CN116920161A - 高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料及其制备与应用。该止血材料的制备包括以下步骤：(1)将菌落接种到培养基中进行发酵培养，得到水凝胶状的细菌纤维素膜；对细菌纤维素膜进行剪切、匀浆和冷冻干燥处理，得到细菌纤维素纳米短纤维；(2)将细菌纤维素纳米短纤维分散后进行氧化处理，制备得到氧化细菌纤维素纳米短纤维；(3)将氧化细菌纤维素纳米短纤维与氨甲环酸按重量比3：100混合，采用EDC/NHS反应制备得到负载氨甲环酸的氧化细菌纤维素纳米短纤维复合物，即为所述止血材料。本发明的止血材料能够实现体内抑制显性和隐性出血的双重功效，且在能够抑制隐性出血的前提下，实现了抑制显性出血效果的大幅度提升。

Description

高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料及其制备与应用
技术领域
本发明属于医用止血材料技术领域，具体涉及一种高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料及其制备与应用。
背景技术
在军事、运动、医疗等领域，创伤、软组织撕裂伤、贯通伤和烧伤等情况时有发生，这些创面组织往往会导致体外或体内出血，造成机体疼痛并容易引起感染，严重者甚至威胁到伤员的生命。因此，研制开发具有高效止血、持久镇痛、预防和消除创面感染，并能有效促进创面愈合的止血材料显得尤为迫切，快速、有效的止血也是战、创伤中提高伤员生存率的关键因素。
据研究表明，血液凝固过程是一系列凝血因子相继酶解激活的过程，具体包括凝血酶原激活物的形成，凝血酶形成，纤维蛋白形成三个步骤。凝血机制主要有三类：(1)直接激活或参与凝血系统；(2)吸水作用等物理及化学途径富集伤口部位凝血成分从而刺激生理止血；(3)通过强粘附物理封闭血管。基于上述凝血机制，研究人员开发出了一系列用于止血的医用材料。
常用的止血材料主要有以下几类：1)具有较强亲水、吸水性能的材料，例如纱布等棉织物、多孔沸石等无机多孔材料、淀粉等；2)利用特殊化学作用的止血材料，如静电吸引作用，由于血液中血细胞带负电，因此可以在织物表面引入带正电的多糖类物质，通过静电相互作用，促进血液凝固；3)多肽基止血材料，如纤维蛋白，胶原蛋白等，其中胶原蛋白可以激活部分血液凝血因子的活动，引导血小板附着，产生释放反应和聚集，还可以对损伤血管的机械压迫起到填塞作用；4)复合材料，如多糖、多肽复合材料，止血敷料与止血纱布或绷带的复合材料等。
普通的棉织品如纱布、止血绷带等虽然具有一定的止血效果，但是棉织物对血液的吸收量非常高，当给伤员或患者包扎出血伤口时，纱布的高吸血量会使患者流失更多的血液，血液的大量流失可能会造成伤员或患者失血过多，昏厥、休克甚至死亡。因此，研究和开发止血时间短、止血过程中吸血量低的止血材料具有重要意义。
目前临床上通常使用的止血材料是明胶海绵，但这种医用敷料主会产生大量医疗废物，且其吸收性也较差，同时拆除这些敷料时会为患者带来二次伤害。因此，开发具备止血效果、失血量低、止血速度快的止血材料显得尤为重要。
众所周知，出血分为显性出血和隐性出血，然而目前的止血材料主要聚焦在抑制看得见的显性出血，对于隐性出血的关注极少。隐性出血是创伤或术后难以避免的体内出血，直接导致血红蛋白急剧下降继而引发贫血甚至死亡。
研究报道[1]，老年股骨粗隆间骨折手术中，采取股骨近端防旋髓内钉治疗的患者中，平均术中失血(48.9±2.8)mL，术后平均显性失血量为(62.3±3.8)mL，平均隐性失血量为(385.0±6.2)mL，显然，隐性出血量远远高于显性出血量。Yoji Ogur等[2]报道了107例颈椎前路融合术治疗退行性脊柱的患者，隐形失血量为261mL，占总失血量的50％。因此，在抑制显性出血的同时，如何更好地实现抑制隐性出血，是止血材料必须要考虑的问题。
临床上改善隐性出血的金标准是全血或者血液成分的输血，以及使用纤维蛋白原浓缩剂或重组凝血因子，然而存在免疫原性、易污染等风险。因此，隐性失血量是不可忽视的危险因素，对于患者术后生存质量有显著影响，减少患者术后隐性失血量能有效促进患者术后功能康复，提高其生存质量。
目前常见的控制隐性出血的临床手段是静脉输注或局部浸泡氨甲环酸(TXA)，广泛应用于骨科手术、脑手术、产后出血等。各种临床环境中的多项临床试验表明，氨甲环酸可以减少隐性失血、输血率和出血相关死亡率。然而，在采用氨甲环酸抑制隐性出血时，面临着止血材料抑制显性出血的效果下降的问题。如何提升氨甲环酸止血材料抑制显性出血的效果，开发一种在能够很好保证隐性出血的前提下，还具有显性止血效果好、止血速度快的医用止血材料，成为止血材料开发的一大难点。
专利文献CN 103394078 A公开了一种自主加压多靶点协同止血的外伤急救用可降解止血制剂，包括可生物降解材料10-90％、凝血酶1-40％、纤维蛋白原1-40％、凝血因子1-40％、氨甲环酸1％-20％、去胺加压素1％-20％、钙盐0.5％-20％、局麻镇痛药0.1-5％、纳米银0.01-2％，其中可生物降解材料为明胶、微纤维胶原、壳聚糖、胶原蛋白或可降解纤维素，可以在短时间内抑制各种出血。但是该专利中的可降解止血制剂存在出血量较高、抑制显性止血的效果有待提高的问题，该降解止血制剂用于大鼠肝中叶切除出血模型的止血效果显示，考查出血时间在200s内时，出血量达到了1.01g以上；该降解止血制剂对凝血功能障碍大鼠股动脉切口止血效果显示，考查出血时间在180s左右时，出血量达到了1.76g。因此，该氨甲环酸止血材料在实现隐性止血的前提下，存在对显性止血的抑制效果不佳，显性出血量较高的问题。
专利文献CN 113667706 A公开了一种载氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料，是由淀粉酶解制孔、经BOC保护的氨甲环酸发生酰氯反应、酶解淀粉与BOC-氨甲酰氯发生酯化反应制备而得，其原料包括：淀粉、BOC-氨甲环酸、氯化亚砜、淀粉酶。该止血材料用于小鼠断尾模型的止血效果显示，考查10s内的自由出血量就达到了0.7g，表明该止血材料的显性出血量较高。因此，该氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料在实现隐性止血的前提下，仍然存在显性出血量高的问题。
可见，就目前采用氨甲环酸来实现隐性止血的前提下，普遍存在止血材料抑制显性出血的效果差的问题，这类氨甲环酸止血材料的显性出血量较高，止血速度较慢。因此，如何开发一种兼具隐性止血和显性止血的氨甲环酸止血材料，以提升氨甲环酸止血材料在显性止血效果上的不足，降低显性出血量，更快地实现止血效果，成为亟待解决的技术问题。
引用的参考文献如下：
[1]Zhang,P.X.,et al.,Clinical analysis ofobvious and hidden bloodloss in inter-trochanter fracture patients treated with proximal femoral nailanti-rotation and dynamic hip screw.Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2012.44(6):p.891-894.
[2]Ogura,Y.,et al.,Hidden blood loss following 2-to 3-level posteriorlumbar fusion.Spine J,2019.19(12):p.2003-2006.
发明内容
本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料及其制备与应用。本发明的技术目的在于，一方面解决现有的氨甲环酸功能化止血材料主要针对于隐性出血，而明显降低了显性止血效果的问题；另一方面解决现有的氨甲环酸止血材料存在的显性出血量高、显性止血效果不足的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将菌落接种到培养基中进行发酵培养，于气液表面得到水凝胶状的细菌纤维素膜；对细菌纤维素膜进行剪切、匀浆和冷冻干燥处理，得到细菌纤维素纳米短纤维；
(2)将细菌纤维素纳米短纤维分散后进行氧化处理，制备得到氧化细菌纤维素纳米短纤维；
(3)将氧化细菌纤维素纳米短纤维与氨甲环酸按重量比3：100混合，采用EDC/NHS反应制备得到负载氨甲环酸的氧化细菌纤维素纳米短纤维复合物，即为所述止血材料。
本发明提供的上述方法，首先通过细菌合成细菌纤维素膜并制备成纳米短纤维，然后通过TEMPO化学氧化得到可降解的氧化细菌纤维素纳米短纤维，TEMPO结构中氧铵盐形态的氮氧自由基选择性地将BNC侧链的伯醇氧化成羧基，再与氨甲环酸上的氨基形成酰胺键，从而构建得到了一种能够同时抑制显性和隐性出血的短纤维基止血材料。经实验证明，本发明提供的纳米短纤维可以制备成悬液、凝胶、海绵和粉末等多种形态满足不同使用场景下的止血需求。同时，该纳米短纤维基止血材料具有优异的抑菌效果，有利于大鼠成纤维细胞的增殖，在体外促进血小板和全血细胞的黏附，促进凝血反应，在大鼠断尾出血模型、肝脏出血模型和腹直肌缺损出血模型中，具有显著优异的抑制显性出血的效果，同时对腹直肌出血模型具有显著优异的抑制隐性出血效果，是一种同时抑制显性出血和隐性出血的高效止血材料。
进一步的是，步骤(1)中所述菌落为木葡糖醋酸杆菌。
进一步的是，步骤(1)中所述发酵培养基的组分为：100g/L D-果糖、5g/L蛋白胨和3g/L酵母提取物，pH 5.0。
进一步的是，步骤(1)中所述培养的条件为30℃恒温静置培养7天。
进一步的是，步骤(1)中所述均质的操作为采用均质机以15000rpm的速度处理15min。
进一步的是，步骤(2)中所述氧氧化细菌纤维素纳米短纤维的制备方法为：将冻干的BNC短纤维重新分散在磷酸钠缓冲液中，将四甲基哌啶氧化物和NaClO2溶解到悬浮液中，将NaClO滴入磷酸钠缓冲溶液中，然后立即加入悬浮液，在50℃下磁力搅拌48小时，所得产物经洗涤冻干后，即得氧化细菌纤维素纳米短纤维。
进一步的是，步骤(3)中所述EDC/NHS反应包括以下步骤：将OBNC短纤维分散到MES缓冲液中，依次加入NaCl、NHS和EDC，然后加入氨甲环酸，于30℃搅拌反应12h，即得。
本发明的目的之二是提供如上任一项所述方法制备得到的高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料。
进一步的是，所述止血材料包括乳液状、凝胶状、海绵状或粉末状。
本发明的目的之三是提供由如上任一项所述方法制备得到的高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料在同时抑制显性出血和隐性出血方面的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种可降解的氨甲环酸功能化细菌纤维素短纤维。该短纤维具有微米和纳米两极孔径，吸水率超过96％，能够迅速激活凝血反应抑制显性出血，且能持续释放氨甲环酸并扩散到组织内降低纤溶酶的活性和抑制隐性出血。
(2)本发明提供的短纤维止血材料具有优异的抑菌效果，在体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别约为壳聚糖的2.36倍和1.57倍。
(3)本发明提供的短纤维止血材料具有显然的抑制显性和隐性出血的双重功效。体外血液实验中，该短纤维止血材料具有显著优异的促凝血性能。大鼠断尾和肝损伤出血模型的凝血实验中，该短纤维止血材料显示出低的出血量，同时在腹直肌缺损出血模型中抑制隐性出血，血红蛋白值4天内快速从128±5.5g/L回升至165±2.6g/L。
附图说明
图1为本实验过程示意图；(a)细菌产BNC过程示意图；(b)材料制备过程结构示意图；(c)不同比例的OBNC和TXA可能构建出的三类不同的复合物i，ii，iii，其中i表示OBNC上的羧基比例多余TXA上的氨基比例时可能生成的复合物，ii表示OBNC上的羧基刚好可以与TXA上的氨基一比一接枝，iii表示TXA上的氨基远远多于OBNC上的羧基时，TXA上的氨基与自身的羧基进一步结合。图2为实施例所得材料的理化性能表征；(a)OBNC纳米短纤维的四种不同形态，(i)表示均匀的悬液状态，(ii)表示凝胶状态，(iii)表示海绵状态，(ⅳ)粉末；(b)OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3和TXA的红外光谱分析；(c)OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3和TXA的XPS分析；(d)OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3和TXA的SEM图片用于观察微观形貌。
图3为体外血液相容性和促凝血性能分析；其中A,B,C,D分别表示OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3四种不同的海绵状态的短纤维；(a)表示红细胞溶液与材料接触时的宏观图片，可以看出红细胞溶液即刻被海绵吸收；(b)表示红细胞溶液与材料接触1h后，加入生理盐水(除阳性对照是加入超纯水)时的宏观图片；(c)表示加入生理盐水/超纯水再37℃孵育1h，离心后样品的宏观图，可以看出A,B,C,D四种材料和阴性对照组红细胞均未见明显破裂，而阳性对照中红细胞破裂；(d)溶血率；(e)全血凝固过程吸光度变化值；(f)血浆复钙动力学曲线；(g)血浆复钙时间，其中H-M time是指吸光度值达到最高值一半时的时间；#表示无显著性差异，p>0.05，*表示存在显著性差异，p<0.05。
图4为体外与血细胞黏附性能测试；(a)表示材料与富血小板血浆(PRP)孵育示意图；(b，c，d)分别表示材料与血小板、红细胞、全血细胞孵育后的SEM图；(e，f，g)分别表示根据SEM图统计血小板、红细胞、全血细胞的数量；#表示无显著性差异，p>0.05，*表示存在显著性差异，p<0.05。
图5为菌性能及细胞相容性；其中A,B,C,D分别表示OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3四种不同的海绵状态的短纤维；(a)表示接触法测试材料抑菌性的示意图；(b)表示涂板后菌落的宏观图；(c)表示材料浸提液与L929细胞共培养后的活细胞染色荧光图；(d)表示根据菌落宏观图，采用image-J统计菌落的面积得出的抑菌率；(e)表示材料浸提液与L929细胞共培养后的CCK-8实验吸光度值；#表示无显著性差异，p>0.05，*表示存在显著性差异，p<0.05。
图6为体内显性及隐性止血效果评价；其中A,B,C,D分别表示OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3四种不同状态的短纤维海绵；(a，b，c)分别表示大鼠断尾出血模型、大鼠肝损伤出血模型和腹直肌缺损出血模型，材料吸收血液后的宏观图；(d)表示大鼠腹直肌缺损出血模型，用不同的材料止血一周后的宏观图；(e，f，g)分别表示三种出血模型，用四种不同的纳米短纤维海绵止血处理的显性失血量统计；(h)表示用氨甲环酸功能化的短纤维处理出血部位，通过抑制纤溶酶的活性，促进纤维蛋白的活化与聚集从而促进凝血，减少隐性失血量的示意图；(i)表示大鼠腹直肌出血模型，用四种不同的纳米短纤维海绵止血后，第四天相比于第一天血红蛋白的变化值，即间接反映隐性失血量，纱布止血后去除纱布作为对照组(Control)；#表示无显著性差异，p>0.05，*表示存在显著性差异，p<0.05。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中涉及的代号及含义如下：
BNC：细菌纤维素；OBNC：氧化细菌纤维素；TEMPO：四甲基哌啶氧化物；TXA：氨甲环酸；NHS：N-羟基硫代琥珀酰亚胺；EDC：N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
实施例1
一、实验材料与方法
1、实验材料及来源
除非特别说明，所有化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。L929成纤维细胞购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所(中国上海)。D-果糖品牌为Adamas，购自上海泰坦科技股份有限公司(上海，中国)；胎牛血清(FBS)、Dulbecco改良Eagle(DMEM)高糖培养基、双抗(10000U/mL青霉素、10000μg/mL链霉素)和0.25％Trypsin-EDTA(1x)均为Gibco品牌，购自上海泰坦科技股份有限公司(上海，中国)；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自上海碧云天生物科技有限公司(上海，中国)；钙黄绿色采购自上海翊圣生物科技有限公司(Shanghai Yeasen Biotechnology Co.,Ltd.，上海，中国)；清洁级SD大鼠(约200g)购自上海斯莱克实验动物有限公司(SLAC，中国上海)。
2、细菌合成纤维素及氨甲环酸功能化纤维素的构建
(1)水凝胶状BNC膜的细菌合成及纯化
将木葡糖醋酸杆菌菌落接种到高温高压灭菌过的发酵培养基中(100g/L D-果糖、5g/L蛋白胨和3g/L酵母提取物，pH调至5.0)，接种后30℃恒温静置培养约7天，在气液表面得到水凝胶状的细菌纤维素膜(BNC膜)。纯化过程采用80℃的NaOH溶液(1％，w/v)碱煮4h后，反复利用超纯水置换直到pH为中性，浸渍在超纯水中高温高压处理5次，以达到三类医疗器械内毒素含量的植入标准。
(2)可降解OBNC纳米短纤维的制备及氨甲环酸的功能化
首先用剪刀将水凝胶状的BNC膜切成小块，置于水中，均质机(IKA T-25，Staufen，Germany)以15,000rpm的速度匀浆15分钟，冷冻干燥后得到BNC纳米短纤维。
然后采用TEMPO(四甲基哌啶氧化物)选择性氧化方法制备可降解型的OBNC纳米短纤维，具体方法如下：将0.1g冻干BNC短纤维重新分散在30mL磷酸钠缓冲液(0.05M，pH6.86)中，将TEMPO(0.1mmol/g干BNC)和NaClO2(17mmol/g干BNC)溶解到悬浮液中，将0.2mL的NaClO滴入10mL磷酸钠缓冲溶液(0.05M，pH6.86)中，然后立即加入悬浮液。最后，将悬浮液在50℃下磁力搅拌48小时，收集产物并用大量的水离心洗涤3次，冻干后获得可降解的OBNC纳米短纤维。
OBNC-TXA的制备采用改良过的EDC/NHS催化酰胺键形成的复合方式制备得到，具体方法为：将0.3g的OBNC短纤维分散到120mL 0.05M的MES缓冲液中(pH调至5.5)，依次加入NaCl(0.25M)，NHS(0.03M)和EDC(0.06M)，然后分装成3瓶，分别加入10mg、20mg、30mg的TXA，30℃搅拌反应12h。根据电导率滴定法已测得制备的OBNC羧基含量1.15mmol/g，将0.1g的OBNC，按照10mg、20mg、30mg三种浓度的TXA投料比，制备得到三种不同的纳米短纤维复合物，分别记为：OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3。
将四种不同的材料(OBNC、OBNC-TXA1、OBNC-TXA2、OBNC-TXA3)按照1％(w/v)的浓度悬浮，超声处理5min后，取0.5mL置于24孔板的孔中，冷冻干燥，以用于后续理化性能分析、微观形貌观察、抑菌性能评价、体外凝血性能、体外细胞毒性和体内止血性能分析。
3、纳米短纤维理化性能的表征
配制1％(w/v)的OBNC纳米短纤维悬浮液，采用细胞破碎仪超声处理5min，即得到凝胶状的OBNC纳米短纤维；用水再稀释一百倍并超声处理后得到稀释的OBNC纳米短纤维的悬浮液；将1％(w/v)的OBNC纳米短纤维冻干后得到海绵状的纳米短纤维，采用粉碎机处理后，即得粉末状的纳米短纤维。样品冷冻干燥后，ATR-FTIR光谱分析样本的化学结构和组成。采用X射线光电子能谱(XPS,Thermo Scientific K-Alpha，Waltham,Massachusetts)，扫描并记录在150～600eV和N1s 392～410eV范围内的XPS谱。冷冻干燥后的样品，贴于样品台并喷金后，通过场发射扫描电子显微镜(Sirion200，FEI，俄勒冈州Hillsboro，美国)分别观察微观形貌。
4、纳米短纤维体外凝血性能评价
(1)血液及材料的准备
体外凝血性能的评价参照文献报道的方法，具体如下：取SD大鼠心脏部位新鲜的血液，将其与3.2％(w/v)枸橼酸钠混合以防止凝血，4℃下保存备用。5mL全血以100g离心10分钟，上清液为富血小板血浆(PRP)，用于血小板粘附实验。沉淀部分用生理盐水定容至5mL，即红细胞溶液，用于溶血率和红细胞粘附分析。通过将全血以3000g离心5min，获得用于血浆复钙动力学分析的贫血小板血浆(PPP)。
(2)溶血率
将120μL红细胞溶液滴加到材料表面，37℃孵育1h，加入2mL生理盐水(阳性对照加入2mL无菌水)继续孵育1h。轻轻震荡后将混合物分别转移到离心管中，660g离心5分钟。取100μL上清液到96孔板中，酶标仪测量550nm处的吸光度。
溶血率计算公式：溶血率(％)＝(ODt-ODn)/(ODp-ODn)×100，其中ODt、ODn和ODp分别为供试品、阴性对照和阳性对照的吸光度值。
(3)全血凝固实验
将500μL CaCl2(0.025M)溶液添加到5mL全血中，取100μL活化后的全血转移到每个样品中，并分别在37℃下孵育0、3、6、9、12、15和18min，在每个时间点，每孔加2.5mL无菌水，再孵育5min，轻轻混合后，将所得混合物取200μL至96孔板并测量550nm处的吸光度，绘制和比较样品吸光度随时间的曲线，为全血凝固动力学曲线。
(4)血浆复钙实验
将500μL PPP添加到每个样品和空白孔中，37℃振荡孵育1h后，取100μL血浆转移至96孔板，除阴性对照外立即加入100μLCaCl2(0.05M)溶液(阴性对照加入100μL生理盐水)，测定405nm处的吸光度值，30s测定一次，共记录15min，绘制吸光度值随时间的变化曲线为血浆复钙动力学曲线，血浆复钙时间为达到最大吸光度值一半时所需的时间(H-Mtime)。
(5)血细胞黏附(血小板黏附、红细胞黏附、全血细胞黏附)
将500μL血小板溶液、红细胞溶液和全血细胞分别加入材料表面，37℃孵育2h，用生理盐水轻轻清洗附着有红细胞的样品，2.5％戊二醛固定4h，梯度乙醇(25％、50％、75％、95％、100％，各浓度浸泡15min)脱水后，换用叔丁醇置换出乙醇，冷冻干燥，通过FE-SEM观察分别黏附的血小板、红细胞和全血细胞，并统计5K倍视野中观察到的黏附血细胞的数量(每个样品统计三个视野)。
5、抑菌性能评价
抑菌性能的评价方法采用GB/T 20944.2-2007改良后的方法进行测试，首先将冻干后的短纤维材料置于24孔板中，紫外照射灭菌之后，将活化后的菌种接种0.5mL到孔板中，静置培养4h后，加入1.5mL的LB培养基，震荡12h，然后用无菌PBS以10倍梯度稀释，取100μL稀释液涂平板，37℃静置培养12h后，拍照并用image-J测量菌落所占面积，并计算出抑菌率。
6、体外细胞毒性评价
将400μL细胞悬液(10％FBS、1％双抗、89％DMEM和1.0*104L929小鼠成纤维细胞)接种到每个样品表面，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养。L929培养1、3、5天后，PBS洗涤3次，每孔加入40μL CCK-8和360μL DMEM的混合物，孵育1h后，取100μL转移到96孔板中测量450nm处的吸光度，评价材料的细胞毒性并比较不同材料对细胞增殖的影响。为了观察L929细胞的活细胞情况，用钙黄绿色对细胞进行荧光染色，并在荧光显微镜下观察细胞的分布及形貌。
7、动物体内止血实验
所有动物实验符合单位动物保护条例，上海交通大学医学院附属瑞金医院动物研究委员会批准了所有涉及动物的实验。体重为200-250g的雄性SD大鼠用于动物实验。
(1)显性出血量统计
采用三种动物出血模型用于评估海绵在体内的止血效果，分别为断尾模型、肝损伤模型和腹直肌缺损模型。每种动物模型将SD大鼠分为5组，大鼠腹腔注射1.0％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，切掉大鼠50％长度，创造断尾出血模型；通过腹部切口暴露小鼠肝脏并用20号针刺引出血创造肝损伤出血模型；腹部切口暴露腹直肌，用刀片制造大约直径5mm，深度1mm的腹直肌缺损出血模型。不同的出血模型，将预先称重的海绵分别覆盖在出血口上，直至不出血，称量吸收血液后的材料重量。根据吸收血液前后材料的重量计算不同出血模型的失血量。
(2)创伤后血红蛋白变化
采用腹直肌缺损出血模型用于监测出血后血红蛋白的变化，从而用于比较不同分组隐性失血量的差异。简单讲，将大鼠腹腔注射1.0％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，腹部切口暴露腹直肌，用刀片制造大约直径5mm，深度1mm的腹直肌缺损出血模型，将不同的材料覆盖在缺损位置用于止血，然后缝合皮肤，分别于出血后1，4，7天取尾静脉血液约200μL，加入EDTA抗凝剂，采用迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪(BC-2800vet，深圳，中国)测试血红蛋白值。
二、实验结果与表征
1、氨甲环酸功能化纤维素成分及微纳米结构分析
首先，如图1所示，为本发明上述实验方法中细菌产BNC的过程示意图(如图1中a)和材料制备过程结构示意图(如图1中b)，以及采用不同比例的OBNC和TXA可能构建出的三类不同复合物(i)，(ii)，(iii)的示意图(如图1中c)。
如图2中a所示，为本发明制备的四种不同状态的OBNC纳米短纤维，包括乳液状(ⅰ)，凝胶状(ⅱ)，海绵状(ⅲ)和粉末状(ⅳ)。乳液状的OBNC短纤维分散性极好，静置7天后，没有观察到分层或沉积现象；将1％(w/v)的OBNC纳米短纤维经超声处理后得凝胶状态，该凝胶状态具有可注射性和可塑性，可用于不规则创面的止血；冻干后得到海绵状的OBNC短纤维，表现出超级蓬松的海绵状，具有可压缩性，回弹性，强吸水性，可用于常见的创面止血；粉末状的OBNC短纤维密度极低，可用于喷洒在创面达到止血效果。
图2中b为产品的红外光谱分析，可以看出，TXA在1537cm-1和1643cm-1处有吸收峰，为氨基的特征吸收峰，OBNC-TXA1在1550cm-1和1643cm-1处有吸收峰，OBNC-TXA2在1560cm-1和1640cm-1处有吸收峰，OBNC-TXA3在1539cm-1和1635cm-1处有吸收峰，这些吸收峰均为酰胺键I和酰胺键Ⅱ的特征吸收峰，三组样品之间有所偏移，可以看出OBNC-TXA3中氨基过量，TXA中过量的氨基也可能与自身的羧基反应，形成新的酰胺键；OBNC-TXA2中OBNC表面的羧基基本上全部消耗；OBNC-TXA1中反应添加的TXA中氨基不足，剩余OBNC表面的羧基。图2中c为XPS结果，包括150～600eV和N1s 392～410eV范围内的结果，N 1s的能谱分析可以看出，OBNC-TXA1检测到微量的N元素，说明仅少量的TXA接枝复合到OBNC上，OBNC-TXA2和OBNC-TXA3样品均检测到明显的N元素，说明样品上有一定量的TXA的复合。
如图2中d为场发射扫描电子显微镜在5000倍和50000倍下的观察结果，在5000倍下可观察到四种海绵状态材料具有三维的微米级别的孔径，50000倍下可以观察到这些海绵均是由直径均匀的无规则排布的纳米纤维组成。因此，冻干后的OBNC，OBNC-TXA1，OBNC-TXA2和OBNC-TXA3材料是由纳米纤维构成的具有纳米结构和微米孔径的短纤维海绵。
2、氨甲环酸功能化纤维素的体外血液相容性—溶血率
溶血率反映的是材料与血液接触后，红细胞的破裂程度。如图3中a所示，将120μL红细胞溶液滴加到四种材料表面(OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2和OBNC-TXA3)，材料迅速将红细胞溶液完全吸收，孵育1h并加入2mL生理盐水后，如图3中b所示，红细胞悬浮到生理盐水中，离心后如图3中c所示，未破裂的红细胞沉降在EP管的底部，A(OBNC)，B(OBNC-TXA1)，C(OBNC-TXA2)，D(OBNC-TXA3)四种样品得到的上清液均为无色透明状，说明均无明显的红细胞破裂，测定吸光度后计算出四种短纤维的溶血率如图3中d所示，分别约为-0.08％，-0.34％，0.11％和-0.23％，它们之间没有显著性差异。虽然短纤维迅速吸收红细胞溶液，但四种短纤维的溶血率均低于0.5％，几乎不造成红细胞的破裂，具有优异的血液相容性，满足ISO10993-4:2017国际标准对第三类医疗器械溶血率的要求。OBNC、OBNC-TXA1和OBNC-TXA3三种短纤维的溶血率为负值的原因是因为短纤维的溶血程度低于空白的孔板组，具有极好的血液相容性，氨甲环酸功能化过程并不影响纤维素的血液相容性。
3、氨甲环酸功能化纤维素体外促进全血凝固
全血凝固过程反映的是成分复杂的全血与材料接触后引发凝血速度的快慢程度，采用动态全血凝固过程来评估短纤维的体外止血性能(如图3中e所示)，四种短纤维及孔板与血液接触后0，3，6，9，12，15，18min，溶液的吸光度值变化过程可以看出，18min内，孔板组的溶液呈现红色，吸光度值几乎无变化，说明孔板组的血液几乎未形成凝块而导致红细胞悬浮在溶液中，说明孔板组几乎不引发凝血，四种短纤维组(OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2和OBNC-TXA3)溶液随着时间的变化，逐渐变透明，测得的吸光度值均随时间而降低，说明OBNC短纤维及氨甲环酸功能化的短纤维中，逐渐形成血凝块，均具有促凝血的效果，其中OBNC6min时即完全凝血，可以认为OBNC的凝血时间约为6min，促凝血性能显著快于氨甲环酸功能化后的短纤维，OBNC-TXA1和OBNC-TXA2的凝血时间约为12min，而OBNC-TXA3的凝血时间超过18min，他们之间凝血速度的关系是OBNC＞OBNC-TXA1＞OBNC-TXA2＞OBNC-TXA3，说明OBNC的促凝血性能最好，TXA的功能化使凝血速度显著减慢，而且在这三种浓度中，TXA的浓度越高，凝血效果越差。全血凝固时间反应的是18min内血液的凝固程度，从而证明短纤维对显性出血的抑制程度，说明OBNC具有显著优异的抑制显性出血的效果。
现有的医用止血海绵由静电纺制备而成，纤维直径约为683±147nm，而本发明中的细菌纳米纤维素的纤维直径仅几十纳米，与血液的接触比表面积显著更大。不同实验的凝血时间长短并不能证明该报道中的止血海绵的凝血效果优于本报道中的短纤维，这与全血中加入的Ca2+浓度、血液的激活程度等密切相关。而且，本发明的OBNC-TAX1短纤维的全血凝固速度明显快于商用的明胶止血海绵，说明本发明的短纤维具有优异的全血凝固效果。
临床上使用的明胶止血材料，不易被压缩，吸水后体积几乎不膨胀，OBNC表现为超级蓬松的海绵状，可被压缩，且吸水后膨胀；OBNC和明胶止血海绵分别可吸收37倍和5.51倍自重的水，OBNC吸水量显著高于明胶止血海绵，表现出极高的吸水率；吸水过程中，重量不再变化时所需要的时间为吸水时间，它们的吸水时间分别为27.6s和162.6s，OBNC高的吸水率和快速的吸水速度主要归因于高的孔隙率和比表面积。通过BET测试，OBNC和明胶止血海绵的孔隙率分别为41m2/g和2.262m2/g。
4、氨甲环酸功能化纤维素的体外血浆复钙动力学过程及血浆复钙时间
血浆复钙时间的测试是去除血细胞后的血浆与材料接触后的凝血反应，反映的是内源性凝血途径的激活程度。15min内血浆复钙动力学曲线如图3中f所示，据此统计出血浆复钙时间(H-M time)，如图3中g所示，可以看出，四种短纤维(OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2和OBNC-TXA3)的血浆复钙时间平均值分别为4.75min，6.57min，8.24min和7.3min，它们中OBNC的血浆复钙时间最短，其次是OBNC-TXA1，而OBNC-TXA2和OBNC-TXA3之间没有显著性差异，说明在促发凝血反应的15min内，OBNC短纤维促发凝血速度是极快的，而TXA的复合反而减缓了早期内源性凝血速度。
5、氨甲环酸功能化纤维素表面体外促进血细胞黏附及聚集
观察血小板在材料表面的聚集、变形，有利于判断材料的促凝血效果。除此之外，红细胞的黏附聚集也有利于形成血栓子，促进凝血过程，因此，材料与血细胞共孵育后，观察血细胞在材料表面的聚集现象将有助于判断材料的凝血性能。黏附在材料表面的血小板微观形貌如图4中b所示(1000倍和5000倍)，任意统计3张5000倍下的血小板数量，统计结果如图4中e所示，视野中在OBNC表面仅约6个，而在OBNC-TXA1,OBNC-TXA2,OBNC-TXA3表面的血小板数量分别约20，20，20，三者之间没有显著性差异，说明TXA的复合有利于血小板的黏附，能促进凝血过程。由于全血凝固和血浆复钙时间仅分别测试的是18min和15min内的血液凝固情况，而血小板黏附是血小板与材料共孵育2h后的黏附情况，可能原因是复合的TXA在18min之后、2之内的孵育过程中，促进血小板的黏附与聚集，从而发挥促凝血效果。
材料表面黏附的红细胞微观形貌如图4中c所示，任意统计3张5000倍下的红细胞数量结果如图4中f所示，OBNC-TXA2和OBNC-TXA3表面的红细胞数量没有显著性差异，均显著低于OBNC和OBNC-TXA1表面的红细胞数量，说明TXA的复合不能显著促进红细胞的聚集。全血细胞的黏附结果如图4中d所示，任意统计3张5000倍下的红细胞数量结果如图4中g所示，可以看出OBNC-TXA1表面黏附的血细胞数量是最多的，显著多于OBNC，OBNC-TXA2和OBNC-TXA3，同时在OBNC-TXA1表面观察到大量聚集的血浆蛋白，与血细胞一起形成血栓子，这是材料与多种血细胞及血浆共同作用的结果，说明血液与材料共孵育的2h过程中，OBNC-TXA1更能促进血液的凝固。并且，OBNC表面适量TXA的复合，会抑制纤溶酶的活性，从而促进纤维蛋白的聚集，进一步激活凝血途径。
6、氨甲环酸功能化纤维素抗菌性能评定
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与四种短纤维及壳聚糖止血粉共孵育4h，洗脱后涂板结果如图5中b所示，统计出的对两种细菌的抑菌率如图5中d所示，可以看出，对于大肠杆菌的抑制效果最好的是OBNC短纤维，随着TXA的复合，抑菌率降低。对于金黄色葡萄球菌的抑制效率最高的是OBNC和OBNC-TXA1，这与对大肠杆菌的抑菌趋势一致，即TXA的复合降低了短纤维的抑菌效果。
7、氨甲环酸功能化纤维素体外细胞相容性
OBNC、OBNC-TXA1、OBNC-TXA2和OBNC-TXA3四种短纤维的浸提液与L929细胞共培养1，3，5天后，活细胞用钙黄绿素染色后，荧光显微镜观察结果如图5中c所示。在第一天时，各组中仅观察到零星的活细胞，到第五天时，每组的细胞铺展率超过90％。CCK-8实验的结果如图5中e所示，可以看出，第一天和第三天，四种材料组的吸光度值没有显著性差异，各组的吸光度值均随时间而增加，说明四种材料均没有细胞毒性。
8、氨甲环酸功能化纤维素降低动物体内显性失血量
采用了三种动物出血模型(断尾模型、肝脏出血模型和腹直肌缺损出血模型)进一步研究了四种短纤维(OBNC,OBNC-TXA1,OBNC-TXA2和OBNC-TXA3)的止血效果，记录了止血过程血液浸润情况(如图6中a,b,c)，并统计了出血过程的失血量(如图6中e，f，g)。
大鼠断尾模型中，四种短纤维组的失血量分别约为0.0883g，0.0169g，0.0797g和0.133g，可以看出OBNC-TXA1组的失血量显著低于其他组。
肝损伤出血模型中，四种短纤维组的失血量分别约为0.0425g，0.0325g，0.0526g和0.0947g，可见OBNC-TXA3组的失血量显著高于其他三组，而OBNC-TXA1组的失血量明显低于其他组。
腹直肌缺损失血模型中，四种短纤维组的失血量分别约为0.0266g，0.0244g，0.0505g和0.0504g，其中OBNC组和OBNC-TXA1组没有显著性差异，OBNC-TXA2和OBNC-TXA3组没有显著性差异，但是OBNC组和OBNC-TXA1组的失血量显著低于OBNC-TXA2和OBCN-TXA3组。
另外，在大鼠断尾模型中，明胶止血海绵的失血量约为200mg；大鼠肝损伤模型中，明胶止血海绵的失血量约为65.5mg。以上结果均表明，本发明制备的短纤维对于大鼠出血模型的止血效果显著优于临床上使用的明胶止血海绵。
从上述三种动物出血模型的止血实验结果可以看出，本发明制备得到的OBNC-TXA1短纤维具有最优异的降低显性出血量的效果，而过量的TXA的复合会明显降低OBNC短纤维原有的凝血性能，导致材料抑制显性出血的效果较差。综合来看，OBNC-TXA1短纤维的止血性能明显优于另外三组，这与体外促进凝血结果一致，即OBNC表面适量TXA的接枝，有利于激活凝血过程，降低动物出血模型的显性失血量。
为了进一步考查本发明制备的短纤维的止血性能，将本发明中的OBNC-TXA1短纤维的止血效果与专利文献CN 113667706 A中的止血材料进行对比，该专利文献中记载，其制备得到的载氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料对小鼠断尾模型的止血效果为10s内自由出血量仍然达到了0.07g，而本发明中的OBNC-TXA1短纤维止血材料在考查大鼠断尾模型10min的总出血量仅为0.0169g。上述结果表明本发明止血材料的止血效果极佳，在更长的考查时间内采用本发明的止血材料的出血量仍然远低于CN 113667706 A中的止血材料。
9、氨甲环酸功能化纤维素抑制隐性出血分析
大鼠腹直肌缺损出血模型，对照组(纱布止血)和用四种短纤维止血后，一周后材料在体内的宏观图如图6中d所示，未见明显的血肿现象。第四天相比于第一天血红蛋白的变化值如图6中i所示，四种短纤维组的血红蛋白变化值分别约为-26.7g/L，36.3g/L，19.7g/L和14.7g/L，对照组的血红蛋白变化值为25.7g/L，第七天检测血红蛋白值，对照组和OBNC-TXA1,OBNC-TXA2和OBNC-TXA3均恢复至正常水平，所以第7天相比于第4天血红蛋白的变化值没有参考意义。OBNC-TXA1组前4天血红蛋白恢复速度最快，一方面是该复合短纤维处理组相比于另外两种短纤维处理组(OBNC-TXA2和OBNC-TXA3)，具有显著少的显性失血量(图6中g)；另一方面，适量的TXA的复合，抑制出血部位附近纤溶酶的活性，提高了纤维蛋白的活性(示意图如图6中h所示)，进一步聚集，激活凝血途径，尤其激活了开放性毛细血管的凝血途径，减少了隐性失血量，因此创面缝合后，材料在创面出血组织周围原位抑制隐性出血，使血红蛋白值快速恢复正常值。

Claims (10)

1.一种高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将菌落接种到培养基中进行发酵培养，于气液表面得到水凝胶状的细菌纤维素膜；对细菌纤维素膜进行剪切、匀浆和冷冻干燥处理，得到细菌纤维素纳米短纤维；
(2)将细菌纤维素纳米短纤维分散后进行氧化处理，制备得到氧化细菌纤维素纳米短纤维；
(3)将氧化细菌纤维素纳米短纤维与氨甲环酸按重量比3：100混合，采用EDC/NHS反应制备得到负载氨甲环酸的氧化细菌纤维素纳米短纤维复合物，即为所述止血材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述菌落为木葡糖醋酸杆菌。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵培养基的组分为：100g/LD-果糖、5g/L蛋白胨和3g/L酵母提取物，pH5.0。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养的条件为30℃恒温静置培养7天。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述均质的操作为采用均质机以15000rpm的速度处理15min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述氧氧化细菌纤维素纳米短纤维的制备方法为：将冻干的BNC短纤维重新分散在磷酸钠缓冲液中，将四甲基哌啶氧化物和NaClO2溶解到悬浮液中，将NaClO滴入磷酸钠缓冲溶液中，然后立即加入悬浮液，在50℃下磁力搅拌48小时，所得产物经洗涤冻干后，即得氧化细菌纤维素纳米短纤维。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述EDC/NHS反应包括以下步骤：将OBNC短纤维分散到MES缓冲液中，依次加入NaCl、NHS和EDC，然后加入氨甲环酸，于30℃搅拌反应12h，即得。
8.如权利要求1-7任一项所述方法制备得到的高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料。
9.根据权利要求8所述的止血材料，其特征在于，所述止血材料包括乳液状、凝胶状、海绵状或粉末状。
10.由权利要求1-7任一项所述方法制备得到的高效抑制显性出血和隐性出血的止血材料在同时抑制显性出血和隐性出血方面的应用。
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