CN116930298B - 用于检测hiv的电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种用于检测HIV的电化学生物传感器及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域。生物传感器包括微流控芯片和固定在微流控芯片中的多个生物荧光探针，其中，微流控芯片包括进样单元、免疫反应单元和出样单元，进样单元包括进样口、多个进样通道和多个进样阀，免疫反应单元包括多个储液槽、多个基片和多个检测元件，进样口和各进样阀分别通过各进样通道与免疫反应单元连接，出样单元包括多个出样阀、多个出样通道和废液池，各出样阀和废液池分别通过各出样通道与免疫反应单元连接；各生物荧光探针分别结合有不同的HIV生物标志物分子，各生物荧光探针分别固定在各基片上。本申请解决了现有HIV检测方法的窗口期较长的技术问题。

Description

用于检测HIV的电化学生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测HIV的电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征，是一种由人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus，HIV）引起的危害性极大的传染病。人类免疫缺陷病毒首先侵入人体的淋巴细胞进行大量繁殖，使之失去识别外来抗原的能力。
常规的人类免疫缺陷病毒的检测方法有：特异性抗体检测和抗原抗体检测，但这两种方式的窗口期较长，通常需要3-12周，在此期间HIV具有极强的传染性。
上述内容仅用于辅助理解本申请的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器及其制备方法和应用，旨在解决现有HIV检测方法窗口期较长的技术问题。
为实现上述目的，本申请提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器包括：
微流控芯片，所述微流控芯片包括进样单元、免疫反应单元和出样单元，所述进样单元包括进样口、多个进样通道和多个进样阀，所述免疫反应单元包括多个储液槽、多个基片和多个检测元件，所述进样口和各所述进样阀分别通过各所述进样通道与所述免疫反应单元连接，所述出样单元包括多个出样阀、多个出样通道和废液池，各所述出样阀和所述废液池分别通过各所述出样通道与所述免疫反应单元连接；
多个生物荧光探针，各所述生物荧光探针分别结合有不同的HIV生物标志物分子，所述生物荧光探针的示踪标记物为二硫化钼量子点，各所述生物荧光探针分别固定在各所述基片上。
可选地，所述生物荧光探针包括第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针，所述第一荧光探针的HIV生物标志物分子为特异性抗原HIV-DET-Ag1，所述第二荧光探针的HIV生物标志物分子为特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1，所述第三荧光探针的HIV生物标志物分子为HIV-核酸适配体，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列。
本申请还提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，用于制备如上述的用于检测HIV的电化学生物传感器，所述制备方法包括以下步骤：
向微流控芯片的储液槽中分别注入磁性四氧化三铁吡咯溶液，在常温下孵化1.5-3 h，并向所述储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，其中，所述储液槽包括：第一储液槽、第二储液槽和第三储液槽；
向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中分别注入10 μL 5 µg/mL捕获抗原HIV-Ag1、10 μL 5 µg/mL捕获抗体HIV-Ab1和10 μL 0.5-5 mg/mL第三荧光探针，在常温下孵化1.5-3 h，并向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中分别注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中注入10 μL 5 %牛血清白蛋白，用以封闭非特异性活性位点，在常温下孵化1.5-3 h，并分别向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤；
将10-20μL不同浓度的HIV标准溶液或未知浓度的HIV血清样本分别注入所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽，在常温下孵化0.5-1 h，并分别向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽和所述第二储液槽中注入10 μL 0.5-5 mg/mL第一荧光探针和10 μL 0.5-5 mg/mL第二荧光探针，在常温下孵化1.5-3 h，并分别向所述第一储液槽和所述第二储液槽中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤，制得电化学生物传感器，其中，所述第一荧光探针、所述第二荧光探针和所述第三荧光探针的示踪标记物为二硫化钼量子点。
可选地，所述磁性四氧化三铁吡咯溶液的浓度为10 mg/mL，注入量为10 μL。
可选地，所述第一荧光探针的制备方法包括：
将特异性抗原HIV-DET-Ag1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5mg/mL的HIV-DET-Ag1-1溶液；
向1-2 mL所述HIV-DET-Ag1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第一荧光探针。
可选地，所述第二荧光探针的制备方法包括：
将特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5 mg/mL的HIV-DET-P24-Ab1-1溶液；
向1-2 mL所述HIV-DET-P24-Ab1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第二荧光探针。
可选地，所述第三荧光探针的制备方法包括：
将HIV-核酸适配体和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5 mg/mL的HIV-核酸适配体-1溶液，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列；
向1-2 mL所述HIV-核酸适配体-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第三荧光探针溶液。
可选地，所述二硫化钼量子点的制备方法包括：
将0.01-0.05 g 二硫化钼晶体加入10-50 mL N-甲基吡咯烷酮中，在40-50 ℃温度下，超声时间30-120 min，超声功率150-250 W，进行超声分散，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液；
将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液倒入反应釜中，在温度100-200 ℃下反应50-200 min，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液；
待所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液恢复常温后，以5500-6000 r/min离心速度进行35 min离心，并取二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液；
将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液依次通过孔径3-7 μm和孔径0.2-0.7 μm的双层滤膜，得到二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液；
使用氮吹仪，在温度30-45 ℃，时间25-35 min将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液吹干，制得所述二硫化钼量子点。
可选地，所述磁性四氧化三铁吡咯溶液的制备方法包括：
将1.35 g六水三氯化铁、3.6 g醋酸钠和1 g聚乙二醇倒入50 mL乙二醇中，搅拌50-70 min使之完全溶解，制得混合液A；
将所述混合液A倒入反应釜中，在250 ℃温度下反应6 h；
待反应产物冷却至常温后，用去离子水冲洗后干燥，制得四氧化三铁纳米粒子；
通过超声将0.2-0.4 g所述四氧化三铁纳米粒子分散到30-50mL蒸馏水中制得溶液A；
将1-3 mL吡咯和2-5 mL浓度为6 mol/L的盐酸加入10 mL乙醇溶液中，制得溶液B；
将所述溶液A和所述溶液B混合，并在超声2-4 h后，用去离子水冲洗后干燥，并复溶得到磁性四氧化三铁吡咯溶液。
本申请还提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器的应用，所述用于检测HIV的电化学生物传感器为如上述的用于检测HIV的电化学生物传感器，所述用于检测HIV的电化学生物传感器在制备检测HIV的试剂盒中的应用。
本申请公开了一种用于检测HIV的电化学生物传感器，包括：微流控芯片和固定在所述微流控芯片中多个生物荧光探针；所述微流控芯片包括进样单元、免疫反应单元和出样单元，所述进样单元包括进样口、多个进样通道和多个进样阀，所述免疫反应单元包括多个储液槽、多个基片和多个检测元件，所述进样口和各所述进样阀分别通过各所述进样通道与所述免疫反应单元连接，所述出样单元包括多个出样阀、多个出样通道和废液池，各所述出样阀和所述废液池分别通过各所述出样通道与所述免疫反应单元连接；微流控芯片具有微型化、集成化、便携、灵敏等特点，能够将反应、分离、检测等操作集成到一块微米尺寸的芯片上，自动完成分析过程；通过微流控芯片的设置使得HIV检测时对样品需求大幅减少，并且能够减少人为干扰，防止污染，实现自动高效的重复实验，提升HIV的检测速度；进一步的在微流控芯片中固定有多个有生物荧光探针，各所述生物荧光探针分别结合有不同的HIV生物标志物分子，并以二硫化钼量子点作为示踪标记物；由于电化学生物传感器中设置有多个结合有不同的HIV生物标志物分子的生物荧光探针，进而使得电化学生物传感器可以实现针对HIV的抗原、抗体和核酸中的一种和多种进行检测，实现将多种HIV检测方法的结合，既能有效缩短窗口期，利用新型技术与材料将检测价格降低，并且使得检测结果能够综合互补，使结果更具有参考性；并且，使用二硫化钼量子点作为失踪标记物，使得电化学生物传感器具备更高的检测灵敏度和更低的检测限度。
附图说明
图1为本申请实施例方案涉及的电化学生物传感器的结构示意图；
图2为本申请实施例方案涉及的孵化时间对电化学生物传感器灵敏度影响的趋势示意图；
图3为生物荧光探针浓度对电化学生物传感器灵敏度影响的趋势示意图；
图4为pH对电化学生物传感器灵敏度影响的趋势示意图；
图5为电化学生物传感器中第一荧光探针对应的检测标准曲线示意图；
图6为电化学生物传感器中第二荧光探针对应的检测标准曲线示意图；
图7为电化学生物传感器中第三荧光探针对应的检测标准曲线示意图。
附图标号说明：
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本申请要求的保护范围之内。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
常规的HIV病毒的检测方法有：特异性抗体检测和抗原抗体检测，但这两种方式的窗口期较长，通常需要3-12周，在此期间HIV具有极强的传染性。另一种方法是核酸检测，窗口期1-4周，但此方法通常需要由实验室进行专业设备检测，成本高昂且检测地点局限。因此建立一种能够快速、便携的检测HIV病毒的方法尤为迫切。
鉴于此，本申请提出一种用于检测HIV的电化学生物传感器，包括：微流控芯片和固定在微流控芯片中多个生物荧光探针；微流控芯片包括进样单元100、免疫反应单元200和出样单元300，进样单元100包括进样口101、多个进样通道和多个进样阀，免疫反应单元200包括多个储液槽、多个基片和多个检测元件，进样口101和各进样阀分别通过各进样通道与免疫反应单元200连接，出样单元300包括多个出样阀、多个出样通道和废液池307，各出样阀和废液池307分别通过各出样通道与免疫反应单元200连接；微流控芯片具有微型化、集成化、便携、灵敏等特点，能够将反应、分离、检测等操作集成到一块微米尺寸的芯片上，自动完成分析过程；通过微流控芯片的设置使得HIV检测时对样品需求大幅减少，并且能够减少人为干扰，防止污染，实现自动高效的重复实验，提升HIV的检测速度；进一步的在微流控芯片中固定有多个有生物荧光探针，各生物荧光探针分别结合有不同的HIV生物标志物分子，并以二硫化钼量子点作为示踪标记物；由于电化学生物传感器中设置有多个结合有不同的HIV生物标志物分子的生物荧光探针，进而使得电化学生物传感器可以实现针对HIV的抗原、抗体和核酸中的一种和多种进行检测，实现将多种HIV检测方法的结合，既能有效缩短窗口期，利用新型技术与材料将检测价格降低，并且使得检测结果能够综合互补，使结果更具有参考性；并且，使用二硫化钼量子点作为失踪标记物，使得电化学生物传感器具备更高的检测灵敏度和更低的检测限度。
本申请实施例第一方面提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器，参照图1，图1为本申请实施例方案涉及的生物传感器结构示意图，生物传感器包括：微流控芯片和多个生物荧光探针（附图未示出）。
所述微流控芯片包括进样单元100、免疫反应单元200和出样单元300；进样单元100用于待检验样品的进入，使待检验样品进入免疫反应单元200以进行免疫反应从而检测HIV病毒；进样单元100包括：进样口101、第一进样通道105、第二进样通道106、第三进样通道107、第一进样阀102、第二进样阀103和第三进样阀104；其中，第一进样阀102、第二进样阀103和第三进样阀104为一种控制阀，分别设置在第一进样通道105、第二进样通道106和第三进样通道107中，以控制待检测样品的流入；进样口101分别与第一进样通道105、第二进样通道106和第三进样通道107连通；当待检测样品进入进样口101后，分别流入第一进样通道105、第二进样通道106和第三进样通道107，从而流入免疫反应单元200以实现对待检测样品的三重检测。
免疫反应单元200用于免疫反应孵化，包括：第一储液槽201、第二储液槽202、第三储液槽203、第一基片207、第二基片208、第三基片209、第一检测元件204、第二检测元件205和第三检测元件206；在各储液槽内待检测样品流经方向依次设置检测元件和基片，其中，第一基片207和第一检测元件204均设置于第一储液槽201内，第二基片208和第二检测元件205均设置于第二储液槽202内，第三基片209和第三检测元件206均设置于第三储液槽203内；第一基片207、第二基片208和第三基片209下方分别设置有一磁铁，用于吸附磁性四氧化三铁吡咯，使磁性四氧化三铁吡咯附着于各基片上，从而与生物荧光探针形成夹心型检测物；基片的材料可以为：硅片、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯中的一种或多种；检测元件用于待检测液体与生物荧光探针反应后所产生的免疫反应信号，并将免疫反应信号转化为电信号后输出，以显示检测结果；其中，检测元件可以为电极单元，电极单元可以为双电极单元或三电极单元，本实施例对此不加以限制。
出样单元300用于将反应后的待检测样品和/或过量的待检测样品排出免疫反应单元200；包括：第一出样阀301、第二出样阀302302、第三出样阀303、第一出样通道304、第二出样通道305、第三出样通道306和废液池307；第一出样阀301、第二出样阀302302和第三出样阀303分别设置于第一出样通道304、第二出样通道305和第三出样通道306中，并与废液池307连通；废液池307用于存储检测废液，以避免废液随意流出造成污染。
在本申请中，微流控芯片具有微型化、集成化、便携、灵敏等特点，能够将反应、分离、检测等操作集成到一块微米尺寸的芯片上，自动完成分析过程；对样品需求微量，能够减少人为干扰，防止污染，实现自动高效的重复实验。
进一步地，生物传感器还包括多个生物荧光探针；各所述生物荧光探针分别结合有不同的HIV生物标志物分子，所述生物荧光探针的示踪标记物为二硫化钼量子点，各所述生物荧光探针分别固定在各所述基片上。
生物荧光探针是在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质可随所处环境的性质改变而灵敏地改变的一类荧光性分子，包括：生物标志物和示踪标记物。
进一步地，生物荧光探针包括第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针；其中，三种生物荧光探针的示踪标记物均为二硫化钼量子点；二硫化钼量子点具有原子共价堆叠层的典型层状结构，层和层之间由范德华力相互作用结合在一起；二硫化钼量子点在剥离为单层-双层结构时，荧光效率由层数减少而增大，但考虑到结构稳定性与荧光效能，本申请采用双层结构，其颜色为淡蓝色，晶粒尺寸小于10 nm，激发波长365 nm，发射波长450 nm，具有良好的生物兼容性、水溶性和荧光特性，相较于常规胶体金，二硫化钼量子点制备的荧光探针选择性更高、灵敏度更强检验限度更广。
进一步地，所述第一荧光探针的HIV生物标志物分子为特异性抗原HIV-DET-Ag1，所述第二荧光探针的HIV生物标志物分子为特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1，所述第三荧光探针的HIV生物标志物分子为HIV-核酸适配体，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列；第一荧光探针设置于第一储液槽201的第一基片207上，用于检测样品中是否含有HIV抗体，能够快速检测感染后3-12周内，样品中HIV抗体状况；第二荧光探针设置于第二储液槽202的第二基片208上，用于检测样品中是否含有HIV抗原，能够快速检测感染后3-6周内，样品中HIV抗原状况；第三荧光探针设置于第三储液槽203的第三基片209上，用于检测样品中是否含有HIV核酸，能够快速检测感染后1-4周内，样品中HIV核酸状况；第三荧光探针中的HIV-核酸适配体是短的单链寡核苷酸，其序列可以以高亲和力特异性结合多种靶分子，从而实现对HIV病毒的直接检测。
在本申请中，通过分别将特异性抗原HIV-DET-Ag1、特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1和HIV-核酸适配体作为生物标志物分子，结合在以二硫化钼量子点为示踪标记物的生物荧光探针上，实现将多种HIV检测方法的结合，既能有效缩短窗口期，利用新型技术与材料将检测价格降低，并且使得检测结果能够综合互补，使结果更具有参考性。
本领域技术人员可以理解，图1中示出的结构并不构成对电化学生物传感器的限定，可以包括比图示更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者不同的部件布置。
本申请实施例电化学生物传感器可通过以下实施例方法制得。
本申请实施例第二方面提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10，向微流控芯片的储液槽中分别注入磁性四氧化三铁吡咯溶液，在常温下孵化1.5-3 h，并向所述储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，其中，所述储液槽包括：第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203；
可选地，所述磁性四氧化三铁吡咯溶液的浓度为10 mg/mL，注入量为10 μL。
步骤S20，向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中分别注入10 μL 5 µg/mL捕获抗原HIV-Ag1、10 μL 5 µg/mL捕获抗体HIV-Ab1和10 μL 0.5-5mg/mL第三荧光探针，在常温下孵化1.5-3 h，并向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中分别注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
步骤S30，分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入10 μL 5 %牛血清白蛋白，用以封闭非特异性活性位点，在常温下孵化1.5-3 h，并分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤；
步骤S40，将10-20μL不同浓度的HIV标准溶液或未知浓度的HIV血清样本分别注入所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203，在常温下孵化0.5-1 h，并分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
步骤S50，分别向所述第一储液槽201和所述第二储液槽202中注入10 μL 0.5-5mg/mL第一荧光探针和10 μL 0.5-5 mg/mL第二荧光探针，在常温下孵化1.5-3 h，并分别向所述第一储液槽201和所述第二储液槽202中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤，制得电化学生物传感器，其中，所述第一荧光探针、所述第二荧光探针和所述第三荧光探针的示踪标记物为二硫化钼量子点。
在本申请中，通过分别向第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203中加入磁性四氧化三铁吡咯溶液并孵化，使具有磁性的磁性四氧化三铁吡咯分子能够固定于各储液槽中的基片上形成磁性四氧化三铁吡洛基底；进而分别向第一储液槽201和第二储液槽202中加入捕获抗原HIV-Ag1和捕获抗体HIV-Ab1，使其分别与第一荧光探针和第二荧光探针形成夹心型HIV检测物质，并加入牛血清白蛋白以封闭非特异性活性位点；进而将10-20μL不同浓度的HIV标准溶液，或未知浓度的HIV血清样本分别注入第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203，在常温下孵化0.5-1 h；进而分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；最后将第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针加入各储液槽中，以制备用于检测HIV的电化学生物传感器。
进一步地，所述第一荧光探针的制备方法包括：
步骤A10，将特异性抗原HIV-DET-Ag1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5 mg/mL的HIV-DET-Ag1-1溶液；
步骤A20，向1-2 mL所述HIV-DET-Ag1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第一荧光探针。
在本申请中通过将特异性抗原HIV-DET-Ag1与二硫化钼量子点结合，制备了用于检测HIV抗体的第一荧光探针溶液，制备过程简单、易操作，适合于大规模生产。
进一步地，所述第二荧光探针的制备方法包括：
步骤B10，将特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5 mg/mL的HIV-DET-P24-Ab1-1溶液；
步骤B20，向1-2 mL所述HIV-DET-P24-Ab1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第二荧光探针。
在本申请中通过将特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1与二硫化钼量子点结合，制备了用于检测HIV抗原的第二荧光探针溶液，制备过程简单、易操作，适合于大规模生产。
进一步地，所述第三荧光探针的制备方法包括：
步骤C10，将HIV-核酸适配体和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5mg/mL的HIV-核酸适配体-1溶液，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列；
步骤C20，向1-2 mL所述HIV-核酸适配体-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第三荧光探针溶液。
在本申请中通过将HIV-核酸适配体与二硫化钼量子点结合，制备了用于检测HIV核酸的第三荧光探针溶液，制备过程简单、易操作，适合于大规模生产。
进一步地，所述二硫化钼量子点溶液的制备方法包括：
步骤D10，将0.01-0.05 g 二硫化钼晶体加入10-50 mL N-甲基吡咯烷酮中，在40-50 ℃温度下，超声时间30-120 min，超声功率150-250 W，进行超声分散，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液；
步骤D20，将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液倒入反应釜中，在温度100-200 ℃下反应50-200 min，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液；
步骤D30，待所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液恢复常温后，以5500-6000 r/min离心速度进行35 min离心，并取二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液；
步骤D40，将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液依次通过孔径3-7 μm和孔径0.2-0.7 μm的双层滤膜，得到二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液；
步骤D50，使用氮吹仪，在温度30-45 ℃，时间25-35 min将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液吹干，制得所述二硫化钼量子点。
在本申请中通过水热合成与液相剥离相结合的方法，制备了二硫化钼量子点，用于作为各生物荧光探针的示踪标记物，制备过程简单、易操作，适合于大规模生产。
进一步地，磁性四氧化三铁吡咯溶液的制备方法包括：
步骤E10，将1.35 g六水三氯化铁、3.6 g醋酸钠和1 g聚乙二醇倒入50 mL乙二醇中，搅拌50-70 min使之完全溶解，制得混合液A；
步骤E20，将所述混合液A倒入反应釜中，在250 ℃温度下反应6 h；
步骤E30，待反应产物冷却至常温后，用去离子水冲洗后干燥，制得四氧化三铁纳米粒子；
步骤E40，通过超声将0.2-0.4 g所述四氧化三铁纳米粒子分散到30-50mL蒸馏水中制得溶液A；
步骤E50，将1-3 mL吡咯和2-5 mL浓度为6 mol/L的盐酸加入10 mL乙醇溶液中，制得溶液B；
步骤E60，将所述溶液A和所述溶液B混合，并在超声2-4 h后，用去离子水冲洗后干燥，并复溶得到磁性四氧化三铁吡咯溶液。
在本申请中制备了磁性四氧化三铁吡咯溶液，以在电化学生物传感器中生成夹心型HIV检测物质，制备过程简单、易操作，适合于大规模生产。
本申请实施例第三方面提供一种用于检测HIV的电化学生物传感器的应用，包括在制备检测HIV的试剂盒中的应用；实现对HIV的快速、便捷检测，所制备的检查HIV的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、便携、易操作、成本低等特点。
为使本申请上述实施例细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例用于检测HIV的电化学生物传感器及其制备方法和应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
向微流控芯片的储液槽中分别注入10 μL 10 mg/mL磁性四氧化三铁吡咯溶液，在常温下孵化2 h，然后向所述储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，其中，所述储液槽包括：第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203；
向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中分别注入10μL 5 µg/mL捕获抗原HIV-Ag1、10 μL 5 µg/mL捕获抗体HIV-Ab1和10 μL 0.5-5 mg/mL第三荧光探针，在常温下孵化2 h，并向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中分别注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入10μL 5 %牛血清白蛋白，用以封闭非特异性活性位点，在常温下孵化2 h，然后分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤；
将18μL不同浓度的HIV标准溶液分别注入第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203，在常温下孵化0.5-1 h，并分别向第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽201和所述第二储液槽202中注入10 μL 2 mg/mL第一荧光探针和10 μL 2 mg/mL第二荧光探针，在常温温度下孵化2 h，然后分别向所述第一储液槽201和所述第二储液槽202中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，制得电化学生物传感器。
实施例2
向微流控芯片的储液槽中分别注入10 μL 10 mg/mL磁性四氧化三铁吡咯溶液，在常温下孵化2 h，然后向所述储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，其中，所述储液槽包括：第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203；
向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中分别注入10μL 5 µg/mL捕获抗原HIV-Ag1、10 μL 5 µg/mL捕获抗体HIV-Ab1和10 μL 0.5-5 mg/mL第三荧光探针，在常温下孵化2 h，并向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中分别注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入10μL 5 %牛血清白蛋白，用以封闭非特异性活性位点，在常温下孵化2 h，然后分别向所述第一储液槽201、所述第二储液槽202和所述第三储液槽203中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤；
将18μL未知浓度的HIV血清样本分别注入第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203，在常温下孵化0.5-1 h，并分别向第一储液槽201、第二储液槽202和第三储液槽203中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽201和所述第二储液槽202中注入10 μL 2 mg/mL第一荧光探针和10 μL 2 mg/mL第二荧光探针，在常温温度下孵化2 h，然后分别向所述第一储液槽201和所述第二储液槽202中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，制得电化学生物传感器。
实施例3
将特异性抗原HIV-DET-Ag1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度2 mg/mL的HIV-DET-Ag1-1溶液；
向1.5 mL所述HIV-DET-Ag1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌220 min后，以5700 r/min离心速度进行40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第一荧光探针。
实施例4
将特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为2mg/mL的HIV-DET-P24-Ab1-1溶液；
向1.5 mL所述HIV-DET-P24-Ab1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌220 min后，以5700 r/min离心速度进行40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第二荧光探针。
实施例5
将HIV-核酸适配体和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为2 mg/mL的HIV-核酸适配体-1溶液，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列；
向1-2 mL所述HIV-核酸适配体-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌220 min后，以5700 r/min离心速度进行40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第三荧光探针溶液。
实施例6
将0.02 g二硫化钼晶体加入20 mL N-甲基吡咯烷酮中，在45 ℃温度下，超声时间80 min，超声功率200 W，进行超声分散，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液；
将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液倒入反应釜中，在温度150 ℃下反应100 min，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液；
待所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液恢复常温后，在常温下，以5500r/min离心速度进行35 min离心，并取二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液；
将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液依次通过孔径5 μm和孔径0.4 μm的双层滤膜，得到二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液；
使用氮吹仪，在温度35 ℃，时间30 min将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液吹干，制得所述二硫化钼量子点溶液。
实施例7
将1.35 g六水三氯化铁、3.6 g醋酸钠和1 g聚乙二醇倒入50 mL乙二醇中，搅拌60min使之完全溶解，制得混合液A；
将所述混合液A倒入反应釜中，在250 ℃温度下反应6 h；
待反应产物冷却至常温后，用去离子水冲洗后干燥，制得四氧化三铁纳米粒子；
通过超声将0.28 g所述四氧化三铁纳米粒子分散到40 mL蒸馏水中制得溶液A；
将2.4 mL吡咯和2.4 mL浓度为6 mol/L的盐酸加入10 mL乙醇溶液中，制得溶液B；
将所述溶液A和所述溶液B混合，并在超声3 h后，用去离子水冲洗后干燥，并复溶得到10 mg/mL磁性四氧化三铁吡咯溶液。
实施例8
为提高生物传感器的性能，对其核心参数进行测试优化；由于差分脉冲伏安法定量分析灵敏度较高，因此，采用该方法进行分析。
参照图2-4，横坐标的变量为优化参数，包括各生物荧光探针的孵化时间，纵坐标使用差分脉冲峰值电流相应信号的变化值△I与峰值电流I的比值进行表示；△I/I值越高，生物传感器的灵敏度越高。
参照图2，为孵化时间对生物传感器灵敏度影响的趋势示意图，其中，图2（a）为孵化时间对生物传感器中第一荧光探针灵敏度影响的趋势示意图，图2（b）为孵化时间对生物传感器中第二荧光探针灵敏度影响的趋势示意图，图2（c）为孵化时间对生物传感器中第三荧光探针灵敏度影响的趋势示意图；参照图2可知，随着孵化时间增加，△I/I均增加，即灵敏度增加，并均在2 h达到峰值，而后随着孵化时间增加，△I/I变化不明显；因此，生物传感器中各生物荧光探针的最佳孵化时间均为2 h。
参照图3，为生物荧光探针浓度对生物传感器灵敏度影响的趋势示意图，其中，图3（a）为第一荧光探针浓度对生物传感器中第一荧光探针灵敏度影响的趋势示意图，图3（b）为第二荧光探针浓度对生物传感器中第二荧光探针灵敏度影响的趋势示意图，图3（c）为第三荧光探针浓度对生物传感器中第三荧光探针灵敏度影响的趋势示意图；参照图3可知，随着各生物荧光探针浓度的增加，△I/I均增加，即灵敏度增加，并均在2 mg/mL达到峰值，而后随着各生物荧光探针浓度的增加，△I/I呈现下降趋势；因此，生物传感器中各生物荧光探针的最佳浓度均为2 mg/mL。
参照图4，为pH对生物传感器灵敏度影响的趋势示意图，其中，图4（a）为pH对生物传感器中第一荧光探针灵敏度影响的趋势示意图，图4（b）为pH对生物传感器中第二荧光探针灵敏度影响的趋势示意图，图4（c）为pH对生物传感器中第三荧光探针灵敏度影响的趋势示意图；参照图4可知，随着pH的增加，△I/I均无明显变化，因此，生物传感器对pH不做限制。
实施例9
（1）参照图5，为生物传感器中第一荧光探针对应的检测标准曲线，曲线建立步骤包括：
步骤A，使用PH为7.4的0.01M PBS溶液，将HIV抗体标准溶液稀释成不同梯度浓度的HIV抗体标准溶液；
步骤B，将10 µL不同浓度的HIV抗体标准溶液从进样口101注射到各储液槽中，常温孵化40 min，再用PH为7.4的磷酸盐缓冲液充分洗涤；
步骤C，通过软件读取并换算，以获得不同浓度的HIV抗体标准试剂所对应的发光强度数据；
步骤D，将发光强度数据绘制成标准曲线，线性回归方程为：y=0.2133x+15.443，相关系数为0.991，其中，y为发光强度，x为HIV抗体标准溶液的浓度。
（2）生物传感器对不同浓度HIV抗体待测液的测试，其步骤包括：
将不同浓度HIV抗体待测液经步骤B和C进行测定，得到待测样本的发光强度，进而代入步骤D中的线性回归方程中，即得到HIV抗体待测液中的HIV抗体浓度；鉴于安全性考虑，本申请只使用模拟样本进行测试，结果如表1所示：
表1
根据测试结果可知，生物传感器对不同浓度HIV抗体待测液的测试结果准确，且回收率均在90-110%之间，正确率较高。
（3）参照图6，为生物传感器中第二荧光探针对应的检测标准曲线，曲线建立步骤包括：
步骤E，使用PH为7.4的0.01M PBS溶液，将HIV-1 P24抗原标准溶液稀释成不同梯度浓度的HIV抗原标准溶液；
步骤F，将10 µL不同浓度的HIV抗原标准溶液从进样口101注射到各储液槽中，常温孵化40 min，再用PH为7.4的磷酸盐缓冲液充分洗涤；
步骤G，通过软件读取并换算，以获得不同浓度的HIV抗原标准试剂所对应的发光强度数据；
步骤H，将发光强度数据绘制成标准曲线，线性回归方程为：y=0.2176x+19.601，相关系数为0.9871，其中，y为发光强度，x为HIV抗原标准试剂的浓度。
（4）生物传感器对不同浓度HIV抗原待测液的测试，其步骤包括：
将不同浓度HIV抗原待测液经步骤F和G进行测定，得到待测样本的发光强度，进而代入步骤H中的线性回归方程中，即得到HIV抗原待测液中的HIV抗原浓度；鉴于安全性考虑，本申请只使用模拟样本进行测试，结果如表2所示：
表2
根据测试结果可知，生物传感器对不同浓度HIV抗原待测液的测试结果准确，且回收率均在90-110%之间，正确率较高。
（5）参照图7，为生物传感器中第三荧光探针对应的检测标准曲线，曲线建立步骤包括：
步骤I，使用PH为7.4的0.01M PBS溶液，将HIV核酸标准溶液稀释成不同梯度浓度的HIV核酸标准溶液；
步骤J，将10 µL不同浓度的HIV核酸标准溶液从进样口101注射到各储液槽中，常温孵化40 min，再用PH为7.4的磷酸盐缓冲液充分洗涤；
步骤K，通过软件读取并换算，以获得不同浓度的HIV核酸标准试剂所对应的发光强度数据；
步骤L，将发光强度数据绘制成标准曲线，线性回归方程为：y=0.2733x+26.315，相关系数为0.9921，其中，y为发光强度，x为HIV核酸标准试剂的浓度。
（6）生物传感器对不同浓度HIV核酸待测液的测试，其步骤包括：
将不同浓度HIV核酸待测液经步骤J和K进行测定，得到待测样本的发光强度，进而代入步骤L中的线性回归方程中，即得到HIV核酸待测液中的HIV核酸浓度；鉴于安全性考虑，本申请只使用模拟样本进行测试，结果如表3所示：
表3
根据测试结果可知，生物传感器对不同浓度HIV核酸待测液的测试结果准确，且回收率均在90-110%之间，正确率较高。
以上仅为本申请的优选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于检测HIV的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器包括：
微流控芯片，所述微流控芯片包括进样单元、免疫反应单元和出样单元，所述进样单元包括进样口、多个进样通道和多个进样阀，所述免疫反应单元包括多个储液槽、多个基片和多个检测元件，所述进样口和各所述进样阀分别通过各所述进样通道与所述免疫反应单元连接，所述出样单元包括多个出样阀、多个出样通道和废液池，各所述出样阀和所述废液池分别通过各所述出样通道与所述免疫反应单元连接；
多个生物荧光探针，各所述生物荧光探针分别结合有不同的HIV生物标志物分子，所述生物荧光探针的示踪标记物为二硫化钼量子点，各所述生物荧光探针分别固定在各所述基片上；
其中，所述生物荧光探针包括第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针，所述第一荧光探针的HIV生物标志物分子为特异性抗原HIV-DET-Ag1，所述第二荧光探针的HIV生物标志物分子为特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1，所述第三荧光探针的HIV生物标志物分子为HIV-核酸适配体，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
向微流控芯片的储液槽中分别注入磁性四氧化三铁吡咯溶液，在常温下孵化1.5-3 h，并向所述储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤，其中，所述储液槽包括：第一储液槽、第二储液槽和第三储液槽；
向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中分别注入10 μL 5 µg/mL捕获抗原HIV-Ag1、10 μL 5 µg/mL捕获抗体HIV-Ab1和10 μL 0.5-5 mg/mL第三荧光探针，在常温下孵化1.5-3 h，并向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中分别注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中注入10 μL 5 %牛血清白蛋白，用以封闭非特异性活性位点，在常温下孵化1.5-3 h，并分别向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤；
将10-20μL不同浓度的HIV标准溶液或未知浓度的HIV血清样本分别注入所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽，在常温下孵化0.5-1 h，并分别向所述第一储液槽、所述第二储液槽和所述第三储液槽中注入pH为7.4的磷酸盐溶液充分洗涤；
分别向所述第一储液槽和所述第二储液槽中注入10 μL 0.5-5 mg/mL第一荧光探针和10 μL 0.5-5 mg/mL第二荧光探针，在常温下孵化1.5-3 h，并分别向所述第一储液槽和所述第二储液槽中注入pH为7.4的所述磷酸盐溶液充分洗涤，制得电化学生物传感器，其中，所述第一荧光探针、所述第二荧光探针和所述第三荧光探针的示踪标记物为二硫化钼量子点。
3.如权利要求2所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述磁性四氧化三铁吡咯溶液的浓度为10 mg/mL，注入量为10 μL。
4.如权利要求2所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述第一荧光探针的制备方法包括：
将特异性抗原HIV-DET-Ag1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5 mg/mL的HIV-DET-Ag1-1溶液；
向1-2 mL所述HIV-DET-Ag1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第一荧光探针。
5.如权利要求2所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述第二荧光探针的制备方法包括：
将特异性抗体HIV-DET-P24-Ab1和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5mg/mL的HIV-DET-P24-Ab1-1溶液；
向1-2 mL所述HIV-DET-P24-Ab1-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第二荧光探针。
6.如权利要求2所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述第三荧光探针的制备方法包括：
将HIV-核酸适配体和H-PBS缓冲液充分混合，稀释配置成浓度为0.5-5 mg/mL的HIV-核酸适配体-1溶液，其中，所述HIV-核酸适配体具有SEQ ID No .1所示的核苷酸序列；
向1-2 mL所述HIV-核酸适配体-1溶液中加入10 mL二硫化钼量子点溶液，在常温下搅拌120-240 min后，以5500-6000 r/min离心速度进行30-40 min离心，并取离心后的沉淀物复溶，制得第三荧光探针溶液。
7.如权利要求2所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述二硫化钼量子点的制备方法包括：
将0.01-0.05 g 二硫化钼晶体加入10-50 mL N-甲基吡咯烷酮中，在40-50 ℃温度下，超声时间30-120 min，超声功率150-250 W，进行超声分散，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液；
将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮混合溶液倒入反应釜中，在温度100-200 ℃下反应50-200 min，制得二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液；
待所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1混合溶液恢复常温后，以5500-6000 r/min离心速度进行35 min离心，并取二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液；
将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1的上清液依次通过孔径3-7 μm和孔径0.2-0.7μm的双层滤膜，得到二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液；
使用氮吹仪，在温度30-45 ℃，时间25-35 min将所述二硫化钼晶-N-甲基吡咯烷酮-1过滤液吹干，制得所述二硫化钼量子点。
8.如权利要求2所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述磁性四氧化三铁吡咯溶液的制备方法包括：
将1.35 g六水三氯化铁、3.6 g醋酸钠和1 g聚乙二醇倒入50 mL乙二醇中，搅拌50-70min使之完全溶解，制得混合液A；
将所述混合液A倒入反应釜中，在250 ℃温度下反应6 h；
待反应产物冷却至常温后，用去离子水冲洗后干燥，制得四氧化三铁纳米粒子；
通过超声将0.2-0.4 g所述四氧化三铁纳米粒子分散到30-50mL蒸馏水中制得溶液A；
将1-3 mL吡咯和2-5 mL浓度为6 mol/L的盐酸加入10 mL乙醇溶液中，制得溶液B；
将所述溶液A和所述溶液B混合，并在超声2-4 h后，用去离子水冲洗后干燥，并复溶得到磁性四氧化三铁吡咯溶液。
9.一种如权利要求1所述的用于检测HIV的电化学生物传感器的应用，其特征在于，所述应用为所述用于检测HIV的电化学生物传感器在制备检测HIV的试剂盒中的应用。
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