CN116947680A - 一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用。本发明中合成阳离子脂质化合物时对异腈的选择没有限制条件，无需催化剂的参与即可正常进行；本发明中合成阳离子脂质化合物的方法简单、廉价，容易推广应用，并且合成的脂质分子结构多变，合成产率较高，达到70％以上。通过本发明中的阳离子脂质化合物制备的基因载体具有良好的基因转染效率和较低细胞毒性，具有临床应用的潜能。

Description

一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗在病毒、疫苗、神经系统疾病、炎症、癌症等各种疾病的诊断和治疗中显示出巨大的潜力。基因治疗中，由于DNA极易被体内的核酸酶降解，且不能直接与细胞膜接触进入细胞，需要载体与外源DNA结合，在体内运输过程中起到运载、保护DNA的作用。目前，基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两类。病毒可以将其基因组整合到靶细胞中，利用病毒载体递送遗传物质通常具有很高的转染效率，但存在免疫原性高、毒性大、靶向性不足、对DNA尺寸和目标细胞的种类有限制、成本高等弊端，在临床应用上受到限制。与病毒载体相比，非病毒基因载体具有毒性低、易于制备、易于化学修饰、可大量生产等优势，近年来受到广泛关注。非病毒载体主要包括脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子聚合物、无机纳米材料和天然多糖类载体等。
LNP是由阳离子类脂和辅助脂质(DOPE、DOPC、胆固醇、聚乙二醇酯类脂质等)按一定比例混合形成的囊泡结构。阳离子类脂表面携带的正电荷可以与带负电的基因通过静电相互作用结合为稳定的复合物，起到保护基因的目的。辅助脂质主要通过提高LNP的生物相容性、结构稳定性、血清稳定性等，提高基因递送效率。
阳离子类脂的结构是影响LNP基因转运性能的重要因素。首先，脂质分子的正电荷是由亲水头部上胺基的氮原子通过质子化得到的，不同种类和数量的胺基会导致带有不同的正电荷，从而造成不同的转染活性和细胞毒性；疏水尾链的种类、长度和不饱和度会影响LNP/DNA复合物的亲脂性、生物相容性、转变温度、pKa等，进而对材料的转染效率产生影响；类脂分子的连接键通常具有良好的生理稳定性和特定条件下的生物降解性，即在体内循环时保持结构稳定，到达靶向位点后迅速降解，有效释放基因，同时降低细胞毒性。最常见的连接基团包括酯键、酰胺键、胺基甲酸酯键、磷酸盐、醚键等。
目前，阳离子类脂的合成方法有很多，但大多数仍然存在合成路线复杂，合成产率低，成本高、难易进行大规模生产等问题。
已有报道通过Ugi三组分反应同时偶联伯胺/仲胺、酮和异腈的方法，一步合成类脂分子，类脂结构由胺头基、异腈接头和烷基或亚烷基酮脂质尾链组成。与使用多步反应合成的传统脂质相比具有合成简单快速的优势。当α-酸性异腈化物作为反应物时，异腈既可以作为亲电试剂，也可以作为亲核试剂，反应不需要催化剂，在二氯甲烷和乙醇的混合溶剂中即可以进行，但合成产率较低，最高只达到34％。对于其它异腈，反应需要路易斯酸(如苯基次磷酸、AlCl3、SbCl5等)作为催化剂。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用，以解决现有基因载体转运性能差、制备基因载体的脂质化合物合成产率低以及反应需要路易斯酸作为催化剂等技术问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是，提供一种阳离子脂质化合物，阳离子脂质化合物的结构式如式I所示，
其中，R1为氮杂环基或胺基，R2为取代苯基或直链烷基；R3为直链烃基。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，氮杂环基为哌啶基或吡咯烷基，胺基为N-甲基乙胺基；取代苯基为硝基取代的苯基；直链烷基为正十三烷基；直链烃基为正十二烷基或油烯基。
进一步，阳离子脂质化合物为如下化合物中的一种：
本发明还公开了上述阳离子脂质化合物的制备方法，制备方法包括以下步骤：
S1：将酸、醛和异腈共溶于第一有机溶剂中，于40～50℃下反应16～32h，然后去除溶剂并纯化，得到产物A；
酸为如下酸中的一种：
醛为如下醛中的一种：
异腈为如下异腈中的一种：
S2：将产物A溶解在第二有机溶剂中，在冰浴条件下加入三氟乙酸，然后升温至室温，并保温反应5～8h；再旋干溶剂并去除三氟乙酸，即得。
制备方法在上述技术方案的基础上还可以做如下进一步的改进。
进一步，酸、醛和异腈的摩尔比为1:1:1。
进一步，第一有机溶剂为四氢呋喃；第二有机溶剂为二氯甲烷。
进一步，S1中纯化方式为柱层析，柱层析所用洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯按3:1的体积比混合得到。
进一步，S2中去除三氟乙酸的方法为：将旋干溶剂后的物质溶于第二有机溶剂中，再旋干；重复上述操作4～6次。
本发明还公开了阳离子脂质化合物在制备基因载体中的应用。因载体经过以下步骤制得：将阳离子脂质化合物与DOPE按1:1～2的摩尔比加入反应容器中，并用无水氯仿溶解，然后旋干溶剂，得到贴于反应容器侧壁的薄膜，真空干燥过夜；再向反应容器中加入超纯水，于70℃下加热30min，使薄膜脱落，随后冰浴下粉碎，得基因载体溶液。
本发明的有益效果是：
1、通过本发明中的阳离子脂质化合物制备的基因载体具有良好的基因转染效率和较低细胞毒性，是一种性能优良的基因载体。
2、本发明中合成阳离子脂质化合物的方法简单、廉价，容易推广应用。
3、本发明中合成阳离子脂质化合物时对异腈的选择没有限制条件，无需催化剂的参与即可正常进行。
附图说明
图1为本发明制备阳离子脂质化合物的反应方程式；
图2为LNP的粒径和Zeta电位分布图；
图3为LNP的凝胶电泳实验结果；
图4为LNP(B1、B2)和pGL-3质粒复合物在HepG 2细胞中的细胞毒性检测结果；
图5为LNP(B3、B4、B5)和pGL-3质粒复合物在A549细胞中的细胞毒性检测结果；
图6为LNP(B1、B2)和pEGFP-N1质粒复合物在HepG 2细胞中有/无血清条件下的定性转染实验结果；
图7为LNP(B3、B4、B5)和pEGFP-N1质粒复合物在A549细胞中有/无血清条件下的定性转染实验结果；
图8为LNP(B1、B2)和pGL-3质粒复合物在HepG 2细胞中有/无血清条件下的定量转染实验结果；
图9为LNP(B3、B4、B5)和pGL-3质粒复合物在A549细胞中有/无血清条件下的定量转染实验结果。
具体实施方式
本发明中制备阳离子脂质化合物的反应方程式如图1所示。下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种阳离子脂质化合物，其结构式如下所示：
本实施例中的阳离子脂质化合物经过以下步骤制得：
(1)将1-Boc-吡咯烷-3-甲酸(0.15g，0.7mmol)、邻硝基苯甲醛(0.11g，0.7mmol)和油烯基异腈(0.19g，0.7mmol)溶解在2mL四氢呋喃中，加热到45℃并保温反应24h；再减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到0.53g淡黄色油状产物A1，其结构式如下，产率为78.3％；
(2)将A1(0.35g，0.55mmol)溶解在2mL二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加三氟乙酸(0.63g，5.5mmol)，滴加完毕后，升温至室温并保温反应6h，点板监测反应进程；反应结束后，通过减压蒸馏旋干溶剂，再加入3mL二氯甲烷，继续旋干，重复上述操作5次，直到将三氟乙酸全部旋掉，真空干燥得到0.34g淡黄色油状产物B1，即本实施例中的阳离子脂质化合物，产率为93％；B1的表征结果为：
1H-NMR:(400MHz,CDCl3):δ(ppm)7.99(d,1H,Ar-H),7.75(m,2H,Ar-H),7.55(t,1H,Ar-H),6.59(d,1H,-COOCHCONH-),5.45-5.20(m,2H,-CH＝CH-),3.42(s,2H,-NHCH2CH-),3.20(d,2H,-CONHCH2-),2.32(m,4H,-CH2CH＝),1.92(s,1H,-CH2CHCOO-),1.60(m,4H,-NHCH2CH2CH-),1.42(s,2H,-CONHCH2CH2-),1.23(d,24H,-CH2CH2-,-CH2CH3),0.85(t,3H,CH3CH2-).
HR-MS：[M+H]+：544.3751
实施例2
一种阳离子脂质化合物，其结构式如下所示：
本实施例中的阳离子脂质化合物经过以下步骤制得：
(1)将1-Boc-4-哌啶甲酸(0.15g，0.65mmol)、邻硝基苯甲醛(0.10g，0.65mmol)和油烯基异腈(0.18g，0.65mmol)溶解在2mL四氢呋喃中，加热到45℃并保温反应24h；再减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到0.27g淡黄色油状产物A2，其结构式如下，产率为76.5％；
(2)将A2(0.27g，0.49mmol)溶解在2mL二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加三氟乙酸(0.56g，4.9mmol)，滴加完毕后，升温至室温并保温反应6h，点板监测反应进程；反应结束后，通过减压蒸馏旋干溶剂，加入3mL二氯甲烷，继续旋干，重复上述操作5次，直到将三氟乙酸全部旋掉，真空干燥得到0.3g淡黄色油状产物B2，即本实施例中的阳离子脂质化合物，产率为90.2％；B2的表征结果为：
1H-NMR:(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.00(d,1H,Ar-H),7.77(m,2H,Ar-H),7.56(t,1H,Ar-H),6.64(d,1H,-COOCHCONH-),5.33(m,2H,-CH＝CH-),3.54-3.04(m,6H,-NHCH2CH2-,-CONHCH2-),2.81(s,1H,-CH2CHCOO-),2.30-1.87(m,4H,-CH2CH＝),1.60(s,4H,-NHCH2CH2CH-),1.42(t,2H,-CONHCH2CH2-),1.23(d,24H,-CH2CH2-,-CH2CH3),0.85(t,3H,CH3CH2-).
HR-MS：[M+H]+：558.3909
实施例3
一种阳离子脂质化合物，其结构式如下所示：
本实施例中的阳离子脂质化合物经过以下步骤制得：
(1)将1-Boc-吡咯烷-3-甲酸(0.15g，0.7mmol)、十四醛(0.15g，0.7mmol)和十二异腈(0.14g，0.7mmol)溶解在2mL四氢呋喃中，加热到45℃并保温反应24h；再减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到0.32g白色固态产物A3，其结构式如下，产率为72％：
(2)将A3(0.32g，0.5mmol)溶解在2mL二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加三氟乙酸(0.11g，5mmol)，滴加完毕后，升温至室温并保温反应6h，点板监测反应进程；反应结束后，通过减压蒸馏旋干溶剂，加入3mL二氯甲烷，继续旋干，重复上述操作5次，直到将三氟乙酸全部旋掉，真空干燥得到0.29g白色固态产物B3，即本实施例中的阳离子脂质化合物，产率为90.7％；B1的表征结果为：
1H-NMR:(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.02(m,1H,-COOCH-),3.62(m,2H,-NHCH2CH-),3.41(m,3H,-NHCH2CH2CH-,-NHCH2CH-),3.25(m,2H,-COONHCH2-),2.38(m,2H,-NHCH2CH2CH-),1.81(m,2H,-COOCHCH2-),1.25(m,42H,-CH2CH2-,-CH2CH3),0.88(t,6H,CH3CH2-)
HR-MS：[M+H]+：523.4837
实施例4
一种阳离子脂质化合物，其结构式如下所示：
本实施例中的阳离子脂质化合物经过以下步骤制得：
(1)将1-Boc-4-哌啶甲酸(0.15g，0.65mmol)、十四醛(0.14g，0.65mmol)和十二异腈(0.14g，0.65mmol)溶解在2mL四氢呋喃中，加热到45℃并保温反应24h；再减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到0.30g白色固状产物A4，其结构式如下，产率为73.1％；
(2)将A4(0.30g，0.48mmol)溶解在2mL二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加三氟乙酸(0.55g，4.8mmol)，滴加完毕后，升温至室温并保温反应6h，点板监测反应进程；反应结束后，通过减压蒸馏旋干溶剂，再加入3mL二氯甲烷，继续旋干，重复上述操作5次，直到将三氟乙酸全部旋掉，真空干燥得到0.28g白色固状产物B4，即本实施例中的阳离子脂质化合物，产率为89.2％；B4的表征结果为：
1H NMR:(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.04(m,1H,-COOCH-),3.43(t,2H,-CH2NHCH2-),3.27(m,2H,-CH2NHCH2-),3.08(m,2H,-CH2CH2NHCH2CH2-),2.75(m,2H,-CH2CH2NHCH2CH2-,-CHCOO-),1.81(m,2H,-COOCHCH2-),1.25(m,42H,-CH2CH2-,-CH2CH3),0.88(t,6H,CH3CH2-)
HR-MS：[M+H]+：537.4996
实施例5
一种阳离子脂质化合物，其结构式如下所示：
本实施例中的阳离子脂质化合物经过以下步骤制得：
(1)将N-Boc-3-(甲基氨基)丙酸(0.15g，0.74mmol)、十四醛(0.16g，0.74mmol)和十二异腈(0.14g，0.74mmol)溶解在2mL四氢呋喃中，加热到45℃并保温反应24h；再减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(洗脱剂体积比：石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到0.38g白色固状产物A5，其结构式如下，产率为83.2％：
(2)将A5(0.38g，0.62mmol)溶解在2mL二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加三氟乙酸(0.71g，6.2mmol)，滴加完毕后，升温至室温并保温反应6h，点板监测反应进程；反应结束后，通过减压蒸馏旋干溶剂，再加入3mL二氯甲烷，继续旋干，重复上述操作5次，直到将三氟乙酸全部旋掉，真空干燥得到0.36g白色固状产物B5，即本实施例中的阳离子脂质化合物，产率为92％，B5的表征结果为：
1H NMR：δ(ppm)5.08(m,1H,-COOCH-),3.39(d,3H,-CH3NH-),3.25(m,2H,-CONHCH2-),2.80(m,4H,CH3NHCH2CH2-,CH3NHCH2CH2-),2.75(m,2H,-CH2CH2NHCH2CH2-,-CHCOO-),1.81(m,2H,-COOCHCH2-),1.25(m,42H,-CH2CH2-,-CH2CH3),0.88(t,6H,CH3CH2-)
HR-MS：[M+H]+：511.4821
实验例
1、LNP的制备：
分别称取实施例1～2所制备的阳离子脂质化合物B1和B2(0.0025mmol)与DOPE(0.005mmol)加入到10mL磨口圆底试管中，加入1.5mL无水氯仿溶解，利用旋转蒸发仪(12r/min)在室温下缓慢旋干溶剂，得到贴于试管壁的薄膜，真空干燥过夜；加入2.5mL超纯水，70℃水浴下加热30min，使脂质体膜脱落，旋涡混匀，冰浴条件下用超声粉碎机粉碎10min，得到1mmol/L的LNP溶液，在4℃冰箱中保存备用。
分别称取实施例3～5所制备的阳离子脂质分子B3、B4和B5(0.0025mmol)与DOPE(0.0025mmol)加入到10mL磨口圆底试管中，加入1.5mL无水氯仿溶解，利用旋转蒸发仪(12r/min)在室温下缓慢旋干溶剂，得到贴于试管壁的薄膜，真空干燥过夜；加入2.5mL超纯水，70℃水浴下加热30min，使脂质体膜脱落，旋涡混匀，冰浴条件下用超声粉碎机粉碎10min，得到1mmol/L的LNP溶液，在4℃冰箱中保存备用。
2、考察LNP/质粒复合物的基因递送性能
为了考察以上应用例所得LNP(B1、B2、B3、B4、B5)基因递送的性能，对其进行如下检测：
(1)LNP的粒径和Zeta电位
取20μL制备得到的LNP溶液(1mmol/L)，用超纯水稀释至浓度为20nml/mL，溶液总体积为1mL，吹打混合均匀；用纳米粒度及电位分析仪ZEN 3600(Malvern Inc公司生产)测量粒径和Zeta电位，结果如图2所示，其中图2A为LNP的粒径，图2B为LNP的Zeta电位。从图中可以看出，B1、B2、B3、B4、B5的粒径都在100～200nm之间，电位显正电性，分布在在20～50mV之间，初步判定这些性质符合基因载体的要求，可以与DNA结合。
(2)LNP/pUC-19质粒复合物的凝胶电泳实验
将制备得到的LNP溶液(1mmol/L)与pUC-19质粒(0.5mg/mL)按N/P为0、1、2、4、6分别混合均匀，然后用超纯水稀释使pUC-19质粒的浓度为12.5μg/mL，溶液总体积为20μL，吹打混合均匀；室温孵化30min得到LNP和pUC-19质粒复合物。
将1.2g琼脂糖(美国Amor公司生产)加入到250mL锥形瓶中，再加120mL TAE缓冲液(由分析纯化学试剂配制)，加热使琼脂糖颗粒完全溶解，得无色透明液体。冷却至50℃～60℃，加入2.5μL GelRed核酸染料，混匀后缓慢倒入带有梳子并事先调节为水平的制胶槽中。室温静置，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子得到1％的琼脂糖凝胶。将准备好的不同氮磷比的LNP/pUC-19质粒复合物加入凝胶上的槽孔中，pUC-19质粒作为空白对照(0.125μg)，每孔加入2.5μL10×loading buffer(上海拜力生物科技有限公司)用于固定材料。然后将带有凝胶的制胶槽放入电泳槽中，加入TEA缓冲液，缓冲液的量没过胶面1mm，盖上电泳槽，室温(25℃)下150V电压电泳约15min后停止，取出凝胶在凝胶成像系统GelDoc 2000(美国BIO-RAD公司生产)中曝光后采集图片，结果如图3所示。从图中可以看出，B1和B2在N/P＝2时完全阻滞DNA，B3、B4、B5在N/P＝4时完全阻滞DNA。LNP都在较小的氮磷比下实现DNA的包裹，具有良好的结合质粒的能力，具有基因递送的潜力。
(3)B1/pGL-3质粒复合物和B2/pGL-3质粒复合物的细胞毒性实验
将HepG 2细胞接种在96孔板(美国Corning公司生产)中，密度为104个/孔，培养在100μL DMEM完全培养基中，培养基中含有10％的小牛血清(FBS)和1％的双抗(青霉素+链霉素，10000U/mL)，置于培养箱(法国JOUAN公司生产)中37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长密度达到70～80％。
制备得到的LNP溶液(B1和B2)(1mmol/L)与pGL-3质粒(1mg/mL)按N/P为1、2、4、6、8、10分别混合均匀，然后用opti-MEM培养基稀释使pGl-3质粒的浓度为4μg/mL，总体积为50μL，每个比例设置5个平行复孔。采用不含LNP的pGL-3质粒作为空白对照，Lipo 2000/pGL-3质粒复合物作为阳性对照。室温孵化30min得到LNP/pUC-19质粒复合物。
弃去孔内原有培养基，在每孔中加入50μL DMEM完全培养基，分别加入预先制备好的LNP/pGL-3质粒复合物溶液50μL，在37℃、5％ CO2条件下继续培养24h后，移除旧培养基，再向每孔加入100μL无血清无抗生素DMEM培养基(含10μL CCK-8溶液)孵育30min，在吸收波长450nm处用酶标仪(美国Bio-RAD公司生产)测定溶液吸光值。细胞的相对存活率公式如下：
细胞存活率(％)＝(OD450样品/OD450空白对照)×100％
其中，OD为5个平行样所测得的平均值。
检测结果如图4所示。从图中可以看出，B1、B2转染24h后的细胞存活率基本可达75％以上，而市售的Lipo 2000在达到最佳转染效率的氮磷比时细胞存活率只有57％，B1、B2比市售的Lipo 2000的细胞毒性更低，具有潜在开发价值。
(4)B3/pGL-3质粒复合物、B4/pGL-3质粒复合物和B5/pGL-3质粒复合物的细胞毒性实验
将A549细胞接种在96孔板(美国Corning公司生产)中，密度为104个/孔，培养在100μL 1640完全培养基中，培养基中含有10％的小牛血清(FBS)和1％的双抗(青霉素+链霉素，10000U/mL)，置于培养箱(法国JOUAN公司生产)中37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长密度达到70～80％。
制备得到的LNP溶液(B3、B4、B5)(1mmol/L)与pGL-3质粒(1mg/mL)按N/P为1、2、4、6、8、10分别混合均匀，然后用opti-MEM培养基稀释使pGl-3质粒的浓度为4μg/mL，总体积为50μL，每个比例设置5个平行复孔。采用不含LNP的pGL-3质粒作为空白对照，Lipo 2000/pGL-3质粒复合物作为阳性对照。室温孵化30min得到LNP/pUC-19质粒复合物。
弃去孔内原有培养基，在每孔中加入50μL 1640完全培养基，分别加入预先制备好的LNP/pGL-3质粒复合物溶液50μL，在37℃、5％ CO2条件下继续培养24h后，移除旧培养基，再向每孔加入100μL无血清无抗生素1640培养基(含10μL CCK-8溶液)孵育30min，在吸收波长450nm处用酶标仪(美国Bio-RAD公司生产)测定溶液吸光值。细胞的相对存活率公式如下：
细胞存活率(％)＝(OD450样品/OD450空白对照)×100％
其中，OD为5个平行样所测得的平均值。
检测结果如图5所示。从中可以看出，B3、B5转染24h后的细胞存活率基本可达95％以上，B4转染24h后的细胞存活率可以达到60％。而市售的Lipo 2000在达到最佳转染效率的氮磷比时细胞存活率约91％，B3、B5比Lipo 2000的细胞毒性低，具有更好的开发价值。
(5)B1/pEGFP-N1质粒复合物和B2/pEGFP-N1质粒复合物的体外定性转染实验
将HepG 2细胞接种在48孔板(美国Corning公司生产)中，密度为5×104个/孔，培养在250μL DMEM完全培养基中，培养基中含有10％的小牛血清(FBS)和1％的双抗(青霉素+链霉素，10000U/mL)，置于培养箱(法国JOUAN公司生产)中37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长密度达到70～80％。
制备得到的LNP溶液(B1、B2)(1mmol/L)与pEGFP-N1质粒(1mg/mL)按N/P为1、2、4、6、8、10分别混合均匀，然后用opti-MEM培养基稀释使pEGFP-N1质粒的浓度为8μg/mL，总体积为50μL。Lipo 2000/pEGFP-N1质粒复合物作为阳性对照。室温孵化30min得到LNP/pEGFP-N1质粒复合物。
弃去孔内原有培养基，在每孔中加入200μL有/无血清的DMEM完全培养基，分别加入预先制备好的LNP/pEGFP-N1质粒复合物溶液50μL，在37℃、5％CO2条件下继续培养4h后，移除旧培养基，再向每孔加入250μL DMEM有血清培养基，在培养箱中继续培养20h。其后取出细胞板在倒置荧光显微镜(日本Olympus公司生产)下观察pEGFP蛋白的表达情况，并采图，结果如图6所示。从图中可以看出，B1和B2在HepG细胞中存在一定的转染，但转染效果较Lipo2000低一些。
(6)B3/pEGFP-N1质粒复合物、B4/pEGFP-N1质粒复合物和B5/pEGFP-N1质粒复合物的体外转染实验：
将A549细胞接种在48孔板(美国Corning公司生产)中，密度为5×104个/孔，培养在250μL 1640完全培养基中，培养基中含有10％的小牛血清(FBS)和1％的双抗(青霉素+链霉素，10000U/mL)，置于培养箱(法国JOUAN公司生产)中37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长密度达到70～80％。
制备得到的LNP溶液(B3、B4、B5)(1mmol/L)与pEGFP-N1质粒(1mg/mL)按N/P为1、2、4、6、8、10分别混合均匀，然后用opti-MEM培养基稀释使pEGFP-N1质粒的浓度为8μg/mL，总体积为50μL。Lipo 2000/pEGFP-N1质粒复合物作为阳性对照。室温孵化30min得到LNP/pEGFP-N1质粒复合物。
弃去孔内原有培养基，在每孔中加入200μL有/无血清的1640完全培养基，分别加入预先制备好的LNP/pEGFP-N1质粒复合物溶液50μL，在37℃、5％ CO2条件下继续培养4h后，移除旧培养基，再向每孔加入250μL 1640有血清培养基，在培养箱中继续培养20h。其后取出细胞板在倒置荧光显微镜(日本Olympus公司生产)下观察pEGFP蛋白的表达情况，并采图，结果如图7所示。从图中可以看出，B3、B4、B5在A549中都有较好的转染效果，且比Lipo2000的转染效果更好。
(7)B1/pGL-3质粒复合物和B2/pGL-3质粒复合物的体外定量转染实验
将HepG 2细胞接种在48孔板(美国Corning公司生产)中，密度为5×104个/孔，培养在250μL DMEM完全培养基中，培养基中含有10％的小牛血清(FBS)和1％的双抗(青霉素+链霉素，10000U/mL)，置于培养箱(法国JOUAN公司生产)中37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长密度达到70～80％。
制备得到的LNP溶液(B1、B2)(1mmol/L)与pGL-3质粒(1mg/mL)按N/P为1、2、4、6、8、10分别混合均匀，然后用opti-MEM培养基稀释使pGL-3质粒的浓度为8μg/mL，总体积为50μL。每个比例设置3个平行复孔。Lipo2000/pGL-3质粒复合物作为阳性对照。室温孵化30min得到LNP/pGL-3质粒复合物。
弃去孔内原有培养基，在每孔中加入200μL有/无血清的DMEM完全培养基，分别加入预先制备好的LNP/pGL-3质粒复合物溶液50μL，在37℃、5％ CO2条件下继续培养4h后，移除旧培养基，再向每孔加入250μL DMEM有血清培养基，在培养箱中继续培养20h。吸掉培养基，每孔都用200μL预先冷却的PBS缓冲溶液洗涤两次(1×)，按照荧光素酶试剂盒生产商(promega)提供的方法，将60μL(浓度为1×)的细胞裂解液加入细胞中，室温下裂解30min后将细胞裂解物转移至1.5mLEP管中，12000转/min离心10min，取20μL上清液到96孔板中。然后加入100μL荧光素酶底物使它们发生复合作用，用酶标仪测(美国Thermo公司生产)荧光活性，裂解液的蛋白浓度用Thermo Modified Lowry Protein Assay(Thermo，Rockford，IL，USA)测定，转染效率用相对荧光活性(RLU)/mg蛋白表达，即RLU/mg protein，转染结果是三次平行实验的平均值。
结果如图8所示。从图中可以看出，B1和B2虽然转染效果较Lipo 2000差一些，但已经达到107，具有临床应用的可能性。
(8)B3/pGL-3质粒复合物、B4/pGL-3质粒复合物和B5/pGL-3质粒复合物的体外定量转染实验
将A549细胞接种在48孔板(美国Corning公司生产)中，密度为5×104个/孔，培养在250μL1640完全培养基中，培养基中含有10％的小牛血清(FBS)和1％的双抗(青霉素+链霉素，10000U/mL)，置于培养箱(法国JOUAN公司生产)中37℃、5％CO2条件下孵育24h，使细胞生长密度达到70～80％。
制备得到的LNP溶液(B3、B4、B5)(1mmol/L)与pGL-3质粒(1mg/mL)按N/P为1、2、4、6、8、10分别混合均匀，然后用opti-MEM培养基稀释使pGL-3质粒的浓度为8μg/mL，总体积为50μL。每个比例设置3个平行复孔。Lipo2000/pGL-3质粒复合物作为阳性对照。室温孵化30min得到LNP/pGL-3质粒复合物。
弃去孔内原有培养基，在每孔中加入200μL有/无血清的1640完全培养基，分别加入预先制备好的LNP/pGL-3质粒复合物溶液50μL，在37℃、5％ CO2条件下继续培养4h后，移除旧培养基，再向每孔加入250μL 1640有血清培养基，在培养箱中继续培养20h。吸掉培养基，每孔都用200μL预先冷却的PBS缓冲溶液洗涤两次(1×)，按照荧光素酶试剂盒生产商(promega)提供的方法，将60μL(浓度为1×)的细胞裂解液加入细胞中，室温下裂解30min后将细胞裂解物转移至1.5mLEP管中，12000转/min离心10min，取20μL上清液到96孔板中。然后加入100μL荧光素酶底物使它们发生复合作用，用酶标仪(美国Thermo公司生产)测荧光活性，裂解液的蛋白浓度用Thermo Modified Lowry Protein Assay(Thermo，Rockford，IL，USA)测定，转染效率用相对荧光活性(RLU)/mg蛋白表达，即RLU/mg protein，转染结果是三次平行实验的平均值。
结果如图9所示。从图中可以看出，B3、B4和B5在A549中的转染效果在有/无血清条件下都达到了Lipo 2000的10～20倍，转染效果优于Lipo 2000，具有临床应用的可能性。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物的结构式如式I所示，
其中，R1为氮杂环基或胺基，R2为取代苯基或直链烷基；R3为直链烃基。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于：所述氮杂环基为哌啶基或吡咯烷基，所述胺基为N-甲基乙胺基；所述取代苯基为硝基取代的苯基；所述直链烷基为正十三烷基；所述直链烃基为正十二烷基或油烯基。
3.根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物为如下化合物中的一种：
4.权利要求1～3任一项所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将酸、醛和异腈共溶于第一有机溶剂中，于40～50℃下反应16～32h，然后去除溶剂并纯化，得到产物A；
所述酸为如下酸中的一种：
所述醛为如下醛中的一种：
所述异腈为如下异腈中的一种：
S2：将产物A溶解在第二有机溶剂中，在冰浴条件下加入三氟乙酸，然后升温至室温，并保温反应5～8h；再旋干溶剂并去除三氟乙酸，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述酸、醛和异腈的摩尔比为1:1:1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述第一有机溶剂为四氢呋喃；所述第二有机溶剂为二氯甲烷。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：S1中纯化方式为柱层析，柱层析所用洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯按3:1的体积比混合得到。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S2中去除三氟乙酸的方法为：将旋干溶剂后的物质溶于第二有机溶剂中，再旋干；重复上述操作4～6次。
9.权利要求1～3任一项所述的阳离子脂质化合物在制备基因载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基因载体经过以下步骤制得：将阳离子脂质化合物与DOPE按1:1～2的摩尔比加入反应容器中，并用无水氯仿溶解，然后旋干溶剂，得到贴于反应容器侧壁的薄膜，真空干燥过夜；再向反应容器中加入超纯水，于70℃下加热30min，使薄膜脱落，随后冰浴下粉碎，得基因载体溶液。
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