CN110835600A - 生物样品的数字聚合酶链式反应的微流体系统以及相应方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于生物样品的dPCR的微流体系统以及相应的方法。

Description

生物样品的数字聚合酶链式反应的微流体系统以及相应方法
技术领域
总体上，本发明涉及样品分析技术领域，如化学反应或生物化学反应的测定，并且更具体地涉及生物样品的高通量分析技术领域。更详细地，本发明涉及一种用于生物样品的数字聚合酶链式反应(dPCR)的微流体系统。进一步详细地，这种系统包括微流体设备，所述微流体设备具有与例如孔或微孔形式的反应区域(通常也称为实施为反应室或反应容器的分区)阵列处于流体连通的流动通道，所述反应区域分别起用于其中提供的至少一种生物样品的化学反应或生物反应的反应位点的作用，并且所述系统可以尽可能快速且尽可能可靠地在微流体设备中实现希望的热循环温度分布。进一步地，本发明涉及在这种微流体系统中用于生物样品的dPCR的相应方法。
背景技术
在用于化学反应或生物化学反应的测定的诊断技术领域中，目标是能够在同一(优选地是一次性的)微流体设备上对一个或多个测试样品进行多种不同测定，从而提供在单个分析过程中使用多种不同试剂独立分析一个或多个测试样品的方法。作为此类测试样品，通常使用生物样品，所述生物样品常由医疗人员从患者取得以用于实验室分析，例如用于确定所取样品中不同成分的浓度水平。因此，术语“样品”和“生物样品”是指可能潜在地含有感兴趣的分析物的一种或多种材料，其中样品可能来源于任何生物源，如生理液，包括血液、唾液、晶状体液、脑脊液、汗液、尿液、粪便、精液、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水、组织、培养细胞等，其中可能特别地怀疑样品含有某种抗原或核酸。
已知的化学测定、生物化学测定和/或生物学测定大多数包括将如上所述的生物样品固定在反应位点内，并与经固定的样品材料进行一种或多种反应，随后进行定量和/或定性分析过程。在此，对于许多生物学应用、生物化学应用、诊断应用或治疗应用，必要的是能够准确地确定生物样品中某种物质或化合物(即，感兴趣分析物)的量或浓度。为了能够尽可能准确地实现此目标，本技术领域中多年来已经开发了不同的方法，如广为人知的聚合酶链式反应(PCR)方法，聚合酶链式反应方法使能够对生物样品中的核酸进行体外合成，通过这种体外合成可以明确地复制DNA区段，即一种用于复制或扩增样品中的小DNA或RNA区段的有成本效益的方式。用于扩增DNA或RNA区段的此类方法的开发已经在基因分析以及许多遗传疾病的诊断中、或者还在病毒载量的检测中产生了巨大的益处。
通常，利用热学循环(还称为热循环)提供对用于扩增此类DNA或RNA区段的反应室内的样品中反应物的加热和冷却，其中常用包括热循环仪的实验室仪器来实现基于PCR的自动诊断测定程序，其中在PCR实施期间，液体PCR样品必须被反复加热和冷却至不同的温度水平并且必须在不同温度平台保持一定的时间量。例如，在典型PCR实施过程中，通过对步骤循环的一系列重复来扩增特定靶核酸，其中反应混合物中存在的核酸(a)在相对较高温度下变性，例如在高于90℃的变性温度下(通常为约94℃至95℃)，以便分离双链DNA，然后(b)将反应混合物冷却至短寡核苷酸引物结合到单链靶核酸上的温度，例如在约52℃至56℃的退火温度下，使引物在分离的DNA链处结合以便提供模板(退火)，并且之后(c)使用聚合酶例如在约72℃的延伸温度下延伸/延长引物以创造新的DNA链，从而复制原始核酸序列。变性、退火和延伸的重复循环(通常约25至30次重复循环)导致样品中存在的靶核酸量的指数增加。现在，为了能够在热循环期间准确地维持此类温度平台，应该维持反应区上的均匀温度分布，使得可以均匀地加热和冷却所有反应区域，以在含有样品的反应区域之间获得均匀的样品收率。为了进行合格的PCR方法，可以使用用于扩增DNA区段的众所周知的热循环设备(如热学循环仪/热循环仪)，所述热循环设备基本上由用于接收样品的安装件(通常也称为样品回火安装件)和附接至所述安装件的热泵组成，所述热管常以下项的组合的形式设置：用于主动加热和冷却安装件并由此用于主动控制提供给样品的温度的Peltier元件，以及用于与所述Peltier元件热学地耦合以将热量散发掉和例如散发到周围环境中的相应散热器。
通常，基本需要是保持使诊断测定执行起来更快、更便宜和更简单，同时实现高精度同时提高常规实验室过程的效率。所提及的用于扩增DNA或RNA区段的方法的一个特定例子(本发明的焦点)是数字聚合酶链式反应方法(也称为数字PCR或dPCR)，所述数字聚合酶链式反应方法表示对如上所述常规PCR方法的生物技术细化，并且所述数字聚合酶链式反应方法可以用于直接量化和无性地扩增核酸，包括DNA、cDNA或RNA。在此，dPCR与传统PCR之间的实质差异基本上在于测量核酸量的方法，因为传统的PCR每单个样品进行一次反应，而dPCR在被分离到设置在相应大量反应区域内的大量分区中的样品中进行单一反应，其中反应在各反应区域中单独进行，使得更可靠地收集和更灵敏地测量核酸量成为可能。因此，为了实现各种测定操作的小型化和整合已经进行了大量努力，以增加单个载体设备上平行测定的数量。作为这种单个载体设备的例子，已经开发了如微流体芯片等微流体设备，所述微流体设备提供微型通道和微型反应区域来接收可流动样品液(如水性样品液)形式的微升规模样品或纳升规模样品。典型地预先填充到小孔(即，作为反应区域设置在微流体芯片上的微孔或纳米孔)阵列中的微升规模试剂被置于其中是为了接触流动通过流动通道的样品液流，其中每种类型的测定取决于装载到反应区域阵列中的试剂以及流动通道和检测器的配置，其中可以通过将样品液吸移到芯片中来实施将样品液填充到微流体芯片中。此先进技术允许以小型化规模同时进行多种测定。这些化学测定、生物化学测定和/或生物学测定中大多数涉及将生物材料(如多肽和核酸、细胞或组织)固定在孔中，以及与已固定的材料进行一种或多种反应的表现，随后进行如发光测试测量等定量和/或定性分析过程。出于说明的目的，图3A以示意性方式示出了已知微流体芯片6的例子的俯视图，并且图3B以沿图3A中的线A-A的截面视图示出了图3A的芯片6。微流体芯片6由下板61和上板62组成，即所谓的双层微流体芯片，其中上板62提供用于将液体引入芯片的入口63和用于液体从芯片离开的出口64，并且下板61(即芯片的下层)与上板62(即芯片的上层)的组合在其之间建立了流动通道65，所述流动通道65将入口63连接到出口64，其中在所述流动通道65内的上侧(即在上板62的内侧)设置有微孔阵列66。在此，当通过入口53向流动通道65中朝向出口63填充样品液时，当使样品液沿着微孔阵列流动时，样品液被填充到微孔阵列62的每个构件中。
然而，当实际上使反应室体积小型化以变成微流体设备的微流体结构从而产生希望的小尺寸时，增加了几个已知的问题，如与以下项有关的问题：增加的表面体积比、或不希望的样品液蒸发、以及特别是在微流体设备中提供的或流动通过微流体设备的液体内不希望的生成气泡。作为本发明的焦点，微流体结构内液体中存在的气泡可能构成严重的问题，因为循环通过微流体系统的气泡可能——从侧面来说——不仅损害其中使用的任何种类传感器的微流体结构，而且主要还可能由于造成相邻微孔中样品的不希望的混合而损坏感兴趣生物样品，导致交叉污染以及本发明由此导致实质性实验误差和错误的测定结果。例如，气泡可能通过使反应区域内的反应成分变干而导致层析柱的实验误差。而且，气泡会严重影响反应区域的光学检测和其中发生的反应，从而可能导致测定失败。特别是当在微流体设备中进行样品的dPCR时，几个原因导致有频繁发生气泡(如空气泡)趋势：
(a)在用样品液和分离液填充微流体设备期间，气泡可能被禁锢在微流体设备中；
(b)在热循环期间，最初被禁锢的气泡(参见(a))会因样品液的蒸发而生长；或者
(c)由于样品蒸发，可能出现新的气泡。
针对关于所提及的气泡生成和生长的说明性原因，图4A至图4D以截面示意性方式示出了微流体芯片7，其中芯片7被插入相应的热循环器具(也仅以示意性方式示出)中。微流体芯片7具有与图3A和图3B的微流体芯片6类似的结构，即具有下板71和上板72，并提供入口73、出口74、和将入口73连接到出口74的流动通道75，其中在流动通道75内的上侧(即在上板72的内侧)设置有微孔形式的反应区域阵列76。在此，反应区域阵列76已经填充有样品液77，并且密封液78已经被引入到流动通道75中，从而将样品液77密封在反应区域内部，并且从入口73到出口74填满流动通道75。为了能够实现微流体芯片7的热循环，芯片7安排在所谓的板循环仪8形式的热循环器具内部，即具有由可加热板(也称为热板)实施的底部加热器81和顶部加热器82的热学循环仪或热循环仪。在图4A中，示出了加热器81、82的未加热状态下的微流体芯片7，其中在用样品液77和/或分离液78填充微流体设备7期间意外地将气泡91(例如空气泡等)引入到反应区域阵列76正下方的流动通道75中。
因此，在填充期间，“初始”气泡91可能被禁锢在芯片7内部，例如在微孔内部的样品液中、或者在芯片7的流动通道内部提供的密封液中。如图4B中可见，其中至少底部加热器81已经被打开以提供高于50℃的加热温度，已经引入的气泡91由于反应区域阵列76内部样品液77的蒸发而正在生长。而且，反应区域阵列76内部样品液77的不希望的蒸发导致生成新的气泡92。在此，在回火期间新的气泡92可能在所述反应区域中任何一个内部出现并生长，并且可能留在流动通道75中。在图4C中，可以注意到由于样品液77的不希望的蒸发导致气泡91、92的生长推进，其中流动通道75显示沿其长度的气泡生长，使得生长的气泡91、92逐渐推动密封液78离开流动通道75并因此离开入口73和出口74，在此用相应的箭头说明。从而，生长的气泡91、92将密封液78从微孔去除，导致微孔内部的样品液77会更容易地蒸发。而且，生长的气泡91、92可能在不只一个微孔上延伸，即气泡91、92可能将密封液78推离几个微孔并因此将这些微孔一起“揭露”，导致一个微孔的内容物可能越到相邻微孔中。随着热学循环仪进一步进行的加热，气泡91、92可能进一步生长，并且还可能合并成一个大气泡93(参见图4D)，导致合并后且仍在生长的气泡93逐渐推动密封液78进一步离开流动通道75，并因此进一步离开入口73和出口74，同样用相应的箭头说明。通过如图4A至图4D所描绘的发展，并具体考虑图4D，可以清楚地看出，通过不希望的气泡生成和生长，密封液78几乎完全被推离反应区域阵列76，从而废除了由密封液78提供的密封效果。因此，在反应区域阵列76内部提供的样品液77中的反应成分未受到密封液78进一步保留并因此会变干。换句话说，图4A至图4D示出了在热循环期间“初始”气泡91和新出现的气泡92可能由于在反应区域76内部提供的样品液77的蒸发而生长，其中气泡生长持续直到流动通道75和/或以反应区域阵列76形式提供的测量区域大部分被清空。因此，由于密封液78被气泡91、92、93去除，导致可能发生相邻反应区域之间的交叉污染。而且，气泡91、92、93可以增加反应区域76内部生物样品材料的剪切应力，因为细胞膜在由此生成的不希望的液体-空气界面的力的作用下拉伸。而且，如前文已经提及的，气泡对于反应区域的光学检测和其中发生的反应可能是实质性问题，实质上导致需要通过尽一切办法避免的测定失败。因此，去除或避免气泡是本技术领域的主要挑战。
到目前为止，已经有不同的方法来解决微流体设备的流动通道中的气泡问题。如在例如EP 2 830 769 A1中描述的，气泡问题的一种解决方案是通过在入口之后提供某些微流体结构来防止在填充期间气泡被引入微流体设备，如提供沿着基板的整个边缘形成的狭缝(基本上围绕基板的整个边缘)，其中流体可以从入口歧管流经狭缝并且在相等的压力且没有气泡的情况下进入反应室。然而，在此，这种解决方案的实质性缺点是，如果此类微流体结构未能防止气泡进入微流体设备，则气泡可能最终在反应室内并且可能由于样品在增加的循环温度下蒸发而生长，而没有任何方法去除已经进入的气泡。而且，由于样品在增加的循环温度下蒸发而可能出现新的气泡，从而导致dPCR方法将失败。因此，即使所提供的已知解决方案对于避免已经存在的气泡进入微流体设备可能或多或少有效，但在热循环期间不能处理仍然进入的气泡或新生成的气泡。
从例如US 2005/0009101 A1中已知对气泡问题的另一种解决方案，其描述了可以用于对样品进行多次操纵以最终引起对目标分析物检测或量化的微流体盒或设备，其中提供了使能够检测在杂化液或洗涤缓冲液中形成的气泡的光管，并且其中提供了在蠕动交互的意义上与柔性层具有功能关系以便去除检测到的任何气泡的滚轴，，其中柔性层的弹性材料用作蠕动操作材料。因此，所提供的解决方案旨在有一些将任何种类的气泡都从微流体设备中挤出，然而这需要弹性流体芯片材料。然而，这种解决方案被认为不适用于dPCR芯片，因为这种柔性芯片材料的处理和填充是无效的并且只是不精确的，并且与通常使用的非柔性芯片材料相比，这种材料的表面可修改性和光学质量较差。
作为由样品液蒸发引起的微流体设备内部的气泡问题的进一步解决方案，可以对微流体设备施加压力，如在例如US 2005/0148066 A1中描述的，其中公开了一种用于以阵列样式进行多种同时的微体积化学和生物化学反应的装置。在此，在热学循环仪中借助跨其表面的凹槽对装置进行热学循环，使得可以将薄微孔芯片插入凹槽中并对所述薄微孔芯片进行热学循环，其中可以使用薄导热硅胶垫来向微孔芯片的表面提供热学接触以及压力，以防止阵列内部样品的蒸发并由此防止气泡的生成或生长。在此，利用这种解决方案，实质性缺点是整个仪器结构的复杂性更高以及向芯片施加压力需要额外的结构复杂性。
因此，在dPCR测定技术领域中通常需要提供微流体系统和用于生物样品的dPCR的相应方法，其展现的是用于避免和/或去除流动通道内部气泡同时维持或甚至改善微流体系统的热循环效率的改善型解决方案。
发明内容
本发明的发明人可以证实气泡可能在成功完成样品的热循环方面造成严重问题，并且可能因此导致实质性测定失败。还发现的是，前文提出的解决方案在避免此类气泡方面并不完全足够或令人满意。特别是，现有技术中已经提出的解决方案(参见上文)要么太昂贵要么不足以生成可再现的测试结果。因此，必须避免将气泡引入微流体设备的流动通道以及在回火期间生成新的气泡和气泡生长，并且新的和改善型解决方案必需的。因此，发明人基本上基于通过用分离液(即，用密封液)“冲洗”微流体芯片来去除已存在或出现的气泡的想法开发了一种新的和创造性的解决方案，因为密封液在流动通过流动通道时可以可靠地将任何气泡冲洗通过流动通道并离开微流体芯片的出端口。因此，本发明解决了简化地且更有效地避免和/或去除微流体系统内微流体设备的流动通道内部气泡的上述问题，同时改善其热循环效率。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于生物样品的dPCR的微流体系统，例如用于对以样品液形式(如样品极性水溶液)提供到反应区域阵列的单独反应区域的生物样品进行测定，其中微流体系统包括至少一个微流体设备，所述微流体设备具有入口、出口、将所述入口连接到所述出口的流动通道、以及与所述流动通道处于流体连通的反应区域阵列。在此，微流体设备可以呈现至少由顶层和底层组成的结构，其中顶层或底层可以提供反应区域阵列、入口和出口。流动通道建立在顶层与底层之间，并且与反应区域阵列处于流体连接，可以以微孔或纳米孔的形式实施所述反应区域阵列，从而使微流体设备成为例如微流体芯片。例如，整个流动通道的宽度(也称为道宽度)可以在6mm与7mm之间的范围内(如6.4mm)，这通常提供宽度为(即在流动通道的横向方向上)用于约60至100个彼此相邻的孔的空间。进一步地，每个孔的开口的截面积可以具有圆形形状、椭圆形形状、或多边形形状(如六边形形状)。利用孔开口的多边形形状，并且特别是利用孔开口的六边形形状，可以将孔开口安排成彼此之间有较小距离，即，实现流动通道内部孔开口的分布密度增加。因此，可以进一步最大化板的孔阵列中的孔数量。而且，孔开口的宽度(包括孔之间的中间空间)可以是60μm≤w≤110μm，如62μm(小孔)≤w≤104μm(大孔)。进一步地，微流体系统包括：流动回路，所述流动回路可连接到微流体设备，用于使液体流动通过微流体设备的流动通道；以及样品液源，所述样品液源可连接到微流体设备，用于例如通过流动回路为微流体设备提供样品液。作为用于微流体设备(即用于设备层)的材料，可以使用如环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)等材料，其中COP的使用例如出于成本考虑是优选的。进一步地，流动回路可以通过管道系统实施，例如由一个或几干个柔性管组成的柔性管道系统，所述管可以由乙烯丙烯二烯单体(EPDM)橡胶的内层和丁腈橡胶(NBR)的外层组成(也可能用合成网加强)，或者通常可以由EPDM、NBR、氟化乙烯-丙烯聚合物(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚醚砜(PES)、氟橡胶(FKM)、硅酮制成，并且还可以借助隔热材料护套所述管。
而且，本发明的微流体系统包括：主密封液源，所述主密封液源可连接到微流体设备，用于为微流体设备提供初始或主密封液以将样品液密封在反应区域阵列内部，其中初始密封液可以是例如在环境温度下或环境温度附近提供的未回火密封液，即未加热的密封液。此外，本发明的微流体系统包括：次密封液源，所述次密封液源可连接到所述微流体设备，用于为所述微流体设备提供附加密封液；以及泵送装置，所述泵送装置连接到所述流动回路并被适配成将所述附加密封液泵送通过所述流动通道。例如，本发明的泵送装置可以是蠕动泵、计量泵、或注射泵中的一种，或者可替代地，借助如阀等附加流体部件，本发明的泵送装置可以是任何其他类型的泵，例如隔膜泵、摆动活塞泵、微型齿轮泵等。进一步地，作为本发明的微流体系统的微流体设备与可连接部件之间的可连接性的例子，微流体设备的入口和/或出口可分别以单个连接端口的形式实施，如(例如鲁尔锁适配器等形式的)圆形流体密封端口，用于将微流体设备与样品液源连接、用于将微流体设备与主密封液源连接、或用于将微流体设备与次密封液源连接。
利用本发明的微流体系统的密封液源和泵送装置的上述组合，并且在有可能将附加密封液泵送通过流动通道的情况下，通过用附加密封液冲洗流动通道可以将流动通道内部已经存在的气泡、或者在微流体设备内部样品热循环期间出现的任何种类的气泡从微流体设备中去除。因此，利用本发明，可以至少减少或可以完全避免气泡对测试结果的负面影响，从而导致显著改善型微流体系统。
换句话说，本发明涉及使用基于孔板的热循环结构的一般PCR技术领域，主要关注终点数字PCR。更具体地，孔板以微孔板或者甚至具有几千个纳米孔特征的纳米孔板形式设置在微流体芯片内。在此，微流体芯片可以是一次性的，其中流动通道是位于孔的开口侧的封闭填充通道形式，所述通道一侧与肉眼可见的填充入端口连接且另一侧与溢流出端口连接。而且，一次性微流体芯片可以包含具有这种微孔结构的不只一个反应区域阵列，以及因此位于开口侧的不只一个填充通道。通常，微流体芯片可以预填充有所谓的PCR预混液，混合有样品液形式的目标混合物。然后，用密封液(例如覆盖油)填充微孔开口侧的流动通道，以防止微孔中的样品液在热循环期间蒸发，并避免样品在孔之间迁移。在此，可以使用例如蠕动泵施加约500毫巴压力将油填充到流动通道中。最后，本发明的微流体系统可以具有执行填充检查、正确放置检查等的不同传感器特征。
根据本发明的dPCR微流体系统的特定实施方案，初始密封液和附加密封液由同一种密封液材料组成，这意味着与本发明的微流体系统一起使用的任何密封液都可以是相同的密封液类型。进一步地，任何密封液都必须与样品液不混溶。作为这种不混溶的液体，可以使用油液或聚合物液(例如硅酮液(如聚二甲基硅氧烷(PDMS)液))，或油液与聚合物液的混合物。而且，初始密封液和附加密封液可由不同的密封液源提供，或者可替代地由同一密封液源提供，这意味着初始密封液源和次密封液源可由不同的密封液储器或者可替代地由公共密封液储器实施。具体地，在初始密封液和附加密封液由同一种密封液材料或类型组成的情况下，主密封液源和次密封液源可以由一个公共密封液储器实施，其中在这种情况下，术语“主”和“次”仅仅指公共密封液储器的功能，即公共密封液储器可以起用于提供初始密封液的主密封液源的作用，所述初始密封液主要将样品密封在微流体设备的反应区域阵列内部，并且所述公共密封液储器然后可以起用于提供附加密封液的次密封液源的作用，所述附加密封液用于将任何气泡冲洗出微流体设备的流动通道。由于与提供两个不同的密封液储器相比可以减少微流体系统的结构的复杂性这一事实，可以选择这种配置。
根据本发明的dPCR微流体系统的进一步特定实施方案，可由控制单元控制泵送装置以根据需要将附加密封液泵送通过流动通道，用于将气泡冲洗出流动通道。在此，可以由操作者用手来触发所述控制单元，或者例如基于来自检测或监测流动通道内部气泡的发生的附加系统部件的反馈信号自动地触发所述控制单元。而且，控制单元可以指示泵送装置基于预定模式将附加密封液泵送通过流动通道，例如基于要应用于反应区域内部样品液的热循环步骤。在此，会有利的是控制泵送装置将预定量的附加密封液泵送通过流动通道，其中可以控制泵送装置不断地、间歇地、或者在检测到流动通道中的气泡时将附加密封液泵送通过流动通道。
根据本发明的dPCR微流体系统的另一特定实施方案，微流体系统可以还包括连接到流动回路的气泡阱，用于将空气与密封液分离，所述气泡阱安排在微流体设备的出口下游。从而，可以从流动回路中流动的密封液中去除借助于流动的附加密封液从微流体设备的流动通道冲洗出的任何气泡。因此，任选的气泡阱可以安排在由流动回路提供的密封液的流体路径中，以便将气泡与流动的密封液分离。从而，可立即从本发明的微流体系统中去除气泡，而无需收集离开微流体设备的密封流体和从中提取任何气泡。
根据本发明的dPCR微流体系统的另一特定实施方案，样品液可以是包含生物样品和dPCR测定所需试剂的水溶液，其中首先可以使样品液流动通过流动通道进入反应区域阵列，以便用样品液填充每个反应区域。然后，即在将样品液提供到反应区域阵列之后，使初始密封液流动到微流体设备的流动通道中，以将样品液密封在反应区域内部。
根据本发明的dPCR微流体系统的进一步特定实施方案，微流体系统可以还包括如光学成像设备(例如光学相机)等用于检测微流体设备中气泡的存在或生成的检测装置，所述检测装置可以在热循环之前和期间检测和/或监测流动通道内部气泡的存在或生成，前提是流动通道允许光学监测。在此，例如，可以使流动通道的内部是例如通过观察窗、流动通道的透明壁等从外部可见的。因此，检测装置可以用于提供指示流动通道内部气泡的发生的反馈信号，其中可基于这种反馈信号触发控制单元。因此，利用这种结构，微流体系统可以自动工作，而无需操作者在热循环期间监测微流体设备等。
为了能够为反应区域内部样品材料提供热循环温度分布，微流体系统可以包括接收微流体设备的热学安装件，用于向反应区域阵列提供热循环温度分布。例如，可以使用如联系图4A至图4D中任一项所描述的热学结构，即所谓的板循环仪可以容纳本发明的微流体系统的微流体设备。可替代地，可以通过加热和/或冷却装置实施向反应区域阵列提供热循环温度分布，所述加热和/或冷却装置用于将附加密封液的温度加热和/或冷却至希望的热循环温度分布温度。因此，可以不借助与微流体设备热学连接的外部热源施加热量，而是借助流动通过微流体设备的流动通道的被相应加热或冷却的密封液来实施反应区域的内容物的希望的热循环温度分布，即，向样品材料施加热量的同时能够将流动通道内任何种类的气泡冲洗出去的新方式。因此，利用这种方案，不仅可以去除气泡，还可以实现从微流体设备内加热和/或冷却反应区域内部的生物样品。因此，还可以实现将热循环温度分布更直接和更快地应用到生物样品上，其中可以省略如顶部加热器和底部加热器等通常已知的外部部件，由此简化热循环器具的已知结构。在此，为了从微流体设备内实现这种温度控制代替外部施加热量，有几种如果希望的话可以相互组合的选项，所述选项可以包括以下项：
(a)次密封液源包括具有未加热的附加密封液的储器，其中在所述储器下游设置有流动型加热装置，用于根据需要加热附加密封液，即用于在热循环温度分布需要时对流动通过流动型加热装置的密封液进行加热，所述流动型加热装置可以按照绕流动回路的来自密封液储器的一部分设置的回火装置、连接的流体加热器等形式实施；
(b)次密封液源包括具有经加热的附加密封液的至少一个储器和具有未加热或经冷却的附加密封液的至少一个储器，其中所述储器可以通过相应的阀机构(如电子控制的递送阀)等可分离地连接到流动回路，或者所述储器可以通过混合阀连接到流动回路，用于混合经加热的附加密封液和未加热或经冷却的附加密封液，以实现要提供到微流体设备的密封液的希望的温度；
(c)附加密封液包括如石墨烯材料等导电材料，用于根据需要通过对附加密封液施加电力来加热附加密封液。
当使用(a)和(b)之一或其组合时，泵送装置必须被适配成能够遵循希望的dPCR循环，即，将分别被回火的附加密封液置于样品阵列上方并再次远离所述样品阵列，并且将任意量的附加密封流泵送通过流动通道以去除气泡。在使用选项(c)的情况下，即在密封液被电加热的情况下，液体应该是导电液，所述导电液提供合适的电阻使得导电液在电流流动期间变热。在此，石墨烯溶液适合于这种应用。然而，在这种情况下，密封液不能被电气冷却；相反，在dPCR期间的样品温度需要降低的情况下，则必须冷却储器或微流体芯片本身。此外，如果应用电加热方案，则可以使用圆形密封液系统，而不需要储器，这将需要精确控制dPCR循环，例如通过实时监测温度和电流的综合传感器结构。
根据本发明的dPCR微流体系统的进一步特定实施方案，微流体系统可以另外包括至少围绕微流体设备的压力室。在此，这种附加压力室的功能可以增加已经实现的避免或去除在本发明的微流体系统内部发生的气泡，从而进一步确保气泡不会干扰测定结果。对于热循环本身，包括充油端口的一次性微流体设备因此可以设定在1巴至2巴的压力下(例如约1.5巴)，以进一步抑制热循环期间的气泡生成。在此，通过将整个微流体设备安排在压力室内部，优选地向微流体设备的内部施加压力。
根据本发明的进一步特定实施方案，发明的设备可以还包括至少一个传感器，用于控制微流体设备中接收的生物样品的温度，其中这种传感器可以是温度传感器例如与流体流量传感器组合。因此，通过在发明的微流体系统的任何部件处设置相应的传感器，可以密切监测dPCR期间生物样品的温度，并且可以基于测量的样品温度值来控制微流体系统的加热/冷却功能，以准确地且高效地调节dPCR的不同温度平台。因此，一个或多个这种传感器(例如温度传感器)使能够通过控制算法等精确控制热循环温度，其中温度传感器和其他传感器用于控制相应的加热/冷却速率，其中通过改变流体泵送速度可以显著改变加热/冷却功率。
根据本发明的另一方面，提供了一种在如上所述微流体系统中用于生物样品的dPCR的方法，所述方法包括：使样品液流动通过具体以微流体芯片的形式提供的所述微流体设备的所述流动通道，并通过将所述样品液推动通过所述流动通道而以连续的方式用所述样品液填充所述反应区域阵列的步骤；使初始密封液流动通过所述微流体设备的所述流动通道，以在所述反应区域阵列被填充了所述样品液之后密封每个反应区域并且推动剩余的样品液离开所述微流体设备的后续步骤；将热循环温度分布应用于所述反应区域阵列的步骤；以及将附加密封液泵送通过所述微流体设备的所述流动通道以便将气泡冲洗出所述流动通道的步骤。在此，可以在组合式步骤过程中提供将热循环温度分布应用于所述反应区域阵列的步骤以及将附加密封液泵送通过所述微流体设备的所述流动通道以便将气泡冲洗出所述流动通道的步骤，即在通过将经加热的附加密封液泵送通过流动通道来实现向反应区域阵列应用温度的情况，其中附加密封液的泵送导致反应阵列内部样品液的变热并同时将气泡冲洗出所述流动通道。进一步优选地，本发明的dPCR方法还包括测定反应区域阵列中提供的生物样品的步骤，从而使所述方法成为基于dPCR的分析方法。
根据特定的另一个实施方案，将附加密封液泵送通过所述流动通道的步骤可以包括根据需要将预定量的附加密封液泵送通过所述流动通道，优选地，其中将附加密封液泵送通过所述流动通道的步骤可以是不断地将附加密封液泵送通过所述流动通道的步骤、或间歇地将附加密封液泵送通过所述流动通道的步骤(例如，仅在反应区域内部样品液需要被回火时)、和/或在检测到所述流动通道中的气泡时将附加密封液泵送通过所述流动通道的步骤。在此，在有可能根据需要将附加密封液泵送通过流动通道的情况下，通过用附加密封液冲洗流动通道可以将流动通道内部已经存在的气泡、或者在微流体设备内部样品热循环期间出现的任何种类的气泡从微流体设备中去除。因此，利用发明的方法，可以至少减少或可以完全避免气泡对测试结果的负面影响，从而导致在发明的微流体系统中用于生物样品的dPCR的显著改善的方法。
根据本发明的dPCR方法的特定实施方案，所述方法可以还包括：例如借助于(例如，光学相机等形式的)检测装置监测和检测所述微流体设备中气泡的存在或生成的步骤，所述检测装置可以在热循环之前和期间检测和/或监测流动通道内部气泡的存在或生成，前提是流动通道允许光学监测，即流动通道的内部是例如通过于观察窗、流动通道的透明壁等从外部可见的。因此，检测装置可以用于提供指示流动通道内部内气泡的发生的反馈信号，其中可基于这种反馈信号触发控制单元，从而产生反馈控制型dPCR方法。可替代地或另外，发明的方法可以还包括例如借助与微流体设备出口下游的流动回路连接的气泡阱将气泡与附加密封液分离的步骤。从而，可以从流动回路内部流动的密封液中去除已经借助于流动的附加密封液从微流体设备的流动通道冲洗出的任何气泡。因此，借助于安排在密封液的流体路径中的气泡阱将气泡与附加密封液分离的任选步骤可能对立即将气泡从本发明的微流体系统去除有用，而无需在稍后阶段收集离开微流体设备的密封液和从中提取任何气泡。可替代地或另外，发明的方法还可以包括例如通过至少围绕微流体设备的压力室向微流体设备施加压力的步骤。这种附加的压力施加步骤的功能可以增加发明的dPCR方法已经实现的避免或去除能力，从而进一步确保气泡不干扰测试结果。据此，微流体设备可以被设置在1巴至2巴的压力下(例如约1.5巴)，以进一步抑制热循环期间的气泡生成，其中可以通过向充当柔性压力传送部件的流动通道的侧壁施加压力、或者通过在整个微流体设备上施加压力(在这种情况下，微流体设备需要表现出一定的可压缩性)来向微流体设备的内侧施加压力。
根据本发明的dPCR方法的特定实施方案，将热循环温度分布应用于反应区域阵列的步骤可以包括：控制接收微流体设备的热学安装件的温度分布的步骤，用于向反应区域阵列提供热循环温度分布，或者可替代地，控制加热和/或冷却装置的步骤，用于将密封液温度加热和/或冷却到希望的热循环温度分布温度。在此，控制加热和/或冷却装置的步骤可以包括以下选项之一：
(a)控制设置在所述次密封液源下游的流动型加热装置的步骤，用于根据需要加热所述附加密封液；
(b)控制阀机构的步骤，用于将来自具有经加热的附加密封液的至少一个储器和来自具有未加热或经冷却的附加密封液的至少一个储器的附加密封液混合；
(c)根据需要向所述附加密封液施加电力的步骤，所述附加密封液包括如石墨烯材料等导电材料，用于通过施加电力来加热所述附加密封液；
(d)任何前述任选步骤(a)至(c)的组合。
本发明的上述微流体系统以及相应的发明方法可以是自动化处理系统(如分析、预分析或后分析处理系统)的一部分，所述自动化处理系统在现有技术实验室中普遍用于自动处理生物样品，所述自动化处理系统可以涵盖可操作以对一个或多个生物样品执行一个或多个处理步骤/工作流程步骤的任何装置或装置部件，并且覆盖了分析仪器、预分析仪器、以及还有后分析仪器。表达“处理步骤”从而指的是实际上执行的处理步骤，如进行dPCR实施的特定步骤。如本文所使用的术语“分析”涵盖由一个或多个实验室设备或操作单元执行的任何工艺步骤，所述实验室设备或操作单元可操作以对一个或多个生物样品执行分析测试。在生物医学研究的背景下，分析处理是表征生物样品的参数或分析物的参数的技术程序。参数的这种表征包括，例如确定源自人或实验室动物等的生物样品中各种大小的特定蛋白质、核酸、代谢物、离子或分子的浓度等。所收集的信息可以用于评估例如药物给药对生物体或特定组织的影响。进一步分析可以确定生物样品、或样品材料中包含的分析物的光学参数、电化学参数或其他参数。
上述方法步骤可由所描述的微流体系统的控制单元控制，所述控制单元还可控制上述微流体系统及其部件的任何种类的致动或监测，其中如本文所使用的术语“控制单元”涵盖任何实际或虚拟处理设备，如CPU等，所述控制单元还可以以进行一个或多个工作流程和一个或多个工作流程步骤的方式控制整个实验室仪器或甚至包括一个或多个实验室仪器的整个工作站。控制单元可以例如携带不同种类的应用软件并指示自动化处理系统或其特定仪器或设备进行一个或多个预分析、后分析和分析工作流程/工作流程步骤。控制单元可以从数据管理单元接收关于需要对某一样品执行哪些步骤的信息。进一步地，控制单元可以与数据管理单元集成在一起，可以由服务器计算机构成和/或是一个仪器的一部分或甚至跨自动化处理系统的多个仪器分布。控制单元可以例如被实施为运行计算机可读程序的可编程逻辑控制器，所述计算机可读程序被设置有用于执行操作的指令。在此，为了由用户接收此类指令，可以另外提供用户接口，其中如本文所使用的术语“用户接口”涵盖供操作者与机器之间交互的任何合适软件和/或硬件应用，包括但不限于用于接收来自操作者的命令作为输入并且还向操作者提供反馈和传达信息的图形用户接口。而且，系统/设备可以暴露几个用户接口，以服务于不同种类的用户/操作者。
当在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。同样，词语“包括”、“包含”和“涵盖”应该被解释为包容性地而非排他地，即“包括但不限于”的意义。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文中另外明确指示。术语“多种”、“多个”或“众多”是指整数倍地两个或更多个(即2或大于2)，其中术语“单个”或“唯一”是指一个(即等于1)。此外，术语“至少一个/种”应被理解为同样整数倍地一个或多个(即1或大于1)。因此，使用单数或复数的词语还分别包括复数和单数。此外，当在本申请中使用时，词语“本文”、“以上”、“前述”、“以下”以及类似含义的词语应指本申请整体、而不是指本申请的任何特定部分。
对本发明的特定实施方案的描述并不旨在是穷尽的或将本公开文本限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明性目的描述本公开文本的特定实施方案和实施例，但相关领域技术人员将认识到，在由所附权利要求书所呈现的本公开文本的范围内各种等效的修改是可能的。任何前文和后文描述的实施方案的特定元件可以组合或替换其他实施方案中的元件。而且，在附图中，相同的附图标记表示相同的元素以避免重复，并且可以省略本领域普通技术人员轻易实施的零件。此外，虽然已经在本公开文本的某些实施方案的背景下描述了与这些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以展现出此类优点并且并非所有的实施方案都必需展现出此类优点才落入所附权利要求书所限定的本公开文本范围内。
以下实施例旨在说明本发明的特定实施方案。因此，如下文所讨论的具体实施方式不应解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离由所附权利要求书限定的本发明的范围的情况下，可以进行各种等效、改变、和修改，并且因此应当理解，此类等效实施方案应包括在本文中。从对附图中图示的特定实施方案的以下描述，本发明的进一步方面和优点将变得明显。
附图说明
图1是根据本发明第一实施方案的用于生物样品的dPCR的微流体系统的截面概念图示；
图2是根据本发明第二实施方案的用于生物样品的dPCR的微流体系统的截面概念图示；
图3A和图3B是本领域中已知的微流体系统的俯视图和截面视图的示意性结构图示；以及
图4A至图4D以本领域已知的微流体系统内部生长和生成气泡的示意性功能图示示出了dPCR中的不同阶段。
附图标记列表
1 微流体系统(第一实施方案)
1’ 微流体系统(第二实施方案)
2 微流体设备
21 微流体设备的下板/底层
22 微流体设备的上板/顶层
23 微流体设备入口
231 微流体设备入口盖
24 微流体设备出口
241 微流体设备出口盖
25 微流体设备流动通道
26 反应区域/孔阵列
27 (反应区域中填充的)样品液
28 初始密封液
29 附加密封液
3 流动回路
31 泵
32 气泡阱
4 次密封液源
41 回火储器
411 电子控制的递送阀
42 未回火储器
421 电子控制的递送阀
5 流体加热器
6 微流体芯片
61 微流体芯片的下板/底层
62 微流体芯片的上板/顶层
63 微流体芯片入口
64 微流体芯片出口
65 微流体芯片流动通道
66 微孔阵列
7 微流体芯片
71 微流体芯片的下板/底层
72 微流体芯片的上板/顶层
73 微流体芯片入口
74 微流体芯片出口
75 微流体芯片流动通道
76 反应区域/孔阵列
77 (反应区域中填充的)样品液
78 密封液
8 板循环仪
81 板循环仪的底部加热器
82 板循环仪的顶部加热器
91 初始气泡
92 新出现的气泡
93 合并后的气泡
具体实施方式
图1在示意性图示中示出了根据本发明第一实施方案的用于生物样品的dPCR的微流体系统1，其中在说明性截面中或作为图符提供了主要部件。如图1所图示的微流体系统1包括微流体芯片形式的微流体设备2，设备2显示出与图3B中所描绘的现有技术芯片7类似的结构，其中设备2基本上由下板21和上板22组成并提供了入口23、出口24、和将入口23连接到出口24的流动通道25。此外，在流动通道25内的上侧(即在上板22的内侧)设置有微孔或纳米孔形式的反应区域阵列26，以便能够从上方监测反应区域26中的反应。而且，在所示状态下，已经用样品液27冲洗微流体设备2，所述样品液填充在反应区域阵列26中，即所述样品液应该填充到反应区域阵列26中的每单个微孔中。可以在将微流体设备2安排在微流体系统1内部之前，在填充站(未示出)处进行这种将样品液27填充到反应区域阵列26中，其中填充站(未示出)被认为是微流体系统1的一部分，用于将样品液27引入反应区域阵列26中。而且，初始密封液28已经被填充到微流体设备2中，所述初始密封液将样品液27密封在反应区域阵列26内部，还可以在将微流体设备2安排在微流体系统1内部之前在填充站(未示出)处进行这种将初始密封液28填充到流动通道25中以密封反应区域阵列26。可替代地，还可以由微流体系统1本身借助于附加密封液29进行这种将初始密封液28填充到流动通道25中以密封反应区域阵列26，其中附加密封液29中实际将样品液29密封在反应区域阵列26内部的那部分应被理解为“初始”密封液28。在此，由于填充站可连接到微流体设备2以便为微流体设备2提供样品液27，所以填充站(未示出)可以被认为是样品液源以及主密封液源，作为微流体系统1的组合的可连接功能部分。
微流体系统1还包括连接到微流体设备2的流动回路3，其中流动回路3用于使附加密封液29流动通过微流体设备2的流动通道25，并且主要用于使附加密封液29流动通过微流体设备2的流动通道25。在此，通过逆时针转动的箭头圆圈说明附加密封液29的流动。附加密封液29基本上源自次密封液源4，所述次密封液源由包括经加热的附加密封液29的回火储器41和包括未加热或经冷却的附加密封液29的未回火储器42组成，其中所述储器41、42通过相应的电子控制的递送阀411、421连接到流动回路3。因此，通过控制递送阀411，可以将经加热的附加密封液29引入流动回路3中，并且通过控制递送阀421，可以将未加热的附加密封液29引入流动回路3中，从而产生流动回路3内部的附加密封液29的希望的温度分布。可替代地，回火储器41和未回火储器42可以共用公共混合阀，所述混合阀则连接到流动回路3从而从混合旋塞的意义上起作用，使得已经预先混合并因此相应地回火的附加密封液29被引入流动回路3中，准备好提供到微流体设备2。
现在，为了向流动通道25提供附加密封液29，提供起微流体系统1的泵送装置作用的蠕动泵31作为流动回路3的一部分，用于将附加密封液29泵送到微流体设备2、通过微流体设备的入口23通过流动通道25并离开出口24，从而不仅向反应区域阵列26提供热量或冷量以用于对反应区域阵列26内部的样品的热循环，而且还实现了将任何气泡(如果发生在流动通道25内部)都冲洗出流动通道25和出口24，即离开微流体设备2。在此，泵31可以不断地将附加密封液29泵送通过流动通道25，或者可以间歇地将附加密封液29泵送通过流动通道25(例如仅在反应区域阵列26内部的样品液27需要回火时)。因此，在有可能根据需要将附加密封液29泵送通过流动通道25的情况下，通过用附加密封液29冲洗流动通道25可以将流动通道25内部已经存在的气泡、或者样品液27的热循环期间出现的任何种类的气泡从微流体设备2去除。为了能够最终将任何气泡从整个流体系统去除，微流体系统1还包括安排在微流体设备2的出口24下游并且在本实施方案中安排在泵31之前的气泡阱32，其中气泡阱32用于将任何气泡与流动的附加密封液29分离。从而，可以将气泡(如果有的话)立即从微流体系统1去除。因此，至少可以减少或者可以完全避免气泡对测试结果的任何负面影响。
在图2中，描绘了本发明的微流体设备1'的第二实施方案，所述微流体设备基本上由与关于如图1中所示的第一实施方案所描述的类似结构组成。在此，相同的附图标记表示相同的元件，并且省略相应的描述以避免重复。然而，与第一实施方案相反，微流体设备1'仅包括未回火储器42，所述未回火储器包括未加热的附加密封液29，其中在储器42下游设置有流体加热器5，用于根据要应用于到反应区域阵列26内部样品上的希望的热循环温度分布对未回火储器42进行回火。在此，同样地，储器42通过相应的电子控制的递送阀421连接到流动回路3，其中，通过控制递送阀421，可以将分别经温度调节的附加密封液29引入流动回路3中并且可以由泵31将其泵送到微流体设备2中，以便不仅向反应区域阵列26内部样品提供希望的热循环温度分布，而且最重要的是将流动通道25内部发生的任何气泡都冲洗出去。
根据替代实施方案，如本领域中已知的并且联系图4A至图4D中的任何一项进行描述的，如图2所示但不具有流体加热器5的前述实施方案的结构可以应用于板循环仪8，其中板循环仪8让微流体设备2设置于其中。从而，可以通过板循环仪8完成对反应区域阵列26内部样品液27提供希望的热循环温度分布，并且未加热的附加密封液29的泵送仅用于去除流动通道25内部的气泡(如果有的话)。此外，根据另一替代实施方案，可以在没有流体加热器5或没有板循环仪8的情况下应用如图2所示的实施方案的结构，但是其中附加密封液29包括导电石墨烯材料，用于通过根据需要向附加密封液29施加电力来加热附加密封液29，从而实现对附加密封液29的加热，以便能够将希望的热循环温度分布应用到反应区域阵列26内部的样品材料，而不需要任何种类的外部加热器或经加热的储器。
虽然已经联系本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解，此描述仅用于说明目的。因此，本发明旨在仅受所附权利要求的范围限制。

Claims (15)

1.一种用于生物样品的数字聚合酶链式反应dPCR的微流体系统(1；1’)，所述微流体系统(1；1')包括：
至少一个微流体设备(2)，所述微流体设备具有入口(23)、出口(24)、将所述入口(23)连接到所述出口(24)的流动通道(25)、以及与所述流动通道(25)处于流体连通的反应区域阵列(26)；
流动回路(3)，所述流动回路可连接到所述微流体设备(2)，用于使液体流动通过所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)；
样品液源，所述样品液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供样品液(27)；
主密封液源，所述主密封液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供初始密封液(28)以将所述样品液(27)密封在所述反应区域阵列(26)内部；
次密封液源(4)，所述次密封液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供附加密封液(29)；以及
泵送装置(31)，所述泵送装置连接到所述流动回路(3)并且被适配成将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)。
2.权利要求1的微流体系统(1；1')，其中任何密封液(28，29)都是不混溶的液体，优选地，其中任何密封液(28，29)是油和如硅酮液等聚合物液中的一种或其混合物，进一步优选地，其中所述初始密封液(28)和所述附加密封液(29)由相同的密封液材料组成。
3.权利要求1或2的微流体系统(1；1')，其中所述主密封液源和所述次密封液源(4)由不同的密封液储器或由公共密封液储器实施，优选地，其中所述初始密封液(28)是未回火密封液。
4.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述泵送装置(31)由控制单元控制以根据需要将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)，以便将气泡冲洗出所述流动通道(25)，优选地，其中所述泵送装置(31)被控制成将预定量的所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)，进一步优选地，其中所述泵送装置(31)被控制成不断地、间歇地、或在检测到所述流动通道(25)中的气泡时将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)。
5.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括连接到所述流动回路(3)的气泡阱(32)，用于将气体与密封液(28，29)分离，所述气泡阱(32)安排在所述微流体设备(2)的所述出口(24)下游。
6.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中
所述微流体系统(1；1')用于对以所述样品液(27)形式提供到所述反应区域阵列(26)的每个构件的所述生物样品进行测定；和/或
以连接端口的形式实施所述入口(23)和/或所述出口(24)，用于将所述微流体设备(2)与所述样品液源连接，用于将所述微流体设备(2)与所述主密封液源连接，和/或用于将所述微流体设备(2)与所述次密封液源(4)连接；和/或
所述微流体设备(2)至少由底层(21)和顶层(22)构成，其中所述底层(21)或所述顶层(22)提供所述反应区域阵列(26)、所述入口(23)和所述出口(24)，并且其中所述流动通道(25)建立在所述底层(21)与所述顶层(22)之间，并与所述反应区域阵列(26)处于流体连接，优选地，其中每个反应区域是微孔或纳米孔，进一步优选地，其中所述微流体设备(2)是微流体芯片；和/或
所述样品液(27)是包含所述生物样品和dPCR测定所需试剂的水溶液，优选地，其中首先使所述样品液(27)流动通过所述流动通道(25)进入所述反应区域阵列(26)，并且其中在将所述样品液(27)提供到所述反应区域阵列(26)之后，使所述初始密封液(28)流动进入所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)。
7.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括用于检测所述微流体设备(2)中气泡的存在或生成的检测装置，优选地，其中所述检测装置是光学成像设备，进一步优选地是光学相机。
8.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括接收所述微流体设备(2)的热学安装件，用于向所述反应区域阵列(26)提供热循环温度分布。
9.权利要求1至7中任一项的微流体系统(1；1')，其中通过加热和/或冷却装置实施向所述反应区域阵列(26)提供热循环温度分布，所述加热和/或冷却装置用于将密封液温度加热和/或冷却至希望的热循环温度分布温度，并且其中
所述次密封液源(4)包括具有未加热的附加密封液(29)的储器(42)，其中在所述储器(42)下游设置有流动型加热装置(5)，用于根据需要加热所述附加密封液(29)；和/或
所述次密封液源(4)包括具有经加热的附加密封液(29)的至少一个储器(41)和具有未加热或经冷却的附加密封液(29)的至少一个储器(42)，所述储器(41，42)通过如相应的电子控制的递送阀(411，421)或公共混合阀等阀机构(411，421)可分离地连接到所述流动回路(3)；和/或
所述附加密封液(29)包括如石墨烯材料等导电材料，用于根据需要通过对所述附加密封液施加电力来加热所述附加密封液(29)。
10.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括至少围绕所述微流体设备(2)的压力室。
11.一种用于对前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')中的生物样品进行数字聚合酶链式反应dPCR的方法，所述方法包括：
使样品液(27)流动通过具体以微流体芯片的形式提供的所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)，并通过将所述样品液(27)推动通过所述流动通道(25)而以连续的方式用所述样品液(27)填充所述反应区域阵列(26)的步骤；
使初始密封液(28)流动通过所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)，以在所述反应区域阵列(26)被填充了所述样品液(27)之后密封所述反应区域阵列的每个反应区域并且推动剩余的样品液(27)离开所述微流体设备(2)的步骤；
将热循环温度分布应用于所述反应区域阵列(26)的步骤；以及
将附加密封液(29)泵送通过所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)以便将气泡冲洗出所述流动通道(25)的步骤。
12.权利要求11的方法，其中将附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)的步骤包括根据需要将预定量的附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)，优选地，其中将附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)的步骤是不断地将附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)的步骤、或间歇地将附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)的步骤、和/或在检测到所述流动通道(25)中的气泡时将附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)的步骤。
13.权利要求11或12的方法，其中所述方法还包括：
优选地借助于如光学成像设备例如光学相机等检测装置监测和检测所述微流体设备(2)中气泡的存在或生成的步骤；和/或
优选地借助于气泡阱(32)将气泡与所述附加密封液(29)分离的步骤，所述气泡阱连接到所述微流体设备(2)的所述出口(24)下游的所述流动回路(3)；和/或
优选地借助于至少围绕所述微流体设备(2)的压力室向所述微流体设备(2)施加压力的步骤；和/或
测定所述反应区域阵列(26)中提供的所述生物样品的步骤。
14.权利要求11至13中任一项的方法，其中将热循环温度分布应用于所述反应区域阵列(26)的步骤包括：
控制接收所述微流体设备(2)的热学安装件的温度分布的步骤，用于向所述反应区域阵列(26)提供热循环温度分布；或者
控制加热和/或冷却装置的步骤，用于将密封液温度加热和/或冷却至希望的热循环温度分布温度。
15.权利要求14的方法，其中控制加热和/或冷却装置(5)的步骤包括：
控制设置在所述次密封液源(4)下游的流动型加热装置(5)的步骤，用于根据需要加热所述附加密封液(29)；和/或
控制阀机构(411，421)的步骤，用于将来自具有经加热的附加密封液(29)的至少一个储器(41)的附加密封液(29)和来自具有未加热或经冷却的附加密封液(29)的至少一个储器(42)的附加密封液混合；和/或
根据需要向所述附加密封液(29)施加电力的步骤，所述附加密封液(29)包括如石墨烯材料等导电材料，用于通过施加电力来加热所述附加密封液(29)。
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