CN116981940A - 质谱分析装置和质谱分析方法 - Google Patents

Abstract

一种质谱分析装置，具备：反应室(132)，其被导入前体离子；自由基生成部(54)，其生成已知自由基；自由基供给部(5)，其使前体离子与所述自由基发生反应来生成碎片离子和加合离子；测定控制部(63)，其测定包含前体离子、碎片离子以及加合离子的离子群，来获得质谱；以及精确质量估计部(64)，其在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定加合离子的峰，该质量值是对根据前体离子的峰求出的质量加上源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值，所述精确质量估计部(64)从该加合离子的精确质量减去所述原子或分子的精确质量，来估计前体离子的精确质量。

Description

质谱分析装置和质谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种质谱分析装置和质谱分析方法。

背景技术

为了鉴定试样中的高分子化合物成分或解析其构造，广泛地利用了如下质谱分析法：从源自试样成分的离子中筛选具有特定的质荷比的离子来作为前体离子，将使该前体离子解离而生成的各种碎片离子根据质荷比进行分离后进行检测。

高分子化合物大多是以烃链为主要的骨架的有机物。为了知晓高分子化合物的特性，得到碳原子有无不饱和键、有无特征性官能团等信息是有效的。因此，最近提出了通过使自由基附加于源自试样成分的前体离子来使前体离子在碳原子的不饱和键或特定的官能团的位置处解离的、自由基附加解离法。例如，在专利文献1及2中记载了通过使氢自由基等附加于前体离子来使前体离子在肽键的位置处选择性地解离。另外，在专利文献3及4中记载了通过使氧自由基等附加于前体离子来使前体离子在烃链中包含的不饱和键的位置处选择性地解离。

在使用自由基附加解离法来对试样中包含的未知的成分进行分析时，例如使用具备前级滤质器、碰撞池以及后级滤质器的质谱分析装置进行数据依赖(data dependant)分析(DDA)。在DDA中，例如向液相色谱仪中导入液体试样，在其柱内将试样中包含的成分分离后导入到质谱分析装置中。然后，在各成分被导入到质谱分析装置中的期间连续进行MS分析和MS/MS分析。在MS分析中，利用前级滤质器或后级滤质器根据质荷比将由试样成分生成的离子进行分离，并对它们进行检测以获取质谱(MS谱)的数据。然后，确定质谱所包含的质量峰中满足规定的基准的质量峰(典型的是强度最大的质量峰)，并将与该质量峰对应的离子决定为前体离子。在MS/MS分析中，利用前级滤质器从由试样成分生成的离子中筛选前体离子，并在碰撞池中使前体离子解离来生成碎片离子，利用后级滤质器根据质荷比将这些碎片离子进行分离后进行检测，从而获取产物离子谱(MS/MS谱)的数据。

在MS分析和MS/MS分析结束后，确定MS谱或MS/MS谱中的前体离子的质量峰的峰顶，并将前体离子的质荷比计算到例如小数点后3位的精确值，基于该精确质荷比来估计化合物的组成式。另外，关于MS/MS谱中的碎片离子，也基于质量峰的精确质荷比来估计组成式，从而估计由所估计出的组成式的化合物生成的离子的部分分子构造。然后，将根据多个碎片离子的质量峰估计出的部分分子构造进行组合来估计化合物整体的分子构造，从而鉴定该化合物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/133259号

专利文献2：国际公开第2018/186286号

专利文献3：国际公开第2019/155725号

专利文献4：国际公开第2020/240908号

专利文献5：日本特开2020-177784号公报

非专利文献

非专利文献1：Hidenori Takahashi,Yuji Shimabukuro,Daiki Asakawa,AkihitoKorenaga,Masaki Yamada,Shinichi Iwamoto,Motoi Wada,Koichi Tanaka,"IdentifyingDouble Bond Positions in Phospholipids Using Liquid Chromatography-TripleQuadrupole Tandem Mass Spectrometry Based on Oxygen Attachment Dissociation",Mass Spedctrometry,Volume 8,Issue 2,Pages S0080,2020

发明内容

发明要解决的问题

通过专利文献1～4中记载的自由基附加解离法生成的碎片离子的量少至前体离子的几％左右。因此，为了以足够的强度测定这些碎片离子，需要将检测器的增益设定得较大。但是，如果像这样使增益变大，则前体离子的测定强度饱和。于是，前体离子的质量峰变形而无法准确地确定峰顶的位置，前体离子的精确质荷比的误差变大。在上述的DDA中，基于前体离子的精确质荷比来估计化合物的组成式，因此，如果前体离子的精确质荷比的误差变大，则存在无法正确地估计化合物的组成式而难以鉴定化合物这样的问题。

本发明要解决的问题在于提供一种能够在对使前体离子解离而生成的碎片离子进行质谱分析时在以足够的强度测定碎片离子的同时正确地决定前体离子的质荷比的技术。

用于解决问题的方案

为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的质谱分析方法包括以下步骤：

使前体离子与已知种类的自由基发生反应，来产生碎片离子和加合离子；

将检测器的增益设定为使得所述碎片离子和所述加合离子不发生光晕但所述前体离子发生光晕的增益；

利用该检测器测定包含所述前体离子、所述碎片离子以及所述加合离子的离子群，来获得质谱；

根据所述质谱来确定与所述前体离子对应的峰；

通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定所述加合离子的峰，该质量值是对根据所确定出的与前体离子对应的所述峰求出的质量加上假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值；

通过从根据所确定出的所述加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的精确质量，来估计所述前体离子的精确质量；以及

将所述质谱中的除所确定出的所述前体离子和所确定出的所述加合离子的峰以外的峰确定为所述碎片离子的峰候选。

另外，为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的质谱分析装置具备：

反应室，其被导入前体离子；

自由基生成部，其生成已知种类的自由基；

自由基供给部，其向被导入了前体离子的所述反应室供给由所述自由基生成部生成的自由基，从而产生碎片离子和加合离子；

测定控制部，其测定包含所述前体离子、所述碎片离子以及所述加合离子的离子群，来获得质谱；以及

精确质量估计部，其在所述质谱中确定与所述前体离子对应的峰，通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定所述加合离子的峰，该质量值是对根据与该前体离子对应的峰求出的质量加上假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值，通过从根据该加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的精确质量，来估计所述前体离子的精确质量。

发明的效果

在自由基附加解离法中，仅前体离子的几％会发生反应而生成加合离子或碎片离子，因此，如果使检测器的增益变大使得以足够的强度测定碎片离子，则前体离子的质量峰的强度饱和。另一方面，使自由基附加于前体离子而生成的加合离子的量为与前体离子解离而生成的碎片离子的量相同程度。在本发明所涉及的质谱分析方法和质谱分析装置中，通过设定检测器的增益使得以足够的强度测定碎片离子，从而能够也同样以足够的强度测定加合离子，且能够正确地决定该加合离子的精确质量。然后，通过从根据加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于该加合离子中的源自自由基的原子或分子的精确质量，从而能够正确地决定前体离子的质荷比。

附图说明

图1是本发明所涉及的质谱分析装置的一个实施例的主要部分结构图。

图2是本实施例的质谱分析装置中的自由基生成部的概要结构图。

图3是本实施例的质谱分析装置中的自由基的输送路径的概要结构图。

图4是将离子检测器的施加电压设定为上限值来使磷脂酰胆碱(PC18:2/18:0)与氧自由基反应而测定出的产物离子谱。

图5是示出了图4的产物离子谱的、质子化离子(protonated ion)的附近的范围的图。

图6是在使前体离子与各种自由基发生反应时生成的加合离子的精确质荷比与前体离子的精确质荷比之差。

具体实施方式

下面，参照附图对本发明所涉及的质谱分析装置和质谱分析方法的实施例进行说明。

图1是将本实施例的质谱分析装置1与液相色谱仪2进行组合而得到的液相色谱质谱联用装置100的主要部分结构图。

液相色谱仪2具备收容有流动相的流动相容器20、用于输送流动相的送液泵21、注射器22以及柱23。另外，注射器22与自动进样器24连接，该自动进样器24以规定的顺序将多个液体试样导入到注射器中。

质谱分析装置1具备处于大致大气压的离子化室10、由真空腔室构成的主体以及控制/处理部6。在真空腔室的内部从离子化室10侧起依次设置第一中间真空室11、第二中间真空室12、第三中间真空室13以及分析室14，且具有使真空度按该顺序变高的多级差动排气系统的结构。

在离子化室10中设置有向液体试样施加电荷来进行喷雾的电喷雾离子化探针(ESI探针)101。向ESI探针101依次导入由液相色谱仪2的柱23分离出的试样成分。

离子化室10与第一中间真空室11通过细径的加热毛细管102进行连通。在第一中间真空室11中配置有离子透镜111，该离子透镜111由直径不同的多个环状的电极构成，用于使离子聚焦在离子的飞行路径的中心轴即离子光轴C的附近。

第一中间真空室11与第二中间真空室12被顶部具有小孔的分离器(skimmer)112隔开。在第二中间真空室12中配置有离子导向器121，该离子导向器121由以包围离子光轴C的方式配置的多个杆电极构成，用于使离子聚焦在该离子光轴C的附近。

在第三中间真空室13中配置有四极滤质器131、碰撞池132以及离子导向器134，该四极滤质器131根据质荷比将离子分离，该碰撞池132在内部具备多极离子导向器133，该离子导向器134用于输送从碰撞池132释放出的离子。离子导向器134由同一直径的多个环状的电极构成。

碰撞池132与碰撞气体供给部4连接。碰撞气体供给部4具有：碰撞气体源41、将气体从该碰撞气体源41导入到碰撞池132的气体导入流路42以及用于将该气体导入流路42开闭的阀43。碰撞气体例如使用氮气、氩气等惰性气体。

另外，碰撞池132还与自由基供给部5连接。自由基供给部5具有与专利文献5或非专利文献1所记载的结构相同的结构。如图1和图2所示，自由基供给部5具备：自由基源54，其在内部形成有自由基生成室51；真空泵(省略图示)，其对自由基生成室51进行排气；原料气体供给源52，其用于供给作为自由基的原料的气体(原料气体)；以及高频电力供给部53。在从原料气体供给源52到自由基生成室51的流路上设置有用于调整原料气体的流量的阀56。

在图2中用截面图示出了自由基源54。自由基源54具有由矾土等电介质(例如氧化铝、石英、氮化铝)构成的管状体541，其内部空间成为自由基生成室51。管状体541以被插入到中空筒状的磁体544的内部的状态被柱塞545固定。在管状体541中的、位于磁体544的内侧的部分的外周卷绕有螺旋天线542(图2的虚线)。

另外，在自由基源54中设置有高频电力接通部546。从高频电力供给部53向高频电力接通部546供给高频电力。自由基源54还具备用于将该自由基源54的前端部分固定的凸缘547。在凸缘547的内部收容有与磁体544成对的、直径与该磁体544的直径相同的中空筒状的磁体548。通过磁体544、548在管状体541的内部(自由基生成室51)产生磁场，通过该磁场的作用而使等离子体的产生和维持变得容易。

在自由基源54的出口端经由阀582连接有用于将在自由基生成室51内生成的自由基输送到碰撞池132的输送管58。输送管58是绝缘管，例如能够使用石英玻璃管或硼硅酸玻璃管。

如图3所示，在输送管58中的、沿着碰撞池132的壁面配设的部分设置有多个头部581。在各头部581设置有倾斜的锥形状的导入口，沿与离子的飞行方向的中心轴(离子光轴C)交叉的方向导入自由基。由此，能够向碰撞池132的内部均匀地供给自由基。

在分析室14中具备：离子输送电极141，其用于输送从第三中间真空室13入射的离子；正交加速电极142，其由隔着离子的入射光轴(正交加速区域)相向配置的1组推出电极1421和引入电极1422构成；加速电极143，其对利用该正交加速电极142向飞行空间送出的离子进行加速；反射电极144，其在飞行空间内形成离子的折返轨道；离子检测器145；以及飞行管146，其用于限定飞行空间的外缘。离子检测器145例如是电子倍增管或微通道板。

控制/处理部6具有对各部的动作进行控制并且对由离子检测器145得到的数据进行保存和解析的功能。控制/处理部6具备存储部61。在存储部61中收录有化合物数据库611和自由基信息数据库612。另外，在存储部61中还保存有记载了执行后述的测定时的测定条件的方法文件、用于将离子的飞行时间变换为离子的质荷比的信息。控制/处理部6还具备测定条件设定部62、测定控制部63、精确质量估计部64以及化合物鉴定部65作为功能块。控制/处理部6的实体是连接有输入部7和显示部8的普通的个人计算机，通过利用处理器执行预先安装的质谱分析程序来实现上述的功能块。

接着，作为本发明所涉及的质谱分析方法的一例，说明使用了本实施例的液相色谱质谱联用装置100的分析的过程。在该例子中，为了鉴定液体试样中包含的未知的成分而进行数据依赖分析(DDA)。在该例子中未知成分的保留时间是已知的。只要在未知成分的保留时间不清楚的情况下遍及执行液相色谱法的整个时间的范围内进行DDA即可。在DDA中，在各试样成分被导入到质谱分析装置1的期间，首先进行MS扫描测定来决定前体离子，接着进行MS/MS扫描测定来使该前体离子解离从而获取产物离子谱。另外，在进行以下的测定之前，离子检测器145的增益被设定为能够以足够的强度测定碎片离子的值。能够通过多个增益设定测定同种试样并基于其结果来设定离子检测器145的增益。或者，即使不进行预备的测定，也可以由理论值决定或者基于分析者的经验来设定。并且，也可以是，如后述的测定例那样，在预计碎片离子和加合离子的强度低时，将检测器的增益设定为最大。在本实施例中，在MS/MS扫描测定时，使前体离子与氧自由基发生反应。

当使用者通过规定的输入操作来指示开始分析时，测定条件设定部62将用于输入测定条件的画面显示于显示部8，该测定条件包含DDA中的质量扫描范围、前体离子的选定条件、自由基种类、碰撞诱导解离(CID：Collision-Induced Dissociation)的信息。作为质量扫描条件的信息，例如输入MS扫描测定和MS/MS扫描测定中的质量扫描范围或扫描速度。作为前体离子的选定条件的信息，例如输入在MS扫描测定数据中测定强度最大的离子。作为自由基种类的信息，例如输入与前体离子发生反应的自由基的种类或生成自由基所使用的原料气体的种类的信息。关于CID，选择MS/MS测定中有无导入碰撞气体、碰撞气体的种类以及碰撞能量的大小。当使用者设定包含这些的所需的测定条件时，测定条件设定部62制作记载了它们的批处理文件。当执行该批处理文件时，利用测定控制部63如以下那样配合未知成分的保留时间连续地进行MS扫描测定和MS/MS扫描测定。

当在制作出批处理文件之后使用者通过规定的输入操作来指示开始测定时，首先，利用真空泵将自由基生成室51的内部排气到规定的真空度，从原料气体供给源52向自由基生成室51导入原料气体(在本实施例中为氧气)。接着，从高频电力供给部53向螺旋天线542供给高频电压，从而在自由基生成室51中产生等离子体。由此，由被供给到自由基生成室51中的氧气生成氧自由基。但是，在该时间点将阀582关闭而不向碰撞池132导入氧自由基。

接着，使用者预先放置于自动进样器24的液体试样被导入到注射器22。液体试样随着通过送液泵21从流动相容器20输送的流动相的流动被导入到柱23中。液体试样中包含的各成分在柱23中被按时间分离之后，依次被导入到电喷雾离子化探针101而被离子化。

由试样生成的离子由于离子化室10与第一中间真空室11之间的压力差而通过加热毛细管102被引入到第一中间真空室11。在第一中间真空室11中，通过离子透镜111将离子聚焦在离子光轴C的附近。

在第一中间真空室11中被聚焦的离子接着进入第二中间真空室12，被离子导向器121再次聚焦到离子光轴C的附近，之后进入第三中间真空室13。

当在开始测定后、达到未知成分从柱23流出的时间(保留时间)时，进行MS扫描测定。在MS扫描测定中，在第三中间真空室13中在不使四极滤质器131和碰撞池132进行动作的情况下使所有离子直接通过。通过了碰撞池132的离子被离子导向器134聚焦在离子光轴C的附近，之后进入分析室14。

进入了分析室14的离子通过离子输送电极141被输送到正交加速电极142。被正交加速电极142以规定的周期施加电压，离子的飞行方向向与这之前的飞行方向大致正交的方向偏转。飞行方向被偏转后的离子被加速电极143加速而被送出到飞行空间。被送出到飞行空间的离子在由反射电极144和飞行管146限定的规定的飞行路径上以与各离子的质荷比相应的时间飞行，并入射到离子检测器145。离子检测器145每当离子入射到该离子检测器145时输出与离子的入射量相应的大小的信号。来自离子检测器145的输出信号依次被保存于存储部61。在存储部61中保存以离子的飞行时间和离子的检测强度为轴的测定数据。

当MS扫描测定完成时，测定控制部63读出存储部61中保存的测定数据和用于将离子的飞行时间变换为离子的质荷比的信息，并将它们变换为以离子的质荷比和离子的检测强度为轴的质谱数据。

测定控制部63接着在质谱数据中确定强度最大的峰，并获取其质荷比。在本实施例中使用的电喷雾离子化探针101中，通常对试样分子加成质子所得到的质子化离子生成得最多。因而，在本实施例中，质子化离子被确定为与强度最大的峰对应的前体离子。然后，利用估算值(例如小数点后1位或2位的精度的值)来决定前体离子的质荷比。此外，自身能够求出小数点后3位以上作为数值，但由于测定强度饱和，因此，即使求出精确质荷比，该值通常也包含误差。

在决定了前体离子的质荷比之后，测定控制部63接着进行MS/MS扫描测定。首先，将阀582打开，向碰撞池132导入氧自由基。

在MS/MS扫描测定中，由试样生成的离子也与MS扫描测定时同样地在通过第一中间真空室11、第二中间真空室12的期间被聚焦在离子光轴C的附近后进入第三中间真空室13。

在第三中间真空室13中，利用四极滤质器131筛选具有基于上述的MS扫描测定结果而决定的质荷比的离子作为前体离子，并将其导入到碰撞池132。如上述那样向碰撞池132导入了氧自由基，氧自由基附加于前体离子，由此生成前体离子解离而成的碎片离子以及未解离且保持附加有氧自由基的状态的加合离子。在碰撞池132中生成的碎片离子和加合离子(下面，将它们也统称为“产物离子”。)被离子导向器134聚焦在离子光轴C的附近，之后进入分析室14。

在分析室14中，与MS扫描测定时同样地，产物离子在由反射电极144和飞行管146限定的规定的飞行路径上以与各离子的质荷比相应的时间飞行，并入射到离子检测器145。离子检测器145每当离子入射到该离子检测器145时输出与离子的入射量相应的大小的信号。来自离子检测器145的输出信号依次被保存于存储部61。在存储部61中保存为以离子的飞行时间和离子的检测强度为轴的测定数据。

当测定完成时，测定控制部63读出存储部61中保存的测定数据和用于将离子的飞行时间变换为离子的质荷比的信息，并将它们变换为以离子的质荷比和离子的检测强度为轴的质谱(产物离子谱)的数据。

接着，精确质量估计部64确定产物离子谱中的、氧原子附加于前体离子所得到的加合离子的质量峰。在本分析例那样的自由基附加解离法中，仅前体离子的几％发生反应而生成产物离子。因而，在产物离子谱中强度最大的质量峰成为前体离子的质量峰。然后，搜索处于以比该质量峰大16Da的质量为中心的规定的质量范围内的峰，并将该峰确定为加合离子的峰，该16Da相当于氧原子的估算质量。只要根据与前体离子对应的峰的饱和的程度来适当地决定该规定质量范围即可。只要考虑前体离子的检测强度饱和的质量范围越大则前体离子的质荷比的估算值的误差有可能越大的情况来扩大上述规定的质量范围即可，作为具体的数值，例如能够设为±1Da或±0.5Da。

精确质量估计部64接着以小数点后4位的精度求出加合离子的质量峰的精确质量(质荷比)，并计算从该精确质量减去氧原子的精确质量(15.9949Da)所得到的值。该值为前体离子的精确质荷比。通常来说，只要确定1个加合峰就足够，但在此也可以确定多个加合峰。例如，在如上述实施例那样使用了氧自由基的情况下，以与氧的同位素(15.9949Da、16.9991Da、17.9991Da)的存在比相应的强度出现多个加合峰。因而，也可以确定这些多个加合峰组。

当前体离子的精确质荷比被计算时，化合物鉴定部65基于该精确质荷比来估计未知成分的组成式。另外，将从产物离子谱中去除前体离子的质量峰和加合离子的质量峰所得到的质量峰确定为碎片离子的质量峰候选。然后，根据碎片离子的质量峰候选的精确质荷比来求出未知成分的组成式，并基于该组成式来估计未知成分的部分分子构造。将根据多个碎片离子估计出的部分分子构造进行组合来与收录在化合物数据库611中的已知的化合物的分子构造进行对照，从而鉴定未知成分。根据碎片离子来估计部分分子构造从而鉴定化合物的处理只要使用专利文献1～4中记载那样的方法与以往同样地进行即可，因此在此省略说明。

在本实施例的质谱分析方法和液相色谱质谱联用装置100中，如上所述，使源自试样成分的前体离子与氧自由基发生反应，来生成包含附加有氧原子的加合离子的产物离子。

在自由基附加解离法中，仅前体离子的几％会发生反应而生成碎片离子。如果使离子检测器145的增益变大使得以足够的强度测定碎片离子，则前体离子的质量峰的强度饱和。另一方面，使自由基附加于前体离子而生成的加合离子的量为与前体离子解离而生成的碎片离子的量相同程度。因此，通过设定离子检测器145的增益使得以足够的强度测定碎片离子，从而能够也同样以足够的强度测定加合离子，且能够正确地决定该加合离子的质荷比。因而，能够基于加合离子的质荷比和附加于该加合离子的原子或分子的质量，来正确地决定前体离子的质荷比。特别是，对于作为质谱分析装置的离子检测器而被广泛使用的电子倍增管或微通道板而言，检测器的增益的动态范围被限定于狭小的范围，测定强度易于饱和，因此，能够优选地使用上述实施例的质谱分析方法和质谱分析装置1。

此外，在DDA中，MS扫描测定时和MS/MS扫描测定时的离子检测器145的增益相同，因此，在通过MS扫描测定而得到的质谱中，前体离子的测定强度也饱和，但由于在MS/MS扫描测定中筛选前体离子所需要的质荷比的精度为小数点1位～2位，因此，即使在质谱中前体离子的质量峰的测定强度饱和，也不会产生特别的问题。

接着，参照图4和图5来说明实际的测定例。图5是使磷脂酰胆碱(PC18:2/18:0)与氧自由基发生反应而测定出的产物离子谱。在该测定中，作为离子检测器，使用了微通道板(MCP)。本发明人以往根据进行了使磷脂与各种自由基发生反应的测定的经验可知，在使磷脂与氧自由基发生反应的情况下生成的碎片离子和加合离子的强度低，因此，在该测定中将施加电压设定为作为上限值的2.5kV(即，将检测器的增益设定为最大)。

图4示出了图5的产物离子谱中的质子化离子(前体离子。[M+H]⁺：精确质荷比为786.600731)的附近的范围。在产物离子谱中，可知：质子化离子(氢原子全部为1H的单一同位素离子)的质量峰的测定强度饱和，如图4所示那样质量峰的形状变形。另外，该质量峰的峰顶的质荷比为786.6364。该值相对于真值(786.600731Da)大幅偏离，质量精度为约50ppm。此外，在该测定中使用的质谱分析装置原本的质量精度为3ppm。

在进行MS/MS扫描测定来估计分子构造时，根据前体离子的精确质量来估计组成式。另外，将从产物离子谱中去除前体离子的质量峰和加合离子的质量峰所得到的质量峰确定为碎片离子的质量峰候选。然后，基于所估计出的组成式和所确定出的碎片离子的质量峰候选的质荷比，来分配各碎片离子的质量峰候选。因此，如果像图5所示的例子那样测定强度饱和而前体离子的质荷比的误差变大，则无法正确地进行构造解析。一般来说，为了根据前体离子的质荷比来正确地估计组成式，要求10ppm以上的质量精度。

如图5所示，由于将检测器的施加电压设定得高，因此观测到微弱的碎片离子。如上述那样前体离子的质量峰的测定强度饱和，另一方面附加有氧自由基的加合离子的信号强度低，因此，该质量峰不会饱和，作为其质荷比的值而得到了802.6026。由于氧自由基的精确质量为15.9949Da，因此，作为前体离子[M+H]+的质量值而得到了802.6026-15.9949＝786.6077。该值按10ppm以上的精度与真值(786.600731Da)一致。

上述实施例是一例，能够按照本发明的主旨适当地进行变更。上述实施例设为液相色谱质谱联用装置，但既可以使用气相色谱质谱联用装置，或者也可以不使用色谱仪而仅使用质谱分析装置。在上述实施例中，作为后级滤质器，而使用了正交加速飞行时间型的滤质器，但也能够使用多重循环型、磁场扇型等的滤质器。

另外，精确质量只要是具有能够基于其精确质荷比根据前体离子来估计作为未知试样的化合物的组成式的程度的精度的质量即可。在上述实施例中，以小数点后4位的精度来计算出精确质量，但所需的精度根据要测定的化合物的特性(具有类似的构造的化合物的数量等)而不同，不限于上述实施例所记载的精度。

在上述实施例中，将作为正离子的质子化离子设为前体离子，并使其与氧自由基发生反应，但前体离子的极性和自由基的种类的组合能够适当变更。在使用负的前体离子的情况下，例如能够将钠加成物、氨加成物、钾加成物、氯加成物作为前体离子。

作为与前体离子发生反应的自由基，除了氧自由基以外，例如还能考虑氢自由基、羟基自由基、氮自由基、甲基自由基、氯自由基、氟自由基、磷酸自由基、硅自由基等。另外，作为能够生成这样的自由基的原料气体，例如能够使用能够生成氢自由基的氢气、能够生成氧自由基的氧气或臭氧气体、能够生成氢自由基、氧自由基及羟基自由基的水蒸气、能够生成氮自由基的氮气、能够生成甲基自由基的甲基气体、能够生成氯自由基的氯气、能够生成氟自由基的氟气、能够生成磷酸自由基的磷酸的蒸气、或能够生成硅自由基的硅烷气体。在图6中示出在使用了各种自由基(X)的情况下得到的加合离子(普通的加合离子[M+H(+X)]⁺(中央栏)、氢原子脱离后的加合离子[M+H(+X-H)]⁺(左栏)以及附加有氢原子的加合离子[M+H(+X+H)]⁺)的精确质荷比与前体离子的精确质荷比之差。

在上述实施例中，使通过碰撞池132的前体离子与自由基发生了反应，但也能够使用离子阱来取代碰撞池132，将前体离子捕获到离子阱中来使该前体离子与自由基发生反应。

根据试样成分，在自由基诱导解离中，由于与背景气体碰撞，H₂O、CO₂、极性基团等脱离(中性丢失)，其结果，有时无法检测到前体离子本身。在该情况下，只要根据相对于该中性丢失峰的自由基附加离子的质量值来计算前体离子的精确质量即可。

在上述实施例中，说明了不进行CID的情况下的测定例，但也可以在供给自由基的同时向碰撞池132导入碰撞气体，通过CID生成碎片离子。通过同时使用CID，从而能够生成更多种类的碎片离子以供解析。但是，如果由于进行CID而导致前体离子全部断裂，则无法通过上述测定例的方法求出前体离子的精确质荷比。在这样的情况下，测定控制部63只要构成为在MS扫描测定之后依次(单独地)进行与自由基反应的MS/MS扫描测定和进行CID的MS/MS扫描测定即可(测定条件设定部62只要制作按该顺序进行测定的批处理文件即可)。

并且，在上述实施例中说明了进行MS扫描测定和MS/MS扫描测定的情况，但在通过将前体离子捕获到离子阱中并进行多次解离来生成碎片离子的MSⁿ扫描测定中也能够应用本发明。

[方式]

本领域技术人员理解的是，上述的多个例示性的实施方式是以下方式的具体例。

(第一项)

一个方式所涉及的质谱分析方法包括以下步骤：

使前体离子与已知种类的自由基发生反应，来产生碎片离子和加合离子；

将检测器的增益设定为使得所述碎片离子和所述加合离子不发生光晕但所述前体离子发生光晕的增益；

利用该检测器测定包含所述前体离子、所述碎片离子以及所述加合离子的离子群，来获得质谱；

根据所述质谱来确定与所述前体离子对应的峰；

通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定所述加合离子的峰，该质量值是对根据所确定出的与前体离子对应的所述峰求出的质量加上假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值；

通过从根据所确定出的所述加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的精确质量，来估计所述前体离子的精确质量；以及

将所述质谱中的除所确定出的所述前体离子和所确定出的所述加合离子的峰以外的峰确定为所述碎片离子的峰候选。

(第二项)

一个方式所涉及的质谱分析装置具备：

反应室，其被导入前体离子；

自由基生成部，其生成已知种类的自由基；

自由基供给部，其向被导入了前体离子的所述反应室供给由所述自由基生成部生成的自由基，从而产生碎片离子和加合离子；

测定控制部，其测定包含所述前体离子、所述碎片离子以及所述加合离子的离子群，来获得质谱；以及

精确质量估计部，其在所述质谱中确定与所述前体离子对应的峰，通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定所述加合离子的峰，该质量值是对根据与该前体离子对应的峰求出的质量加上假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值，通过从根据该加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的精确质量，来估计所述前体离子的精确质量。

在第一项的质谱分析方法和第二项的质谱分析装置中，使源自试样成分的前体离子与已知种类的自由基发生反应，来生成与该自由基的种类相应的原子或分子附加于前体离子所得到的加合离子以及前体离子断裂所得到的碎片离子。然后，对包含前体离子、碎片离子以及加合离子的离子群进行测定来获得质谱。此时，预先将检测器的增益设定为使得碎片离子和加合离子不发生光晕而前体离子发生光晕的增益。能够通过多个增益设定测定同种试样并基于其结果来设定这样的检测器的增益。或者，即使不进行预备的测定，也可以由理论值决定或者基于分析者的经验来设定。并且，也可以是，在预计碎片离子和加合离子的强度低时，将检测器的增益设定为最大。总之，作为测定出的结果，只要设定为能够以足够的强度且不发生饱和地测定碎片离子和加合离子的增益即可。

接着，根据质谱来分别确定与前体离子对应的峰。一般来说，在上述质谱中高度或面积最大的峰是与前体离子对应的峰。因而，只要将质谱中的最大的峰确定为与前体离子对应的峰即可。然后，根据该峰来求出前体离子的质量。如上所述，由于检测器的增益被设定为使得前体离子发生光晕，因此前体离子的峰饱和，根据饱和的峰求出的质量包含误差，但在该时间点求出的质量只要为整数级别的估算值且正确即可，例如小数点以后的数值也可以存在少许误差。接着，通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定加合离子的峰，该质量值是对该估算值加上假定附加于加合离子中的源自自由基的原子或分子的质量所得到的值。只要根据与前体离子对应的峰的饱和的程度来适当地决定该规定质量范围即可，例如能够设为±1Da或±0.5Da。之后，通过从根据所确定出的加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于加合离子中的源自自由基的原子或分子的精确质量，来估计前体离子的精确质量。最后，将质谱中的除前体离子和加合离子的峰以外的峰确定为碎片离子的峰候选。

在自由基附加解离法中，仅前体离子的几％会发生反应而生成加合离子或碎片离子，因此，如果使检测器的增益变大使得以足够的强度测定碎片离子，则前体离子的质量峰的强度饱和。另一方面，使自由基附加于前体离子而生成的加合离子的量为与前体离子解离而生成的碎片离子的量相同程度。因此，通过设定检测器的增益使得以足够的强度测定碎片离子，从而能够也同样以足够的强度测定加合离子，且能够正确地决定该加合离子的质量比。然后，通过从根据加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于该加合离子中的源自自由基的原子或分子的精确质量，从而能够正确地决定前体离子的质荷比。

(第三项)

根据第二项所述的质谱分析装置，其中，

所述自由基是氢自由基、氧自由基、羟基自由基、氮自由基、甲基自由基、氯自由基、氟自由基、磷酸自由基以及硅自由基中的任一者。

如第三项所述的质谱分析装置那样，在第二项所述的质谱分析装置中，作为与前体离子发生反应的自由基，能够设为氢自由基、氧自由基、羟基自由基、氮自由基、甲基自由基、氯自由基、氟自由基、磷酸自由基以及硅自由基中的任一者。这些自由基都容易生成，另外，能够预测附加于前体离子的原子或分子，因此，能够通过简便的测定获取前体离子的精确质荷比。

(第四项)

根据第二项或第三项所述的质谱分析装置，其中，

还具备电子倍增管或微通道板来作为检测所述离子群的离子检测器。

在第四项所述的质谱分析装置中使用的电子倍增管或微通道板被广泛用作离子检测器，但由于检测器的增益的动态范围被限定于狭小的范围，因此，能够特别优选使用第二项或第三项所述的质谱分析装置。

(第五项)

在第二项至第四项中的任一项所述的质谱分析装置中，

所述测定控制部还进行将由试样生成的离子进行质量分离并进行测定的MS扫描测定来获取质谱数据，基于该质谱数据中包含的质量峰以预先决定的条件决定前体离子，之后，执行使该前体离子与所述自由基发生反应的MS/MS扫描测定。

通过使用第五项的质谱分析装置，从而能够对未知的试样成分进行数据依赖分析(DDA)。

(第六项)

在第五项所述的质谱分析装置中，

还具备碰撞气体供给部，所述碰撞气体供给部向所述反应室供给碰撞气体，

所述测定控制部执行使所述前体离子与所述自由基发生反应的MS/MS扫描测定和向所述反应室供给所述碰撞气体的MS/MS扫描测定。

通过使用第六项所述的质谱分析，能够使用通过自由基附加解离法生成的碎片离子和通过CID法生成的碎片离子这双方来对试样成分进行分析。此外，使用自由基附加解离法的MS/MS扫描测定和使用CID法的MS/MS扫描测定既可以同时进行，也可以独立进行。但是，在通过CID法而使大量前体离子断裂的情况下，优选依次(独立)进行这两者。

附图标记说明

100：液相色谱质谱联用装置；1：质谱分析装置；10：离子化室；101：电喷雾离子化(ESI)探针；11：第一中间真空室；12：第二中间真空室；13：第三中间真空室；131：四极滤质器；132：碰撞池；133：多极离子导向器；14：分析室；142：正交加速电极；144：反射电极；145：离子检测器；146：飞行管；2：液相色谱仪；20：流动相容器；21：送液泵；22：注射器；23：柱；24：自动进样器；4：碰撞气体供给部；41：碰撞气体源；42：气体导入流路；5：自由基供给部；51：自由基生成室；52：原料气体供给源；53：高频电力供给部；54：自由基源；541：管状体；542：螺旋天线；544、548：磁体；546：高频电力接通部；58：输送管；6：控制/处理部；61：存储部；611：化合物数据库；612：自由基信息数据库；62：测定条件设定部；63：测定控制部；64：精确质量估计部；65：化合物鉴定部；7：输入部；8：显示部；C：离子光轴。

Claims (6)

1.一种质谱分析方法，包括以下步骤：

使前体离子与已知种类的自由基发生反应，来产生碎片离子和加合离子；

将检测器的增益设定为使得所述碎片离子和所述加合离子不发生光晕但所述前体离子发生光晕的增益；

利用该检测器测定包含所述前体离子、所述碎片离子以及所述加合离子的离子群，来获得质谱；

根据所述质谱来确定与所述前体离子对应的峰；

通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定所述加合离子的峰，该质量值是对根据所确定出的与前体离子对应的所述峰求出的质量加上假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值；

通过从根据所确定出的所述加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的精确质量，来估计所述前体离子的精确质量；以及

将所述质谱中的除所确定出的所述前体离子和所确定出的所述加合离子的峰以外的峰确定为所述碎片离子的峰候选。

2.一种质谱分析装置，具备：

反应室，其被导入前体离子；

自由基生成部，其生成已知种类的自由基；

自由基供给部，其向被导入了前体离子的所述反应室供给由所述自由基生成部生成的自由基，从而产生碎片离子和加合离子；

测定控制部，其测定包含所述前体离子、所述碎片离子以及所述加合离子的离子群，来获得质谱；以及

精确质量估计部，其在所述质谱中确定与所述前体离子对应的峰，通过在以如下的质量值为中心的规定的质量范围内进行搜索来确定所述加合离子的峰，该质量值是对根据与该前体离子对应的峰求出的质量加上假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的质量所得到的值，通过从根据该加合离子的峰求出的精确质量减去假定附加于所述加合离子中的源自所述自由基的原子或分子的精确质量，来估计所述前体离子的精确质量。

3.根据权利要求2所述的质谱分析装置，其中，

所述自由基是氢自由基、氧自由基、羟基自由基、氮自由基、甲基自由基、氯自由基、氟自由基、磷酸自由基以及硅自由基中的任一者。

4.根据权利要求2所述的质谱分析装置，其中，

还具备电子倍增管或微通道板来作为检测所述离子群的离子检测器。

5.根据权利要求2所述的质谱分析装置，其中，

所述测定控制部还进行将由试样生成的离子进行质量分离并进行测定的MS扫描测定来获取质谱数据，基于该质谱数据中包含的质量峰以预先决定的条件决定前体离子，之后，执行使该前体离子与所述自由基发生反应的MS/MS扫描测定。

6.根据权利要求5所述的质谱分析装置，其中，

还具备碰撞气体供给部，所述碰撞气体供给部向所述反应室供给碰撞气体，

所述测定控制部执行使所述前体离子与所述自由基发生反应的MS/MS扫描测定和向所述反应室供给所述碰撞气体的MS/MS扫描测定。