CN116948806B - 一种宽测量范围的数字pcr芯片、使用方法及制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片、使用方法及制作方法，涉及PCR芯片领域，芯片包括：芯片本体，芯片本体设置有储液孔、通油孔、出液孔、第一腔室区、第二腔室区、第一连通结构以及第二连通结构；第一腔室区设置有多个体积相等的第一腔室；第一连通结构分别与储液孔、通油孔以及第一腔室连通；第二腔室区设置有多个体积相等的第二腔室；第二连通结构分别与第一连通结构、第二腔室以及出液孔连通；第一腔室与第二腔室的体积以及数量均不相等。通过设置有第一腔室区以及第二腔室区，第一腔室区的第一腔室与第二腔室区的第二腔室两者体积、数量不同，能够增大整体的测量范围，有利于提高对未知样本浓度的适应性，令使用更加便捷。
Description
技术领域
本发明涉及PCR芯片技术领域，尤其涉及一种宽测量范围的数字PCR芯片、使用方法及制作方法。
背景技术
PCR芯片是一种集成了PCR（聚合酶链式反应）技术的微流控芯片，用于在微尺度上进行PCR反应，实现高通量、快速检测、低成本的PCR分析。与实时定量PCR（qPCR）相比，数字PCR（dPCR）因其在核酸绝对定量方面的优势，在生物医学领域引起了广泛的关注。在数字PCR中，测试样本被分成数万个单独的反应分区，在反应扩增后，通过统计阴性分区和阳性分区数，处理后可以得到原始样本的浓度。数字PCR具有独立于外部参考的高精度DNA定量能力，因此在癌症早期检测、胎儿遗传病诊断等生物医学领域具有广阔的应用前景。
现有的数字PCR平台可分为两大类：基于液滴的数字PCR（ddPCR）和基于腔室的数字PCR（cdPCR）。通常，ddPCR平台具有更灵活的DNA定量测量范围，因为它们可以实现不同设定数量的分区而不需要大幅改变芯片及分析设备，然而，ddPCR平台通常需要复杂的设备和工作流程，这大大增加了检测的成本，更严重的是，稳定性差的油包水液滴在操作和热循环过程中可能会碰撞和融合，这可能会影响定量结果的准确性，此外，在液滴转移过程中可能会发生交叉污染，这也会影响检测结果的可靠性。与ddPCR平台相比，cdPCR平台通过物理腔室将样品分成相等的体积，避免了操作过程中碰撞引起的液滴融合，并且cdPCR平台采用全封闭芯片，也可避免交叉污染，此外cdPCR可以在荧光显微镜下轻松获得视觉上的核酸扩增结果，这使得测量结果更加直观和有效。
然而，虽然cdPCR芯片具有避免交叉污染、直观获取测量结果等优点，但是现有的cdPCR芯片的测量范围，即能够可靠地测量样本浓度的范围较窄，在使用过程对未知浓度的样本适应性较差，并且操作复杂，导致使用不便。
发明内容
本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片、使用方法及制作方法，用以解决现有技术中基于腔室的数字PCR芯片测量范围较窄和操作复杂的缺陷。
本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片，包括：芯片本体，所述芯片本体设置有储液孔、通油孔、出液孔、第一腔室区、第二腔室区、第一连通结构以及第二连通结构；所述第一腔室区设置有多个体积相等的第一腔室；所述第一连通结构分别与所述储液孔、所述通油孔以及所述第一腔室连通；所述第二腔室区设置有多个体积相等的第二腔室；所述第二连通结构分别与所述第一连通结构、所述第二腔室以及所述出液孔连通；所述第一腔室与所述第二腔室的体积以及数量均不相等。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述芯片本体还设置有进水孔、出水孔以及储水区，所述储水区的竖直投影区域覆盖所述第一腔室区以及所述第二腔室区，所述储水区设置有储水通道，所述储水通道呈连续U型弯曲状，所述储水通道连通所述进水孔以及所述出水孔。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述芯片本体包括第一基片、第二基片以及第三基片，所述第一腔室、所述第二腔室、所述第一连通结构、所述第二连通结构设置于所述第一基片与所述第二基片之间，所述储水通道设置于所述第二基片与所述第三基片之间，所述储液孔、所述通油孔、所述出液孔、所述进水孔以及所述出水孔均设置于所述第三基片上。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述第一连通结构包括第一分流结构以及至少两条相互平行的第一通道，所述第一通道位于所述第一腔室区，所述第一腔室排列于所述第一通道的两侧并且所述第一腔室与所述第一通道连通，所述储液孔以及所述通油孔均通过所述第一分流结构与全部所述第一通道连通。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述第二连通结构包括第二分流结构、汇流结构以及至少四条相互平行的第二通道，所述第二通道位于所述第二腔室区，所述第二腔室排列于所述第二通道的两侧并且所述第二腔室与所述第二通道连通，所述第一通道通过所述第二分流结构与至少两条所述第二通道连通，每条所述第一通道连通所述第二通道的数量相同，全部所述第二通道通过所述汇流结构与所述出液孔连通。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述第一腔室排成多列，相邻两列的所述第一腔室之间错位设置；和/或，所述第二腔室排成多列，相邻两列的所述第二腔室之间错位设置。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述第一分流结构包括第一满二叉树状通道，所述储液孔以及所述通油孔均与所述第一满二叉树状通道的顶端连通，所述第一满二叉树状通道的底端与所述第一通道一一对应连通；和/或，所述第二分流结构包括与所述第一通道一一对应的第二满二叉树状通道，所述第一通道与对应的所述第二满二叉树状通道的顶端连通，所述第二满二叉树状通道的底端与所述第二通道一一对应连通；和/或，所述汇流结构包括第三满二叉树状通道，所述第三满二叉树状通道的底端与所述第二通道一一对应连通，所述第三满二叉树状通道的顶端与所述出液孔连通。
根据本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，所述第一腔室的长度为210微米、宽度为180微米以及高度为150至200微米；所述第二腔室的长度为45微米、宽度为45微米以及高度为35至45微米；所述第一腔室区的面积与所述第二腔室区的面积比为7：3；所述第一通道的宽度为45微米以及高度为35至40微米；所述第二通道的宽度为10微米以及高度为8至12微米；所述储水通道的宽度为500至800微米、高度为50至500微米以及相邻通道段之间的间隔为300至500微米，所述储水通道的宽度大于相邻通道段之间的间隔。
本发明还提供应用于上述一种宽测量范围数字的PCR芯片的使用方法，所述第二基片由透气材料制成，使用步骤包括：
将含样本的反应液注入所述储液孔，密封所述通油孔以及所述出液孔，所述进水孔与所述出水孔其中之一施加负压并且另一密封，使反应液填充所述第一腔室以及所述第二腔室；
将水注入所述进水孔并且在所述进水孔处施加正压，使水填充所述储水通道；
将油相物质注入所述通油孔，在所述通油孔处施加正压，在所述出液孔施加负压，使油相物质填充所述第一连通结构以及所述第二连通结构，令所述第一腔室之间以及所述第二腔室之间相互隔离；
加热所述芯片本体至第一预设温度值，维持第一预设温度值持续第一预设时间值；
统计存在荧光的所述第一腔室的数量以及存在荧光的所述第二腔室的数量，利用泊松分布公式处理得到样本中目标核酸分子数量计算值。
本发明还提供应用于上述一种宽测量范围数字的PCR芯片的制作方法，包括：
打印第一图案层在第一掩膜上，打印第二图案层在第二掩膜上；
将光刻胶设置在第一硅片以及第二硅片上；
加热所述第一硅片与所述第二硅片至第二预设温度值并维持第二预设时间值；
使用所述第一掩膜对所述第一硅片上的所述光刻胶进行曝光，使用所述第二掩膜对所述第二硅片上的所述光刻胶进行曝光；
加热所述第一硅片与所述第二硅片至第三预设温度值并维持第三预设时间值；
使用显影液对所述第一硅片上的光刻胶进行处理形成第一成型部，使用显影液对所述第二硅片上的光刻胶进行处理形成第二成型部；
使用聚二甲基硅氧烷覆盖所述第一成型部以及所述第二成型部，进行注模；
加热所述第一硅片以及所述第二硅片至第四预设温度值并维持第四预设时间值；
将固化的所述聚二甲基硅氧烷从所述第一硅片上脱模，形成所述第二基片，将固化的所述聚二甲基硅氧烷从所述第二硅片上脱模，形成所述第三基片；
对所述第二基片以及所述第三基片进行表面等离子体处理；
将所述第二基片以及所述第三基片对位粘合；
加热所述第二基片以及所述第三基片至第五预设温度值并维持第五预设时间值；
对所述第二基片以及所述第三基片进行打孔处理；
将已粘合的所述第二基片和所述第三基片通过所述第二基片与第一基片粘合实现封装。
本发明提供的一种宽测量范围的数字PCR芯片，至少具备以下有益效果：将包含样本的反应液注入储液孔中，反应液经第一连通结构流入第一腔室以及经第二连通结构流入第二腔室，然后将油相物质注入通油孔，油相物质填充第一连通结构以及第二连通结构，使得反应液隔离在每个第一腔室以及第二腔室中，令每个第一腔室和第二腔室单独进行聚合酶链式反应。由于较大的反应体积有更大的概率包含目标物分子，对低浓度样品具有更高的分辨率，对应地，较小的反应体积对高浓度样品具有较高的分辨率，通过第一腔室与第二腔室的体积不同，即测量范围不同，两者结合能够增大整体的测量范围，同时第一腔室的数量与第二腔室的数量不同，体积小的可以设置更多数量即密度更高，有利于进一步增大测量范围。以此，通过设置有第一腔室区以及第二腔室区，第一腔室区的第一腔室与第二腔室区的第二腔室两者体积、数量不同，能够增大整体的测量范围，有利于提高对未知样本浓度的适应性，令使用更加便捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片其中一种实施例的结构示意图之一；
图2是图1中A处的局部放大示意图；
图3是图1中B处的局部放大示意图；
图4是本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片其中一种实施例的结构示意图之二；
图5是本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片的截面示意图；
图6是本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片其中一种实施例的结构示意图之三；
图7是本发明提供一种宽测量范围的数字PCR芯片的制作方法的流程示意图。
附图标记：
100：芯片本体；101：储液孔；102：通油孔；103：出液孔；104：进水孔；105：出水孔；110：第一基片；120：第二基片；130：第三基片；200：第一腔室区；210：第一腔室；300：第二腔室区；310：第二腔室；410：第一分流结构；420：第一通道；510：第二分流结构；520：汇流结构；530：第二通道；600：储水区；610：储水通道；710：第一成型部；720：第二成型部。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合图1-图6描述本发明的一种宽测量范围的数字PCR芯片，包括：芯片本体100，所述芯片本体100设置有储液孔101、通油孔102、出液孔103、第一腔室区200、第二腔室区300、第一连通结构以及第二连通结构；所述第一腔室区200设置有多个体积相等的第一腔室210；所述第一连通结构分别与所述储液孔101、所述通油孔102以及所述第一腔室210连通；所述第二腔室区300设置有多个体积相等的第二腔室310；所述第二连通结构分别与所述第一连通结构、所述第二腔室310以及所述出液孔103连通；所述第一腔室210与所述第二腔室310的体积以及数量均不相等。
将包含样本的反应液注入储液孔101中，反应液经第一连通结构流入第一腔室210以及经第二连通结构流入第二腔室310，然后将油相物质注入通油孔102，油相物质填充第一连通结构以及第二连通结构，使得反应液隔离在每个第一腔室210以及第二腔室310中，令每个第一腔室210和第二腔室310单独进行聚合酶链式反应。由于较大的反应体积有更大的概率包含目标物分子，对低浓度样品具有更高的分辨率，对应地，较小的反应体积对高浓度样品具有较高的分辨率，通过第一腔室210与第二腔室310的体积不同，即测量范围不同，两者结合能够增大整体的测量范围，同时第一腔室210的数量与第二腔室310的数量不同，体积小的可以设置更多数量即密度更高，有利于进一步增大测量范围。以此，通过设置有第一腔室区200以及第二腔室区300，第一腔室区200的第一腔室210与第二腔室区300的第二腔室310两者体积、数量不同，能够增大整体的测量范围，有利于提高对未知样本浓度的适应性，令使用更加便捷。
测量过程大致为：往储液孔101注入含样本的反应液，反应液经第一连通结构流动填充第一腔室210后，反应液继续沿第二连通结构填充第二腔室310，然后往通油孔102注入油相物质，油相物质流动填充第一连通结构以及第二连通结构，油相物质隔离第一腔室210、第二腔室310中的反应液，避免交叉污染。进行加热等操作，以令反应液进行聚合酶链式反应。拍摄第一腔室区200与第二腔室区300的图像，通常反应液中添加荧光剂，使得含有目标物分子的第一腔室210或第二腔室310会发出荧光，根据第一腔室210发出荧光的数量、第二腔室310发出荧光的数量进行统计处理，能够获知样本浓度信息。
参考图4和图5，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述芯片本体100还设置有进水孔104、出水孔105以及储水区600，所述储水区600的竖直投影区域覆盖所述第一腔室区200以及所述第二腔室区300，所述储水区600设置有储水通道610，所述储水通道610呈连续U型弯曲状，所述储水通道610连通所述进水孔104以及所述出水孔105。
在进行聚合酶链式反应过程中，需要进行加热，通过设置有储水区600并且储水区600的竖直投影区域覆盖第一腔室区200以及第二腔室区300，通过进水孔104向储水通道610注入水，使得储水区600能够为第一腔室区200、第二腔室区300提供良好的热传导和保温效果，有利于使聚合酶链式反应的温度控制更加稳定，进而提高聚合酶链式反应的扩增效率，同时，设置有储水区600的结构亦有利于减少第一腔室210、第二腔室310的水分蒸发。
需要说明的是，图5仅是截面结构的示意图，并不是实际物体的界面图，只是用于方便理解芯片本体100的结构关系。
参考图5，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述芯片本体100包括第一基片110、第二基片120以及第三基片130，所述第一腔室210、所述第二腔室310、所述第一连通结构、所述第二连通结构设置于所述第一基片110与所述第二基片120之间，所述储水通道610设置于所述第二基片120与所述第三基片130之间，所述储液孔101、所述通油孔102、所述出液孔103、所述进水孔104以及所述出水孔105均设置于所述第三基片130上。
通过上述结构，可以是在第二基片120上设置有第一凹腔、第二凹腔、第一凹槽结构以及第二凹槽结构，使得第二基片120与第一基片110连接后，第一基片110遮挡第一凹腔的开口、第二凹腔的开口、第一凹槽结构的开口以及第二凹槽结构的开口，对应形成第一腔室210、第二腔室310、第一连通结构以及第二连通结构；相应的，可以是在第三基片130上设置有储水凹槽，第三基片130与第二基片120连接后，第二基片120的背面遮挡储水凹槽的开口，对应形成储水通道610。储液孔101、通油孔102、出液孔103、进水孔104以及出水孔105均设置在第三基片130上，便于使用，第二基片120设置有与储液孔101、通油孔102、出液孔103对应的通孔以与第二基片120上的对应结构连通。以此，第一基片110、第二基片120以及第三基片130的结构，有利于方便加工制作。
在本发明的一些实施例中，第一基片110可以为玻璃或者聚二甲基硅氧烷，第二基片120以及第三基片130可以是由聚二甲基硅氧烷材料制成。
参考图1和图2，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述第一连通结构包括第一分流结构410以及至少两条相互平行的第一通道420，所述第一通道420位于所述第一腔室区200，所述第一腔室210排列于所述第一通道420的两侧并且所述第一腔室210与所述第一通道420连通，所述储液孔101以及所述通油孔102均通过所述第一分流结构410与全部所述第一通道420连通。
多条第一通道420平行排布，每条第一通道420的两侧排列有第一腔室210，每个第一腔室210与对应的第一通道420连通，储液孔101以及通油孔102提供过第一分流结构410与全部的第一通道420连通。以此结构，各第一通道420提供相同的液体流通环境，有利于均衡各第一腔室210的进样条件，提高第一腔室210进样的一致性，进而令测量的结果更加精准。
参考图1至图3，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述第二连通结构包括第二分流结构510、汇流结构520以及至少四条相互平行的第二通道530，所述第二通道530位于所述第二腔室区300，所述第二腔室310排列于所述第二通道530的两侧并且所述第二腔室310与所述第二通道530连通，所述第一通道420通过所述第二分流结构510与至少两条所述第二通道530连通，每条所述第一通道420连通所述第二通道530的数量相同，全部所述第二通道530通过所述汇流结构520与所述出液孔103连通。
多条第二通道530平行排布，每条第二通道530的两侧排列有第二腔室310，每个第二腔室310与对应的第二通道530连通，第一通道420通过第二分流结构510与对应的第二通道530连通。以此结构，各第二通道530提供相同的液体流通环境，有利于均衡各第二腔室310的进样条件，提高第二腔室310进样的一致性，进而令测量结构更加精准。
参考图1至图3，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述第一腔室210排成多列，相邻两列的所述第一腔室210之间错位设置；和/或，所述第二腔室310排成多列，相邻两列的所述第二腔室310之间错位设置。
第一通道420的两侧排列有第一腔室210，即全部第一腔室210排成多列，相邻两列的第一腔室210错位设置，令相邻列第一腔室210之间的隔离壁面体积更大，防止相邻列第一腔室210之间的壁面过薄，有利于提高结构的可靠性。同理，全部第二腔室310排成多列，相邻两列的第二腔室310错位设置，令相邻列第二腔室310之间的隔离壁面体积更大，有利于提高结构的可靠性。
参考图1，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述第一分流结构410包括第一满二叉树状通道，所述储液孔101以及所述通油孔102均与所述第一满二叉树状通道的顶端连通，所述第一满二叉树状通道的底端与所述第一通道420一一对应连通。
第一分流结构410采用第一满二叉树状通道的结构，储液孔101、通油孔102中的流体从第一满二叉树状通道的顶端流入，流体能够在每个底端的端口均匀流出，有利于令流向每条第一通道420的流体压力、流量等条件均衡。
参考图1和图2，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述第二分流结构510包括与所述第一通道420一一对应的第二满二叉树状通道，所述第一通道420与对应的所述第二满二叉树状通道的顶端连通，所述第二满二叉树状通道的底端与所述第二通道530一一对应连通；
第二分流结构510采用第二满二叉树状通道的结构，第一通道420的流体从第二满二叉树状通道的顶端流入，流体能够在第二满二叉树状通道的每个底端的端口均匀流出，有利于令流向每条第二通道530的流体压力、流量等条件均衡。
参考图1和图3，在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述汇流结构520包括第三满二叉树状通道，所述第三满二叉树状通道的底端与所述第二通道530一一对应连通，所述第三满二叉树状通道的顶端与所述出液孔103连通。
回流结构采用第三满二叉树状通道的结构，每条第二通道530对应与第三满二叉树状通道底端的端口连接，使得第二通道530的流体从第三满二叉树状通道底端的端口流入，并汇聚之后从第三满二叉树状通道的顶端流向出液孔103，以此有利于令每条第二通道530中流体流向第三满二叉树状通道的流体阻力等条件均衡。
满二叉树状通道，即以顶端为始点，向下每层级以一分为二的规则向下增长，最下级的底端为终点。第一满二叉树状通道的层级数，与单个储液孔101对应第一通道420的数量相关，第二满二叉树状通道的层级数与单个第一通道420对应第二通道530的数量相关，第三满二叉树状通道的层级数与单个储液孔101对应第二通道530的数量相关。以第一满二叉树状通道为例，若单个储液孔101对应八条第一通道420，则第一满二叉树状通道的层级数为三。第一满二叉树状通道与第二满二叉树状通道为正二叉树，流体从顶端流向各底端，第三满二叉树状通道为倒二叉树，流体从各底端流向顶端。
在本发明的一些实施例中，第一分流结构410可以是包括与第一通道420一一对应的第一支流通道，储液孔101、通油孔102通过所述第一支流通道与对应的第一通道420连通；第二分流结构510可以是包括与第二通道530一一对应的第二支流通道，第二通道530通过第二支流通道与对应的第一通道420连通；汇流结构520可以是包括与第二通道530一一对应的第三支流通道，每条第二通道530通过第三支流通道与出液孔103连通。
在本发明一种宽测量范围的数字PCR芯片的一些实施例中，所述第一腔室210的长度为210微米、宽度为180微米以及高度为200微米；所述第二腔室310的长度为45微米、宽度为45微米以及高度为40微米；所述第一腔室区200的面积与所述第二腔室区300的面积比为7：3；所述第一通道420的宽度为45微米以及高度为35至40微米；所述第二通道530的宽度为10微米以及高度为8至12微米；所述储水通道610的宽度为500至800微米、高度为50至500微米以及相邻通道段之间的间隔为300至500微米，所述储水通道610的宽度大于相邻通道段之间的间隔。
第一腔室210、第二腔室310、第一通道420以及第二通道530采用上述尺寸，第一腔室区200面积与第二腔室区300面积比为7：3，有利于使第一腔室区200的测量范围与第二检测区的测量范围减少重叠，有利于增大整体的测量范围，同时，有利于改善在通入油相物质后第一腔室210、第二腔室310的密封效果，另外，亦有利于缓解流体对各通道壁面的造成的形变压力，保证通入油相物质的稳定性，令最终测量测过更加准确。储水通道610采用上述尺寸，有利于令第一腔室210、第二腔室310的温度均匀，并且减少水分蒸发。
本发明还提供应用于上述一种宽测量范围数字的PCR芯片的使用方法，其中所述第二基片120由透气材料制成，使用步骤包括：
将含样本的反应液注入所述储液孔101，密封所述通油孔102以及所述出液孔103，所述进水孔104与所述出水孔105其中之一施加负压并且另一密封，使反应液填充所述第一腔室210以及所述第二腔室310；
将水注入所述进水孔104并且在所述进水孔104处施加正压，使水填充所述储水通道610；
将油相物质注入所述通油孔102，在所述通油孔102处施加正压，在所述出液孔103施加负压，使油相物质填充所述第一连通结构以及所述第二连通结构，令所述第一腔室210之间以及所述第二腔室310之间相互隔离；
加热所述芯片本体100至第一预设温度值，维持第一预设温度值持续第一预设时间值；
统计存在荧光的所述第一腔室210的数量以及存在荧光的所述第二腔室310的数量，利用泊松分布公式处理得到样本中目标核酸分子数量计算值。
参考图6，将含样本的反应液注入储液孔101中，密封除出水孔105外的端口，在出水孔105处施加负压，或者密封除进水孔104外的端口，在进水孔104处施加负压。由于第二基片120是由透气材料制成，能够透过气体但不能透过液体，在出水孔105或进水孔104处施加负压，会抽出储水通道610以及第一腔室区200、第二腔室区300、第一连通结构和第二连通结构中的空气，使得储液孔101中的反应液沿第一连通结构流入第一腔室210中，然后沿第二连通结构流入第二腔室310中，以此，利用第二基片120的透气性以及负压驱使反应液流动，相当于对第一腔室210与第二腔室310抽真空，确保第一腔室210与第二腔室310均填充反应液。解除端口的密封，对进水孔104注水，令水填充储水通道610，能够防止后续加热过程中，反应液的水分蒸发。对通油孔102注入油相物质，使得油相物质流入通油孔102并在通油孔102施加正压，同时在出液孔103处施加负压，使油相物质填充第一连通结构以及第二连通结构，令各第一腔室210、第二腔室310隔离，多余的油相物质从出液孔103排出。然后加热芯片本体100，令第一腔室210、第二腔室310中的反应液进行聚合酶链式反应。反应液中具有荧光物质，如若聚合酶链式反应产生的产物中具有目标物分子，该目标分子会带有荧光物质并产生荧光信号，通过拍摄第一腔室区200与第二腔室区300的图像，能够统计存在荧光的第一腔室210以及第二腔室310的数量，进而通过泊松分布公式处理获得样本中目标核酸分子的数量计算值，达到测量目的。由于第一腔室210、第二腔室310的体积以及数量不同，有利于提高测量范围，并且操作简单便捷。
第二基片120采用透气材料制成，具体可以是为聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）等具有透气性的材料，在一些实施例中，第二基片120与第三基片130均采用聚二甲基硅氧烷制成。
在注入反应液过程中，由于使用利用第二基片120的透气材料特性以及负压驱动，能够抽出第一腔室210以及第二腔室310中原有的物质，如空气等，令反应液能够填充第一腔室210以及第二腔室310，在出水孔105或进水孔104处施加的负压可以为450mbar。在注入油相物质过程中，由于在通油孔102使用正压驱动，第一腔室210、第二腔室310中已有反应液，油相物质不能挤出反应液，只能填充第一连通结构以及第二连通结构，此过程中在出液孔103施加负压，能够令油相物质更容易流动填充第一连通结构以及第二连通结构，但仍以正压驱动为主，在通油孔102处施加的正压可以是150mbar，在出液孔103处施加的负压可以为80mbar。
上述过程中，采用环介导等温扩增方法促使进行聚合酶链式反应，第一预设温度值可以为65℃，第一预设时间值为45分钟。使用的油相物质为氟化油FC40。
参考图7，本发明还提供应用于上述一种宽测量范围的数字PCR芯片的制作方法，包括：
打印第一图案层在第一掩膜上，打印第二图案层在第二掩膜上；
将光刻胶设置在第一硅片以及第二硅片上；
加热所述第一硅片与所述第二硅片至第二预设温度值并维持第二预设时间值；
使用所述第一掩膜对所述第一硅片上的所述光刻胶进行曝光，使用所述第二掩膜对所述第二硅片上的所述光刻胶进行曝光；
加热所述第一硅片与所述第二硅片至第三预设温度值并维持第三预设时间值；
使用显影液对所述第一硅片上的光刻胶进行处理形成第一成型部710，使用显影液对所述第二硅片上的光刻胶进行处理形成第二成型部720；
使用聚二甲基硅氧烷覆盖所述第一成型部710以及所述第二成型部720进行注模；
加热所述第一硅片以及所述第二硅片至第四预设温度值并维持第四预设时间值；
将固化的所述聚二甲基硅氧烷从所述第一硅片上脱模，形成所述第二基片120，将固化的所述聚二甲基硅氧烷从所述第二硅片上脱模，形成所述第三基片130；
对所述第二基片120以及所述第三基片130进行表面等离子体处理；
将所述第二基片120以及所述第三基片130对位粘合；
加热所述第二基片120以及所述第三基片130至第五预设温度值并维持第五预设时间值；
对所述第二基片120以及所述第三基片130进行打孔处理；
将已粘合的所述第二基片120和所述第三基片130通过所述第二基片120与第一基片110粘合实现封装。
通过使用第一掩膜、第二掩膜分别对第一硅片、第二硅片上的光刻胶进行曝光、显影等处理，能够使光刻胶呈现所需要的形状，在第一硅片上形成第一成型部710，在第二硅片上形成第二成型部720。使用聚二甲基硅氧烷在第一硅片、第二硅片上进行注模，固化后的聚二甲基硅氧烷，形成与第一成型部710对应的第二基片120、与第二成型部720对应的第三基片130，第二基片120上具有第一凹腔、第二凹腔、第一凹槽结构以及第二凹槽结构，第三基片130上具有储水凹槽。对第二基片120与第三基片130进行等离子体处理，能够改变表面的亲水性、亲油性的特性，同时，亦可以在表面引入聚合的功能性单体，形成致密的、化学稳定的表面聚合物层，提高化学稳定性、生物相容性以及耐久性。将第二基片120与第三基片130粘合后进行打孔，以形成储液孔101、通油孔102、出液孔103、进水孔104以及出水孔105并与对应结构相连通。最后将第二基片120与第一基片110连接，第一基片110、第二基片120以及第三基片130形成芯片本体100。第二基片120与第一基片110之间形成第一腔室210、第二腔室310、第一连通结构以及第二连通结构，由于第一腔室210、第二腔室310的体积以及数量不同，有利于提高测量范围，令测量操作更加便捷。
使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作第二基片120、第三基片130，具有良好的光学透过性，方便对第一腔室210、第二腔室310进行观察，同时聚二甲基硅氧烷具有较好的生物相容性以及良好的机械性能。第一基片110可以是为玻璃或者聚二甲基硅氧烷。
上述制作方法中，第二预设温度值可以为95℃，第二预设时间值可以为15分钟；第三预设温度值可以为95℃，第三预设时间值可以为15分钟；第四预设温度值可以为70℃，第四预设时间值可以为45分钟；第五预设温度值可以为70℃，第五预设时间值可以为20分钟。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种宽测量范围的数字PCR芯片，其特征在于，包括：
芯片本体（100），所述芯片本体（100）设置有储液孔（101）、通油孔（102）、出液孔（103）、第一腔室区（200）、第二腔室区（300）、第一连通结构以及第二连通结构；
所述第一腔室区（200）设置有多个体积相等的第一腔室（210）；
所述第一连通结构分别与所述储液孔（101）、所述通油孔（102）以及所述第一腔室（210）连通；
所述第二腔室区（300）设置有多个体积相等的第二腔室（310）；
所述第二连通结构分别与所述第一连通结构、所述第二腔室（310）以及所述出液孔（103）连通；
所述第一腔室（210）与所述第二腔室（310）的体积以及数量均不相等；
所述芯片本体（100）还设置有进水孔（104）、出水孔（105）以及储水区（600），所述储水区（600）的竖直投影区域覆盖所述第一腔室区（200）以及所述第二腔室区（300），所述储水区（600）设置有储水通道（610），所述储水通道（610）呈连续U型弯曲状，所述储水通道（610）连通所述进水孔（104）以及所述出水孔（105）；
所述芯片本体（100）包括第一基片（110）、第二基片（120）以及第三基片（130），所述第一腔室（210）、所述第二腔室（310）、所述第一连通结构、所述第二连通结构设置于所述第一基片（110）与所述第二基片（120）之间，所述储水通道（610）设置于所述第二基片（120）与所述第三基片（130）之间，所述储液孔（101）、所述通油孔（102）、所述出液孔（103）、所述进水孔（104）以及所述出水孔（105）均设置于所述第三基片（130）上，所述第二基片（120）由透气材料制成。
2.根据权利要求1所述的一种宽测量范围的数字PCR芯片，其特征在于：所述第一连通结构包括第一分流结构（410）以及至少两条相互平行的第一通道（420），所述第一通道（420）位于所述第一腔室区（200），所述第一腔室（210）排列于所述第一通道（420）的两侧并且所述第一腔室（210）与所述第一通道（420）连通，所述储液孔（101）以及所述通油孔（102）均通过所述第一分流结构（410）与全部所述第一通道（420）连通。
3.根据权利要求2所述的一种宽测量范围的数字PCR芯片，其特征在于：所述第二连通结构包括第二分流结构（510）、汇流结构（520）以及至少四条相互平行的第二通道（530），所述第二通道（530）位于所述第二腔室区（300），所述第二腔室（310）排列于所述第二通道（530）的两侧并且所述第二腔室（310）与所述第二通道（530）连通，所述第一通道（420）通过所述第二分流结构（510）与至少两条所述第二通道（530）连通，每条所述第一通道（420）连通所述第二通道（530）的数量相同，全部所述第二通道（530）通过所述汇流结构（520）与所述出液孔（103）连通。
4.根据权利要求3所述的一种宽测量范围的数字PCR芯片，其特征在于：所述第一腔室（210）排成多列，相邻两列的所述第一腔室（210）之间错位设置；和/或，所述第二腔室（310）排成多列，相邻两列的所述第二腔室（310）之间错位设置。
5.根据权利要求3所述的一种宽测量范围的数字PCR芯片，其特征在于：所述第一分流结构（410）包括第一满二叉树状通道，所述储液孔（101）以及所述通油孔（102）均与所述第一满二叉树状通道的顶端连通，所述第一满二叉树状通道的底端与所述第一通道（420）一一对应连通；
和/或，所述第二分流结构（510）包括与所述第一通道（420）一一对应的第二满二叉树状通道，所述第一通道（420）与对应的所述第二满二叉树状通道的顶端连通，所述第二满二叉树状通道的底端与所述第二通道（530）一一对应连通；
和/或，所述汇流结构（520）包括第三满二叉树状通道，所述第三满二叉树状通道的底端与所述第二通道（530）一一对应连通，所述第三满二叉树状通道的顶端与所述出液孔（103）连通。
6.根据权利要求3所述的一种宽测量范围的数字PCR芯片，其特征在于：所述第一腔室（210）的长度为210微米、宽度为180微米以及高度为150至200微米；
所述第二腔室（310）的长度为45微米、宽度为45微米以及高度为35至45微米；
所述第一腔室区（200）的面积与所述第二腔室区（300）的面积比为7：3；
所述第一通道（420）的宽度为45微米以及高度为35至40微米；
所述第二通道（530）的宽度为10微米以及高度为8至12微米；
所述储水通道（610）的宽度为500至800微米、高度为50至500微米以及相邻通道段之间的间隔为300至500微米，所述储水通道（610）的宽度大于相邻通道段之间的间隔。
7.应用于如权利要求1至6任一权利要求所述一种宽测量范围的数字PCR芯片的使用方法，其特征在于，所述第二基片（120）由透气材料制成，使用步骤包括：
将含样本的反应液注入所述储液孔（101），密封所述通油孔（102）以及所述出液孔（103），所述进水孔（104）与所述出水孔（105）其中之一施加负压并且另一密封，使反应液填充所述第一腔室（210）以及所述第二腔室（310）；
将水注入所述进水孔（104）并且在所述进水孔（104）处施加正压，使水填充所述储水通道（610）；
将油相物质注入所述通油孔（102），在所述通油孔（102）处施加正压，在所述出液孔（103）施加负压，使油相物质填充所述第一连通结构以及所述第二连通结构，令所述第一腔室（210）之间以及所述第二腔室（310）之间相互隔离；
加热所述芯片本体（100）至第一预设温度值，维持第一预设温度值持续第一预设时间值；
统计存在荧光的所述第一腔室（210）的数量以及存在荧光的所述第二腔室（310）的数量，利用泊松分布公式处理得到样本中目标核酸分子数量计算值。
8.应用于如权利要求1至6任一权利要求所述一种宽测量范围的数字PCR芯片的制作方法，其特征在于，包括：
打印第一图案层在第一掩膜上，打印第二图案层在第二掩膜上；
将光刻胶设置在第一硅片以及第二硅片上；
加热所述第一硅片与所述第二硅片至第二预设温度值并维持第二预设时间值；
使用所述第一掩膜对所述第一硅片上的所述光刻胶进行曝光，使用所述第二掩膜对所述第二硅片上的所述光刻胶进行曝光；
加热所述第一硅片与所述第二硅片至第三预设温度值并维持第三预设时间值；
使用显影液对所述第一硅片上的光刻胶进行处理形成第一成型部（710），使用显影液对所述第二硅片上的光刻胶进行处理形成第二成型部（720）；
使用聚二甲基硅氧烷覆盖所述第一成型部（710）以及所述第二成型部（720）进行注模；
加热所述第一硅片以及所述第二硅片至第四预设温度值并维持第四预设时间值；
将固化的所述聚二甲基硅氧烷从所述第一硅片上脱模，形成所述第二基片（120），将固化的所述聚二甲基硅氧烷从所述第二硅片上脱模，形成所述第三基片（130）；
对所述第二基片（120）以及所述第三基片（130）进行表面等离子体处理；
将所述第二基片（120）以及所述第三基片（130）对位粘合；
加热所述第二基片（120）以及所述第三基片（130）至第五预设温度值并维持第五预设时间值；
对所述第二基片（120）以及所述第三基片（130）进行打孔处理；
将已粘合的所述第二基片（120）和所述第三基片（130）通过所述第二基片（120）与第一基片（110）粘合实现封装。
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