群的水平)和/或为了保持人体或动物身体处于良好状态以达到健康和/或幸福目的和/或改善人体或动物体的外观，例如，通过改善施用于人体或动物体上的产品的外观；和/或

-提供具有生物活性益处的化妆品和/或皮肤科功能和/或益处(但不影响身体结构或功能。为免生疑问，化妆品或化妆品活性成分或其任何部分也可作为功能性成分和/或营养品。

“功能性成分”是指具有药用或健康益处的食品成分或食品的一部分，包括以下任何一种：类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、多酚(如白藜芦醇)、植物甾醇或甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)、多元醇、益生元、植物雌激素、大豆蛋白，硫化物/硫醇、维生素、葡糖胺、防腐剂、水合剂、可食用凝胶成分、可食用凝胶混合物和凝胶组合物、长链伯脂族饱和醇、着色剂、纹理剂、乳化剂及其组合。

“营养品”是指与健康和/或化妆品益处相关以及改善或保持人体外观的任何和所有天然的、天然存在的、可持续的、人工合成产生的和生物合成产生的化合物、化合物的混合物、功能成分、分子、组合物、原料和中间体(包括与其相关的组分和递送装置(如胶囊)、其递送系统(如共混物或制剂)和制备前述物质的方法)。为免生疑问，营养品包括可用作食品或饮料补充剂的化合物，无论是固体制剂、胶囊、片剂、液体制剂、溶液还是悬浮液。

可供选择地，营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品可以由或基本上由本发明的组合物组成。

化妆品制剂/产品可以是抗衰老制剂。

如本文所用，提及药学上、兽医学上或美容上可接受的赋形剂可指本领域技术人员已知的药学上、兽医学上或美容上可接受的佐剂、稀释剂和/或载体。

所谓“药学上/兽医学上/美容上可接受”，我们的意思是该组合物的附加组分通常是安全、无毒的，并且在生物学上或其他方面都不是有害的。例如，额外组分通常可以是无菌的和无热原的。从与本发明的组合物相容的意义上讲，此类组分必须是“可接受的”，并且对其接受者没有害。因此，“药学上可接受的赋形剂”包括用于形成制剂一部分的任何化合物，该化合物仅用作赋形剂，即本身不具有生物活性。

营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品可以是液体或固体的形式。

口服施用的液体剂型/产品包括溶液、乳液、水性或油性悬浮液、糖浆和酏剂。

本文所述的制剂和产品(例如药物、兽医或化妆品制剂/产品)，例如用于口服施用的制剂和产品，可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如通过将制剂/产品的组分混合在一起。

制剂或产品(例如药物、兽医或化妆品制剂/产品)可含有一种或多种额外成分，例如药物成分和赋形剂，例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。

制剂或产品(例如药物、兽医或化妆品制剂/产品)还可以含有一种或多种额外的活性成分，例如化妆品或药物活性成分，例如透明质酸、积雪草(centella asiatica)提取物、肽，例如和/>以及它们的混合物。

本发明的制剂或产品可含有与无毒药学上可接受的赋形剂(或成分)混合的一种或多种活性成分。这些赋形剂(或成分)可以是，例如：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒和崩解剂，例如玉米淀粉、麦芽糊精或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石及其混合物。

液体制剂或产品(例如药物、兽医或化妆品制剂/产品)可以包含在胶囊内，其可以是如上所述的未涂覆或涂覆的。

合适的药物或兽医载体包括惰性固体稀释剂或填料、无菌水溶液和各种有机溶剂。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。

此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何缓释材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡混合。

合适的药物载体包括惰性无菌水溶液和各种有机溶剂。液体载体的实例是糖浆、植物油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何缓释材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡混合。

合适的化妆品载体通常是那些适合于局部施用到人体外表面，例如皮肤和/或头发和/或头皮的化妆品载体。

通常，此类载体是皮肤学上可接受的。

术语“皮肤学上可接受的载体”是指该载体适用于局部施用至角质组织，具有良好的美学性能，与组合物中的活性物质相容，并且不会引起任何不合理的安全性或毒性问题。

载体可以有多种形式。在某些情况下，组分(例如提取物、防晒活性成分、其他组分)的溶解度或分散性可能决定载体的形式和特性。非限制性实例包括简单溶液(例如水溶液或无水溶液)、分散体、乳液和固体形式(例如凝胶、棒、可流动固体或无定形材料)。

皮肤学上可接受的载体可以是乳液的形式。乳液通常可分为具有连续水相(例如水包油和水包油包水)或连续油相(例如油包水或水包油)。本发明的油相可以包含硅油、非硅油，例如烃油、酯、醚等，以及它们的混合物。水相通常包含水和水溶性成分(例如水溶性保湿剂、调理剂、抗菌剂、保湿剂和/或其他皮肤护理活性物质)。然而，在一些情况下，水相可以包含除水之外的组分，包括但不限于水溶性保湿剂、调理剂、抗菌剂、保湿剂和/或其他水溶性皮肤护理活性物质。在一些情况下，组合物的非水组分包含保湿剂，例如甘油和/或其他多元醇。乳液也可能含有乳化剂。乳化剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。

载体可以包含一种或多种皮肤学上可接受的亲水性稀释剂。如本文所用，“稀释剂”包括其中可以分散、溶解或以其他方式掺入本发明组合物的材料。亲水性稀释剂包括水、有机亲水性稀释剂，例如低级单价醇(例如C₁-C₄)，以及低分子量二醇和多元醇，包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、丁二醇、1,2,4-丁三醇、山梨醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇、异丙醇、山梨醇酯，丁二醇、醚丙醇、乙氧基醚、丙氧基醚及其组合。

化妆品制剂/产品可以任选地包括化妆品组合物中常用的一种或多种其他成分(例如，着色剂、调肤色剂、皮肤抗老化剂、抗炎剂、防晒剂、这些的组合等)，条件是所述其他成分不会不期望地改变组合物提供的抗糖化(anti-glycation)益处。

在某些情况下，可能需要选择通过不同生物途径发挥作用的调肤色剂，以使活性物质不会相互干扰，这可能会降低两种试剂的功效。当添加到组合物中时，所述其他成分应适合与人类皮肤组织接触使用，而不会产生过度毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。

如本文使用，术语“载体”也可以指天然产物或来源于自然、经过转化或改性使其不同于其来源的天然产物的产物，例如麦芽糊精。

本发明组合物在营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品中的含量将根据应用而变化。

通常，本发明的组合物可存在于营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品中的量将为营养品、药物、兽医、酒类或化妆品制剂/产品的约0.001-约50重量％，例如约0.01％-约30重量％或约1％-约20重量％，例如制剂或产品的约0.01至约20％、或约0.1至10％、或约1至约5重量％。

方法和用途

如前所述，本发明人出人意料地发现，将鼠尾草酸与视黄醇组合可减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性，特别是在生物视黄醇形成过程中。

因此，本发明提供了一种用于减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性的方法，其中所述方法包括将视黄醇与鼠尾草酸组合。

本发明还提供鼠尾草酸在减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性中的用途。

特别地，本发明提供一种减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性的方法，其中将鼠尾草酸添加到包含能够提供视黄醇的微生物的培养基中。

与本发明的组合物一样，鼠尾草酸可以以从选自唇形科的至少一种植物，例如如上文定义的迷迭香和/或鼠尾草获得或可获得的提取物的形式提供。

在本文所述的方法或用途中，一旦组合，鼠尾草酸的存在量可以为该组合的至少约0.5重量％。

在本文定义的方法或用途中，视黄醇和鼠尾草酸(例如，以从先前定义的唇形科的植物获得或可获得的提取物的形式)可以组合在化妆品制剂中，例如抗衰老制剂。

如本文所用，术语“减少或防止视黄醇的氧化”是指在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，少于约10％的存在于组合物中的视黄醇被氧化为视黄醛和/或视黄酸。例如，在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，少于约5％的存在于组合物中的视黄醇被氧化成视黄醛和/或视黄酸，或少于1％或少于0.5％的存在于组合物中的视黄醇被氧化成视黄醛和/或视黄酸。

如本文所用，术语“增强视黄醇的氧化稳定性”是指在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，至少90％的存在于组合物中的视黄醇仍是视黄醇的形式。例如，在至少1个月、或至少3个月或至少6个月的时间段内，超过95％的存在于组合物中的视黄醇仍是视黄醇的形式，或超过99％或99.5％的存在于组合物中的视黄醇仍是视黄醇的形式。

将参考以下非限制性实例来进一步描述本发明：

实施例1：本发明组合物的制备

将72.9kg葵花油在50-55℃下加热，并加入8.8kg迷迭香水乙醇提取物。搅拌混合物直到迷迭香提取物完全溶解。然后在过滤板AF6(保留率35-15μm)上用1％的珍珠岩对混合物进行热过滤。然后对混合物中的鼠尾草酸含量进行定量，并在需要时用额外的油进行调节，以获得按照混合物重量计4％的鼠尾草酸。

然后将45kg视黄醇和55kg上述获得的油混合物在35℃下混合。

实施例2：与包含BHT的视黄醇组合物相比，本发明组合物中视黄醇的氧化稳定性。

视黄醇不可逆地氧化为视黄酸。为了评估本发明组合物的氧化稳定性，在1、3和6个月时测试本发明范围内的组合物和仅包含BHT的组合物，以确定是否发生了任何视黄醇氧化。

如下面的表1至表4所示，包含视黄醇和鼠尾草酸或视黄醇、鼠尾草酸和BHT的组合物能够将视黄醇稳定在与单独包含BHT作为抗氧化剂的视黄醇组合物相似的水平。这些稳定性测试分别在室温(RT)、低温(4℃)和高温(40℃)下进行。

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Claims (13)

1.一种用于制备包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物的方法，该方法包括在包含油的培养基中培养能够提供视黄醇的微生物的步骤，使得视黄醇在油中聚积，其中将鼠尾草酸加入培养基中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在培养开始时和/或在培养过程中将所述鼠尾草酸加入培养基中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述鼠尾草酸以对微生物无毒的量加入。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括从培养的微生物和/或培养基中分离包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物的步骤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述鼠尾草酸是从选自唇形科的至少一种植物获得或可获得的提取物的形式，更优选其中所述鼠尾草酸是从迷迭香获得或可获得的提取物的形式，优选水乙醇提取物，其中从迷迭香获得或可获得的提取物优选为叶提取物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中从迷迭香获得或可获得的提取物中的鼠尾草酸含量为迷迭香提取物的至少约20重量％，更优选至少约30％。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物在包含一种或多种植物油或菜油的培养基中培养，所述植物油或菜油选自下述的一种或多种：椰子油、棕榈油、棉籽油、小麦胚芽油、大豆油、芝麻油、橄榄油、玉米油、葵花油、红花油、花生油、亚麻籽油、葡萄籽油、菜籽油及其混合物，优选葵花油。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其可以任选地被基因改性以优化视黄醇的产生。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物在含有水相和油提取相的生物反应器中培养。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物是化妆品组合物。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括将包含视黄醇、油和鼠尾草酸的组合物配制成制剂的步骤，所述制剂优选为化妆品制剂，更优选为抗衰老制剂。

12.一种可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的组合物，特别是化妆品组合物。

13.一种减少或防止视黄醇的氧化和/或增强视黄醇的氧化稳定性的方法，其中将鼠尾草酸加入包含能够提供视黄醇的微生物的培养基中。