JP7319861B2 - 生物学的試料のデジタルポリメラーゼ連鎖反応のためのマイクロ流体システム、及びそれぞれの方法 - Google Patents
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Description
ここで、従来のPCRは1つの試料ごとに1つの反応を行うのに対して、dPCRは、多数の反応領域にそれぞれ提供された多数のパーティションに分かれた試料内で1つの反応を行い、より確実な核酸の収集及び高感度な測定が可能になるように、各反応領域で個別に反応が行われるので、dPCRと従来のPCRの実質的な違いは、核酸量の測定方法にある。したがって、単一のキャリアデバイス上での並行化学分析の数を増やすために、さまざまな化学分析操作の小型化及び統合を達成するために、かなりの努力が行われてきた。そのような単一キャリアデバイスの例として、マイクロ流体チップなどのマイクロ流体デバイスが開発されており、水性試料液体などの流動可能な試料液体の形でマイクロリットル又はナノリットルスケールの試料を受け取るマイクロスケールチャネル及びマイクロスケール反応領域を提供する。マイクロ流体チップ上の反応領域として提供されるマイクロウェル又はナノウェルなどの小さなウェルのアレイに事前に典型的に充填されるマイクロリットルスケールの試薬は、流路を流れる試料液体の流れに接触するためにそこに配置され、化学分析の各タイプは、流路と検知器の構成と同様に反応領域のアレイにロードされた試薬に依存し、マイクロ流体チップへの試料液体の充填は、試料液体をチップにピペッティングすることで実行され得る。この高度な技術により、複数の化学分析を小型化したスケールで同時に実行することができる。これらの化学的、生化学的及び/又は生物学的化学分析のほとんどは、ポリペプチド及び核酸、ウェル内の細胞又は組織等の生物学的材料の固定、並びに発光テスト測定等の定量的及び/又は定性的な分析プロセスに続いて固定化された材料との1つ又は複数の反応の実行を対象とする。説明のため、図3Aは、既知のマイクロ流体チップ6の一例の上面図を概略的に示し、図3Bは、図3Aの線A-Aに沿った断面図における図3Aのチップ6を示す。マイクロ流体チップ6は、下部プレート61と、上部プレート62、即ち、いわゆる2層マイクロ流体チップからなり、上部プレート62は、チップへの液体の導入のための入口63と、チップからの液体の流出のための出口64とを提供し、下部プレート61、即ちチップの下層、及び上部プレート62、即ちチップの上層の組み合わせは、それらの間に流路65を確立し、流路65は入口63を出口64に接続し、マイクロウェル66のアレイは、その上側、すなわち上部プレート62の内側で流路65に設けられている。ここで、試料液体を入口63を通じて流路65内に、出口63に向けて充填する場合、試料液体をマイクロウェルのアレイに沿って流すと、試料液体はマイクロウェル66のアレイの各部に満たされる。
また、気泡は、反応領域の光学的な検知及びそこで発生する反応に深刻な影響を与える可能性があり、化学分析の失敗につながる可能性がある。特に、マイクロ流体デバイスで試料のdPCRを実行するとき、いくつかの理由:(a)試料液体と分離液でマイクロ流体デバイスを充填するとき、気泡がマイクロ流体デバイスに閉じ込められ得る、(b)サーモサイクリング中、最初に閉じ込められた気泡((a)参照)が、試料液体の蒸発により成長し得る、又は(c)試料の蒸発により、新たな気泡が発生し得る、により、空気泡などの気泡は頻繁に発生する傾向がある。
(b)2次シーリング液体源は、加熱された追加のシーリング液を備えた少なくとも1つのリザーバと、非加熱又は冷却された追加のシーリング液を備えた少なくとも1つのリザーバと、を含み、リザーバは、電子制御送達バルブ等のそれぞれのバルブ機構によって流れ回路に分離可能に接続され得るか、又はリザーバは、マイクロ流体デバイスに供給されるシーリング液の所望の温度を達成するために、加熱された追加のシーリング液と非加熱又は冷却された追加のシーリング液を混合するための混合バルブによって流れ回路に接続され得る;
(c)追加のシーリング液は、必要に応じて追加のシーリング液に電力を印加することにより追加のシーリング液を加熱するための、グラフェン材料などの導電性材料を含む。
(a)必要に応じて追加のシーリング液を加熱するために、二次シーリング液体源の下流に設けられたフロー型加熱手段を制御するステップ。
(b)加熱された追加のシーリング液を備えた少なくとも一つのリザーバと非加熱又は冷却した追加のシーリング液を備えた少なくとも一つのリザーバとからの追加のシーリング液を混合するためのバルブ機構を制御するステップ。
(c)必要に応じて追加のシーリング液に電圧を印加するステップであって、追加のシーリング液は、電力の印加によって追加のシーリング液を加熱するためのグラフェン材料などの導電性材料を含む、ステップ。
(d)前述のオプションのステップ(a)から(c)のいずれかの組み合わせ。
1´ マイクロ流体システム(第2実施形態)
2 マイクロ流体デバイス
21 マイクロ流体デバイスの下部プレート/下層
22 マイクロ流体デバイスの上部プレート/上層
23 マイクロ流体デバイス入口
231 マイクロ流体デバイス入口カバー
24 マイクロ流体デバイス出口
241 マイクロ流体デバイス出口カバー
25 マイクロ流体デバイス流路
26 反応領域/ウェルのアレイ
27 試料液体(反応領域に充填される)
28 初期シーリング液
29 追加のシーリング液
3 流れ回路
31 ポンプ
32 気泡トラップ
4 二次シーリング液体源
41 調温されたリザーバ
411 電子制御送達バルブ
42 調温されていないリザーバ
421 電子制御送達バルブ
5 フローヒータ
6 マイクロ流体チップ
61 マイクロ流体チップの下部プレート/下層
62 マイクロ流体チップの上部プレート/上層
63 マイクロ流体チップ入口
64 マイクロ流体チップ出口
65 マイクロ流体チップ流路
66 マイクロウェルのアレイ
7 マイクロ流体チップ
71 マイクロ流体チップの下部プレート/下層
72 マイクロ流体チップの上部プレート/上層
73 マイクロ流体チップ入口
74 マイクロ流体チップ出口
75 マイクロ流体チップ流路
76 反応領域/ウェルのアレイ
77 試料液体(反応領域に充填される)
78 シーリング液
8 プレートサイクラ
81 プレートサイクラのボトムヒータ
82 プレートサイクラのトップヒータ
91 初期気泡
92 新しく出現した気泡
93 合併した気泡
Claims (15)
- 生物学的試料のデジタルポリメラーゼ連鎖反応dPCRのためのマイクロ流体システム(1;1´)であって、
入口(23)、出口(24)、前記入口(23)を前記出口(24)に接続する流路(25)、及び前記流路(25)と流体連通する反応領域(26)のアレイを有する少なくとも1つのマイクロ流体デバイス(2)と、
前記マイクロ流体デバイス(2)の前記流路(25)を通して液体を流すための、前記マイクロ流体デバイス(2)に接続可能な流れ回路(3)と、
前記マイクロ流体デバイス(2)に試料液体(27)を提供するための、前記マイクロ流体デバイス(2)に接続可能な試料液体源と、
前記反応領域(26)のアレイ内部の前記試料液体(27)を封止するために前記マイクロ流体デバイス(2)に初期シーリング液(28)を提供するための、前記マイクロ流体デバイス(2)に接続可能な一次シーリング液体源と、
前記マイクロ流体デバイス(2)に追加のシーリング液(29)を提供するための、前記マイクロ流体デバイス(2)に接続可能な二次シーリング液体源(4)と、
前記流れ回路(3)に接続され、前記流路(25)を通して前記追加のシーリング液(29)を送り出すように構成されるポンプ手段(31)と、
前記流路(25)から気泡を洗い流すために、前記流路(25)における気泡の検出に基づいて前記追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して送り出すように前記ポンプ手段(31)を制御する制御ユニットと、を有する、マイクロ流体システム。 - 請求項1に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
任意のシーリング液(28,29)が不混和性液体であり、好ましくは、任意のシーリング液(28,29)が、油、及びシリコーン液等のポリマー液のうちの1つ、又はそれらの混合物であり、さらに好ましくは、前記初期シーリング液(28)及び前記追加のシーリング液(29)は、同一のシーリング液材料からなる、マイクロ流体システム。 - 請求項1又は2に記載されたマイクロ流体システムにおいて、
前記一次シーリング液体源及び前記二次シーリング液体源(4)が、異なるシーリング液リザーバ又は共通のシーリング液リザーバによって実装され、好ましくは、前記初期シーリング液(28)は、調温されていないシーリング液である、マイクロ流体システム。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記ポンプ手段(31)は、所定量の前記追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して送り出すように制御され、さらに好ましくは、前記ポンプ手段(31)は、前記追加のシーリング液(29)を、絶え間なく、断続的に、又は前記流路(25)内の気泡の検出時に、前記流路(25)を通して送り出すように制御される、マイクロ流体システム。 - 請求項1から4のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記マイクロ流体システム(1;1´)は、気体をシーリング液(28,29)から分離するために、前記流れ回路(3)に接続された気泡トラップ(32)をさらに備え、前記気泡トラップ(32)は、前記マイクロ流体デバイス(2)の前記出口(24)の下流に配置される、マイクロ流体システム。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記マイクロ流体システム(1;1´)は、前記反応領域(26)のアレイの各部材に前記試料液体(27)の形態で提供される前記生物学的試料を分析するために使用され、且つ/又は
前記入口(23)及び/又は前記出口(24)は、前記マイクロ流体デバイス(2)と前記試料液体源との接続のため、前記マイクロ流体デバイス(2)と前記一次シーリング液体源との接続のため、及び/又は前記マイクロ流体デバイス(2)と前記二次シーリング液体源(4)との接続のため、接続ポートの形で実装され、且つ/又は
前記マイクロ流体デバイス(2)は、少なくとも下層(21)と上層(22)で構成され、前記下層(21)又は上層(22)のいずれかは前記反応領域(26)のアレイ、前記入口(23)、及び前記出口(24)を提供し、前記流路(25)は、前記下層(21)と前記上層(22)の間に確立され、前記反応領域(26)のアレイと流体接続しており、好ましくは、各反応領域はマイクロウェル又はナノウェルであり、さらに好ましくは、前記マイクロ流体デバイス(2)はマイクロ流体チップであり、且つ/又は
前記試料液体(27)は、前記生物学的試料とdPCR分析に必要な試薬を含む水溶液であり、好ましくは最初に前記試料液体(27)が前記流路(25)を通して前記反応領域(26)のアレイに流され、前記初期シーリング液(28)は、前記反応領域(26)のアレイへの前記試料液体(27)の供給後、前記マイクロ流体デバイス(2)の前記流路(25)に流し込まれる、マイクロ流体システム。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記マイクロ流体システム(1;1´)は、前記マイクロ流体デバイス(2)内の気泡の存在又は発生を検出するための検出手段をさらに備え、好ましくは、検出手段は光学撮像装置であり、さらに好ましくは光学カメラである、マイクロ流体システム。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記マイクロ流体システム(1;1´)は、前記反応領域(26)のアレイにサーモサイクリング温度プロファイルを提供するための、前記マイクロ流体デバイス(2)を受ける熱マウントをさらに有する、マイクロ流体システム。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記反応領域(26)のアレイへのサーモサイクリング温度プロファイルの提供は、シーリング液の温度を所望のサーモサイクリング温度プロファイル温度まで加熱及び/又は冷却するための加熱及び/又は冷却手段によって実施され、
前記二次シーリング液体源(4)は、加熱されていない追加のシーリング液(29)を備えたリザーバ(42)を備え、前記追加のシーリング液(29)を必要に応じて加熱するために、フロー型加熱手段(5)が前記リザーバ(42)の下流に設けられ、及び/又は
前記二次シーリング液体源(4)は、加熱された追加のシーリング液(29)を備えた少なくとも1つのリザーバ(41)と、非加熱又は冷却された追加のシーリング液(29)を備えた少なくとも1つのリザーバ(42)とを含み、前記リザーバ(41,42)は、それぞれの電子制御送達バルブ(411、421)又は共通の混合バルブなどのバルブ機構(411,421)によって流れ回路(3)に分離可能に接続され、及び/又は
前記追加のシーリング液(29)は、前記追加のシーリング液(29)に必要に応じて電圧を印加することによって前記追加のシーリング液を加熱するために、グラフェン材料などの導電性材料を含む、マイクロ流体システム。 - 請求項1から9のいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)において、
前記マイクロ流体システム(1;1´)は、少なくとも前記マイクロ流体デバイス(2)を取り囲む圧力チャンバをさらに備える、マイクロ流体システム。 - 請求項1から10ののいずれか一項に記載されたマイクロ流体システム(1;1´)における生物学的試料のデジタルポリメラーゼ連鎖反応dPCRの方法であって、
特にマイクロ流体チップの形態で提供される前記マイクロ流体デバイス(2)の前記流路(25)を通して試料液体(27)を流し、前記試料液体(27)を前記流路(25)を通して押し込むことにより、前記反応領域(26)のアレイを前記試料液体(27)で連続的に充填するステップと、
前記反応領域(26)のアレイが試料液体(27)で満たされた後、前記反応領域(26)のアレイの各反応領域を封止するため、及び前記マイクロ流体デバイス(2)から残っている試料液体(27)を押し出すために、前記マイクロ流体デバイス(2)の前記流路(25)を通して初期シーリング液(28)を流すステップと、
サーモサイクリング温度プロファイルを前記反応領域(26)のアレイに適用するステップと、
前記流路(25)から気泡を洗い流すために、前記マイクロ流体デバイス(2)の前記流路(25)を通して追加のシーリング液(29)を送り出すステップと、を有する方法。 - 請求項11の方法において、
追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して送り出す前記ステップは、必要に応じて、所定量の追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して送り出すことを含み、好ましくは、追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して送り出す前記ステップは、追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して絶えず送り出すステップ、又は追加のシーリング液(29)を前記流路(25)を通して断続的に送り出すステップ、及び/又は前記流路(25)内の気泡を検出したときに、前記流路(25)を通して追加のシーリング液(29)を送り出すステップである、方法。 - 請求項11又は12に記載された方法において、さらに、
好ましくは光学撮像装置、例えば光学カメラなどの検出手段によって、前記マイクロ流体デバイス(2)内の気泡の存在又は生成を監視及び検出するステップ、及び/又は
好ましくは、前記マイクロ流体デバイス(2)の前記出口(24)の下流の前記流れ回路(3)に接続された気泡トラップ(32)によって、追加のシーリング液(29)から気泡を分離するステップ、及び/又は
好ましくは、少なくとも前記マイクロ流体デバイス(2)を囲む圧力チャンバによって、前記マイクロ流体デバイス(2)に圧力を加えるステップ、及び/又は
前記反応領域(26)のアレイに提供される前記生物学的試料を分析するステップ、を含む、方法。 - 請求項11から13のいずれか一項に記載された方法において、
サーモサイクリング温度プロファイルを前記反応領域(26)のアレイに適用するステップは、
前記反応領域(26)のアレイにサーモサイクリング温度プロファイルを提供するために、前記マイクロ流体デバイス(2)を受け取る熱マウントの温度プロファイルを制御するステップ、又は
シーリング液温度を所望のサーモサイクリング温度プロファイル温度に加熱及び/又は冷却するための加熱及び/又は冷却手段を制御するステップ、を含む、方法。 - 請求項14に記載された方法において、
加熱及び/又は冷却手段(5)を制御するステップは、
必要に応じて前記追加のシーリング液(29)を加熱するために、前記二次シーリング液体源(4)の下流に設けられたフロー型加熱手段(5)を制御するステップ、及び/又は
加熱された追加のシーリング液(29)を含む少なくとも1つのリザーバ(41)と非加熱又は冷却された追加のシーリング液(29)を含む少なくとも1つのリザーバ(42)とからの追加のシーリング液(29)を混合するためのバルブ機構(411,421)を制御するステップ、及び/又は
必要に応じて前記追加のシーリング液(29)に電圧を印加するステップであって、前記追加のシーリング液(29)は、電圧の印加によって前記追加のシーリング液(29)を加熱するために、グラフェン材料などの導電性材料を含むステップ、を含む方法。
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