CN116926072B - 一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用 - Google Patents

一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用，在本发明中，转染LncRNA‑OX1的神经干细胞的分化进度会大幅度提前，其突起数量和轴突长度明显高于未转染LncRNA‑OX1神经干细胞，且进一步地，通过敲低神经干细胞中的LncRNA‑OX1，可以有效抑制神经干细胞的突起数量和轴突长度，进而再次证实LncRNA‑OX1在调控神经干细胞分化中起到重要作用，对于保持神经干细胞的未分化状态起着重要的作用。

Description

一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用。
背景技术
神经干细胞是一类具有强大自我更新能力且具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜力的，并能提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞分布在中枢神经系统的很多部位，如嗅球、海马齿状回、纹状体、脑室带、室下带、中脑、脊髓等，其中侧脑室的室壁下层和海马齿状回的颗粒下层被认为是成体内的两个神经干细胞聚集区。神经干细胞具有强大的可塑性且在体外可持续扩增，为治疗众多不可治愈的神经系统疾病带来了希望，如缺血性脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默症等。
在一般情况下，神经干细胞处于静息状态，当受到一定损伤刺激之后，如：缺血，将启动分化过程以修复组织。在此过程中神经干细胞可以迁移并归巢到特定的损伤部位，并不断地调整自身行为。但是神经干细胞的增殖、分化受诸多因素影响，外源性移植的神经干细胞在脑内主要分化为胶质细胞，不能达到预期的修复效果。因此，如何调控神经干细胞在复杂的信号网络调控中实现有序的分化是目前神经干细胞领域的焦点问题。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种抑制神经干细胞诱导分化方法及其应用。
具体而言，本发明首先提供了一种用于调控神经干细胞分化的LncRNA-OX1，其核苷酸序列为：
5'-attgcagccgatcagcagaaaactggagtctggcgatccgacaagagtcttggggatgtagcatacgtggtccggggcagctattccagtgagcgcgaacaacaccctcatgcgaaagtcttttcgcaatagggcctagacgtctggttcaggtatcgacctggagttcatttctaggggctactctagaaggatcaccgaggcctatggtcagctccagcgaacaaagcaaaggcttaacgtatttc-3'。
本发明的目的在于提供一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法。通过对LncRNA-OX1的调控，建立调控神经干细胞分化和抑制分化的方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种神经干细胞分化和抑制分化的调控方法，其特征在于该方法为：将LncRNA-OX1转染神经干细胞，以促进神经干细胞的分化；通过沉默载体siRNA，使LncRNA-OX1的表达显著下调，以抑制神经干细胞分化，以此来调控神经干细胞的分化和抑制分化。
进一步地，本发明还提供了一种促进神经干细胞的分化的方法，包括如下步骤：
1)构建含有所述LncRNA-OX1的重组表达质粒，
2)将步骤1)中的重组表达质粒转染神经干细胞。
优选地，步骤1)中包括扩增LncRNA-OX1的步骤和将LncRNA-OX1与载体LV18(CMV/Puro)连接构建重组表达质粒的步骤。
进一步优选地，步骤1)中用于扩增LncRNA-OX1的上下游引物含有含有SpeI和NotI酶切位点，其序列如下：
LncRNA-OX1-F'：5'-tctACTAGTattgcagccgatca-3'；
LncRNA-OX1-R'：5'-aatGCGGCCGCGaaatacgttaagc-3'。
进一步优选地，步骤1)中扩增LncRNA-OX1的PCR反应体系为总体积25μL，包括：DNA模板2μL，上下游引物各2μL，10×PCR Buffer 5μL，Taq DNA聚合酶2μL，dNTPs 2μL，ddH2O12μL。
进一步优选地，步骤1)中扩增LncRNA-OX1的PCR反应程序为95℃预变性5min；然后94℃变性60s；53℃退火40s；72℃延伸60s。共40个循环。PCR反应完成后，利用琼脂糖电泳并切胶回收目的基因片段。
进一步优选地，步骤1)中还包括采用SpeI和NotI对LncRNA-OX1片段和载体LV18(CMV/Puro)进行酶切，37℃酶切2小时。
进一步优选地，步骤1)中的50μL酶切体系包括：目的基因片段/载体LV18 5μL，10×工具酶缓冲液5μL，SpeI酶5μL，NotI酶5μL，ddH2O30μL。
进一步优选地，步骤1)中还包括采用T4 DNAligase连接酶切得到的目的基因片段和线性化的LV18载体，即可得到重组LncRNA-OX1-LV18载体。
进一步优选地，步骤1)中的连接反应为45℃温育2h，50μL连接体系包括：10×T4DNA连接酶缓冲液5μL，线性化的LV18载体5μL，目的基因片段5μL，T4 DNAligase 5μL，ddH2O30μL。
优选地，步骤2)是采用以阳离子脂质体转染试剂梭华(SofastTM)介导重组质粒DNA的转染。将重组LncRNA-OX1-LV18载体转染未分化rNSCs-12神经干细胞，并连续培养。
进一步地，本发明还提供了一种抑制神经干细胞的分化的方法，包括如下步骤：
a)根据LncRNA-OX1全长基因序列设计siRNA分子；
b)将步骤a)中的siRNA转染到神经干细胞。
优选地，步骤a)中的siRNA分子为siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4，其序列信息如下所示：SiRNA1：5'-aatagctgccccg-3'、SiRNA2：5'-ttgttcgcgctca-3'、SiRNA3：5'-ctaggccctattg-3'、SiRNA4：5'-gagctgaccatag-3'。
进一步优选地，步骤b)是采用RNAiMAXReagent试剂将siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4转染到神经干细胞中。
进一步优选地，所述siRNA转染终浓度为100nM；
进一步优先地，所述神经干细胞为rNSCs-12。
本发明的优点如下：在本领域，突起数量的增加和轴突长度的延长是神经干细胞分化的向导。在本发明中，申请人惊喜地发现，转染LncRNA-OX1的神经干细胞的分化进度会大幅度提前，其突起数量和轴突长度明显高于未转染LncRNA-OX1神经干细胞，且进一步地，通过敲低神经干细胞中的LncRNA-OX1，可以有效抑制神经干细胞的突起数量和轴突长度，进而再次证实LncRNA-OX1在调控神经干细胞分化中起到重要作用，对于保持神经干细胞的未分化状态起着重要的作用。
附图说明
图1为LncRNA-OX1在未分化和分化神经干细胞中的相对表达量；
图2为过表达LncRNA-OX1诱导神经干细胞的分化结果；
图3为敲除LncRNA-OX1后神经干细胞中LncRNA-OX1相对表达量；
图4为敲除LncRNA-OX1后抑制神经干细胞的分化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例中采用的LncRNA为LncRNA-OX1，其核苷酸序列为：5'-attgcagccgatcagcagaaaactggagtctggcgatccgacaagagtcttggggatgtagcatacgtggtccggggcagctattccagtgagcgcgaacaacaccctcatgcgaaagtcttttcgcaatagggcctagacgtctggttcaggtatcgacctggagttcatttctaggggctactctagaaggatcaccgaggcctatggtcagctccagcgaacaaagcaaaggcttaacgtatttc-3'。
1.1未分化rNSCs-12神经干细胞的培养
本发明采用的rNSCs-12神经干细胞购自于上海雅吉生物科技有限公司。
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基(DMEM/F12+20ng/mL的EGF和bFGF)混合均匀。在1000rpm/min条件下离心5分钟,弃去上清液,补加5mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜,培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞原代培养:细胞密度达80％-90％时，弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。加1-2ml消化液(0.25％Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10％血清的完全培养基终止消化。再用移液器将细胞悬液收集到5mL的离心管，1000rpm/min，5分钟，弃上清，然后用新鲜培养基悬浮细胞沉淀，用移液管转移的无菌的培养瓶内。
观察结果发现：在原代培养过程中第1天观察到细胞呈圆形亮点；第2天可见绝大多数单个细胞已贴壁，部分细胞有突起生成；第3天可见到若干个细胞团形成，且细胞团会随着时间的延长进一步变大。
1.2分化rNSCs-12神经干细胞的培养
原代培养两周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，1000rpm/min，5分钟，弃去上清液，补加5mL培养液后吹匀。再用含10％胎牛血清的培养液(DMEM/F12+20ng/mL的EGF和bFGF)培养两周，同时以未加胎牛血清的培养液作为对照组进行培养。
观察结果发现：在神经干细胞的培养过程中，添加胎牛血清培养的实验组和未加胎牛血清的对照组在培养的前2天可以观察大部分细胞贴壁。到第3天时，实验组绝大部分细胞有突起生成，且轴突的长度相比于对照组有明显的增长。继续培养至第6天后，实验组细胞团的突起数量和轴突长度显著高于对照组，且实验组的细胞团突起部分相互交叉，交织成网状。
1.3LncRNA-OX1在不同分化状态的神经干细胞种的表达情况分析
分别收集培养第3天的上述1.1节的未分化的神经干细胞和1.2节分化的神经干细胞。经离心后，采用Trizol法提取细胞总DNA，经提取得到的总DNA用70％乙醇洗两次(每次12000g，4℃离心2分钟)，干燥，加0.1％DEPC水，-70℃下存放备用。
采用Primer Premier 5软件设计获得用于检测LncRNA-OX1的上下游引物，具体的序列信息如下所示：
LncRNA-OX1-F：5'-attgcagccgatca-3'；
LncRNA-OX1-R：5'-gaaatacgttaagc-3'。
实时荧光定量PCR扩增的PCR反应体系为总体积25μL，包括：DNA模板2μL，上下游引物各2μL，SYBR荧光染液1μL，TaqDNA聚合酶1μL，10×PCRBuffer 5μL，dNTPs 2μL，ddH2O 12μL。
PCR反应程序为95℃预变性5min；然后94℃变性60s；52℃退火40s；72℃延伸60s。共35个循环。PCR反应完成后，定量计算LncRNA-OX1在不同分化状态的相对表达情况。
结果如图1所示：在未分化状态时LncRNA-OX1表达量相对较低，在已分化的神经干细胞中LncRNA-OX1的表达量呈现明显的升高现象。
实施例2
2.1构建含有所述LncRNA-OX1的重组表达质粒，具体步骤如下：
含有LncRNA-OX1的重组质粒构建：设计构建含有SpeI和NotI酶切位点扩增上下游引物，用于载体的亚克隆，上下游序列如下：
LncRNA-OX1-F'：5'-tctACTAGTattgcagccgatca-3'；
LncRNA-OX1-R'：5'-aatGCGGCCGCGaaatacgttaagc-3'。
PCR扩增的PCR反应体系为总体积25μL，包括：DNA模板2μL，上下游引物各2μL，10×PCRBuffer 5μL，TaqDNA聚合酶2μL，dNTPs2μL，ddH2O 12μL。
PCR反应程序为95℃预变性5min；然后94℃变性60s；53℃退火40s；72℃延伸60s。共40个循环。PCR反应完成后，利用琼脂糖电泳并切胶回收目的基因片段。
2.2LncRNA-OX1基因克隆到载体LV18(CMV/Puro)，具体步骤如下：
用SpeI和NotI对2.1节中目的基因片段和载体LV18(CMV/Puro)进行酶切，37℃酶切2小时，50μL酶切体系包括：目的基因片段/载体LV18 5μL，10×工具酶缓冲液5μL，SpeI酶5μL，NotI酶5μL，ddH2O 30μL。用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段/载体LV18。
用T4 DNA ligase连接酶切得到的目的基因片段和线性化的LV18载体，即可得到重组LncRNA-OX1-LV18载体。连接反应为45℃温育2h，50μL连接体系包括：10×T4 DNA连接酶缓冲液5μL，线性化的LV18载体5μL，目的基因片段5μL，T4 DNAligase 5μL，ddH2O 30μL。
2.3过表达LncRNA-OX1诱导神经干细胞的分化，具体步骤如下：
采用以阳离子脂质体转染试剂梭华(SofastTM)介导重组质粒DNA的转染。将重组LncRNA-OX1-LV18载体转染未分化rNSCs-12神经干细胞，并连续培养72h后。以采用相同方式转染空质粒的未分化rNSCs-12神经干细胞作为对照组。通过显微镜拍照观察神经干细胞的突起数量和长度，并做记录。
结果如图2显示：将重组LncRNA-OX1-LV18载体转染未分化的神经干细胞后，经过短暂的培养，神经干细胞的突起长度明显增加，且其树突和轴突数量明显增多。证明LncRNA-OX1会诱导神经干细胞的分化。
2.4敲除LncRNA-OX1后抑制神经干细胞的分化
以LncRNA-OX1为靶序列，设计定向敲低该基因的siRNA分子，并人工合成相应的siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4，其序列信息如下所示：SiRNA1：5'-aatagctgccccg-3'、SiRNA2：5'-ttgttcgcgctca-3'、SiRNA3：5'-ctaggccctattg-3'、SiRNA4：5'-gagctgaccatag-3'。
用RNAiMAX Reagent试剂将siRNA1、siRNA2、siRNA4和siRNA3分别转染到rNSCs-12神经干细胞中，siRNA转染终浓度为100nM，以未转染siRNA的rNSCs-12神经干细胞为对照组。转染后72h，通过实时荧光定量PCR检测LncRNA-OX1的表达量，并记录神经干细胞的突起数量和轴突长度。
在本领域，突起数量的增加和轴突长度的延长是神经干细胞分化的向导。如图3所示：转染siRNA的神经干细胞处理组中LncRNA-OX1的表达量显著低于对照组。且如图4所示，相比于siRNA处理组，对照组的神经干细胞的突起数量和轴突长度占据优势，而处理组细胞突起数量较少，且轴突长度明显缩短。进一步证实可通过调控神经干细胞中的LncRNA-OX1表达量实现对神经干细胞的分化调控。
在本发明中，申请人惊喜地发现，转染LncRNA-OX1的神经干细胞的分化进度会大幅度提前，其突起数量和轴突长度明显高于未转染LncRNA-OX1神经干细胞，且进一步地，通过敲低神经干细胞中的LncRNA-OX1，可以有效抑制神经干细胞的突起数量和轴突长度，进而再次证实LncRNA-OX1在调控神经干细胞分化中起到重要作用，对于保持神经干细胞的未分化状态起着重要的作用。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于调控神经干细胞分化的LncRNA-OX1，其特征在于，所述LncRNA-OX1的核苷酸序列为：5'-attgcagccgatcagcagaaaactggagtctggcgatccgacaagagtcttgggga tgtagcatacgtggtccggggcagctattccagtgagcgcgaacaacaccctcatgcgaaagtcttttcgcaatagggcctagacgtctggttcaggtatcgacctggagttcatttctaggggctactctagaaggatcaccgaggcctatggtcagctccagcgaacaaagcaaaggcttaacgtatttc-3'。
2.一种非治疗目的的神经干细胞分化和/或抑制分化的调控方法，其特征在于，通过对权利要求1中所述LncRNA-OX1的调控，建立调控神经干细胞分化和抑制分化的方法，将LncRNA-OX1转染神经干细胞，以促进神经干细胞的分化；通过沉默载体siRNA，使LncRNA-OX1的表达显著下调，以抑制神经干细胞分化，以此来调控神经干细胞的分化和抑制分化，其中，所述siRNA分子为siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4，其序列信息如下所示：SiRNA1：5'-aatagctgccccg-3'、SiRNA2：5'-ttgttcgcgctca-3'、SiRNA3：5'-ctaggccctattg-3'、SiRNA4：5'-gagctgaccatag-3'。
3.一种非治疗目的的抑制神经干细胞的分化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)根据权利要求1所述的LncRNA-OX1全长基因序列设计siRNA分子；
b)将步骤a)中的siRNA转染到神经干细胞；
其中，步骤a)中的siRNA分子为siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4，其序列信息如下所示：SiRNA1：5'-aatagctgccccg-3'、SiRNA2：5'-ttgttcgcgctca-3'、SiRNA3：5'-ctaggccctattg-3'、SiRNA4：5'-gagctgaccatag-3'。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b)是采用RNAiMAX Reagent试剂将siRNA1、siRNA2、siRNA3或siRNA4转染到神经干细胞中。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述siRNA转染终浓度为100nM。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述神经干细胞为rNSCs-12。
7.一种非治疗目的的促进神经干细胞的分化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)构建含有权利要求1所述LncRNA-OX1的重组表达质粒，
2)将步骤1)中的重组表达质粒转染神经干细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中包括扩增LncRNA-OX1的步骤和将LncRNA-OX1与载体LV18连接构建重组表达质粒的步骤。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)是采用以阳离子脂质体转染试剂梭华(SofastTM)介导重组质粒DNA的转染；将重组LncRNA-OX1-LV18载体转染未分化神经干细胞，并连续培养。
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