CN116925217A - 针对Tau蛋白的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了针对Tau蛋白的抗体，本发明提供的针对Tau蛋白的单克隆抗体，对于Tau蛋白具有很强的亲和活性，能够特异性的结合Tau蛋白，为Tau蛋白的检测Tau蛋白相关疾病的治疗提供了新的方案，具有广阔的应用前景。

Description

针对Tau蛋白的抗体
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及针对Tau蛋白的抗体。
背景技术
神经退行性变性疾病（neurodegene-rative disease）是一类慢性进行性大脑和脊髓的细胞神经元退行性变性、丢失而导致的疾病的总称，阿尔茨海默病（alzheimerdisease，AD）就是其中一种与年龄相关的疾病，其起病隐袭，病程呈慢性进行性，正在成为严重的全球性健康问题。微管相关蛋白Tau（microtubule-associatedprotein tau）的过度磷酸化而引起的神经纤维缠结是AD主要的病理特征之一，与AD的诊断密切相关。研究发现，和正常人相比，AD患者脑脊液和血液中Tau蛋白水平明显升高，可以作为AD的重要生物标志物，在AD的早期发现、早期治疗、改善预后方面发挥重要作用。
因此，高特异性、高亲和力的针对Tau蛋白的抗体的开发十分必要。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了针对Tau蛋白的抗体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了针对Tau蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括三个CDR的重链可变区互补决定区和三个CDR的轻链可变区互补决定区，其中，重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示，轻链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示。
进一步，所述单克隆抗体的重链可变区还包括四个FR的重链可变区框架区，轻链可变区还包括四个FR的轻链可变区框架区，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6、7所示，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.12、13、14、15所示。
进一步，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
进一步，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
进一步，所述CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的。
进一步，所述CDR是根据Kabat编号系统定义的。
进一步，所述单克隆抗体是无岩藻糖基化的单克隆抗体。
本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核酸。
进一步，编码所述单克隆抗体重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核酸分别具有如SEQ ID NO:17、18、19所示的核苷酸序列；编码所述单克隆抗体轻链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核酸分别具有如SEQ ID NO:20、21、22所示的核苷酸序列。
进一步，编码重链的核酸分子可操作的连接第一信号肽，编码轻链的核酸分子可操作的连接第二信号肽。
进一步，所述第一信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，所述第二信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。
进一步，所述信号肽与核酸的5’端连接。
本发明的第三方面提供了包括本发明第二方面所述的核酸的载体。
进一步，所述载体包括与所述单克隆抗体重链可操作的连接的第一信号肽，和/或与所述单克隆抗体轻链可操作的连接的第二信号肽。
进一步，所述第一信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
进一步，所述载体包括质粒载体、病毒载体或噬菌体载体。
本发明的第四方面提供了包括本发明第二方面所述的核酸或本发明第三方面所述的载体的宿主细胞。
进一步，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步，所述真核细胞包括低等真核细胞和高等真核细胞。
进一步，所述高等真核细胞包括哺乳动物细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞包括骨髓瘤细胞系、HuT78细胞、293T细胞、293F细胞、CHO细胞、W138、BHK细胞。
本发明的第五方面提供了一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的宿主细胞。
进一步，所述产品包括试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括缀合于抗体的可检测标记。
进一步，所述可检测标记包括荧光标记、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
进一步，所述产品还包括药物组合物。
进一步，所述药物组合物还包括药学相容性载剂。
进一步，所述药物组合物还包括缓冲剂。
本发明的第六方面提供了如下任一项方法：
（1）一种制备本发明第一方面所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括培养本发明第四方面所述的宿主细胞，回收单克隆抗体；
（2）一种检测样本中Tau蛋白的方法，所述方法包括：使本发明第一方面所述的单克隆抗体与待测样本接触，从而检测待测样本中Tau蛋白的水平。
进一步，（1）中所述的方法还包括纯化所述的单克隆抗体。
进一步，所述方法为非诊断目的的方法。
本发明的第七方面提供了如下任一项应用：
（1）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的宿主细胞在检测Tau蛋白中的应用；
（2）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的宿主细胞在制备诊断Tau蛋白相关疾病的产品中的应用；
（3）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗Tau蛋白相关疾病的药物组合物中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的针对Tau蛋白的单克隆抗体，对于Tau蛋白具有很强的亲和活性，能够特异性的结合Tau蛋白，为Tau蛋白的检测Tau蛋白相关疾病的治疗提供了新的方案，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是抗体识别Tau蛋白的Western结果图；
图2是纯化抗体与抗原结合的特异性图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了针对Tau蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括三个CDR的重链可变区互补决定区和三个CDR的轻链可变区互补决定区，其中，重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示，轻链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示。
在本发明中，单克隆抗体（monoclonal Ab，mAB，单抗）或抗体是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。抗体包含两条重（H）链和两条轻（L）链。哺乳动物重链由可变区（VH）以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区（分别为CH1、CH2、CH3、CH4）组成；哺乳动物轻链由可变区（VL）和恒定区组成。抗体呈Y形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区（complementaritydetermining region；CDR），轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3。轻链和重链的可变区还包括框架区（framework region；FR），轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。
对于CDR的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统、AbM编号系统、IMGT编号系统、接触定义、构象定义。Kabat编号系统是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区域（参见例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res .，28：214-8）。Chothia编号系统与Kabat编号系统类似，但Chothia编号系统考虑了某些结构环区域的位置。（参见例如Chothia等，1986，J .Mol .Biol .，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83）。AbM编号系统使用建模抗体结构的由Oxford MolecuLar Group生产的计算机程序集成套件（参见例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci（USA），86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program forModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford MolecuLar，Ltd）。AbM编号系统使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结构（参见Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl .，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Usinga CombinedHierarchicalApproach”描述的那些）。接触定义基于可用复杂晶体结构的分析（参见例如MacCallum等，1996，J .Mol .Biol .，5：732-45）。构象定义中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基（参见例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166）。另外其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与KabatCDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本发明使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法（包括方法的组合）定义的CDR。本文使用的方法可利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。本公开的实施例中采用Kabat编号规则定义CDR，但本领域技术人员能够理解的是，也可以根据Chothia、延伸的、AbM、IMGT、接触和/或构象定义中的任一个来重新定义CDR。
所述单克隆抗体是无岩藻糖基化的单克隆抗体。
在本发明中，无岩藻糖基化是指在Fc区中在Asn297处具有改变的糖基化样式且具有降低的岩藻糖残基水平的IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种型的）抗体。在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至两个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0、G1（α1,6或α1,3）或G2聚糖残基（Raju,T.S.,BioProcess Int.1（2003）44-53）。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,Glycoconjugate J .14（1997）201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体在Asn297处通常以至少85%的量进行岩藻糖基化。应当理解，如本发明中所使用的，术语无岩藻糖基化抗体包括在其糖基化样式中没有岩藻糖的抗体。通常已知的是，抗体中典型的糖基化残基位置是依照EU编号系统的第297位的天冬酰胺（Asn297）。
本发明提供了包括上述核酸的载体。
在本发明中，载体在将原核细胞作为宿主的情况下，通常包含可使转录进行的强力的启动子（例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子及T7启动子）、用于开始翻译的核糖体结合位置及转录/翻译结束序列。在利用大肠杆菌菌株（E.coli）（例如，HB101、BL21、DH5α、Top10、JM109等）作为宿主细胞的情况下，可以利用E.coli色氨酸生物合成途径的启动子及操纵子部位（Yanofsky，C.，J.Bacteriol.，（1984）158:1018-1024）和噬菌体λ的向左启动子（pLλ启动子、Herskowitz，I.and Hagen，D.，Ann.Rev.Genet.，（1980）14:399-445）作为调节部位。在利用芽孢杆菌作为宿主细胞的情况下，可以利用能够在苏云金杆菌的毒素蛋白基因的启动子（Appl.Environ.Microbiol.（1998）64:3932-3938；Mol.Gen.Genet.（1996）250:734-741）或芽孢杆菌中表达的任何启动子作为调节部位。
载体在将真核细胞作为宿主的情况下，可利用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子（例如：金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子及人肌酸启动子）或来源于哺乳动物病毒的启动子（例如：腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒（CMV）启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、EB病毒（EBV）的启动子及劳斯肉瘤病毒（RSV）的启动子），且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录结束序列。
另外，本发明的载体还包括质粒（例如，pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列及pUC19等）、噬菌体（例如，λgt4.λB、λ-Charon、λΔz1及M13等）或病毒（例如，SV40等）。
本发明提供了包括上述核酸，或上述载体的宿主细胞。
在本发明中，宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli、枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）、链霉菌（Streptomyces sp.）、假单孢菌（Pseudomonas sp.）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）或葡萄球菌（Staphylococcus sp.）。宿主细胞可以是真菌细胞，例如曲霉菌（Aspergillus sp.），酵母细胞如甲醇酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces sp.）和粗糙脉胞菌（Neurospora crassa），低级真核细胞和诸如昆虫细胞之类的高级真核细胞。并且，宿主细胞可以来自植物和/或哺乳动物。宿主细胞的优选实例包括但不限于PER.C6细胞、猴肾细胞7（COS7，特别是simian COS细胞）、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、W138、幼仓鼠肾（BHK）细胞、Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞、293T细胞、293F细胞以及其它产生根据本发明的抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞。
在本发明中，转化到宿主细胞中的方法包括用于将核酸引入有机体、细胞、组织或器官的任何方法，可以如本领域所知那样利用根据宿主细胞的类型所选择的标准技术来进行。该方法包括但不限于电穿孔、原生质体融合、磷酸钙（CaPO4）沉淀、氯化钙（CaCl2）沉淀、利用碳化硅纤维震荡（agitation）、农杆菌介导的转化，以及PEG、硫酸葡聚糖、脂质体（lipofectamine）或干燥/抑制所介导的转化。
本发明提供了一种产品，所述产品包括上述单克隆抗体、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞。
所述产品包括试剂盒。
所述试剂盒还包括缀合于抗体的可检测标记。
在本发明中，可检测标记包括但不限于荧光标记、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
其中，荧光标记包括但不限于Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5，6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或Texas Red。
放射性同位素包括但不限于砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m（technicium）和/或钇90。
顺磁性离子包括但不限于铬（III）、锰（II）、铁（III）、铁（II）、钴（II）、镍（II）、铜（II）、钕（III）、钐（III）、镱（III）、钆（III）、钒（II）、铽（III）、镝（III）、钬（III）和/或铒（III）的离子。
所述产品还包括药物组合物。
所述药物组合物还包括药学相容性载剂。
在本发明中，药学相容性是指无毒材料，其不与药物组合物的活性组分的作用发生相互作用。所述药学相容性载剂是指天然或合成的、有机或无机组分，其与活性组分联用从而有利于应用。根据本发明，药学相容性载剂包括一种或多种相容性固态或液态填充剂、稀释剂或包封物质，所述载剂适于施用给患者。本发明药物组合物的组分一般不会发生显著影响期望药物疗效的相互作用。
在本发明中，药物组合物还包括缓冲剂，所述缓冲剂包括但不限于醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
在本发明中，药物组合物还包括盐，当用于药物时，所述盐应为药学相容性盐。然而，药学不相容的盐也可用于制备药学相容性盐，并且包括在本发明中。此类药理学和药学相容性盐包括但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸。药学相容性盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
在本发明中，药物组合物还酌情包括合适的防腐剂，所述防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、尼泊金（paraben）和硫柳汞。
在本发明中，药物组合物还包括补充的免疫增强物质，所述补充的免疫增强物质例如佐剂，所述佐剂包括但不限于CpG寡核苷酸、细胞因子、趋化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA。
各种递送系统是已知的并可用于施用本发明的药物组合物，例如在脂质体包封、微粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导内吞作用。引入的方法包括但不限于皮内、透皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜内层（例如，口腔粘膜、鼻粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，并可与其他生物活性剂共同施用。施用可为全身性或局部的。其可以作为雾化制剂递送。
药物组合物也可在囊泡，尤其脂质体中递送。
在某些情况下，药物组合物可在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。在又另一个实施方案中，受控释放系统可被放置成接近组合物的靶，因此只需要全身剂量的一部分。
可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可注射制备物可例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。用于注射的水性介质例如生理盐水、含葡萄糖的等张溶液和其它辅剂等，其可与下列组合使用：适合的增溶剂，如醇（例如乙醇）；多元醇（例如丙二醇、聚乙二醇）；非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50（氢化蓖麻油的聚氧乙烯（50mol）加合物）]等。可使的用油性介质为例如芝麻油、大豆油等，其可与如苯甲酸苄酯、苄醇等的增溶剂组合使用。由此所制备的注射剂优选地填充于适当的安瓿瓶中。
本发明的药物组合物可由标准针或注射器进行皮下或静脉内递送。
用于口服或肠胃外用途的药物组合物被制备成适于配合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的这些剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂（安瓿）、栓剂等。
本发明提供了上述单克隆抗体、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞在制备预防和/或治疗Tau蛋白相关疾病的药物组合物中的应用。
在本发明中，Tau蛋白相关疾病是以个体的组织或流体中异常水平的Tau为特征的病症。在一些情况中，Tau蛋白相关疾病以组织或流体中存在升高（高于正常）水平的Tau或Tau肽和/或病理形式的Tau为特征。例如，在一些情况中，Tau蛋白相关疾病以脑组织和/或脑脊液中存在升高水平的Tau或Tau肽和/或病理形式的Tau为特征。组织或流体中“高于正常”水平的Tau指示组织或流体中的Tau水平高于正常对照水平，例如高于相同年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。
在一些情况中，具有Tau蛋白相关疾病的个体展现出Tau蛋白相关疾病的一种或多种其它的症状（例如认知衰退）。在其它情况中，Tau蛋白相关疾病以组织或流体中存在低于正常水平的Tau为特征。组织或流体中“低于正常”水平的Tau指示组织或流体中的Tau水平低于正常对照水平，例如低于相同年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。
Tau蛋白相关疾病包括阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化（amyotrophiclateral sclerosis ）/帕金森病-痴呆复合症（parkinsonism-dementia complex），嗜银颗粒性痴呆（argyrophilic grain dementia ），英国型淀粉样血管病（ British typeamyloid angiopathy），脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy ），皮质基底变性，克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease），拳击员痴呆（dementia pugilistica），弥散性神经纤维缠结伴钙化，唐氏综合征（Down 's syndrome ），额颞痴呆，与第17号染色体连锁的额颞痴呆伴帕金森病，额颞叶变性，格斯特曼-施特劳斯纳-杉克病（Gerstmann-Straussler-Scheinker disease ），哈勒沃登-施帕茨病（Hallervorden-Spatz disease），包涵体肌炎（inclusion body myositis），多系统萎缩（multiple system atrophy），肌强直性营养不良（myotonic dystrophy），尼曼-匹克病（Niemann-Pick disease）C型，非关岛运动神经元病（nonGuamanian motor neuron disease）伴神经纤维缠结，皮克氏病（Pick 's disease），脑炎后帕金森病（postencephalitic parkinsonism），朊病毒蛋白脑淀粉样血管病（prion protein cerebral amyloid angiopathy），进行性皮质下神经胶质增生（progressive subcortical gliosis），进行性核上性麻痹，亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitis），仅缠结痴呆（Tangle only dementia），多发性梗死性痴呆（multiinfa rct dementia），缺血性中风（ischemic stroke），慢性创伤性脑病（chronic traumatic encephalopathy，CTE），创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）和中风。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例
1、免疫原处理：免疫原为重组Tau蛋白，经SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量，经过ImmunoPlus技术处理，增强免疫原性。
2、动物免疫：选取BALB/c小鼠，常规方法免疫。经三次免疫后，用间接ELISA方法测试抗血清效价，选取效价高的小鼠进行后续实验，使用western测试抗血清对重组抗原的识别。
3、脾细胞制备：引颈处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于已消毒的90~100目不锈钢网中。用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液，反复抽吸数次获取细胞，再制成细胞悬液。把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中静置5分钟。离心（800~1000转/分）计数，备用。
4、细胞融合：将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞按1：5比例混合，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。将1ml 40%的PEG溶液60秒内逐滴加入到细胞团中，同时并不断轻微转动离心管。在不断转动的离心管中，60秒内逐滴加入1ml无血清培养液。而后于5分钟内缓慢加完20ml无血清培养基。离心（800 转/分，8 分钟），去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀。将细胞悬液加入96孔板内，每孔50微升。37℃ CO2培养箱中培养24小时后更换成HAT选择性培养液。
5、融合后细胞培养：融合后7~10天用HAT培养液半量换液，以后每隔2~3天半量换液一次。2~3周后出现杂交细胞集落。待集落增殖生长至1/3孔时，应用间接ELISA方法，对小鼠杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体进行亲和力测试。以重组Tau蛋白作为抗原包被酶标板，包被抗原浓度为1μg/ml，100μl/孔。包被缓冲液为PBS（PH=7.4）。4℃放置过夜。次日PBS洗涤3次，每次5分钟。以1% BSA封闭，每孔加入200μl。37℃恒温箱孵育2小时。弃去BSA，加入含有单克隆抗体的细胞培养上清，每孔100μl。以小鼠的阳性抗血清作为阳性对照，以空白培养上清作为阴性对照。37℃恒温箱孵育2小时。弃去一抗，洗涤液洗5次，加Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，37℃恒温箱孵育1小时。加入底物显色后，以酶标仪测定吸光值。
结果显示，在1:10的稀释条件下，抗体的吸光值>2.9，远远大于阴性对照值0.069，说明抗体对重组Tau蛋白抗原有很好的亲和力（表2），抗体的序列如表1所示。
表 1 6G10D7抗体序列
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表 2抗体识别重组Tau蛋白
6、以临床样本中的人Tau蛋白作为抗原，以含有单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞培养上清进行检测。
结果显示，在目标位置，出现强阳性条带，说明抗体对临床样本中的抗原有很强的结合力（图1）。
7、应用双抗体夹心ELISA方法，以2.5μg/ml的纯化抗体包被酶标板，包被液为PBS（pH=7.4），4℃放置过夜。洗涤液洗涤3次，加入重组Tau蛋白作为抗原，抗原浓度分别为0、1、10、100ng/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体，浓度为1μg/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次，加入HRP标记的链酶亲和素，与检测抗体结合，浓度为1mg/ml，1:10,000稀释，每孔加入100μl。37℃孵育30分钟。加底物显色，酶标仪测定吸光值。
结果显示，23H9E4与24F1H2配对成功，随着抗体含量的增加，吸光值随之上升。抗原浓度为100ng/ml时，吸光值>2.2，明显高于阴性对照。说明抗体对抗原有很强的识别和捕获作用（表3）。
表 3纯化抗体对抗原的识别
8、将23H9E4与24F1H2配对组合，对重组Tau蛋白进行检测。将抗原浓度进行倍比稀释，根据抗原浓度与吸光值进行绘图。
结果显示，随着抗原浓度升高，吸光值也随之升高，说明抗体与抗原结合具有特异性（图2）。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.针对Tau蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括三个CDR的重链可变区互补决定区和三个CDR的轻链可变区互补决定区，其中，重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示，轻链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区还包括四个FR的重链可变区框架区，轻链可变区还包括四个FR的轻链可变区框架区，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6、7所示，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.12、13、14、15所示。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体的核酸。
5.包括权利要求4所述的核酸的载体。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体包括与所述单克隆抗体重链可操作的连接的第一信号肽，和/或与所述单克隆抗体轻链可操作的连接的第二信号肽。
7.包括权利要求4所述的核酸或权利要求5或6所述的载体的宿主细胞。
8.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸、权利要求5或6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞。
9.如下任一项方法：
（1）一种制备权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求7所述的宿主细胞，回收单克隆抗体；
（2）一种检测样本中Tau蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：使权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体与待测样本接触，从而检测待测样本中Tau蛋白的水平。
10.如下任一项应用：
（1）权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸、权利要求5或6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在检测Tau蛋白中的应用；
（2）权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸、权利要求5或6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备诊断Tau蛋白相关疾病的产品中的应用；
（3）权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸、权利要求5或6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗Tau蛋白相关疾病的药物组合物中的应用。
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