CN116987690A - 向植物细胞中导入外源dna的方法及由其获得的融合细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种向植物细胞中导入外源DNA的方法及由其获得的融合细胞。其中，所述方法包括：(1)分别获得拟南芥原生质体和酵母原生质体：(2)将拟南芥原生质体与酵母原生质体混匀，使发生融合；其中，所述酵母原生质体与所述拟南芥原生质体的用量比为(40～60):1。本发明突破性地实现了酵母和拟南芥细胞的融合技术，并能实现后续融合培养物的稳定培养，后续细胞再生培养可形成细胞团，且细胞状态正常。本发明为实现植物大尺度片段DNA的转移和植物人工染色体的合成奠定了关键技术基础，也为研究不同细胞融合机制提供了一种新模型。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种向植物细胞中导入外源DNA的方法、由其获得的融合细胞及其应用。
背景技术
细胞融合技术是20世纪60年代发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合(Cell Fusion)也称细胞杂交、原生质体融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融合三类。其中，最常用的是化学法PEG诱导融合。其优点是融合成本低，无需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
对植物基因组进行大尺度的修改仍是目前无法解决的难题，其主要难点在于无法有效将大片段DNA转移到植物细胞中。现有的植物外源基因转化技术常为农杆菌侵染转化、基因枪转化法，但是这些转化方法对片段大小限制严格，无法解决人工染色体合成研究所需的大尺度DNA的转化技术难题。细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，其可将一个细胞中的基因组高效转移到受体细胞，是进行大片段DNA转移的理想方法。
酵母作为进行基因组合成的重要载体，人工合成的小片段DNA可在酵母中重组为大片段DNA或染色体，借助细胞融合可将酵母中的DNA高效转移到其它物种细胞。如何能实现酵母和植物细胞的融合，是突破大片段DNA无法高效转化植物细胞瓶颈的关键技术。
发明内容
为解决现有技术中酵母和拟南芥细胞融合难的技术问题，本发明提供了一种向植物细胞中导入外源DNA的方法及由其获得的融合细胞。
目前涉及到细胞融合的基础研究或者生产投入大多数基于同类细胞或者同种细胞，例如植物细胞之间、动物细胞之间或者微生物细胞之间。虽然细胞融合不受种属的界限，但不同生物体细胞之间的融合仍具有较高的难度，包括融合材料的选择、融合条件的设置以及融合效果的观察等。本发明通过前期实验条件的摸索、人为构建的底盘细胞，加上建立的细胞融合体系，能较好地实现植物及微生物细胞融合及后续融合培养物的稳定培养，具有较为重要的意义。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种新的植物细胞导入外源DNA的技术，即基于拟南芥和酵母细胞融合的方法实现酵母的DNA转移到拟南芥细胞。本发明中，拟南芥原生质体和酵母原生质体均采用特定方法分别制备，并摸索出两种原生质体融合的用量比。
具体地，本发明的方面之一为提供了一种向植物细胞中导入外源DNA的方法，其中，所述方法包括：
(1)分别获得拟南芥原生质体和酵母原生质体：
(2)将拟南芥原生质体与酵母原生质体混匀，使发生融合；其中，所述酵母原生质体与所述拟南芥原生质体的用量比为(40～60):1。
本发明中突破性建立了酵母和拟南芥细胞的融合技术，酵母中携带的DNA片段可在拟南芥中有效表达发挥功能，是一种新型的植物外源基因转化技术。本发明将有望在植物基因组合成和植物定制化改造研究和应用领域发挥关键性作用。
在一些较佳的实施例中，所述拟南芥原生质体的制备包括以下步骤：将拟南芥愈伤组织分散于酶解液中进行酶解；所述酶解液例如包含1％Cellulase、0.2％Macerozyme、0.1％Pectinase、10mM CaCl2、20mM MES、0.4M D-Mannitol、20mM KCl以及0.1％BSA，其中，％为质量体积百分比。
优选地，所述酶解的时间为0.5～2.5小时，例如2小时；和/或，所述酶解在震荡例如在75rpm震荡中进行；和/或，所述拟南芥愈伤组织与所述酶解液的相对用量为0.5～1.0g/5mL，即0.1～0.2g/mL。
更优选地，所述酶解后，还包括润洗、离心和/或重悬的步骤；例如，所述润洗进行1～4次，所述润洗使用的润洗液包含154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2以及2mM MES；所述离心的速度为100×g，所述离心的时间为3～5min；所述重悬使用原生质体诱导培养基。
本发明中发现，当拟南芥愈伤组织用量低于0.5g，5mL酶解液获得的原生质体数量较少；高于1g会导致酶解不充分，也会降低5mL酶解液获得的原生质体数量。即拟南芥愈伤组织和酶解液的用量比低于0.1g/mL或高于0.2g/mL都会降低原生质体制备的效果。
在一些较佳的实施例中，所述酵母原生质体的制备包括如下步骤：
使用包括SPEM溶液、β-巯基乙醇以及Zymolyase的混合液重悬酵母单克隆细胞并消化；优选地，所述酵母单克隆细胞在震荡培养过夜培养的酵母培养液后离心获得，震荡的速度例如为200rpm，离心的速度例如为2500×rpm。
优选地，所述混合溶液中，Zymolyase与SPEM溶液的相对用量为(10～20)μL:20mL，例如15μL:20mL；和/或，β-巯基乙醇与SPEM溶液的相对用量为(30～50)μL:20mL，例如40μL:20mL；和/或，所述混合液和酵母培养液的体积比为(5～20):1，例如10:1；
更优选地，还包括消化后离心并重悬细胞的步骤；例如，所述离心的条件为4～16℃、1000g、5min；所述重悬使用STC溶液，其包括1M Sorbitol、10mM Tris-HCl、10mM CaCl2以及2.5mM MgCl2·6H2O。
在一些更佳的实施例中，所述消化的条件为28-35℃、60～80rpm、50min-80min，得消化液。
优选地，所述消化的条件为30℃，75rpm消化60min。
更优选地，所述消化在OD1/OD2的比值达3-4时结束；所述OD1的测定方法为：将所述消化液与1M山梨醇按1:4混合后测量，所述OD2的测定方法为：将所述消化液与2％SDS溶液按1:4混合后测量。
在一些较佳的实施例中，步骤(2)中：所述酵母原生质体与所述拟南芥原生质体的用量比为50:1。在该比例下，可以获得更好的融合效果。
在一些较佳的实施例中，所述混匀后还包括离心、润洗和/或重悬的步骤，其中所述重悬发生于所述融合后；和/或，所述融合的时间为10～20天，例如15天。
优选地，所述离心的速度为100×g，所述离心的时间为5min；和/或，所述润洗使用的润洗液包含154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2以及2mM MES；和/或，所述融合由含PEG的溶液例如PEG-Ca2+溶液介导；和/或，所述重悬使用原生质体诱导培养基。
本发明中使用的PEG-Ca2+溶液指25％PEG4000，Ca2+浓度为1.27～1.80mmol/L。
为解决上述技术问题，本发明的方面之二为提供了一种根据本发明的方面之一所述的方法制备获得的酵母-拟南芥融合细胞。
为解决上述技术问题，本发明的方面之三为提供了一种如本发明的方面之二的酵母-拟南芥融合细胞在转化外源DNA中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明利用自行构建的底盘细胞，能较好地观察到拟南芥及酵母细胞的融合效果，并能实现后续融合培养物的稳定培养，后续细胞再生培养可形成细胞团，且细胞状态正常。实验过程无涉危险化学试剂，实验操作简单，也无涉及复杂的机器设备。
(2)本发明建立了微生物与植物细胞融合系统，突破性地实现了酵母和拟南芥细胞的融合技术，为实现大片段DNA的转移和植物人工染色体的合成奠定了关键技术基础，也为研究不同细胞融合机制提供了一种新模型；未来有望拓展到应用于多种植物细胞的外源DNA转移技术开发。
附图说明
图1为T3溶液酶解2h后的拟南芥愈伤组织原生质体。
图2为Zymolyase溶液酶解1h后的酵母原生质体。
图3为聚乙二醇PEG化学法融合后的原生质体。
图4为聚乙二醇PEG化学法融合后的细胞培养物。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下所用到的T3酶解液的成分为：1％Cellulase、0.2％Macerozyme、0.1％Pectinase、10mM CaCl2、20mM MES、0.4M D-Mannitol、20mM KCl以及0.1％BSA；以上的“％”为质量体积百分比。
W5润洗液的成分为：154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2以及2mM MES。
STC溶液的成分为：1M Sorbitol、10mM Tris-HCl、10mM CaCl2以及2.5mM MgCl2·6H2O。
SPEM溶液的成分为：1M sorbitol、10mM EDTA pH 7.5、Na2HPO4·7H2O(2.08g L-1)以及NaH2PO4·1H2O(0.32g L-1)。
配制方法如下：
PEG-Ca2+溶液：25％PEG4000，Ca2+浓度为1.27-1.80mmol/L。
实施例1细胞融合的样本制备
1、拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体制备
a)在灭菌的小圆形培养皿中加入5mL T3酶解液；
b)取1皿拟南芥愈伤组织(约0.5g)，用灭菌的镊子小心夹取，使愈伤组织分散于装有T3酶解液的小圆形培养皿中；拟南芥愈伤组织与所述T3酶解液的相对用量为0.5～1g/5mL；
c)置于25℃暗室摇床中75rpm培养2h，消解细胞壁；
d)在新的50mL离心管上放置一个40μm滤网，用1mL W5润洗液润洗滤网，消解混合液缓慢加入滤网中，并用1mL W5润洗液润洗小圆形培养皿(酶解液:W5润洗液为1:1)；
e)过滤完毕后，4℃、100g离心5min；
f)缓慢小心地用移液枪去除上清液，不要剧烈动作引起原生质体重悬，可留有一部分上清；
g)用2mL W5润洗液悬浮原生质体，用40μm滤网再次过滤；
h)加至10mL W5润洗液，100g离心3min，重复洗涤两次；
i)小心去除上清液，加入1mL液体原生质体诱导培养基(Protoplast inductionmedium,PIM)培养基重悬原生质体；本步骤中，本领域常规的PIM都可以用于重悬原生质体；
j)取20μL悬浮液加到细胞计数器中对原生质体进行计数(图1)。
实验结果表明，0.5g拟南芥愈伤组织经过2h T3酶解液的酶解后，能获得形态较好、数量较多的原生质体，计数显示获得的原生质体数量约为1.5×106个/mL。
2、酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)原生质体制备
a)挑酵母单克隆于5mL SC-Leu培养基(Coolber Cat#PM2203-5L)中，30℃，200rpm过夜培养；
b)取2mL过夜培养的酵母于20mL SC-Leu培养基中，30℃，200rpm震荡培养至OD600达2.0-3.0(稀释5倍测OD)；
c)2500rpm，10℃离心5min；
d)弃上清，用20mL 1M山梨醇重悬，4℃保存2h；
e)2500rpm，10℃离心5min；
f)用20mL SPEM溶液+40μLβ-巯基乙醇+15μL Zymolyase(Nacalai20T，货号07663-91)的混合液重悬，本步骤中，消化可以在28-35℃、60～80rpm、50min-80min下进行，例如在30℃，75rpm消化1h；
g)取0.2mL上述酵母消化液，加入0.8mL 1M山梨醇，测OD1，取0.2mL上述酵母消化液，加入0.8mL 2％SDS溶液，测OD2；
h)当OD1/OD2的比值达3-4，加入30mL 1M山梨醇至酵母消化液中，颠倒混匀(若OD1/OD2的比值小于3-4，则需继续酶解，直到比值达到3-4)；
i)1000rcf，10℃离心5min，收集细胞；
j)用50ml 1M山梨醇轻轻的吹打混匀，1000rcf，10℃离心5min；
k)用2mL STC溶液重悬，室温放置10min；
l)取10μL酵母细胞加入到90μL STC溶液中，再取20μL悬浮液加到细胞计数器中对原生质体进行计数(图2)。
实验结果表明，0.5g酵母细胞经过1h Zymolyase溶液的酶解后，能获得形态较好、数量较多的原生质体，计数显示获得的原生质体数量约为2.0×108个/mL。
实施例2聚乙二醇PEG法细胞融合
a)取107个酵母原生质体于1.5mL离心管中，1000g，离心2min，弃上清；
b)按酵母:拟南芥为50:1的比例加入拟南芥原生质体，100g，离心2min；
c)弃上清，用100μL W5轻轻重悬；
d)加入等体积的PEG-Ca2+溶液，立即轻轻颠倒混匀，室温静置10min；
e)加入1mL高pH(pH 9～10)-高Ca2+溶液，室温放置5min；
f)100g，离心5min，弃上清；
g)加入1mL高pH-高Ca2+溶液，轻轻拨弹离心管重悬，然后100g，离心3min，弃上清；
h)加入1mL液体PIM培养基，轻轻拨弹离心管重悬，然后100g，离心2min，弃上清；
i)在6孔细胞培养皿中加入1mL液体PIM培养基润洗，吸取6孔培养皿中的PIM溶液重悬细胞，再转移到相应的培养皿中(图3)，20℃，黑暗，静置培养。
利用DsRed2-GFP双荧光报告系统鉴定拟南芥愈伤组织和酵母原生质体的融合效果。经过上述处理培养15天后，如图4所示，细胞正常聚团，且能在GFP荧光通道下观察到荧光(即融合细胞)。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.向植物细胞中导入外源DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)分别获得拟南芥原生质体和酵母原生质体：
(2)将拟南芥原生质体与酵母原生质体混匀，使发生融合；其中，所述酵母原生质体与所述拟南芥原生质体的用量比为(40～60):1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拟南芥原生质体的制备包括以下步骤：将拟南芥愈伤组织分散于酶解液中进行酶解；所述酶解液包含1％Cellulase、0.2％Macerozyme、0.1％Pectinase、10mM CaCl2、20mM MES、0.4M D-Mannitol、20mM KCl以及0.1％BSA，其中，％为质量体积百分比；
优选地，所述酶解的时间为0.5～2.5小时；和/或，所述酶解在震荡中进行；和/或，所述拟南芥愈伤组织与所述酶解液的相对用量为0.5～1.0g/5mL；
更优选地，所述酶解后，还包括润洗、离心和/或重悬的步骤；所述润洗进行1～4次，所述润洗使用的润洗液包含154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2以及2mM MES；所述离心的速度为100×g，所述离心的时间为3～5min；所述重悬使用原生质体诱导培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母原生质体的制备包括如下步骤：
使用包括SPEM溶液、β-巯基乙醇以及Zymolyase的混合液重悬酵母单克隆细胞并消化；
优选地，所述酵母单克隆细胞在震荡培养后离心过夜培养的酵母培养液获得。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合液中，Zymolyase与SPEM溶液的相对用量为(10～20)μL:20mL；和/或，β-巯基乙醇与SPEM溶液的相对用量为(30～50)μL:20mL；和/或，所述混合液和所述酵母培养液的体积比为(5～20):1；
优选地，还包括消化后离心并重悬细胞的步骤；所述重悬使用STC溶液，其包括1MSorbitol、10mM Tris-HCl、10mM CaCl2以及2.5mM MgCl2·6H2O。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述消化的条件为28-35℃、60～80rpm、50min-80min，得消化液；
优选地，所述消化的条件为30℃，75rpm消化60min。
6.如权利要求5的方法，其特征在于，所述消化在OD1/OD2的比值达3-4时结束；所述OD1的测定方法为：将所述消化液与1M山梨醇按1:4混合后测量，所述OD2的测定方法为：将所述消化液与2％SDS溶液按1:4混合后测量。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：所述酵母原生质体与所述拟南芥原生质体的用量比为50:1。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混匀后还包括离心、润洗和/或重悬的步骤，其中所述重悬发生于所述融合后；和/或，所述融合的时间为10～20天；
优选地，所述离心的速度为100×g，所述离心的时间为5min；和/或，所述润洗使用的润洗液包含154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2以及2mM MES；和/或，所述融合由PEG-Ca2+溶液介导；和/或，所述重悬使用原生质体诱导培养基。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法制备获得的酵母-拟南芥融合细胞。
10.如权利要求9所述的酵母-拟南芥融合细胞在转化外源DNA中的应用。
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