CN116987726A - 一种将非特定血型红细胞转化为o型血红细胞的组合酶系的制备方法及应用 - Google Patents
一种将非特定血型红细胞转化为o型血红细胞的组合酶系的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系的制备方法，该方法利用添加有标签的质粒作为克隆载体，顺利表达纯化得到有活性的A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2、B型血红细胞转化酶融合蛋白，将上述三种转化酶融合蛋白等摩尔数混合，配置得到将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系；本发明还提供一种采用上述方法制得的组合酶系在制备非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的制剂中的应用，该制剂不限定捐献者和需求者的血型，捐献者的红细胞经制剂处理后，即可安全的输注到需求者体内，在紧急情况下，配型相同的红细胞不足时，是非常有效的补充方案，能够极大程度的挽救伤者生命。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及一种将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系的制备方法及应用。
背景技术
失血是各种严重创伤导致死亡的主要因素。尽管进行生理盐水或者代血浆等补充体液可以暂时缓解血容量骤降导致的休克，但无法防治因红细胞减少致血液携氧能力降低而诱发的组织缺氧，甚至衰竭，导致后续出现致死致残。而使用促红细胞生成素等手段动员骨髓红细胞在时间上完全无法满足急救需求，所以及时补充红细胞是对创伤失血进行有效救治的最关键手段。日常医疗活动本就对红细胞有着巨大的需求，全球年使用量达8,500万单位[1]以上。在战争状态或者遇到严重自然灾害出现大规模需求时，各级医院，尤其是基层医院对红细胞的存储能力有限，临时从各级血库调血无疑难度极大。最有效的办法就是现地通过献血方式进行采血，该方法除去普通医疗条件限制外，面临的最重要问题就是红细胞血型配伍的问题。
我国人种在血型配伍方面最重要的区分是ABO血型(亚洲人种Rh阴性人群仅2％)，其中O型血39.8％，A型血27.6％，B型血25.5％，AB型血7.1％，显然同血型的输注最安全。但是紧急情况下，在同血型红细胞不足的情况下或者对不明血型伤员来说，输注O型血红细胞是最安全的选择，所以将其称为“通用红细胞”。但是根据人群比例，能直接获取的O型红细胞不足40％。所以，设法获得更多的O型血红细胞是亟待解决的问题。
除了从O型血供血者体内进行采集外，研究发现其他血型的红细胞能够转变为“通用”的O型。原因是ABO血型差异的本质不涉及蛋白抗原，而仅仅是红细胞表面蛋白上聚糖末端的不同。A型血是在O型血的H聚糖抗原上添加了α1,3-氮乙酰基半乳糖(α1,3-GalNAc)，B型血是在O型血的H聚糖抗原上添加了α1,3-半乳糖(α1,3-Gal)，而AB型血是在同一个人体内的H抗原上分别添加了α1,3-氮乙酰基半乳糖(α1,3-GalNAc)和α1,3-半乳糖(α1,3-Gal)。理论上只要找到能特异性去除以上两种末端糖基的办法，即可将所有血型转变为O型血。自1980年Goldstein使用绿咖啡豆来源的α-半乳糖苷酶将长臂猿红细胞上B抗原成功移除[2]以后，多项研究陆续报道成功将B型血转化为O型，并完成了回输不同血型人体的试验[3-7]，ZymeQuest公司也基于相关研究成果进行了血型转换方面的设备研发，提示该方案具有相当强的可行性，但转化B型血红细胞涉及到的B型转化酶，采用直接进行原始序列和GST标签的表达策略时均出现大量包涵体，无法直接获得有活性的B型转化酶。A型血转换方面直到2019年Rahfeld在Nature Microbiology上报道利用两种酶协同作用，才实现在适宜pH值、不需拥挤剂及室温下的转换[8]，为全血型向O型血转变打下基础，但在表达获取相关酶的重组蛋白时发现，转化A型血红细胞涉及的两种酶(A型转化酶1和A型转化酶2)在采用直接进行原始序列表达策略时无法得到产品。另外，目前也没有可以将非限定血型的红细胞转化为O型血红细胞(可以安全输注给任何血型患者)的试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系的制备方法，该方法通过将A型血红细胞转化酶1的基因序列插入添加有GST标签的pGEX-6p-1质粒中、将A型血红细胞转化酶2的基因序列插入添加有GST标签的pGEX-6p-1质粒中，表达后得到连接有GST标签的A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2，纯化后用PP酶切割GST标签，成功得到具有活性无GST标签的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2；将B型血红细胞转化酶的基因序列插入添加有HIS标签的pET-28a质粒中，表达后得到连接有HIS标签的B型血红细胞转化酶融合蛋白，镍柱系统纯化后得到具有活性的B型血红细胞转化酶；将通过上述方法制得的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2、B型血红细胞转化酶等摩尔数混合，配置得到将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系。
本发明还提供一种采用上述方法制得的组合酶系在制备非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的制剂中的应用，采用该制剂可以不限定捐献者和需求者的血型，捐献者的红细胞经过制剂处理后，即可安全的输注到需求者体内，在紧急情况下，配型相同的红细胞不足时，是非常有效的补充方案，能够极大程度的挽救伤者生命。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系的制备方法，包括以下步骤：
1)表达：
a)将A型血红细胞转化酶1的核苷酸序列插入带GST标签的pGEX-6p-1质粒中，将A型血红细胞转化酶2的核苷酸序列插入带GST标签的pGEX-6p-1质粒中，将B型血红细胞转化酶的核苷酸序列插入带HIS标签的pET-28a质粒中；
b)将步骤a)中得到的[A1]-pGEX-6p-1重组质粒转化至E.Coli BL21中诱导表达，得到A型血红细胞转化酶融合蛋白1，将[A2]-pGEX-6p-1重组质粒转化至E.Coli BL21中诱导表达，得到A型血红细胞转化酶融合蛋白2，将[B]-pET-28a重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)中诱导表达，得到B型血红细胞转化酶融合蛋白；
2)将步骤1)中得到的A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2、B型血红细胞转化酶融合蛋白纯化；
3)将步骤2)纯化后得到的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2、B型血红细胞转化酶等摩尔数混合，配置得到将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系。
所述A型血红细胞转化酶1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，核苷酸序列为SEQ IDNO:2；
所述A型血红细胞转化酶2的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，核苷酸序列为SEQ IDNO:4；
所述B型血红细胞转化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
所述步骤b)中A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2表达的方法：将重组质粒加入E.Coli BL21中，混匀后冰上放置，42℃热激，立即放入冰上，加入LB培养基，37℃振荡培养，涂布到Amp抗性的LB固体培养板上，倒置培养过夜，挑取单个菌落扩增，再取菌液以1:100扩增，待测菌液OD600值为0.6时，加入诱导剂，诱导表达16h，分别得到A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2。
所述步骤b)中B型血红细胞转化酶融合蛋白表达的方法：将重组质粒加入E.ColiBL21(DE3)中，混匀后冰上放置，42℃热激，立即放入冰上，加入LB培养基，37℃振荡培养，涂布到Kana抗性的LB固体培养板上，倒置培养过夜，挑取单个菌落扩增，取菌液以1:100扩增，待测菌液OD600值为0.6时，加入诱导剂，诱导表达16h，得到B型血红细胞转化酶融合蛋白。
所述诱导剂为0.1mM的IPTG。
所述诱导剂为0.05mM半乳糖。
所述步骤2)中A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2纯化的方法：超声破碎E.Coli BL21，收集上清液以0.45μm滤膜过滤，使用GlutathioneSepharose 4B重力柱纯化，上柱结合6h，洗杂，用PP酶4℃酶切过夜后，分别得到纯化的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2。
所述步骤2)中B型血红细胞转化酶融合蛋白纯化的方法：超声破碎E.Coli BL21(DE3)，收集上清液以0.45μm滤膜过滤，使用Ni-NTA-Beads重力柱纯化，以100mM咪唑-磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，再以250mM咪唑-磷酸盐缓冲液收集，得到B型血红细胞转化酶。
采用上述方法制得的组合酶系在制备非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的制剂中的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明有如下优点：
1.本发明所述方法利用添加有标签的质粒作为克隆载体，顺利表达纯化得到有活性的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2、B型血红细胞转化酶。
2.本发明还提供一种采用上述方法制得的组合酶系在制备非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的制剂中的应用，采用该制剂可以不限定捐献者和需求者的血型，捐献者的红细胞经过制剂处理后，即可安全的输注到需求者体内，在紧急情况下，配型相同的红细胞不足时，是非常有效的补充方案，能够极大程度的挽救伤者生命。
附图说明
图1为A型血红细胞转化酶融合蛋白1的诱导表达的印迹图，图中，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为诱导后的菌体上清，泳道2为诱导后的菌体沉淀，泳道3为诱导后的菌体，泳道4为经诱导的菌体蛋白，泳道5为裂解后的菌体上，泳道6为裂解后的菌体。
图2为A型血红细胞转化酶1的纯化的印迹图，图中，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为A型血红细胞转化酶1纯化前，泳道2为A型血红细胞转化酶1纯化后，泳道3为纯化后的Glutathione-Beads填料。
图3为A型血红细胞转化酶融合蛋白2的诱导表达的印迹图，图中，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为诱导后的菌体裂解上清，泳道2为诱导后的菌体裂解沉淀。
图4为A型血红细胞转化酶2的纯化的印迹图，图中，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为A型血红细胞转化酶2纯化后，泳道2为纯化后未结合的蛋白，泳道3为纯化后的Glutathione-Beads填料。
图5为B型血红细胞转化酶融合蛋白的诱导表达的印迹图，图中，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为未经诱导的菌体蛋白，泳道2为半乳糖诱导后的菌体裂解上清，泳道3为半乳糖诱导后的菌体裂解沉淀，泳道4为IPTG诱导后的菌体裂解沉淀，泳道5为IPTG诱导后的菌体裂解上清。
图6为B型血红细胞转化酶的纯化的印迹图，图中，泳道M为蛋白质Marker，泳道1为B纯化后未结合的蛋白，泳道2为50mM咪唑-磷酸盐洗脱液洗脱，泳道3为100mM咪唑-磷酸盐洗脱液洗脱，泳道4为250mM咪唑-磷酸盐洗脱液洗脱，泳道5为500mM咪唑-磷酸盐洗脱液洗脱，泳道6为1M咪唑-磷酸盐洗脱液洗脱，泳道7为1M咪唑-磷酸盐洗脱液洗脱，泳道8为纯化后的Ni-NTA-Beads填料。
图7为A型血红细胞向O型血红细胞的转化过程，图中，图7a：未加抗体的A型血红细胞；图7b：仅使用溶剂处理后加抗体；图7c：酶系处理后加抗体。
图8为B型血红细胞向O型血红细胞的转化过程，图中，图8a：未加抗体的B型血红细胞；图8b：仅使用溶剂处理后加抗体；图8c：酶系处理后加抗体。
图9为AB型血红细胞向O型血红细胞的转化过程，图中，图9a：未加抗体的AB型血红细胞；图9b：仅使用溶剂处理后加抗体；图9c：酶系处理后加抗体。
具体实施方式
试剂来源：
E.Coli BL21(生工生物工程股份有限公司，中国)
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)
Glutathioner Sephaose 4B(GE Healthcare Life Sciences，美国)
PP酶(碧云天生物技术有限公司，中国)
氨苄青霉素(Sigma-Aldrich，德国)
E.Coli BL21(DE3)(生工生物工程股份有限公司，中国)
半乳糖(麦克林生化科技股份有限公司，中国)
卡那霉素(生工生物工程股份有限公司，中国)
Ni-NTA-Beads(天地人和生物科技有限公司，中国)
咪唑(麦克林生化科技股份有限公司，中国)
磷酸盐缓冲液(无锡傲锐东源生物科技公司，中国)
氯化钠(Sigma-Aldrich，德国)
胰蛋白胨(OXOID，英国)
酵母提取物(OXOID，英国)
抗A抗B血型定性试剂(索莱宝科技有限公司，中国)
本实施例所述的其他试剂均采用商用的分析纯试剂。
实施例1
本实施例为对A型血红细胞转化酶1(简称A1，下同)的表达纯化。
1.1A型血红细胞转化酶1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：GSADSSESALNKAPGYQDFPAYYSDSAHADDQVTHPDVVVLEEPWNGYRYWAVYTPNVMRISIYENPSIVASSDGVHWVEPEGLSNPIEPQPPSTRYHNCDADMVYNAEYDAMMAYWNWADDQGGGVGAEVRLRISYDGVHWGVPVTYDEMTRVWSKPTSDAERQVADGEDDFITAIASPDRYDMLSPTIVYDDFRDVFILWANNTGDVGYQNGQANFVEMRYSDDGITWGEPVRVNGFLGLDENGQQLAPWHQDVQYVPDLKEFVCISQCFAGRNPDGSVLHLTTSKDGVNWEQVGTKPLLSPGPDGSWDDFQIYRSSFYYEPGSSAGDGTMRVWYSALQKDTNNKMVADSSGNLTIQAKSEDDRIWRIGYAENSFVEMMRVLLDDPGYTTPALVSGNSLMLSAETTSLPTGDVMKLETSFAPVDTSDQVVKYTSSDPDVATVDEFGTITGVSVGSARIMAETREGLSDDLEIAVVENPYT
1.2A型血红细胞转化酶1核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：
5’-
GGATCCGCTGACTCTTCTGAATCTGCTCTGAACAAAGCTCCGGGTTACCAG
GACTTCCCGGCTTACTACTCTGACTCTGCTCACGCTGACGACCAGGTTACC
CACCCGGACGTTGTTGTTCTGGAAGAACCGTGGAACGGTTACCGTTACTG
GGCTGTTTACACCCCGAACGTTATGCGTATCTCTATCTACGAAAACCCGTCT
ATCGTTGCTTCTTCTGACGGTGTTCACTGGGTTGAACCGGAAGGTCTGTCT
AACCCGATCGAACCGCAGCCGCCGTCTACCCGTTACCACAACTGCGACGC
TGACATGGTTTACAACGCTGAATACGACGCTATGATGGCTTACTGGAACTG
GGCTGACGACCAGGGTGGTGGTGTTGGTGCTGAAGTTCGTCTGCGTATCT
CTTACGACGGTGTTCACTGGGGTGTTCCGGTTACCTACGACGAAATGACCC
GTGTTTGGTCTAAACCGACCTCTGACGCTGAACGTCAGGTTGCTGACGGT
GAAGACGACTTCATCACCGCTATCGCTTCTCCGGACCGTTACGACATGCTG
TCTCCGACCATCGTTTACGACGACTTCCGTGACGTTTTCATCCTGTGGGCTA
ACAACACCGGTGACGTTGGTTACCAGAACGGTCAGGCTAACTTCGTTGAA
ATGCGTTACTCTGACGACGGTATCACCTGGGGTGAACCGGTTCGTGTTAAC
GGTTTCCTGGGTCTGGACGAAAACGGTCAGCAGCTGGCTCCGTGGCACCA
GGACGTTCAGTACGTTCCGGACCTGAAAGAATTCGTTTGCATCTCTCAGTG
CTTCGCTGGTCGTAACCCGGACGGTTCTGTTCTGCACCTGACCACCTCTAA
AGACGGTGTTAACTGGGAACAGGTTGGTACCAAACCGCTGCTGTCTCCGG
GTCCGGACGGTTCTTGGGACGACTTCCAGATCTACCGTTCTTCTTTCTACTA
CGAACCGGGTTCTTCTGCTGGTGACGGTACCATGCGTGTTTGGTACTCTGC
TCTGCAGAAAGACACCAACAACAAAATGGTTGCTGACTCTTCTGGTAACC
TGACCATCCAGGCTAAATCTGAAGACGACCGTATCTGGCGTATCGGTTACG
CTGAAAACTCTTTCGTTGAAATGATGCGTGTTCTGCTGGACGACCCGGGTTACACCACCCCGGCTCTGGTTTCTGGTAACTCTCTGATGCTGTCTGCTGAAACCACCTCTCTGCCGACCGGTGACGTTATGAAACTGGAAACCTCTTTCGCTCCGGTTGACACCTCTGACCAGGTTGTTAAATACACCTCTTCTGACCCGGACGTTGCTACCGTTGACGAATTCGGTACCATCACCGGTGTTTCTGTTGGTTCTGCTCGTATCATGGCTGAAACCCGTGAAGGTCTGTCTGACGACCTGGAAATCGCTGTTGTTGAAAACCCGTACACCTAACTCGAG-3’。
1.3将A型血红细胞转化酶1的核苷酸序列插入克隆载体(pGEX-6p-1)(GST标签)中，酶切位点为BamHI和XhoI。
1.4表达条件：将[A1]-pGEX-6p-1重组质粒转化至E.Coli BL21，0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。具体操作如下：向100uL E.Coli BL21中加入10ng[A1]-pGEX-6p-1重组质粒，轻柔混匀后冰上放置30min，42℃热激45s后，立即放入冰上2min，加入700uL LB培养基，37℃振荡培养1h，涂布到氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养板上倒置培养过夜。挑取单个菌落37℃扩增12h，取菌液以1:100 37℃扩增，待测菌液OD600值为0.6时，加入0.1mM IPTG诱导表达16h，得到了A型血红细胞转化酶融合蛋白1。12％凝胶电泳，如图1所示，[A1]-pGEX-6p-1重组质粒可见高可溶性表达，蛋白大小与预期理论值相符，结论：A1融合蛋白可溶性表达成功，分子量在80KDa，符合预期理论值，但存在杂蛋白带。
超声破碎菌体后收集的上清液经0.45μm滤膜过滤，使用GlutathioneSepharose4B重力柱进行纯化，上柱结合6h，洗杂后，用PP酶4℃酶切过夜，收集酶切后的样品，对其进行SDS-PAFE分析，如图2所示，图2中标注为“2”的泳道，纯化后得到了高纯度的A型血红细胞转化酶1。
实施例2
本实施例为对A型血红细胞转化酶2(简称A2，下同)的表达纯化。
2.1A型血红细胞转化酶2的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：GSTDTGNAGLIAEGDYAIAGNGVRVTYDADGQTITLYRTEGSGLIQMSKPSPLGGPVIGGQEVQDFSHISCDVEQSTSGVMGSGQRMTITSQSMSTGLIRTYVLETSDIEEGVVYTATSYEAGASDVEVSWFIGSVYELYGAEDRIWSYNGGGEGPMHYYDTLQKIDLTDSGKFSRENKQDDTAASIPVSDIYIADGGITVGDASATRREVHTPVQETSDSAQVSIGWPGKVIAAGSVIEIGESFAVVHPGDYYNGLRGYKNAMDHLGVIMPAPGDIPDSSYDLRWESWGWGFNWTIDLIIGKLDELQAAGVKQITLDDGWYTNAGDWALNPEKFPNGASDALRLTDAIHEHGMTALLWWRPCDGGIDSILYQQHPEYFVMDADGRPARLPTPGGGTNPSLGYALCPMADGAIASQVDFVNRAMNDWGFDGFKGDYVWSMPECYNPAHNHASPEESTEKQSEIYRVSYEAMVANDPNVFNLLCNCGTPQDYYSLPYMTQIATADPTSVDQTRRRVKAYKALMGDYFPVTADHNNIWYPSAVGTGSVLIEKRDLSGTAKEEYEKWLGIADTVQLQKGRFIGDLYSYGFDPYETYVVEKDGVMYYAFYKDGSKYSPTGYPDIELKGLDPNKMYRIVDYVNDRVVATNLMGDNAVFNTRFSDYLLVKAVEISEPDPEPVDPDYGFTSVDDRDEALIYTGTWHDDNNASFSEGTARYTNSTDASVVFSFTGTSIRWYGQRDTNFGTAEVYLDDELKTTVDANGAAEAGVCLFEALDLPAAEHTIKIVCKSGVIDIDRFAYEAATLEPIYEKVDALSDRITYVGNWEEYHNSEFYMGNAMRTDEAGAYAELTFRGTAVRLYAEMSFNFGTADVYLDGELVENIILYGQEATGQLMFERTGLEEGEHTIRLVQNAWNINLDYISYLPEQDQPTPPETTVTVDAMDAQLVYTGVWNDDYHDVFQEGTARYASSAGASVEFEFTGSEIRWYGQNDSNFGVASVYIDNEFVQQVNVNGAAAVGKLLFQKADLPAGSHTIRIVCDTPVIDLDYLTYTTNA
2.2A型血红细胞转化酶2的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
5’-GGATCCACAGACACCGGAAACGCTGGCCTTATCGCTGAGGGCGATTACGCGATCGCGGGAAACGGCGTGCGTGTCACCTACGACGCGGATGGTCAAACCATTACGCTTTACCGTACGGAAGGCTCTGGTTTAATCCAGATGAGCAAACCGTCCCCGCTCGGTGGACCGGTTATTGGTGGTCAAGAGGTCCAAGACTTCAGCCACATTAGCTGTGACGTAGAACAGTCTACCTCCGGCGTTATGGGTTCCGGCCAACGTATGACCATCACCAGCCAGAGCATGAGCACCGGTCTGATCCGCACCTATGTGCTGGAAACCTCTGACATTGAAGAGGGCGTGGTTTACACAGCTACCTCCTACGAAGCAGGCGCGTCCGATGTCGAGGTTAGCTGGTTCATCGGTTCTGTGTACGAGCTGTACGGCGCGGAAGACCGCATCTGGAGCTATAACGGTGGTGGCGAGGGTCCGATGCATTATTACGACACGCTCCAGAAGATCGACTTGACTGACTCTGGCAAGTTTTCACGTGAGAATAAGCAAGACGACACTGCGGCGAGCATTCCGGTGTCGGATATTTACATTGCAGACGGCGGCATCACCGTTGGCGACGCGTCTGCGACCCGTCGTGAAGTCCACACCCCGGTTCAAGAAACCAGCGACTCGGCCCAGGTTTCCATTGGCTGGCCGGGTAAAGTGATCGCGGCGGGCTCCGTAATCGAGATCGGTGAGAGCTTCGCTGTGGTCCACCCGGGTGACTACTACAATGGTCTCAGAGGTTATAAAAATGCCATGGATCATCTGGGTGTTATCATGCCGGCTCCGGGTGATATCCCGGACAGCAGCTACGATCTACGCTGGGAAAGCTGGGGATGGGGCTTTAACTGGACCATCGACTTGATAATCGGTAAGCTGGACGAATTACAAGCGGCGGGTGTGAAGCAGATTACCTTGGACGACGGGTGGTACACCAACGCGGGCGATTGGGCATTGAATCCGGAGAAGTTCCCGAA
TGGCGCGTCGGATGCGTTGCGCCTGACCGATGCGATCCATGAACACGGCAT
GACCGCGTTGCTGTGGTGGCGTCCGTGTGACGGTGGCATTGACTCGATCCT
GTACCAGCAACATCCGGAGTATTTTGTGATGGATGCTGACGGCCGTCCGGC
TCGTCTGCCGACCCCGGGTGGCGGCACCAACCCGAGCCTGGGTTACGCCT
TGTGCCCGATGGCAGACGGTGCCATCGCGTCTCAGGTTGATTTTGTCAACC
GTGCCATGAATGATTGGGGTTTCGATGGCTTCAAAGGTGACTACGTGTGGT
CCATGCCGGAGTGCTATAACCCTGCGCATAATCATGCAAGCCCGGAAGAGA
GCACCGAAAAACAGAGCGAAATCTATCGCGTTAGCTACGAGGCTATGGTT
GCTAACGATCCGAATGTTTTCAACCTGCTTTGCAATTGTGGTACTCCGCAG
GATTACTATAGCTTGCCGTACATGACGCAGATTGCCACGGCGGATCCAACC
TCAGTTGATCAGACCCGCCGTCGCGTGAAGGCCTACAAGGCTCTGATGGG
CGATTACTTCCCAGTGACCGCAGACCACAATAACATCTGGTATCCGAGCGC
GGTGGGCACCGGTTCCGTGCTGATTGAGAAGCGTGATTTGAGTGGTACTG
CTAAAGAAGAATACGAAAAGTGGTTGGGGATCGCAGATACGGTGCAACTG
CAAAAAGGCAGATTCATTGGCGACTTGTACAGCTATGGCTTTGATCCGTAT
GAGACCTACGTTGTCGAAAAGGACGGCGTAATGTACTACGCATTTTATAAA
GATGGCTCCAAATATAGCCCAACGGGTTACCCGGATATAGAACTGAAAGGT
CTCGACCCAAATAAAATGTATCGTATTGTTGACTATGTTAACGATCGCGTTG
TAGCAACGAACCTGATGGGTGACAATGCGGTTTTCAACACCCGTTTTTCGG
ATTATCTGCTGGTGAAGGCGGTGGAAATTTCGGAACCCGACCCGGAGCCG
GTTGACCCAGATTACGGTTTTACCTCTGTTGACGATCGTGACGAAGCGTTG
ATCTACACTGGAACCTGGCATGATGACAACAACGCTAGCTTCTCCGAGGGC
ACTGCACGTTATACCAACAGCACTGACGCATCTGTCGTATTTTCGTTCACC
GGTACTAGTATCCGCTGGTATGGTCAACGTGATACGAACTTCGGCACGGCC
GAAGTTTACCTGGATGATGAATTGAAGACCACGGTTGACGCCAATGGCGC
TGCGGAGGCGGGTGTGTGCTTATTTGAAGCTTTGGATCTGCCGGCTGCCGA
GCACACCATTAAAATCGTGTGCAAATCCGGCGTTATTGATATTGATCGCTTC
GCGTACGAGGCAGCTACCCTGGAACCGATTTATGAAAAGGTGGACGCACT
GAGCGACCGCATCACGTACGTTGGCAACTGGGAAGAGTATCACAACAGCG
AGTTCTATATGGGTAACGCGATGCGTACGGACGAAGCGGGTGCGTATGCGG
AGCTGACGTTTCGTGGAACCGCTGTACGCCTGTACGCGGAAATGAGCTTC
AATTTTGGTACCGCAGACGTGTACCTGGACGGCGAGCTGGTTGAGAACAT
TATCCTGTATGGTCAAGAAGCCACCGGTCAGCTGATGTTCGAACGTACGGG
TCTGGAAGAGGGTGAGCACACCATCCGTTTGGTTCAAAATGCGTGGAATAT
CAACCTGGACTACATTAGCTATCTGCCAGAGCAGGACCAGCCGACCCCTCC
GGAAACCACCGTCACCGTGGATGCTATGGATGCGCAACTCGTTTATACCGG
TGTTTGGAACGATGATTACCACGATGTGTTCCAGGAGGGCACGGCACGTTA
TGCGTCGAGCGCGGGCGCGTCTGTGGAGTTCGAGTTTACCGGTAGCGAGA
TCCGCTGGTATGGTCAAAACGACAGCAATTTTGGCGTTGCTAGTGTGTACA
TTGACAACGAATTCGTTCAGCAGGTCAACGTGAACGGTGCGGCGGCGGTC
GGCAAGCTGCTGTTTCAGAAAGCAGATTTACCGGCGGGTAGCCACACCAT
CCGAATTGTGTGCGACACACCGGTCATCGACCTGGATTACCTGACCTATACTACGAACGCCTAACTCGAG-3’。
2.3将A型血红细胞转化酶2的核苷酸序列插入克隆载体(pGEX-6p-1)(GST标签)中，酶切位点为BamHI和XhoI。
2.4表达条件：将[A2]-pGEX-6p-1重组质粒转化至E.Coli BL21，0.1mM IPTG诱导表达。具体操作如下：向100uL E.Coli BL21中加入10ng[A2]-pGEX-6p-1重组质粒，轻柔混匀后冰上放置30min，42℃热激45s后，立即放入冰上2min，加入700uL LB培养基，37℃振荡培养1h，涂布到Amp抗性的LB固体培养板上倒置培养过夜。挑取单个菌落37℃扩增12h，取菌液以1:100 37℃扩增，待测菌液OD600值为0.6时，加入0.1mM IPTG诱导表达16h，得到了A型血红细胞转化酶融合蛋白2。12％凝胶电泳，如图3所示，[A2]-pGEX-6p-1重组质粒可见高可溶性表达，蛋白大小与预期理论值相符，结论：A2融合蛋白可溶性表达成功，分子量在140KDa左右，符合预期理论值，但存在杂蛋白条带。
超声破碎菌体后收集的上清液经0.45μm滤膜过滤，使用Glutathioner Sephaose4B重力柱进行纯化，上柱结合6h，洗杂后，用PP酶4℃酶切过夜，收集酶切后的样品，对其进行SDS-PAFE分析，如图4所示，图4中标注为“1”的泳道，纯化后得到了纯度较高的A型血红细胞转化酶2。
实施例3
本实施例为对B型血红细胞转化酶(简称B，下同)的表达纯化。
3.1B型血红细胞转化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：KDTIYITDFGATPYSYENCVTQIQAAIDECKRTGAKVLSLPNGRYDIWPEGATRKEYFISNTSTEQECPSKVKTVGLMLDKINDLTIEGNGATLMYHGKMTTLALEHCSHIRINNLHIDFERPAGSEVQYKKVTEGETEVSVHPDTRYEIVNGKINLYGEGWRSNKNHCIEYNPDTESFTYSQGWKILANSAAQEISPGIIRFTTPAGFTPKVGNTLTIRDIIRDQVGLFILESKDITLSRVQMHYMHGLGIVSQYTENVTMDRVRCAPRPGSGRLLAASADMMHFSGCKGKILIDSCYFAGAQDDPVNVHGTNLRAIEKVDAQTLRLRFMHGQSYGFNAYFKGDTVAFVRAATMERFARATIQNVTRISDRILEVRFDRDIPTGMELNHDCVENMTCTPEVEIRNSYFTRTSTRGTLVTTPRKVVIENNTYYKTGMSAILIEADAEGWYESGPVKDVWIKGNTFIDCAYNGGPGHAVIAIHPSNKIVDASHPVHQNIRIENNTFKTFDCPVLYAKSTAGLLFRNNTITRTRTFPATSGNPYTFYLNGCKNAVIESTVFEGEVLGRNIKTENMKRNHLKTTLK
3.2B型血红细胞转化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)：
5’-AAAGATACCATTTATATTACCGATTTTGGCGCGACCCCGTATAGCTATGAAAACTGCGTGACCCAGATTCAGGCGGCGATTGATGAATGCAAACGCACCGGCGCGAAAGTGCTGAGCCTGCCGAACGGCCGCTATGATATTTGGCCGGAAGGCGCGACCCGCAAAGAATATTTTATTAGCAACACCAGCACCGAACAGGAATGCCCGAGCAAAGTGAAAACCGTGGGCCTGATGCTGGATAAAATTAACGATCTGACCATTGAAGGCAACGGCGCGACCCTGATGTATCATGGCAAAATGACCACCCTGGCGCTGGAACATTGCAGCCATATTCGCATTAACAACCTGCATATTGATTTTGAACGCCCGGCGGGCAGCGAAGTGCAGTATAAAAAAGTGACCGAAGGCGAAACCGAAGTGAGCGTGCATCCGGATACCCGCTATGAAATTGTGAACGGCAAAATTAACCTGTATGGCGAAGGCTGGCGCAGCAACAAAAACCATTGCATTGAATATAACCCGGATACCGAAAGCTTTACCTATAGCCAGGGCTGGAAAATTCTGGCGAACAGCGCGGCGCAGGAAATTAGCCCGGGCATTATTCGCTTTACCACCCCGGCGGGCTTTACCCCGAAAGTGGGCAACACCCTGACCATTCGCGATATTATTCGCGATCAGGTGGGCCTGTTTATTCTGGAAAGCAAAGATATTACCCTGAGCCGCGTGCAGATGCATTATATGCATGGCCTGGGCATTGTGAGCCAGTATACCGAAAACGTGACCATGGATCGCGTGCGCTGCGCGCCGCGCCCGGGCAGCGGCCGCCTGCTGGCGGCGAGCGCGGATATGATGCATTTTAGCGGCTGCAAAGGCAAAATTCTGATTGATAGCTGCTATTTTGCGGGCGCGCAGGATGATCCGGTGAACGTGCATGGCACCAACCTGCGCGCGATTGAAAAAGTGGATGCGCAGACCCTGCGCCTGCGCTTTATGCATGGCCAGAGCTATGGCTTTAACGCGTATTTTAAAGGCGATACCGTGGCGTTTGTGCGCGCGGCGACCATGGAACGCTTTGCGCGCGCGACCATTCAGAACGTGACCCGCATTAGCGATCGCATTCTGGAAGTGCGCTTTGATCGCGATATTCCGACCGGCATGGAACTGAACCATGATTGCGTGGAAAACATGACCTGCACCCCGGAAGTGGAAATTCGCAACAGCTATTTTACCCGCACCAGCACCCGCGGCACCCTGGTGACCACCCCGCGCAAAGTGGTGATTGAAAACAACACCTATTATAAAACCGGCATGAGCGCGATTCTGATTGAAGCGGATGCGGAAGGCTGGTATGAAAGCGGCCCGGTGAAAGATGTGTGGATTAAAGGCAACACCTTTATTGATTGCGCGTATAACGGCGGCCCGGGCCATGCGGTGATTGCGATTCATCCGAGCAACAAAATTGTGGATGCGAGCCATCCGGTGCATCAGAACATTCGCATTGAAAACAACACCTTTAAAACCTTTGATTGCCCGGTGCTGTATGCGAAAAGCACCGCGGGCCTGCTGTTTCGCAACAACACCATTACCCGCACCCGCACCTTTCCGGCGACCAGCGGCAACCCGTATACCTTTTATCTGAACGGCTGCAAAAACGCGGTGATTGAAAGCACCGTGTTTGAAGGCGAAGTGCTGGGCCGCAACATTAAAACCGAAAACATGAAACGCAACCATCTGAAAACCACCCTGAAATAA-3’。
3.3将B型血红细胞转化酶的核苷酸序列插入克隆载体(pET-28a)(HIS标签)中，酶切位点为Ndel和XhoI。
3.4表达条件：将[B]-pET-28a重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)，0.05mM半乳糖诱导表达。具体操作如下：向100uL E.Coli BL21(DE3)中加入10ng[B]-pET-28a重组质粒，轻柔混匀后冰上放置30min，42℃热激45s后，立即放入冰上2min，加入700uL LB培养基，37℃振荡培养1h，涂布到卡那霉素(Kana)抗性的LB固体培养板上倒置培养过夜。挑取单个菌落37℃小扩12h，取菌液以1:100 37℃大扩，待测菌液OD600值为0.6时，加入0.05mM半乳糖诱导表达16h，得到了B型血红细胞转化酶融合蛋白。12％凝胶电泳，如图5所示，[B]-pET-28a重组质粒可见高可溶性表达，蛋白大小与预期理论值相符，结论：B融合蛋白可溶性表达成功，分子量在65KDa左右，符合预期理论值，但存在杂蛋白条带。
超声破碎菌体后收集的上清液经0.45μm滤膜过滤，使用Ni-NTA-Beads重力柱进行纯化，上柱洗杂后，用不同浓度的咪唑-磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，SDS-PAGE结果如图6所示，100mM咪唑-磷酸盐缓冲液洗脱出来大量杂蛋白和部分目标蛋白，当洗脱液中咪唑浓度达到250mM以上时，目标蛋白能被大量洗脱下来。综上所述，镍柱纯化时，以100mM咪唑-磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，再以250mM咪唑-磷酸盐缓冲液收集目标蛋白。
实施例4
本实施例为将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系的应用。
将A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2、B型血红细胞转化酶按等摩尔数混合，配置得到够将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系，分别对A型血红细胞、B型血红细胞和AB型血红细胞进行转化试验。
4.1A型血红细胞向O型血红细胞的转化。取A型血1mL于肝素钠抗凝管，100g离心1min后，取红细胞加入1mLPBS洗涤3次，取红细胞加入PBS使最终压积为40％，轻轻颠倒混匀，加入终浓度为140μg/mL的组合酶系，35℃反应1h，其中每10min混匀一次。用检测A型血特异性抗原的抗A血型定型试剂检测，具体步骤为：采用玻片法，取受检样品10uL，1:1加入抗A血型定性试剂，混匀1min，判断有无凝集反应。如图7所示，图7a为未加抗体的A型血红细胞，发现仅使用抗A血型定性试剂处理的红细胞出现凝集，表明有A型血抗原存在(图7b)；而经酶系处理后，红细胞未出现凝集(图7c)，表明该红细胞上面的A型血抗原已经被清除，成为O型血红细胞。
4.2B型血红细胞向O型血红细胞的转化。取B型血1mL于肝素钠抗凝管，100g离心1min后，取红细胞加入1mL PBS洗涤3次，取红细胞加入PBS使最终压积为40％，轻轻颠倒混匀，加入终浓度为140μg/mL的组合酶系，35℃反应1h，其中每10min混匀一次。用检测B型血特异性抗原的抗B型血定型试剂检测，具体步骤为：采用玻片法，取受检样品10uL，1:1加入抗B血型定性试剂，混匀1min，判断有无凝集反应。如图8所示，图8a为未加抗体的B型血红细胞，结果发现仅使用抗B型血定型试剂处理的红细胞出现凝集，表明有B型血抗原存在(图8b)；而经酶系处理后，红细胞未出现凝集(图8c)，表明该红细胞表面的B型血抗原已经被清除，成为O型血红细胞。
4.3AB型血红细胞向O型血红细胞的转化。取AB型血1mL于肝素钠抗凝管，100g离心1min后，取红细胞加入1mL PBS洗涤3次，取红细胞加入PBS使最终压积为40％，轻轻颠倒混匀，加入终浓度为140μg/mL的反应酶系，35℃反应1h，其中每10min混匀一次。用检测A型血特异性抗原的抗A型血定型试剂和检测B型血特异性抗原的抗B型血定型试剂检测，具体步骤为：采用玻片法，取受检样品两份各10uL，1:1分别加入抗A和抗B血型定性试剂，混匀1min，判断有无凝集反应。如图9所示，图9a为未加抗体的AB型血红细胞，结果发现仅使用抗A和抗B血型定性试剂处理的红细胞均出现凝集，表明有A型血抗原和B型血抗原存在(图9b)；而经酶系处理后，红细胞均未出现凝集(图9c)，表明该红细胞上面的A型血抗原和B型血抗原均已经被清除，成为O型血红细胞。
参考文献：
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[2]Lenny,L.,Goldstein J.(1980)Enzymatic removal of blood group-Bantigen from gibbon erythrocytes.Transfusion 20,618
[3]Goldstein,J.,Siviglia,G.,Hurst,R.,et al.(1982)Group-B erythrocytesenzymatically converted to group-O survive normally in A,B,and Oindividuals.Science 215,168–170
[4]Lenny,L.L.,Hurst,R.,Goldstein,J.,et al.(1991)Single-unittransfusions of RBC enzymatically converted from group B togroup O to A and Onormal volunteers.Blood77,1383–1388
[5]Lenny,L.,Hurst,R.,Goldstein,J.,and Galbraith,R.(1994)Transfusionsto group O subjects of 2units of red cells enzymatically converted from groupB to group O.Transfusion 34,209–214
[6]Lenny,L.,Hurst,R.,Zhu,A.,et al.(1995)Multiple-unit and secondtransfusions of red cells enzymatically converted from group B to group O:report on the end of phase 1trials.Transfusion 35,899–902
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Claims (9)
1.一种将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)表达：
a)将A型血红细胞转化酶1的核苷酸序列插入带GST标签的pGEX-6p-1质粒中，将A型血红细胞转化酶2的核苷酸序列插入带GST标签的pGEX-6p-1质粒中，将B型血红细胞转化酶的核苷酸序列插入带HIS标签的pET-28a质粒中；
b)将步骤a)中得到的[A1]-pGEX-6p-1重组质粒转化至E.Coli BL21中诱导表达，得到A型血红细胞转化酶融合蛋白1，将[A2]-pGEX-6p-1重组质粒转化至E.ColiBL21中诱导表达，得到A型血红细胞转化酶融合蛋白2，将[B]-pET-28a重组质粒转化至E.ColiBL21(DE3)中诱导表达，得到B型血红细胞转化酶融合蛋白；
2)将步骤1)中得到的A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2、B型血红细胞转化酶融合蛋白纯化；
3)将步骤2)纯化后得到的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2、B型血红细胞转化酶等摩尔数混合，配置得到将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述A型血红细胞转化酶1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
所述A型血红细胞转化酶2的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
所述B型血红细胞转化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2表达的方法：将重组质粒加入E.Coli BL21中，混匀后冰上放置，42℃热激，立即放入冰上，加入LB培养基，37℃振荡培养，涂布到Amp抗性的LB固体培养板上，倒置培养过夜，挑取单个菌落扩增，再取菌液以1:100扩增，待测菌液OD600值为0.6时，加入诱导剂，诱导表达16h，分别得到A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中B型血红细胞转化酶融合蛋白表达的方法：将重组质粒加入E.ColiBL21(DE3)中，混匀后冰上放置，42℃热激，立即放入冰上，加入LB培养基，37℃振荡培养，涂布到Kana抗性的LB固体培养板上，倒置培养过夜，挑取单个菌落扩增，取菌液以1:100扩增，待测菌液OD600值为0.6时，加入诱导剂，诱导表达16h，得到B型血红细胞转化酶融合蛋白。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述诱导剂为0.1mM的IPTG。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述诱导剂为0.05mM半乳糖。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中A型血红细胞转化酶融合蛋白1、A型血红细胞转化酶融合蛋白2纯化的方法：超声破碎E.ColiBL21，收集上清液以0.45μm滤膜过滤，使用Glutathione Sepharose 4B重力柱纯化，上柱结合6h，洗杂，用PP酶4℃酶切过夜后，分别得到纯化的A型血红细胞转化酶1、A型血红细胞转化酶2。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中B型血红细胞转化酶融合蛋白纯化的方法：超声破碎E.Coli BL21(DE3)，收集上清液以0.45μm滤膜过滤，使用Ni-NTA-Beads重力柱纯化，以100mM咪唑-磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，再以250mM咪唑-磷酸盐缓冲液收集，得到B型血红细胞转化酶。
9.采用权利要求1所述方法制得的能将非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的组合酶系在制备非特定血型红细胞转化为O型血红细胞的制剂中的应用。
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