CN116981683A - 用于预防和治疗纤维化的肽 - Google Patents

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CN116981683A CN202280017052.2A CN202280017052A CN116981683A CN 116981683 A CN116981683 A CN 116981683A CN 202280017052 A CN202280017052 A CN 202280017052A CN 116981683 A CN116981683 A CN 116981683A
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Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗纤维化的肽，其通过具有通过与整联蛋白结合来抑制TGF‑β1从LCC解离的特性，或抑制从上皮细胞到间充质细胞的变化并促进从间充质细胞到上皮细胞的变化的特性，以及穿透细胞以与Smad2和Smad3结合，并因此抑制其磷酸化的特性并且因此具有预防或治疗纤维化的效果。根据本发明的肽表现出比作为肺纤维化治疗剂的商业化的尼达尼布和作为肝纤维化治疗剂的商业化的利拉糖肽更好的治疗效果，因此可以用作这些市售治疗剂的替代治疗剂或作为与这些治疗剂联合治疗的药剂。

Description

用于预防和治疗纤维化的肽
技术领域
本发明涉及一种用于预防或治疗纤维化的肽，并且更具体地说，涉及一种用于预防或治疗纤维化的肽，其通过与整联蛋白结合来抑制TGF-β1从LCC的解离，或者其抑制上皮细胞向间充质细胞的转化并促进间充质细胞向上皮细胞的转化，并且还通过细胞穿透与Smad2和Smad3结合以此抑制其磷酸化，从而表现出预防或治疗纤维化的效果。
背景技术
纤维化是由组织中胶原纤维的过度产生和积聚引起的，并且已知主要发生在肺、肝、心脏、肾等。随着肺纤维化的进展，不仅出现呼吸障碍，而且出现各种并发症。可能发生由肺活量减少和氧扩散受损引起的全身性缺氧、由于纤维组织收缩使得肺动脉和毛细血管受到压迫引起的肺动脉高血压、由于肺循环受损使得右心室血液淤积引起的心力衰竭以及其它并发症诸如血栓形成、肺炎等。此外，炎症和纤维化可能会增加肺癌的风险。肺纤维化可能由吸入有毒物质或持续炎症引起，但也存在无法确定具体原因的特发性肺纤维化(IPF)。当特发性肺纤维化(IPF)发生时，肺组织随着时间的推移增厚和硬化，使得肺不能适当地吸收氧气并将其输送到血流中，最终导致肺的永久性疤痕和纤维化，从而使呼吸困难，并减少输送到身体主要器官的氧气量(Coward WR,The pathogenesis of idiopathicpulmonary fibrosis.Ther.Adv.Respir.Dis.2010；4:367-388)。
肺纤维化是一种致命的疾病，诊断后平均生存时间约为2至3年，并且仍然没有办法恢复晚期肺纤维化的肺组织。目前，抑制炎症反应的类固醇和免疫抑制剂被用作肺纤维化的治疗剂，但是纤维化在炎症反应后发展，并且大多数患者是因呼吸困难才去医院就诊，因此治疗开始于炎症反应期已经过去并且纤维化反应期已经开始后，因此，难以预期现有抗炎药物的纤维化抑制作用。
同时，在肝病中，非酒精性脂肪性肝炎(NASH或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD))是由非饮酒性肥胖、糖尿病、高脂血症、药物等引起的脂肪性肝炎。非酒精性脂肪性肝炎由于肝细胞中脂肪积聚导致的肝细胞变性/坏死引起的炎症和肝纤维化而发展成肝硬化和肝癌。因此，即使是非酒精性脂肪性肝炎，如果发生纤维化，恢复成正常组织是不可能的。除了肺和肝，纤维化还可能发生在心脏、肾脏、血管、皮肤、脑等。
目前可用的纤维化药物之一是尼达尼布(nintedanib)(产品名：)，其为一种靶向参与肺纤维化机制的生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂，其中血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)被阻断(Wollin L,Mode of action of nintedanib in the treatment of idiopathicpulmonary fibrosis.Eur.Respir.J.2015；45:1434-1445；EP 1224170 B9)。此外，吡非尼酮(pirfenidone)用于治疗特发性肺纤维化，其中纤维化在没有明确原因的情况下在肺中进展。这种药物是一种小分子口服药剂，其抑制胶原蛋白的合成，减少促纤维化细胞因子，并抑制产生胶原蛋白的成纤维细胞的增殖(US 8383150 B2)。
在正常状态下，组织中的胶原蛋白保持恒定，但在某些病理状态下，这种平衡被打破，并且胶原蛋白在组织中过度产生和积累，导致纤维化。减少纤维化的抑制剂主要发挥以下功能：1)减少与纤维化相关的炎症反应，2)抑制促纤维化细胞因子或生长因子的活性，3)抑制细胞增殖，以及4)减少前胶原生物合成和加工，并且因此，这些作用机制是纤维化抑制剂的主要靶标。TGF-β(转化生长因子-β)已知是一种代表性的促纤维化生长因子，并且直接抑制TGF-β的化合物正被用于开发纤维化治疗剂。然而，由于TGF-β参与体内的各种生理反应，通过靶向TGF-β或TGF-β受体的直接抑制可能具有很大的副作用。因此，需要一种具有间接抑制TGF-β作用的机制的药物。
当从细胞的角度来看纤维化时，当正常的上皮细胞被炎症或一些刺激破坏时，TGF-β的表达增加，并且上皮细胞向间充质细胞的转化(上皮-间质转化，EMT)增加，导致上皮细胞向肌成纤维细胞转化。已知这种肌成纤维细胞通过过度产生胞外基质蛋白诸如胶原蛋白而最终导致纤维化(Rock JR,Multiple stromal populations contribute topulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011；108:E1475-E1483；Fernandez IE,The impact of TGF-bon lung fibrosis:from targeting to biomarkers.Proc.Am.Thorac.Soc.2012；9:111-116；Decaris ML,Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover inbleomycin-induced pulmonary fibrosis.Mol.Cell Proteomics 2014；13:1741-1752)。因此，防止了上皮细胞向肌成纤维细胞过度转化，以及相反地，促进了间充质细胞向正常上皮细胞的转化(间充质-上皮转化，MET)，即细胞重编程，从而治疗纤维化。
因此，本发明人已经确定，由本发明人开发的肽不会直接抑制TGF-β1，但是与存在于肺成纤维细胞中的整联蛋白结合，从而防止TGF-β1从LCC(大潜伏复合物)分离，因此通过抑制TGF-β1诱导的促纤维化信号转导来抑制纤维化，并且还确定该肽抑制上皮细胞向间充质细胞的转化，以及同时促进间充质细胞转向上皮细胞的转化，诱导细胞重编程，并且通过细胞穿透与Smad2和Smad3结合以此抑制其磷酸化，从而抑制纤维化，并且此外，当向肺纤维化动物模型或由非酒精性脂肪性肝炎诱导的肝纤维化动物模型给药该肽时，该肽有效地减少纤维化，从而完成了本发明。
背景技术中描述的信息仅用于改善对本发明的背景的理解，并且不应被解释为包括形成本发明所属领域的普通技术人员已知的相关技术的信息。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种有效预防和治疗纤维化的肽。
本发明的另一个目的是提供包含该肽的用于预防或治疗纤维化的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供包括给药该肽的预防或治疗纤维化的方法。
本发明的再一个目的是提供用于预防或治疗纤维化的肽的用途。
本发明的还有一个目的是提供该肽在制备用于预防或治疗纤维化的药物中的用途。
为了完成上述目的，本发明提供了用于预防或治疗纤维化的肽，该肽由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示。
此外，本发明提供了用于预防或治疗纤维化的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和/或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽。
此外，本发明提供了预防或治疗纤维化的方法，该方法包括向需要其的受试者给药由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽或包含该肽的组合物。
此外，本发明提供了由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽或包含该肽的组合物用于预防或治疗纤维化的用途。
此外，本发明提供了由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽或包含该肽的组合物在制备用于预防或治疗纤维化的药物中的用途。
附图说明
图1示意性地示出了通过使用与整联蛋白结合的根据本发明的肽抑制TGF-β1诱导的促纤维化细胞内信号转导来预防或治疗纤维化的效果。
图2a示意性地示出了通过使用根据本发明的肽抑制上皮细胞向间充质细胞的转化并促进间充质细胞向上皮细胞的转化来预防或治疗纤维化的效果。
图2b示意性地示出了通过使用根据本发明的肽抑制促纤维化细胞内信号转导来预防或治疗纤维化的效果，所述肽通过细胞穿透与Smad2和Smad3结合从而抑制其磷酸化。
图3示出了确认SEQ ID NO:1的肽与整联蛋白β1、β3、αv、α4和α5结合的能力的结果。
图4示出了确认SEQ ID NO:2的肽与Smad2或Smad3结合的能力的结果。
图5示出了SEQ ID NO:2的肽抑制pSmad2和pSmad3表达的结果。
图6示出了确认SEQ ID NO:1或2的肽抑制COL1A2和COL3A1基因表达的效果的结果。
图7a示出了观察到由SEQ ID NO:2的肽增加MET标志物表达的结果。
图7b示出了观察到由SEQ ID NO:2的肽抑制EMT标志物表达的结果。
图8a示出了用于确认用根据本发明的肽处理肺纤维化动物模型的治疗效果的实验方案。
图8b示出了用根据本发明的肽处理肺纤维化动物模型时观察到体重变化的结果。
图8c示出了确认用根据本发明的肽处理肺纤维化动物模型时减少纤维沉积的效果的结果。
图8d示出了通过测量用根据本发明的肽处理肺纤维化动物模型时的纤维化的面积来确认纤维化减少效果的结果。
图9a示出了用于确认用根据本发明的肽处理肝纤维化动物模型的治疗效果的实验方案。
图9b示出了H&E染色的结果以确认用根据本发明的肽处理肝纤维化动物模型的治疗效果。
图9c示出了测量NAFLD活性评分的结果以确认用根据本发明的肽处理肝纤维化动物模型的治疗效果。
图9d示出了Masson三色染色的结果以确认用根据本发明的肽处理肝纤维化动物模型的治疗效果。
图9e示出了测量纤维化面积的结果以确认用根据本发明的肽处理肝纤维化动物模型的治疗效果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。一般来说，本文使用的术语和后面描述的实验方法在本领域中是众所周知的，并且是典型的。
TGF-β1已知是一种在增加纤维化中起重要作用的蛋白质。在体内，TGF-β1与LLC(大潜伏复合物)结合并以潜伏形式存在。LLC由LAP(潜伏相关的肽)、LTBP1(潜伏TGFβ结合蛋白)和TGF-β1组成。当LLC中的LAP与细胞表面上的整蛋白受体结合时，潜伏的TGF-β1从LLC中解离出来。这种游离的TGF-β1与TGFβ受体结合，从而引起促纤维化的细胞内信号转导。SEQ ID NO:1的肽与整合蛋白结合来抑制LLC与整合蛋白反应，从而阻止TGF-β1的释放。最终，由TGF-β1引起的纤维化相关蛋白的表达被抑制(图1)。
在纤维化中，正常上皮细胞受损，TGF-β1的表达增加，因此上皮-间充质转化(EMT)增加，从而发生上皮细胞向肌成纤维细胞的转化。已知这种肌成纤维细胞最终通过过度产生胞外基质蛋白诸如胶原蛋白而诱导纤维化。在本发明中，SEQ ID NO:2的肽抑制上皮细胞过度转化为间充质细胞，特别是肌成纤维细胞，并且相反地，促进间充质细胞转化为正常上皮细胞(间充质-上皮转化，MET)，即增加细胞重编程，确认基质蛋白沉积可以被抑制并且纤维化可以被治疗(图2a)。此外，SEQ ID NO:2的肽通过抑制由TGF-β1增加的Smad2和Smad3的磷酸化来抑制TGF-β1诱导的促纤维化作用。该SEQ ID NO:2的肽能够穿透细胞，与细胞中的Smad2和Smad3蛋白结合以此抑制其磷酸化，从而抑制TGF-β1诱导的纤维化(图2b)。
因此，本发明的一方面涉及用于预防或治疗纤维化的肽，其由下面的SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示。
SEQ ID NO:1:YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT
SEQ ID NO:2:GKCSTRGRKSSRRKK
在本发明中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽通过与整联蛋白结合来防止TGF-β1从LLC(大潜伏复合物)中解离，从而抑制TGF-β1诱导的促纤维化细胞内信号转导，由此抑制纤维化。
在本发明中，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽抑制上皮-间充质转化，并且还通过细胞穿透与Smad2和Smad3结合以此抑制其磷酸化，从而抑制纤维化。
本发明的另一方面涉及用于预防或治疗纤维化的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和/或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽。
在本发明中，纤维化是由胶原蛋白过度沉积引起的疾病，并且可以选自由肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化组成的组，但不限于此，而根据本发明的肽和药物组合物可以用于预防或治疗由胶原蛋白过度沉积引起的所有纤维化疾病。
在本发明中，药物组合物可以配制成选自由以下组成的组的任何一种剂型：注射剂、口服制剂、贴剂、液体、胶囊、颗粒、片剂、粉剂、喷雾剂、鼻腔给药制剂、吸入喷雾剂、软膏、凝胶、粘膜给药制剂以及栓剂，但不限于此。这些制剂可以通过本领域用于制剂的典型方法或在Remington’s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA中公开的方法制备，并且可以根据个体疾病或成分制备成各种形式。然而，以上描述是说明性的，并且适用于本发明的制剂不限于此。
在本发明中，药物组合物还可以包含可接受的佐剂，并且佐剂可以是，例如，载体。药学上可接受的载体可以是盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其一种或多种的混合物，以及必要时可以添加的其它典型添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂和润滑剂来制备可注射制剂(诸如水性溶液、悬浮液、乳液等)、用于鼻腔给药的制剂、吸入喷雾剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。然而，以上描述是说明性的，适用于本发明的佐剂或载体不限于此。
根据所需的方法，本发明的组合物可以口服或胃肠外给药(例如静脉内、皮下、腹膜内、鼻内、气管内或局部应用)，并且其剂量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而变化。本发明的SEQ ID NO:1或2的肽可以以每天约1μg/kg至100mg/kg，优选5μg/kg至50mg/kg给药，并且可以每天给药或每周给药1-3次。然而，剂量和给药间隔不限于此。
这里，给药方案和剂量可以根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。考虑到这些因素的本领域技术人员可以容易地选择合适的给药方案和剂量。
本发明的又一方面涉及预防或治疗纤维化的方法，该方法包括向需要其的受试者给药由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽。
本发明的再一方面涉及预防或治疗纤维化的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和/或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽的组合物。
本发明的另外方面涉及由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽用于预防或治疗纤维化的用途。
本发明的又一另外方面涉及包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和/或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽的组合物用于预防或治疗纤维化的用途。
本发明的又一其他方面涉及由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽或由SEQ IDNO:2的氨基酸序列表示的肽在制备用于预防或治疗纤维化的药物中的用途。
本发明的又一其他方面涉及包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和/或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽的组合物在制备用于预防或治疗纤维化的药物中的用途。
由于在本发明的预防或治疗方法和用途中都采用了上述“肽或包含该肽的组合物”，因此将省略对其的赘述。
在本发明中，描述了SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的特定氨基酸序列，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在本发明的技术思想的范围内，其中本发明的氨基酸序列被部分修饰的等同范围的氨基酸序列被解释为在本发明的范围内。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，并且对于本领域技术人员来说，显然本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
实施例1：肽合成
用于合成所需的氨基酸和试剂购自GL Biochem和Sigma-Aldrich。使用合成仪通过F-moc固相化学合成方法从C-末端合成肽。特别地，具有Fmoc-(9-芴基甲氧羰基)作为保护基团(blocking group)的rink树脂(0.075mmol/g，100-200目，1％ DVB交联)用于合成，将50mg的rink树脂置于合成仪中，用DMF溶胀该树脂，然后加入20％哌啶/DMF溶液以除去Fmoc-基团。从C-末端开始按顺序加入0.5M氨基酸溶液(溶剂：二甲基甲酰胺，DMF)、1.0MDIPEA(溶剂：二甲基甲酰胺&N-甲基吡咯烷酮，DMF&NMP)以及0.5M HBTU(溶剂：二甲基甲酰胺，DMF)，其量分别为5、10和5当量，并在氮气流下反应1至2小时。每当脱保护和偶联步骤终止时，用DMF和异丙醇洗涤两次。在偶联最后一个氨基酸后，进行脱保护以除去Fmoc-基团。
使用茚三酮测试方法确认合成，并且用四氢呋喃(THF)或二氯甲烷(DCM)干燥经测试和合成的树脂，之后加入相对于1g树脂为20ml的量的三氟乙酸(TFA)切割鸡尾酒试剂(cocktail)，摇动3小时，然后过滤以分离其中溶解了树脂和肽的鸡尾酒试剂。在使用旋转蒸发器除去经过滤的溶液后，加入冷乙醚或者将过量的冷乙醚直接加入到溶解有肽的TFA鸡尾酒试剂溶液中，因此肽结晶成固相，然后通过离心分离。这里，通过用乙醚洗涤几次并离心，从而完全除去TFA鸡尾酒试剂。将如此获得的肽溶解在蒸馏水中并冻干。
将合成的肽从树脂上切下，洗涤，冻干，并通过高效液相色谱(Shimadzu，日本)分离和纯化。使用直径为4.6mm的C18柱，以以下方式进行分析：使0.1％的TFA/H2O和0.092％的TFA/乙腈以1ml/min的流速流动30分钟，变化为0-60％。这里，UV检测器的波长设定为220nm。使用直径为2.2cm的柱，在相同的溶剂和检测波长条件下，以20ml/min的流速进行纯化。通过质谱测定纯化肽的分子量。
以下SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽以与上述相同的方式合成。
SEQ ID NO:1:YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT
SEQ ID NO:2:GKCSTRGRKSSRRKK
实施例2：使用免疫沉淀对SEQ ID NO:1的肽与整联蛋白结合能力的确认
在全生长培养基(补充有hFGF-B、胰岛素、GA-1000和2％ FBS的成纤维细胞生长基础培养基-2，Lonza#CC-3132)中培养来源于特发性肺纤维化患者的人肺成纤维细胞(来自IPF患者的患病人肺成纤维细胞，DHLF-IPF，Lonza,#CC-7231)。在用TGF-β1(R&D systems，#240-B-002)处理3×106个DHLF-IPF之前，用Opti-MEM(Gibco，#31985-070)替换培养基，然后培养24小时。在24小时后，用现有的生长培养基替换培养基，并用10ng/ml TGF-β1(R&Dsystems，#240-B-002)处理细胞24小时。在24小时后，用100μM结合生物素的SEQ ID NO:1的肽(生物素-Seq 1)处理细胞1小时。单独用100μM结合生物素的SEQ ID NO:1的肽(生物素-Seq 1)处理的细胞也包括在该组中。
用冰冷的PBS洗涤如此处理的细胞，向其中加入500μl的RIPA缓冲液(pH 8.0的10mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、1％ Triton X-100、0.1％脱氧胆酸钠、0.1％ SDS、140mM NaCl、完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂(Sigma-Aldrich)、磷酸酶抑制剂鸡尾酒试剂(Sigma-Aldrich))，并裂解细胞20分钟。此后，以13000g离心25分钟，并使用垂直振荡器(vertical rocker)使细胞裂解物与抗生物素抗体(稀释1:100；Abcam，ab53494)在4℃下反应过夜。向其中加入20μl的蛋白-A琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology，sc-2003)，然后另外反应3小时。以13000g进行短暂离心，弃去上清液，并用PBS洗涤珠粒。通过加入5x SDS样品缓冲液，以及然后煮沸珠粒，然后进行SDS-PAGE和蛋白质印迹，以分离与珠粒结合的蛋白质。使用针对整合蛋白β1、β3、αv、α4、α5(Santa Cruz Biotechnology，sc-374429、sc-46655、sc-9969、sc-365209、sc-376199)和IgG(Cell Signaling Technology)的抗体进行免疫印迹。蛋白质水平以全裂解物(输入)和免疫沉淀蛋白质(IP)表示。
结果，SEQ ID NO:1的肽(生物素-Seq 1)具有选择性地与整联蛋白β1、β3和αv结合的能力，并且在用SEQ ID NO:1的肽和TGF-β1同时处理时，与整联蛋白β1、β3和αv结合的能力进一步增加(图3)。这意味着SEQ ID NO:1的肽选择性结合整合蛋白β1、β3和αv的能力在TGF-β1高的病理条件下进一步增加。
实施例3：使用免疫沉淀对SEQ ID NO:2的肽与Smad2和Smad3结合能力的确认
在包含5％ DMEM高葡萄糖(Gibco，11965092)、10％ FBS(Gibco，16000044)和1％抗生素-抗真菌剂(Gibco，15240062)的培养基中培养LX-2(人肝星状细胞系，Millipore#SCC064)。
用100μM结合生物素的SEQ ID NO:2的肽(生物素-Seq 2)处理3×106个LX-2细胞1小时。用冰冷的PBS洗涤如此处理的细胞，向其中加入500μl的RIPA缓冲液(pH 8.0的10mMTris-HCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、1％Triton X-100、0.1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、140mMNaCl、完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂(Sigma-Aldrich)、磷酸酶抑制剂鸡尾酒试剂(Sigma-Aldrich))，并裂解细胞20分钟。此后，以13000g离心25分钟，并使用垂直振荡器使细胞裂解物与抗生物素抗体(稀释1:100；OriGene)在4℃下反应过夜。向其中加入20μl的蛋白-A琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology，sc-2003)，然后另外反应3小时。以13000g进行短暂离心，弃去上清液，并用PBS洗涤珠粒。通过加入5x SDS样品缓冲液，以及然后煮沸珠粒，然后进行SDS-PAGE和蛋白质印迹，以分离与珠粒结合的蛋白质。使用抗Smad2(CellSignaling，#5339)和Smad3(Cell Signaling，#9513)的抗体进行免疫印迹。蛋白质水平以全裂解物(输入)和免疫沉淀蛋白质(IP)表示。
结果，SEQ ID NO:2的肽(生物素-Seq 2)显示出与Smad2和Smad3结合的能力，特别是与Smad3结合的能力更高(图4)，这表明SEQ ID NO:2的肽作用于TGF-β1的亚信号Smad2和Smad3。
实施例4：SEQ ID NO:2的肽对Smad2和Smad3磷酸化的抑制的确认
在包含5％ DMEM高葡萄糖(Gibco，11965092)、10％ FBS(Gibco，16000044)和1％抗生素-抗真菌剂(Gibco，15240062)的培养基中培养LX-2(人肝星状细胞系，Millipore#SCC064)。用10ng/ml TGF-β1处理3×106个LX-2细胞并培养24小时。在新鲜培养基中用10、100或200μM的SEQ ID NO:2的肽或10μM SIS3(Smad3抑制剂，Sigma-Aldrich，catalog#566405)处理细胞，并培养24小时。
使用包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(25mM Tris HCl pH7.6，150mM NaCl，1％ NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS)裂解蛋白质。通过BCA蛋白测定对蛋白进行定量，并且通过蛋白质印迹法测定pSmad2、Smad2、pSmad3、Smad3、TGFβ受体1和GAPDH蛋白的表达水平。对于蛋白质印迹，将相同量的样品与大小标志物一起上样到8％SDSPAGE凝胶上，电泳约2小时，并且然后转移到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂乳封闭经转移的膜1小时，并使其以1:1000的比例与一抗反应过夜。所使用的一抗是pSmad2(CellSignaling，#3108)、Smad2(Cell Signaling，#5339)、pSmad3(Abcam，ab52903)、Smad3(CellSignaling，#9513)、TGFβ受体1(Abcam，ab31013)和GAPDH(Cell Signaling，#2118S)。此后，用含有0.1％吐温20的TBST洗涤膜，并使其与缀合HRP的抗兔(Bethyl，A120-101P)和抗小鼠(Bethyl，A90-116P)的二抗以1:5000的比例反应1小时，随后用ECL底物进行化学发光。
结果，pSmad3的表达在10μM的SEQ ID NO:2的肽浓度中完全消失，并且pSmad2的表达随着SEQ ID NO:2的肽浓度的增加而降低(图5)。然而，TGFβ受体的表达水平没有变化。这意味着SEQ ID NO:2的肽与Smad2和Smad3结合从而抑制其磷酸化。
实施例5：对细胞中胶原蛋白基因表达的抑制的确认
在全生长培养基(补充有hFGF-B、胰岛素、GA-1000和2％ FBS的成纤维细胞生长基础培养基-2，Lonza#CC-3132)中培养来源于特发性肺纤维化患者的人肺成纤维细胞(DHLF-IPF，Lonza,#CC-7231)。将细胞接种在24孔板中，并在饥饿培养基(Dulbecco改良Eagle培养基/F12，不含FBS，补充有0.1mM 2-磷酸-L-抗坏血酸)中培养24小时。将重组人TGF-β1蛋白(R&DSystems，#240-B-002)在含有1mg/ml牛血清白蛋白的无菌4mM HCl中稀释至20μg/ml。将细胞在含有10ng/ml TGF-β1的完全生长培养基中培养24小时。在新鲜培养基中用SEQ IDNO:1(200μM)、SEQ ID NO:2(200μM)或尼达尼布(10μM)处理细胞，并培养24小时。将肽溶解在纯化水中，将尼达尼布溶解在二甲基亚砜中，并将培养基中二甲基亚砜的浓度设定为1％。去除培养基，随后用DPBS(Welgene，LB001-02)洗涤，并用1ml的trizol试剂(Ambion，15596)裂解细胞。向其中加入250μl的氯仿，搅拌管，并以10000rpm离心15分钟。用移液管除去水性层后，加入550μl的异丙醇(Sigma，I9516)并轻轻摇动。以15000rpm离心25分钟后，除去异丙醇，并向其中加入1ml的75％乙醇。除去乙醇并在空气中干燥后，将沉淀(pellet)溶解在DEPC水(Invitrogen，AM9915G)中。使用Nano Drop(Thermo Scientific，NanoDropOne，AZY1913798)测量RNA的浓度。
根据制造商的方案，使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher，K1641)从提取的RNA合成cDNA。此外，根据制造商的方案，使用QuantStudio 3(AppliedBiosystems，A28132)进行实时PCR。通过在95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下30秒重复50个循环来进行PCR扩增。这里，使用的引物序列如下表1所示。
[表1]引物序列
结果，用TGF-β1处理增加了COL1A2和COL3A1基因表达，但是当用TGF-β1处理细胞，并且然后用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽处理细胞时，每种胶原蛋白基因的表达显著降低(*p<0.05)，确认了本发明的肽比尼达尼布更有效(图6)。
实施例6：对细胞重编程效应的确认
在包含5％ DMEM高葡萄糖(Gibco，11965092)、10％ FBS(Gibco，16000044)和1％抗生素-抗真菌剂(Gibco，15240062)的培养基中将LX-2(人肝星状细胞系，Millipore#SCC064)以1×106接种在6孔板(Nunc，140675)的每个孔中并培养。在Opti-MEMTM(Gibco，31985-070)中饥饿6小时后，用新鲜的Opti-MEMTM替换培养基，并用10ng/ml TGF-β1和100μM的SEQ ID NO:2的肽处理细胞24小时。去除培养基，随后用DPBS(Welgene，LB001-02)洗涤，并用1ml的trizol试剂(Ambion，15596)裂解细胞。向其中加入250μl的氯仿，搅拌管，并以10000rpm离心15分钟。用移液管除去水性层后，加入550μl的异丙醇(Sigma，I9516)并轻轻摇动。以15000rpm离心25分钟后，除去异丙醇，并向其中加入1ml的75％乙醇。除去乙醇并在空气中干燥后，将沉淀溶解在DEPC水(Invitrogen，AM9915G)中。使用Nano Drop(ThermoScientific，NanoDrop One，AZY1913798)测量RNA的浓度。
根据制造商的方案，使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher，K1641)从提取的RNA合成cDNA。此外，根据制造商的方案，使用QuantStudio 3(AppliedBiosystems，A28132)进行实时PCR。通过在95℃下15秒、60℃下50秒和72℃下15秒重复40个循环来进行PCR扩增。这里，使用的引物序列如下表2所示。
[表2]引物序列
结果，SEQ ID NO:2的肽增加了作为MET标志物的E-钙粘蛋白(E-cadherin)和EpCAM的基因表达，并降低了作为EMT标志物的N-钙粘蛋白、Twist1和Snail1的基因表达。相反，TGF-β1降低了MET标志物的表达，而增加了EMT标志物的表达(图7)。因此，发现SEQ IDNO:2的肽增加MET并抑制EMT。
实施例7：对博莱霉素诱导性肺病动物模型中的治疗效果的确认
7-1:动物试验方法
为了在动物水平上确认根据本发明的肽的纤维化治疗效果，使用了用博莱霉素(bleomycin)诱导的肺病的动物模型。C57BL/6J小鼠(雄性，7周龄)购自Charles River。通过腹腔内给药Imalgene(氯胺酮(ketamine)，100mg/kg)/龙彭(Rompun)(赛拉嗪(xylazine)，20mg/kg)的混合物将小鼠麻醉，并且气管内注射一次总量为50μl的硫酸博莱霉素(1.45mg/kg，MBcell，CA，美国)，而在正常组中气管内注射盐水(第0天)。在第7天，将小鼠分组，每组八只。每周三次皮下注射PBS(NT)、SEQ ID NO:1(30mg/kg)和SEQ ID NO:2(30mg/kg)，每天口服尼达尼布(fluorochem Ref＝050741，100mg/kg)。将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽的每一种溶解在注射用水中后给药，并且尼达尼布在与包含0.5％羟乙基纤维素(Sigma；批次BCBV5033)和0.01％吐温80(Sigma；批次BCBR6211V)的水混合后给药。在给药21天的同时，每2天测量体重，并检查是否有其他临床症状。实验方案如图8a中所示。
7-2:对体重变化的观察
基于从第0天到第22天体重变化的测量结果，在给药博莱霉素后体重一直下降到第7天，但是在用根据本发明的肽和尼达尼布治疗后有所增加(图8b)，并且没有观察到由于根据本发明的肽和尼达尼布的毒性而导致的体重减轻。
7-3:对纤维沉积的观察
在第22天用异氟醚处死小鼠后，从其切下肺组织并进行组织学分析。将石蜡引入肺中，制备5μm石蜡切片，进行天狼猩红染色和苏木精/荧光桃红染色以评估肺纤维化和炎症的程度，并通过显微镜观察炎症和纤维化的程度。因此，在用博莱霉素诱导的肺病并给药PBS的组(NT)中，在肺中观察到大量纤维沉积，而在尼达尼布给药组中，虽然有一些治疗效果，但仍观察到大量沉积的纤维组织。然而，与NT组和尼达尼布给药组相比，给药SEQ IDNO:1的肽的组和给药SEQ ID NO:2的肽的组被确认显著降低了纤维化(图8c)。
7-4:对纤维化面积的测量
为了量化纤维化变化，在用天狼猩红染色的样品中对红色(纤维化部分)的面积进行量化。结果，与NT组和尼达尼布处理组相比，用SEQ ID NO:1的肽和SEQ ID NO:2的肽处理的组显示出纤维化面积的显著减少(图8d，P<0.05)。
实施例8：对甲硫氨酸胆碱缺乏饮食小鼠模型中疗效的确认
8-1:动物试验方法
为了在动物水平上进一步确认根据本发明的肽的纤维化治疗效果，通过向小鼠(甲硫氨酸-胆碱缺乏型饮食小鼠模型)提供甲硫氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食来诱导肝炎和肝纤维化。使用6周龄的雄性C57BL/6J小鼠，并将其分成正常饮食组、喂食MCD饮食后未处理的组、注射有SEQ ID NO:1的肽(20mg/kg)和SEQ ID NO:2的肽(20mg/kg)的组、以及皮下注射利拉糖肽(liraglutide)(0.2mg/kg)的阳性对照组，其中利拉糖肽是一种用作肝炎治疗剂的胰高血糖素样肽1受体激动剂。在自主喂食MCD饮食10周后，将8只小鼠分配到每组，并对其给药治疗剂。肽和利拉糖肽每天给药一次，总共12次，间隔3天(图9a)。
8-2:对肝脏炎症程度的测量
对于所有的动物，在开始给药前立即测量体重，并在整个试验期间每周测量体重两次。在最后一次给药结束后，通过腹膜内注射300μl的阿佛丁(Avertin)来麻醉动物，通过剖腹手术从腹部腔静脉收集血液，从中取出肝脏和脾脏，并测量所取出的器官的重量。将所有接受尸体解剖的动物的组织固定在中性缓冲福尔马林溶液中，并通过组织加工制作石蜡块并切片。将如此获得的组织切片进行H&E染色。对H&E染色的标本进行脂肪变性、气球样变性和小叶炎症的评分(表3)，并测量肝脏炎症的程度(NAFLD活性评分)。
[表3]NAFLD活性评分
其结果如图9b和9c中所示。与NT组或阳性对照GLP-1激动剂给药组相比，给药SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的肽的两组均显著降低了NAFLD活性评分。
8-3:对纤维化面积的测量
以与实施例8-2中相同的方式制造的组织切片用Masson三色染色，并且用光学显微镜(BX51，Olympus，GER)在所有Masson三色染色的载玻片(300MI CMOS照相机，Aptina)中的5个随机指定的不同位点处获得100x放大图像。测量蓝染面积(Image-Pro Plus，MediaCybernetics Inc.，UK)并以百分比进行分析(Masson的三色阳性面积(％))。
结果，如图9d和9e中所示，与NT组或阳性对照GLP-1激动剂给药组相比，给药SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的肽的两组被确认显著减少了纤维化面积。
工业实用性
根据本发明，相比于作为肺纤维化治疗剂的市售尼达尼布和作为肝纤维化治疗剂的市售利拉糖肽，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽能够表现出更优异的治疗效果，因此能够替代这些市售治疗剂，并能够与这些治疗剂联合使用。
上面已经详细描述了本发明的特定部分，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些特定描述仅仅是优选实施方式，本发明的范围并不因此受到限制。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。
序列表自由文本
附上电子文件。
<110> 纳米智能生物医学工程有限公司
首尔大学校产学协力团
<120> 用于预防和治疗纤维化的肽
<130> PP-B2756
<150> KR 2021-0009981
<151> 2021-01-25
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
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Claims (8)

1.一种用于预防和治疗纤维化的由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的所述肽通过与整联蛋白结合抑制TGF-β1从大潜伏复合物(LLC)中解离。
3.根据权利要求1所述的肽，其中，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的所述肽抑制上皮-间充质转化，或通过细胞穿透与Smad2和Smad3结合从而抑制其磷酸化。
4.一种用于预防或治疗纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽和/或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的肽。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述纤维化选自由肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化组成的组。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物被配制成选自由以下组成的组的任何一种剂型：注射剂、口服制剂、贴剂、液体、胶囊、颗粒、片剂、粉剂、喷雾剂、鼻腔给药制剂、吸入喷雾剂、软膏、凝胶、粘膜给药制剂以及栓剂。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含可接受的佐剂。
8.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述肽以每天1μg/kg至100mg/kg给药，并且每天给药或每周给药1-3次。
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