CN116917289A - T型钙通道拮抗剂及其用途 - Google Patents

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CN116917289A
CN116917289A CN202280019131.7A CN202280019131A CN116917289A CN 116917289 A CN116917289 A CN 116917289A CN 202280019131 A CN202280019131 A CN 202280019131A CN 116917289 A CN116917289 A CN 116917289A
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alkyl
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cycloalkyl
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X·王
R·范豪瓦尔特
R·扎勒
V·巴拉特
D·阮
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Akurex Biosciences
Leland Stanford Junior University
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Akurex Biosciences
Leland Stanford Junior University
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Abstract

本文公开了一种降低细胞中Miro1水平的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的T型钙通道拮抗剂接触。

Description

T型钙通道拮抗剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月4日提交的美国临时申请号63/156,806和2021年8月2日提交的63/228,505的优先权，出于任何目的将它们各自以其整体并入本文。
背景技术
神经元是在远离细胞体的位置处的具有高能量需求的代谢活性细胞。因此，如线粒体功能障碍疾病通常具有神经变性组分的观察结果所反映的，这些细胞特别依赖线粒体功能。近期的发现强调了神经元特别依赖线粒体的动态特性。按照一些标准，线粒体是动态细胞器。线粒体参与融合和分裂的重复循环，其用于脂质与线粒体群的内容物混合。此外，线粒体主动募集至亚细胞位点，诸如神经元的轴突和树突。最后，线粒体群的质量通过线粒体自噬来维持，线粒体自噬是一种其中有缺陷的线粒体被选择性地降解的自体吞噬的形式。线粒体动力学的关键特征(诸如线粒体融合、分裂、运输和线粒体自噬)与神经变性障碍相关。一些重要的神经变性障碍(包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病)涉及线粒体动力学的破坏。
线粒体运动受到紧密地控制以维持能量平衡并且预防氧化应激。线粒体移动在线粒体自噬之前停止，线粒体自噬是一种关键的细胞机制，通过这种机制，去极化的线粒体通过自噬体和溶酶体被降解。移动的停止可以隔绝受损的线粒体，防止它们运动并且防止它们再将损害带给其他健康的线粒体。
Miro是将微管马达驱动蛋白和动力蛋白锚定在线粒体上的线粒体外膜(OMM)蛋白(Glater等人,“Axonal transport of mitochondria requires milton to recruitkinesin heavy chain and is light chain independent,”The Journal of cellbiology,2006,173:545-557；和Koutsopoulos等人,“Human Miltons associate withmitochondria and induce microtubule-dependent remodeling of mitochondrialnetworks,”Biochimica et biophysica acta,2010,1803:564-574)。通过将Miro从受损的线粒体表面去除来实现这种触发去极化的线粒体终止(Wang等人,“PINK1 and Parkintarget Miro for phosphorylation and degradation to arrest mitochondrialmotility,”Cell,2011,147:893-906)。Miro随后被蛋白酶体降解(Wang等人,2011)。证据显示，两种PD连接的蛋白PINK1(PTEN诱导的假定激酶1)和Parkin共同靶向Miro以实现降解(Ashrafi等人,“Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distalneuronal axons and requires PINK1 and Parkin,”The Journal of cell biology,2014,206:655-670；Liu等人,“Parkinson’s disease-associated kinase PINK1regulates Miro protein level and axonal transport of mitochondria,”PLoSgenetics,2012,8:e1002537；和Wang等人,2011)。PINK1或Parkin中的突变与隐性早发型PD的罕见形式相关。
改变的线粒体运输是主要成人发作型神经变性疾病中的致病性变化之一(ShengZH,Cai Q,“Mitochondrial transport in neurons:impact on synaptic homeostasisand neurodegeneration,”Nat Rev Neurosci,2012年1月5日；13(2):77-93)。在突变体LRRK2GS2019细胞中，线粒体外膜蛋白Miro是稳定的并且在受损的线粒体上保留比正常情况长的时间，从而延长了活性运输并且抑制了线粒体降解(Hsieh等人,“FunctionalImpairment in Miro Degradation and Mitophagy Is a Shared Feature in Familialand Sporadic Parkinson's Disease,”Cell Stem Cell,2016年12月1日；19(6):709-724)。散发性PD患者中的Miro降解和线粒体移动也受损(Hsieh等人,2016)。延长的Miro保留和带来的下游结果可能构成PD发病机制的中心部分。
T型电压依赖性钙通道或T型钙通道是低电压激活钙通道，所述低电压激活钙通道在细胞膜超级化期间变得失活但然后打开以去极化。有三种已知T型钙通道亚型：Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3。钙进入不同的细胞中会有许多不同的与之相关的生理反应。在心肌细胞和平滑肌细胞中，电压门控钙通道激活通过允许胞浆浓度增加而直接启动收缩。T型钙通道存在于心肌和平滑肌内以及中枢神经系统内的许多神经元细胞中。
需要降低细胞中的Miro1水平的新型化合物和方法以例如治疗诸如帕金森病的神经变性疾病。
发明内容
在一个方面，本公开文本提供了式(II)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
环B是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基、-(CH2)n-(C3-C7环烷基)、4至7元杂环基或-(CH2)n-(4至7元杂环基)，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基，或R4a和R4b连同它们所附接的碳原子一起形成C3-C5环烷基；
R6是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
X1和X5各自独立地是N或CR8，条件是X1和X5中的至少一个是CR8；
X2、X3和X4各自独立地是N、NR9、O、S或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N、NR9、O或S；
R8是H、卤素、CN、OR11、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基或C1-C6卤代烷基；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代；并且
n是1、2或3；
条件是所述化合物不具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
所述式(II)的化合物可以具有其中X1是CR8的结构。例如，R8可以是H。所述式(II)的化合物可以包含各自独立地是N、NR9或CR9的X2、X3和X4，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N或NR9。
本公开文本还提供了式(III)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4a、R4b、R6、R8和R9是如本文任意处所定义的。
式(II)或(III)的化合物或其药学盐可以具有各自独立地是H、卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基的R1、R2和R3，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
式(II)或(III)的化合物或其药学盐可以具有各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基的R1和R2，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。例如，R1和R2可以各自独立地是H、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C2-C3烷氧基烷基、C1-C3卤代烷基或C3-C5环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基或C1-C3卤代烷基取代。
式(II)或(III)的化合物或其药学盐可以具有各自独立地是H或CH3的R4a和R4b。
式(II)或(III)的化合物或其药学盐可以具有是H或C1-C3烷基的R6。例如，R6可以是CH3。
本公开文本还提供了式(IV)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R4a、R6和R9是如本文任意处所定义的。
式(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学盐可以具有是C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基的R9，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。例如，R9可以是C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
式(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学盐可以具有是苯基或5至6元杂芳基的环B。例如，环B可以是苯基或吡啶基。
本公开文本还提供了式(V)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R6和R9是如本文任意处所定义的。
本公开文本的示例性T型钙通道拮抗剂可以具有表1中的化合物中任一个的结构。在表2中可以找到本公开文本的化合物的另外的结构。
本公开文本包括本文所述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本文进一步提供了一种治疗受试者的神经变性障碍的方法，所述方法包括施用本文所述化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文描述了一种降低细胞中Miro1水平的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的T型钙通道拮抗剂接触。所述T型钙通道拮抗剂对T型钙通道的选择性可以是相对于L型、N型、P型和/或R型钙通道中的一种或多种至少约1.2倍或更多。所述方法可以包括具有式(I)的结构的T型钙通道拮抗剂：
或其药学上可接受的盐，其中
环A和环B各自独立地是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基；
R5是H或C1-C6烷基；
R6a和R6b各自独立地是H或C1-C6烷基；
R7是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R8是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；并且
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代。
环A可以是9至10元杂芳基。环B可以是苯基或5至6元杂芳基。例如，所述T型钙通道拮抗剂可以具有式(II)、(III)、(IV)或(V)或其药学上可接受的盐的结构。
本文所述的降低Miro1水平的方法可以在任何合适的细胞中进行。例如，所述细胞可以是肌细胞。在另一个例子中，所述细胞可以是神经元细胞。所述降低Miro1水平可以是在体外或离体的。可替代地，所述降低Miro1水平可以是在体内的。
在另一个方面，本文提供了一种用于鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法，所述方法包括：a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；和b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中，其中所述生物样品和所述对照生物样品包含iPSC或分化自iPSC的细胞。所述线粒体应激物可以是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)。所述方法可以进一步包括通过施用治疗有效量的本文所述化合物或其药学上可接受的盐来治疗处于发展Miro1相关障碍的风险中的受试者。
在另一个方面，提供了一种用于鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法，所述方法包括：a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中。所述线粒体应激物可以是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)；以及c)通过施用治疗有效量的本文所述化合物或其药学上可接受的盐来治疗处于发展Miro1相关障碍的风险中的受试者。所述生物样品和所述对照生物样品可以包含成纤维细胞。
本公开文本进一步描述了一种用于治疗有需要的受试者的神经变性障碍的方法，所述方法包括：a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者用于治疗；和c)向所述受试者施用治疗有效量的本文所述化合物或其药学上可接受的盐。所述线粒体应激物可以是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)。所述生物样品和所述对照生物样品可以包含成纤维细胞。神经变性障碍包括药物诱导的帕金森症、进行性核上性麻痹、血管性帕金森症、路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮层基底节变性、多系统变性(夏-德综合征(Shy-drager syndrome))、帕金森病、阿尔茨海默病、皮克病、额颞叶痴呆、多系统萎缩、血管性痴呆和进行性核上性麻痹(斯蒂尔-理查森综合征(Steel-Richardson syndrome))。所述受试者可以无所述神经变性障碍的症状。
与对照Miro1水平相比，所述Miro1水平可以通过本领域中任何方法(诸如本文进一步描述的方法)确定。例如，所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率可以是约0.5至约10。在另一个例子中，所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率可以是约0.7至约4。
附图说明
图1示出了饲料中的贝尼地平对帕金森病苍蝇模型中的运动减少的效应。
图2示出了Miro1对诱导多能干细胞(iPSC)中的氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)的反应。(A)读出的示意性表示。(B)使用健康-2、PD-29和风险-39的读出的例子。将细胞裂解物如所指示印迹。(C)蛋白质印迹结果的总结。通过学生t检验比较相同受试者中归一化的“用DMSO的情况”和“用CCCP的情况”的Miro1强度，并且P>0.05的受试者和在CCCP后显示出显著Miro1上调的受试者的数目，或在CCCP后Miro1降低的P<0.05的受试者的数目显示在“数目(Miro1 DMSO与CCCP P>0.05或<0.05)”列。使用费舍尔精确检验(Fisher Exact Test)确定与“健康”相比的特定组的P值。(D)热图示出了通过蛋白质印迹测量的相同受试者(n＝3-55)的平均归一化Miro1强度的相对比率(“用CCCP的情况”除以“用DMSO的情况”)。(E-G)对Miro1的ELISA验证。(E)示出了代表性标准曲线。LLOD＝0.112ng/ml。动态范围＝0.625-40ng/ml。(F)通过测量在4个不同板中的相同样品(健康-1)来展示板间变化。(G)通过在相同板中4次测量相同样品(健康-1)来显示板内变化。(H)热图示出了通过ELISA测量的相同受试者(n＝3-4)的平均Miro1值的相对比率(“用CCCP的情况”除以“用DMSO的情况”)。*P<0.05；**P<0.01；并且***P<0.001。
图3示出了对iPSC中Miro1比率的相关分析。(A)使用单因素方差分析确定所有组间的显著区别。(B)使用双因素方差分析确定性别和遗传背景间的相互作用，其中Miro1比率作为反应变量。(C，D)使用多变量回归确定年龄和遗传背景间(C)或年龄和性别间(D)的相互作用，其中Miro1比率作为反应变量。通过线性拟合来计算所有P值。
图4示出了对成纤维细胞中Miro1比率的相关分析。(A)使用单因素方差分析。(B)使用双因素方差分析确定性别和遗传背景间的相互作用，其中Miro1比率作为反应变量。(C，D)使用多变量回归确定年龄和遗传背景间(C)或年龄和性别间(D)的相互作用，其中Miro1比率作为反应变量。通过线性拟合来计算所有P值。
图5示出了人口统计学和临床变量间的相互作用。(A)代表性偏回归图示出了单变量简易精神状态检查(Mini-Mental Status Examination，MMSE)对Miro1比率的影响。(B-D)代表性偏回归图示出了影响Miro1比率的两个变量的相互作用。(B)Hoehn-Yahr量表(hys)和发作年龄。(C)MMSE和hys。(D)发作年龄和MMSE。
具体实施方式
本公开文本尤其提供了能够降低细胞中Miro1水平的方法和选择性T型钙通道拮抗剂并且不是选择性L型或N型钙通道拮抗剂也不是混合的L/N型或L/N/P型钙通道拮抗剂的组合物。因此，选择性T型电压依赖性钙通道拮抗剂或具有T型拮抗剂活性的混合选择性钙通道拮抗剂可用于降低将受益于细胞(例如，神经元细胞)中Miro1水平的降低的疾病或病症中的Miro1水平。此类疾病或病症包括神经变性疾病，诸如帕金森病。
本文还公开了式(II)的酰胺化合物。参见实施例1-55。此类化合物已显示出T型钙通道拮抗剂活性(实施例60)。因此，式(II)的化合物能够降低细胞中的Miro1水平，并且可用于治疗诸如帕金森病的神经变性疾病。
进一步提供了，与测量的对应未处理生物样品的对照Miro1水平相比，通过测量已用线粒体应激物处理的受试者的生物样品的Miro1水平来鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法。Miro1相关障碍包括本文所述任何神经变性障碍，例如，帕金森病。如实施例64所示，在正常受试者中，来自已用线粒体应激物CCCP处理的受试者来源的生物样品的细胞(诸如诱导多能干细胞(iPSC)或皮肤成纤维细胞)中的Miro1水平比未处理细胞中的对照Miro1水平低。然而，在帕金森病患者和处于发展帕金森病风险中的受试者中，Miro1水平与对照Miro1水平相似或更高(图2-图4)。因此，Miro1水平可以用于标记处于发展Miro1相关障碍的风险中的受试者，诸如帕金森病有症状和无症状个体。此外，如通过MMSE得分(图5)所测量的与认知功能衰退相关的较高Miro1水平表明，Miro1可以用于监测帕金森病进展与认知功能受损的组合。这些结果表明，Miro1水平可以用于鉴定受试者患有包括帕金森病在内的症状前Miro1相关障碍并且在症状出现之前用能够降低Miro1水平的化合物治疗受试者。
I.定义
“烷基”是直链或支链饱和单价烃。例如，烷基可以具有1至18个碳原子(即，C1-18烷基)或1至8个碳原子(即，C1-8烷基)或1至6个碳原子(即，C1-6烷基)或1至4个碳原子(即，C1-4烷基)。烷基的例子包括但不限于甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、二丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)和3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。其他烷基包括庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基和十八烷基。
“烯基”是指具有至少2个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基可以包含任何数目的碳，诸如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、和C6。烯基可以具有任何合适数目的双键，包括但不限于1、2、3、4、5或更多个。烯基的例子包括但不限于乙烯基(vinyl)(乙烯基(ethenyl))、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基可以是经取代或未经取代的。
“炔基”是指具有至少2个碳原子和至少一个三键的直链或支链烃。炔基可以包含任何数目的碳，诸如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、和C6。炔基的例子包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基可以是经取代或未经取代的。
“烷氧基”是指具有氧原子的烷基，所述氧原子将烷基连接至附接点：烷基-O-。至于烷基，卤代烷氧基可以具有任何合适数目的碳原子，诸如C1-6。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以进一步被本文所述的各种取代基取代。烷氧基可以是经取代或未经取代的。
“烷氧基烷基”是指与烷基连接的烷氧基，所述烷基与化合物的剩余部分连接，使得所述烷基是二价的。烷氧基烷基可以具有任何合适数量的碳，诸如2至6(C2-6烷氧基烷基)、2至5(C2-5烷氧基烷基)、2至4(C2-4烷氧基烷基)或2至3(C2-3烷氧基烷基)。碳的数量是指烷氧基和烷基中碳的总数。例如，C6烷氧基烷基是指与丁基(C4烷基)连接的乙氧基(C2烷氧基)和与异丙基(C3烷基)连接的正丙氧基(C3烷氧基)。烷氧基和烷基是如上所定义的，其中烷基是二价的，并且可以包括但不限于甲氧基甲基(CH3OCH2-)、甲氧基乙基(CH3OCH2CH2-)和其他。
如本文所用的“卤代”或“卤素”是指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)和碘(-I)。
如本文所用的“卤代烷基”是指如本文所定义的烷基，其中所述烷基的一个或多个氢原子独立地被可以是相同或不同的卤取代基替代。例如，C1-4卤代烷基是C1-4烷基，其中C1-4烷基的一个或多个氢原子已被卤取代基替代。卤代烷基的例子包括但不限于氟甲基、氟氯甲基、二氟甲基、二氟氯甲基、三氟甲基、1,1,1-三氟乙基和五氟乙基。
“环烷基”是指单个饱和或部分不饱和全碳环，所述碳环具有3至20个环碳原子(即，C3-20环烷基)，例如3至12个环原子，例如3至10个环原子或3至8个环原子或3至6个环原子或3至5个环原子或3至4个环原子。术语“环烷基”还包括多缩合、饱和和部分不饱和全碳环体系(例如，包含2、3或4个碳环)。因此，环烷基包括多环碳环诸如二环碳环(例如，具有6至12个环碳原子的二环碳环，诸如二环[3.1.0]己烷和二环[2.1.1]己烷)和多环碳环(例如，具有多达20个环碳原子的三环和四环碳环)。当化合价要求允许时，多缩合环体系的环可以经由稠合键、螺键和桥接键相互连接。单环环烷基的非限制性例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基和1-环己-3-烯基。
如本文所用的“杂环基”或“杂环”或“杂环烷基”是指在环中具有至少一个杂原子(即，至少一个选自氧、氮和硫的环杂原子)的单个饱和或部分不饱和非芳族环或多环体系，其中所述多环体系至少包含含有至少一个杂原子的非芳族环。所述多环体系还可以包含其他芳族环和非芳族环。除非另有说明，杂环基具有3至20个环原子，例如3至12个环原子，例如3至10个环原子或3至8个环原子或3至6个环原子或3至5个环原子或4至6个环原子或4至5个环原子。因此，所述术语包括单个饱和或部分不饱和环(例如，3、4、5、6或7元环)，所述环在环中具有1至6个环碳原子和1至3个选自氧、氮和硫的环杂原子。杂原子可以任选地被氧化以形成-N(-OH)-、＝N(-O-)-、-S(＝O)-或-S(＝O)2-。当化合价要求允许时，多缩合环(例如，二环杂环基)体系的环可以经由稠合键、螺键和桥接键相互连接。杂环包括但不限于氮杂环丁烷、氮杂环丙烷、咪唑啉、吗啉、环氧乙烷(环氧化物)、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、哌嗪、哌啶、吡唑烷、哌啶、吡咯烷、吡咯烷酮、四氢呋喃、四氢噻吩、二氢吡啶、四氢吡啶、奎宁环、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基、6-氧杂-1-氮杂螺[3.3]庚烷-1-基、2-噻-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基、2-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-基、3-氮杂二环[3.1.0]己烷基、2-氮杂二环[2.1.1]己烷基、2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-基、4-氮杂螺[2.4]庚烷基、5-氮杂螺[2.4]庚烷基等。
如本文所用的“芳基”是指单个全碳芳族环或多缩合全碳环体系，其中至少一个环是芳族的。例如，在一些实施方案中，芳基具有6至20个碳原子、6至14个碳原子、或6至12个碳原子。芳基包括苯基。芳基还包括多缩合环体系(例如，包含2、3或4个环的环体系)，所述环体系具有9至20个碳原子，例如9至16个碳原子，其中至少一个环是芳族的并且其中其他环可以是芳族的或不是芳族的(即，碳环)。此类多缩合环体系任选地被多缩合环体系的任何碳环部分上的一个或多个(例如，1、2或3)氧代基取代。当化合价要求允许时，多缩合环体系的环可以经由稠合键、螺键和桥接键相互连接。还应理解，当提及特定原子范围元芳基(例如，6-10元芳基)时，所述原子范围针对芳基的全部环原子。例如，6元芳基包括苯基并且10元芳基包括萘基和1,2,3,4-四氢萘基。芳基的非限制性例子包括但不限于苯基、茚基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基等。
如本文所用的“杂芳基”是指在环中具有至少一个除碳之外的原子的单个芳族环，其中所述原子选自氧、氮和硫；“杂芳基”还包括具有至少一个此类芳族环的多缩合环体系，其中多缩合环体系在以下进一步描述。因此，“杂芳基”包括具有1至6个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的单个芳族环。硫和氮原子也可以以氧化形式存在，条件是环是芳族的。示例性杂芳基环体系包括但不限于吡啶基、嘧啶基、噁唑基或呋喃基。“杂芳基”还包括多缩合环体系(例如，包含2、3或4个环的环体系)，其中如上定义的杂芳基与一个或多个环缩合以形成多缩合环体系，所述一个或多个环选自杂芳基(以形成例如1,8-萘啶基)、杂环(以形成例如1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶基)、碳环(以形成例如5,6,7,8-四氢喹啉基)和芳基(以形成例如吲唑基)。因此，杂芳基(单个芳族环或多缩合环体系)在杂芳基环内具有1-20个碳原子和1-6个杂原子。此类多缩合环体系可以任选地被缩合环的碳环或杂环部分上的一个或多个(例如，1、2、3或4)氧代基取代。当化合价要求允许时，多缩合环体系的环可以经由稠合键、螺键和桥接键相互连接。应理解，多缩合环体系中的独立的环可以按任何顺序相对于彼此连接。应理解，杂芳基或杂芳基多缩合环体系的附接点可以在杂芳基或杂芳基多缩合环体系的任何合适原子(包括碳原子和杂原子(例如，氮))处。还应理解，当提及特定原子范围元杂芳基(例如，5至10元杂芳基)时，所述原子范围针对杂芳基的全部环原子并且包括碳原子和杂原子。例如，5元杂芳基包括噻唑基并且10元杂芳基包括喹啉基。示例性杂芳基包括但不限于吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡唑基、噻吩基、吲哚基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噁二唑基、噻二唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、吲唑基、喹喔啉基、喹唑啉基、5,6,7,8-四氢异喹啉基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、硫茚基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、喹唑啉基-4(3H)-酮、和三唑基。
还提供了本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、异构体或混合物，其中附接至碳原子的1至n个氢原子可以被氘原子或D替代，其中n是分子中氢原子的数目。如本领域中已知的，氘原子是氢原子的非放射性同位素。此类化合物可以增强对代谢的抗性，并且因此可用于当向哺乳动物施用时增加本文所述化合物或其药学上可接受的盐、异构体或混合物的半衰期。参见例如Foster,“Deuterium Isotope Effects in Studies of DrugMetabolism,”Trends Pharmacol.Sci.,5(12):524-527(1984)。此类化合物通过本领域熟知的手段来合成，例如通过采用一个或多个氢原子已经被氘替代的起始材料来合成。
可并入所公开的化合物的同位素的例子还分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯以及碘的同位素，诸如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I以及125I。用正电子发射同位素诸如11C、18F、15O和13N进行取代可以用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查底物受体占有率。同位素标记的式(I)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与如以下所述的实施例中所述的那些类似的方法使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的未标记的试剂来制备。
“本公开文本的化合物”包括本文所述的化合物，例如，本公开文本的化合物包括式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)的化合物，包括实施例中的化合物。
如本文所用，“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产物以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与配制品的其他成分相容并且对其接受者有害。
“药学有效量”是指配制品或其组合中提供所需治疗或药物结果的本公开文本化合物的量。
“药学上可接受的赋形剂”包括而不限于由美国食品药品管理局批准为用于人类或家畜是可接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指用于获得有益或所需结果的途径。出于本公开文本的目的，有益或所需结果包括但不限于症状的缓解和/或症状程度的减弱和/或预防与疾病或病症有关的症状的恶化。在一些实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括以下中的一种或多种：a)抑制疾病或病症(例如，减少由疾病或病症引起的一种或多种症状，和/或减弱疾病或病症的程度)；b)减缓或阻止与疾病或病症相关的一种或多种症状的发展(例如，稳定疾病或病症，延迟疾病或病症的恶化或进展)；和c)减轻疾病或病症，例如，引起临床症状消退、改善疾病状态、延迟疾病的进展、提高生活质量和/或延长存活期)。
如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”是指可有效引发所需生物学或医学反应的量，包括在施用至受试者以治疗疾病时足以实现对疾病的这种治疗的化合物的量。有效量可以根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。有效量可以包括量的范围。如本领域所理解的，有效量可以是一个或多个剂量，即可能需要单剂量或多剂量以达到所需的治疗终点。在施用一种或多种治疗剂的情况下，可以考虑有效量，并且单一药剂如果结合一种或多种其他药剂可以实现或实现了所需的或有益的结果，则可以认为所述药剂是以有效量给予的。由于化合物的组合作用(例如，加性或协同作用)，任何共施用的化合物的合适剂量可以任选地降低。
“施用”是指向受试者口服施用、作为栓剂施用、局部接触、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或皮下施用、鞘内施用或植入缓释装置(例如，微量渗透泵)。可以根据指定施用频率、施用剂量和其他因素的时间表进行施用。
如本文所用，“共同施用”是指在施用单位剂量的一种或多种另外治疗剂之前或之后施用单位剂量的本文所述化合物，例如在施用一种或多种另外治疗剂的数秒、数分钟或数小时内施用本文所述的化合物。例如，在一些实施方案中，首先施用单位剂量的本公开文本化合物，然后在数秒或数分钟内施用单位剂量的一种或多种另外治疗剂。可替代地，在其他实施方案中，首先施用单位剂量的一种或多种另外治疗剂，然后在数秒或数分钟内施用单位剂量的本公开文本化合物。在一些实施方案中，首先施用单位剂量的本公开文本化合物，然后在数小时(例如，1-12小时)时间段后施用单位剂量的一种或多种另外治疗剂。在其他实施方案中，首先施用单位剂量的一种或多种另外治疗剂，然后在数小时(例如，1-12小时)时间段后施用单位剂量的本公开文本化合物。本文所述化合物与一种或多种另外治疗剂的共同施用通常是指同时或依序施用本文所述化合物和一种或多种另外治疗剂，使得治疗有效量的每种药剂存在于患者体内。
“受试者”是指动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施方案中，受试者是人。
“疾病”或“病症”是指能够用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的患者或受试者的生存状态或健康状态。
II.化合物
本公开文本提供了可用作T型电压依赖性钙通道拮抗剂的化合物。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐，其中
环A和环B各自独立地是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基；
R5是H或C1-C6烷基；
R6a和R6b各自独立地是H或C1-C6烷基；
R7是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R8是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；并且
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代。
在一些实施方案中，环A是9至10元杂芳基。
在一些实施方案中，环A是吡咯并吡啶、异噁唑并吡啶、吡唑并吡啶、吡唑并哒嗪或三唑并吡啶。在一些实施方案中，环A是吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基、吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基、异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基、异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基、吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基、吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基、[1,2,3]三唑[4,5-c]吡啶-6-基或吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基。在一些实施方案中，环A是吡唑并吡啶。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(II)的结构：
或其药学上可接受的盐，其中
环B是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基、-(CH2)n-(C3-C7环烷基)、4至7元杂环基或-(CH2)n-(4至7元杂环基)，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基，或R4a和R4b连同它们所附接的碳原子一起形成C3-C5环烷基；
R6是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
X1和X5各自独立地是N或CR8，条件是X1和X5中的至少一个是CR8；
X2、X3和X4各自独立地是N、NR9、O、S或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N、NR9、O或S；
R8是H、卤素、CN、OR11、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基或C1-C6卤代烷基；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代；并且
n是1、2或3。
在一些实施方案中，X1是CR8。
在一些实施方案中，R8是H。
在一些实施方案中，X2、X3和X4各自独立地是N、NR9或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N或NR9。
在一些实施方案中，X1是N或CR8，X2和X3各自独立地是N或NR9，X4是N、NR9或CR9，并且X5是CR8。例如，X1可以是CR8，X2和X3可以各自独立地是N或NR9，X4可以是N、NR9或CR9，并且X5可以是CR8。在一些实施方案中，X1是N或CR8；X2是N或NR9；X3是N、NR9或CR9；X4是N或CR9；并且X5是CR9。在一些实施方案中，X1是CR8；X2是N或NR9；X3是N、NR9或CR9；X4是N或CR9；并且X5是CR9。
在式(I)和/或(II)的化合物的一些实施方案中，所述化合物不具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
在式(I)和/或(II)的化合物的一些实施方案中，所述化合物不具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
在式(II)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中
环B是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基、-(CH2)n-(C3-C7环烷基)、4至7元杂环基或-(CH2)n-(4至7元杂环基)，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基，或R4a和R4b连同它们所附接的碳原子一起形成C3-C5环烷基；
R6是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
X1和X5各自独立地是N或CR8，条件是X1和X5中的至少一个是CR8；
X2、X3和X4各自独立地是N、NR9、O、S或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N、NR9、O或S；
R8是H、卤素、CN、OR11、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基或C1-C6卤代烷基；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代；并且
n是1、2或3；
条件是所述化合物不具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(III)的结构：
或其药学上可接受的盐。
在式(I)、(II)和/或(III)的化合物的一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
在式(I)、(II)和/或(III)的化合物的一些实施方案中，R3是H、卤素或CN。在一些实施方案中，R3是H或卤素。在一些实施方案中，R3是H。
在式(I)、(II)和/或(III)的化合物的一些实施方案中，R4b是H或CH3。
在式(I)、(II)和/或(III)的化合物的一些实施方案中，R4a和R4b各自独立地是H或CH3。
在式(I)、(II)和/或(III)的化合物的一些实施方案中,
环B是苯基、1H-苯并[d]咪唑-5-基、1H-吲唑-5-基、苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基、2H-吲唑-6-基、噻吩-2-基、吡啶-2-基或吡啶-3-基；R1是F、Me、iPr、CF3、CF2CH3、环丙基、1-氟环丙基、1-氰基环丙基、2,2-二氟环丙基或1-三氟甲基环丙基、1,1-二氟甲基环丙基；R2是H、F、Cl、CN或CH3；R3是H或CH3。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IV)的结构：
或其药学上可接受的盐。
在式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的化合物的一些实施方案中，环B是苯基或5至6元杂芳基。在一些实施方案中，环B是苯基或吡啶基。
在式(I)、(II)和/或(III)的化合物的一些实施方案中，R4a是H或CH3。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(V)的结构：
或其药学上可接受的盐。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，R1是H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C2-C6烷氧基烷基。在一些实施方案中，R1是H、卤素、C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R1是H或卤素。在一些实施方案中，R1是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R1是CF3。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，R2是H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C2-C6烷氧基烷基。在一些实施方案中，R2是H、卤素、C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R2是H或卤素。在一些实施方案中，R2是H。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，R1和R2各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。在一些实施方案中，R1和R2各自独立地是H、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C2-C3烷氧基烷基、C1-C3卤代烷基或C3-C5环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基或C1-C3卤代烷基取代。在一些实施方案中，R1和R2各自独立地是H、卤素、C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R1和R2各自独立地是H或卤素。在一些实施方案中，R1和R2各自独立地是H、C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R1和R2各自独立地是H或C1-C3卤代烷基。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，R1是H或C1-C3卤代烷基；并且R2是H或卤素。在一些实施方案中，R1是C1-C3卤代烷基；并且R2是H。在一些实施方案中，R1是CF3；并且R2是H。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，R6是H或C1-C3烷基。在一些实施方案中，R6是CH3。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，R9是C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。在一些实施方案中，R9是C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基被0、1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。在一些实施方案中，R9是C1-C3烷基、C2-C3烷氧基烷基、C1-C3卤代烷基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基被0、1、2或3个F、Cl、CN、OH、NH2、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基或C1-C3卤代烷基取代。在一些实施方案中，R9是C1-C3烷基、C2-C3烷氧基烷基或C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R9是C1-C3卤代烷基。在一些实施方案中，R9是CH2CF3。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，所述化合物不具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
根据特定取代模式，式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物或其药学上可接受的盐可以具有一个或多个立体中心。为促进化合物评价，在某些情况下，分开并且评价单独的对映异构体和/或非对映异构体可能是有利的。产生单独非对映异构体和/或对映异构体的方法在本领域中是已知的，包括但不限于色谱，诸如手性色谱，例如在手性直链淀粉柱上的超临界流体色谱以及使用手性助剂(例如，有机金属加成手性亚磺酰亚胺)的非对映选择性和/或对映选择性合成。参见例如实施例8中描述的程序。因此，在一些实施方案中，所述化合物是对映异构体富集的并且以约90％至约99.999％对映异构体过量(ee)，诸如约90％至约99.99％、约93％至约99.99％、约95％至约99.99％、约95％至约99.9％、约97％至约99.9％、约98％至约99.9％或约99％至约99.99％ee存在。无任何其他指示，主要异构体是本文化合物结构中显示的立体化学。在一些实施方案中，所述化合物主要是R异构体。在一些实施方案中，所述化合物主要是S异构体。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有表1和表2中的任一种化合物或其药学上可接受的盐的结构。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有表1中的任一种化合物或其药学上可接受的盐的结构。
表1
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例如，在一些实施方案中，本公开文本的化合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有表2中的任一种化合物或其药学上可接受的盐的结构。
表2
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在式(I)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有表3中的任一种化合物或其药学上可接受的盐的结构。
表3
本文所述的化合物是T型钙通道拮抗剂或T型电压依赖性钙通道拮抗剂。因此，本公开文本的化合物可以在本领域已知的或本文所述的一种或多种测定中显示出T型钙通道拮抗剂活性。
化合物活性
本公开文本的化合物通常在本文所述的或本领域已知的一种或多种T型钙通道拮抗剂测定中具有活性。在一些实施方案中，本公开文本的化合物在膜片钳测定中具有T型钙通道拮抗剂活性。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<20μM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<10μM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<1μM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<100nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<10nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<1nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<0.1nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50<0.01nM。
在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.01nM至约20μM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.01nM至约10μM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.01nM至约1μM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.01nM至约100nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.01nM至约10nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.1nM至约100nM。在一些实施方案中，所述化合物在膜片钳测定中的IC50的范围是约0.1nM至约10nM。
化合物相对于其他离子通道的选择性
通常优选化合物选择性以便实现所需的药理效应，同时减少不需要的脱靶效应的潜力。因此，在一些实施方案中，本公开文本的化合物的选择性针对T型钙通道，而不是其他类型，包括L型、N型、P型和/或R型钙通道。在一些实施方案中，本公开文本的化合物的选择性针对T型钙通道，而不是L型钙通道。在一些实施方案中，本公开文本的化合物的选择性针对T型钙通道，而不是N型钙通道。在一些实施方案中，本公开文本的化合物的选择性针对T型钙通道，而不是P型钙通道。在一些实施方案中，本公开文本的化合物的选择性针对T型钙通道，而不是R型钙通道。
用于选择性确定的比较离子通道包括Cav1.2(L型)、Cav1.3(L型)、Cav2.1(P型)、Cav2.2(N型)、Cav2.3(L型)、Kv1.5、Kv4.3、KChIP2、Kv7.1、KCNE1(minK)、Kv7.2、Kv7.3、Kv11.1(hERG)、HCN4、Kir2.1、Kir3.1、Kir3.4、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.5和Nav1.6。
可以通过在可比较测定形式上比较给定化合物在至少两种不同离子通道类型上的拮抗剂活性来确定选择性。任何可以测量钙通道拮抗剂活性的合适测定可以用于确定选择性。在一些实施方案中，可以通过比较IC50或抑制％值来确定选择性。在以下进一步描述可以用于确定活性和选择性的说明性测定。例如，可以通过经由膜片钳测定比较化合物的针对每种钙通道获得的拮抗剂IC50值来测量相对于R型钙通道Cav2.3，化合物对T型钙通道Cav3.1的选择性。Cav3.1 IC50＝100nM并且Cav2.3 IC50＝1000nM的给定化合物对Cav3.1的活性是对Cav2.3的活性的十倍并且因此对T型钙通道的选择性是对R型钙通道的选择性的十倍。
在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、10000、100000倍。可通过本领域已知的任何测定(例如，通过膜片钳测定)确定相对于其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)对T型钙通道的选择性。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约1.2倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约1.5倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约10倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约100倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约1000倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约10000倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的至少约100000倍。
在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的约1.2倍至约100000倍。可通过本领域已知的任何测定(例如，通过膜片钳测定)确定相对于其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)对T型钙通道的选择性。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的约1.2倍至约10000倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的约1.2倍至约1000倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的约1.2倍至约100倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的约10倍至约100000倍。在一些实施方案中，本公开文本的化合物对T型钙通道的选择性是对一种或多种(例如，2、3或更多)其他钙通道类型(包括L型、N型、P型和/或R型钙通道)的选择性的约100倍至约100000倍。
III.组合物
本公开文本尤其提供了作为如本文所公开的T型钙通道拮抗剂的一种或多种化合物的组合物。所述一种或多种化合物的组合物可以通过贯穿T型钙通道发挥作用来降低细胞中的Miro1水平。
在一些实施方案中，所述组合物包含本公开文本的化合物或其盐。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含载体或赋形剂。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种药物组合物或药物配制品，所述药物组合物或药物配制品包含药学有效量的本公开文本化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。如以下进一步所述，所述药物组合物能够递送足够量的本公开文本化合物以产生治疗有效治疗。本文还提供了一种药物配制品，其包含药学有效量的式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。
用常规载体和赋形剂配制本文化合物，将根据通常实践选择常规载体和赋形剂。片剂将含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性配制品以无菌形式配制，并且当旨在通过口服施用之外途径递送时通常将是等渗的。所有配制品将任选地含有诸如“Handbook ofPharmaceutical Excipients”(1986)中所阐述的赋形剂的赋形剂。赋形剂包括抗坏血酸和其他抗氧化剂，螯合剂诸如EDTA，碳水化合物诸如右旋糖酐、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。配制品的pH的范围是约3至约11，但通常是约7至10。
虽然可能单独施用活性成分，但是优选将其以药物配制品呈现。如以上所定义，用于兽用和人用两者的配制品包含至少一种活性成分以及一种或多种可接受的载体和任选地其他治疗成分，特别是如本文所讨论的另外的治疗成分。一种或多种载体必须是在与配制品的其他成分相容并且对其接受者生理上无害的意义上“可接受的”。
配制品包括适用于前述施用途径的配制品。配制品可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中熟知的任何方法制备。技术和配制品通常在Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿)中找到。此类方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过以下方式制备配制品：将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，并且然后(如果必要的话)使产品成形。
适于口服施用的配制品可以呈现为离散单元(诸如胶囊剂、扁囊剂或片剂)，每个单元含有预定量的活性成分；呈现为散剂或颗粒剂；呈现为在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或者呈现为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
通过压缩或模制(任选与一种或多种辅助成分一起)来制备片剂。压制片剂可以通过在合适的机器中压制处于自由流动形式(诸如粉末或颗粒)的活性成分来制备，所述活性成分任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。可以任选地将片剂包衣或刻痕，并且任选地配制以便从中提供缓慢释放或控制释放的活性成分。
本文中的药物配制品包含与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和任选地其他治疗剂的组合。含有活性成分的药物配制品可以呈适于预期施用方法的任何形式。当用于口服用途时，可以制备例如片剂、糖锭剂、锭剂、水性混悬剂或油性混悬剂、分散性散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、溶液、糖浆剂或酏剂。旨在用于口服用途的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以含有一种或多种试剂(包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂)以便提供可口的制剂。含有与适合用于生产片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，诸如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术(包括微囊化)包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸附，并且从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯(单独或与蜡一起)。
适合用于局部施用至眼睛的配制品还包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮于合适的载体中，尤其是用于活性成分的水性溶剂中。活性成分可以以约0.5％至约20％(诸如约0.5％至约10％，例如约1.5％w/w)的浓度存在于此类配制品中。
IV.方法
A.测定
可以使用本领域已知的膜片钳测定或荧光成像读板仪(FLIPR)测定来评估包括T型钙通道拮抗剂活性在内的钙通道拮抗剂活性。参见例如Leech,C.A.和Holz,G.G.,IV.Methods Cell Biol.1994；40:135-151；Bell,D.C.和Dallas,M.L.Br.J.Pharmacology2018,175,2312-2321；等人,J.Med.Chem.2017,60,9769；Uebele等人,CellBiochem Biophys 2009.55,81；Xiang等人,ACS Chemical Neuroscience 2011,2,730；以及US 10,562,857。
可以通过本领域中用于在T型钙通道拮抗剂的存在与不存在下检测Miro1的水平和/或活性的任何便利方法来验证能够降低Miro1水平和/或活性的T型钙通道拮抗剂。例如，可以例如通过使用线粒体运输蛋白特异性抗体的免疫沉淀，然后使用磷酸特异性抗体或通用抗体的蛋白质印迹来检测Miro蛋白(Miro1和Miro2的Ser156、Thr298或Thr299，参见例如Wang等人Cell 2011,147(4):893-906)的水平和/或磷酸化状态，其中Miro蛋白的磷酸化的增加和/或Miro蛋白总水平的降低或在与药剂接触后Khc的磷酸化的减少可以指示药剂将治疗帕金森病。作为另一个例子，可以例如通过使用线粒体运输蛋白特异性抗体的免疫沉淀，然后使用泛素特异性抗体的蛋白质印迹来检测Miro蛋白的水平和/或泛素化，其中在与候选药剂接触后泛素化的增加指示药剂将治疗帕金森病。作为另一个例子，可以通过例如以下方式来评估靶线粒体蛋白在细胞内运输线粒体的能力：用T型钙通道拮抗剂处理经培养的细胞(例如，神经元)并且例如使用活细胞成像技术观察相比于未用T型钙通道拮抗剂处理的细胞，细胞中线粒体的运输(参见例如Brickley和Stephenson J.Biol Chem286(20):18079-92(2011)；Misko等人J Neurosci 30(19):4232-40(2010)；Russo GJ等人J.Neurosci 29(17):5443-55(2009))。作为另一个例子，因为Miro(例如，Miro 1和2)、TRAK(例如，TRAK1和2)和Khc之间复合物的形成对神经元中线粒体运输至关重要(参见例如Brickley和Stephenson J.Biol Chem 286(20):18079-92(2011))，可以通过评估Miro、TRAK和Khc在T型钙通道拮抗剂的存在下形成复合物的能力来评估T型钙通道拮抗剂对Miro功能的效应。可以使用任何技术(包括但不限于免疫共沉淀和亲和纯化技术)进行此类评估以确定蛋白质-蛋白质相互作用。在特定实施方案中，在具有家族性PD突变(例如，PINK1或LRRK2突变)的细胞中评估所述能力。
亲和力测定(通常是免疫测定)是依靠靶分子(即，Miro1)与受体、抗体或其他大分子的结合的测定或分析程序。使用检测方法确定形成的结合复合物的存在和程度。用于此类测定许多形式是本领域中已知和使用的，并且适合于在线粒体解偶联或去极化后检测Miro1降解。在一些实施方案中，所述测定形式适合于高通量分析。
合适的测定形式包括利用对Miro1有特异性的抗体的免疫测定。用于此目的的合适的抗体是已知的并且可商购的多克隆或单克隆组合物，例如来自Invitrogen，包括单克隆CL1095、CL1083；来自Sigma Aldrich，包括克隆4H4，Santa Cruz Biotechnology抗RhoT1抗体(A-8)；等。
例如，目的测定包括蛋白质印迹；免疫组织化学；免疫沉淀等，并且特别地包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)。
酶联免疫吸附测定(ELISA)用于定性和定量分析液体样品(诸如细胞裂解物)中特定可溶性抗原(诸如Miro1)的存在或浓度。这些测定通常利用多孔板或其他来结合诱捕同源抗原的抗体的能力。通常使用可以通过吸收波长检测并且通过抗原或抗体稀释液的已知标准曲线定量的比色终点。通常将检测抗体用酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或荧光标签或电化学发光标记或通过中间标记(诸如生物素)标记。
常见的ELISA形式包括夹心ELISA，这样命名是因为分析物被“夹”在两个不同抗体之间。此形式中的捕获底物是捕获抗体，通常是单克隆抗体以增加测定的特异性并且减少背景噪音。分析物结合至捕获抗体，然后通过结合检测抗体检测分析物。夹心ELISA测定的变体(称为单分子测定(Simoa))使用包被有捕获抗体的珠；每个珠结合至一个或零个靶分子，并且用另一种抗体(检测抗体)和标记酶检测单独的珠。
其他ELISA形式包括间接ELISA，其中捕获底物是正被测试的特异性抗原，并且检测步骤由一抗和对一抗有反应性的酶缀合二抗介导。因此，不标记识别抗原的一抗。在直接ELISA中，捕获底物是正被测试的特异性抗原，并且催化变色反应的酶缀合至抗原检测抗体。
免疫-PCR(I-PCR)是将通过PCR的核酸扩增的灵敏度与基于抗体的测定的特异性组合而导致检测灵敏度增加的技术。
用于测量在化合物施用后Miro1减少的示例性方法描述于Hsieh C-H、Li L、Vanhauwaert R、Nguyen KT、Davis MD、Bu G等人Miro1 Marks Parkinson’s DiseaseSubset and Miro1 Reducer Rescues Neuron Loss in Parkinson’s Models.CellMetab.2019；1131-1140中。
B.减少Miro1的方法
本文提供了一种降低细胞中Miro1水平的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的T型钙通道拮抗剂接触。在一些实施方案中，T型钙通道拮抗剂具有本文所述式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物中的一种或多种的结构。例如，可以用表1、表2和表3中的任一种化合物或其药学上可接受的盐进行降低细胞中Miro1水平的方法。本公开文本进一步表明，具有至少一些针对T型钙通道的活性的钙通道拮抗剂可以在蛋白质印迹和成纤维细胞测定中实现Miro1水平的剂量依赖性降低(实施例61和62)。具有T型钙通道拮抗剂活性并且展现出Miro1减少能力的化合物包括贝尼地平(1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶-二甲酸甲基1-(苯基甲基)-3-哌啶基酯)；MK-8998((R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基)乙酰胺)；ABT-639(5-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-羰基]-4-氯-2-氟-N-(2-氟苯基)苯磺酰胺)；ACT-709478(N-(1-((5-氰基吡啶-2-基)甲基)-1H-吡唑-3-基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺)和唑尼沙胺(1,2-苯并异噁唑-3-甲基磺酰胺)。一种说明性化合物贝尼地平在帕金森病苍蝇模型中展现出拯救运动缺陷的体内活性(实施例63)。
T型钙通道拮抗剂已描述于以下中：美国专利号8,377,968；9,403,798；10,562,857；美国申请公开号20120264804；20150329533；20160340322；EP 3572403；和PCT公开号WO 2011022315；WO 2012094615；WO 2013148640；WO 2018200850；WO 2019175395；WO2020072773；以及WO 2021007487；将每个文献通过引用以其整体并入。可以将前述公开中的任一种T型钙通道拮抗剂用在如本文所述的方法中。
如本文所述的方法中Miro1水平的降低是Miro1蛋白的量的减少和/或Miro1蛋白的活性的降低。在一些实施方案中，Miro1水平的降低是如通过导致Miro1活性降低的任何测定方法(包括本领域已知的测定和本公开文本中描述的测定)所确定的Miro1蛋白的量的减少。在本文所述的实施例37-39中，T型钙通道拮抗剂未在疾病来源的成纤维细胞或iPSCDA神经元细胞中诱导高于在幼稚健康成纤维细胞或对照iPSC DA神经元细胞中观察到的Miro1水平的Miro1水平。此外，T型钙通道拮抗剂未在疾病来源的成纤维细胞或iPSC DA神经元细胞中诱导低于在幼稚健康成纤维细胞或对照iPSC DA神经元细胞中观察到的对照水平的Miro1水平。
可以将任何合适的细胞用在降低或下调本文所述的Miro1水平的方法中。经培养的细胞可以源自患者或对照样品；并且可以被修饰以产生遗传修饰细胞、体外分化细胞、暴露于候选治疗剂的细胞等。在一些实施方案中，所述细胞是肌细胞。例如，所述肌细胞可以是心脏细胞，即心肌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肾细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肝细胞。在一些实施方案中，所述细胞是神经元细胞。可以在细胞中体外、离体或体内进行所述方法。在一些实施方案中，降低Miro1水平是在体外或离体的。在一些实施方案中，降低Miro1水平是在体内的。
任何合适的包含细胞的生物样品都可以用在本文所述的方法中。可以对获自受试者的生物样品进行所述方法，所述生物样品包括但不限于诸如成纤维细胞(诸如皮肤成纤维细胞)、外周血淋巴细胞、iPSC等生物样品。
可以将本文所述方法中测量的Miro1水平与通过本领域已知的任何方法测量的对照Miro1水平比较。参见例如Hsieh C-H等人Cell Metab.2019；1131-1140中描述的ELISA测定。
在一些实施方案中，T型钙通道拮抗剂将Miro1水平降低至正常范围。例如，在一些实施方案中，Miro1正常范围可以是在未处理或幼稚健康成纤维细胞或iPSC DA神经元细胞(范围上限)与线粒体应激物激发的健康成纤维细胞或iPSC DA神经元细胞(范围下限)之间观察到的范围。
在一些实施方案中，相对于对照Miro1水平，T型钙通道拮抗剂将Miro1水平降低或下调至约50％、约40％、约30％或约20％内。在一些实施方案中，测量来自未患有或未疑似患有由异常Miro1水平介导的疾病或障碍的对照受试者的对照细胞中的对照Miro1水平。例如，相对于来自未患有或未疑似患有帕金森病的年龄匹配的患者的对照神经元细胞中的对照Miro1水平，T型钙通道拮抗剂可以将来自帕金森病患者的神经元细胞中的Miro1水平下调至约50％内。
在与T型钙通道拮抗剂接触后细胞中的Miro1水平可以比对照细胞中的对照Miro1水平更高或更低。在一些实施方案中，在与T型钙通道拮抗剂接触后细胞中的Miro1水平比对照细胞中的对照Miro1水平高约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施方案中，在与T型钙通道拮抗剂接触后细胞中的Miro1水平可以比对照细胞中的对照Miro1水平高约20％至约50％。在一些实施方案中，在与T型钙通道拮抗剂接触后细胞中的Miro1水平可以比对照细胞中的对照Miro1水平低约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施方案中，在与T型钙通道拮抗剂接触后细胞中的Miro1水平比对照细胞中的对照Miro1水平低约20％至约50％。
可以使用在细胞中任何合适浓度的T型钙通道拮抗剂来实现将细胞中的Miro1水平降低至所需水平。在一些实施方案中，细胞中T型钙通道拮抗剂的浓度可以是约1nM至约100μM，诸如约1nM至约10μM、约1nM至约1μM、约10nM至约100μM、约10nM至约10μM、约10nM至约1μM、约100nM至约100μM、约100nM至约10μM、约100nM至约1μM、约1μM至约100μM或约1μM至约10μM。
在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％或更高，例如，约30％或更高、约40％或更高或约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高或约80％或更高，例如，约90％、约95％或约100％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约25％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约30％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约35％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约40％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约45％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约50％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约55％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约60％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约65％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约70％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约75％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约80％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约85％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约90％。在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约95％。
在一些实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约100％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约90％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约80％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约70％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约60％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约50％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约20％至约40％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约30％至约50％。在实施方案中，相对于未与T型钙通道拮抗剂接触的未处理对照，T型钙通道拮抗剂将Miro1的水平或生物活性降低约40％至约60％。
C.鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法
在受试者展示出神经变性障碍的明显症状(诸如本文所述症状的一种或多种)之前，在细胞中降解Miro1或从细胞中清除Miro1的能力缺陷据信与Miro1相关障碍(例如，神经变性障碍，诸如帕金森病)的发展相关。因此，在一些实施方案中，受试者无神经变性障碍的症状。实施例64示出了支持从源自帕金森病患者或处于发展帕金森病的风险中的受试者的细胞中除去Miro1的缺陷的相关性的实验数据。还参见图2-图5，其示出了与源自患者的皮肤成纤维细胞和iPSC细胞的帕金森病的高Miro1比率相关性。因此，可以将Miro1用作处于发展这种障碍的风险中的受试者的神经变性障碍的预测性生物标志物，例如，作为在症状出现之前治疗神经变性障碍的初始步骤。有风险的受试者可能有发展神经变性障碍的家族史，可能呈现与增加的发展神经变性障碍风险相关的遗传标志物(例如，帕金森病的LRRK2 G2019S突变)或可能没有已知的发展神经变性障碍的风险。
如先前在Hsieh C-H等人Cell Metab.2019；1131-1140和PCT公开WO 2021/046368中所描述，由于线粒体应激物诱导的线粒体自噬过程，用线粒体应激物处理的细胞中的Miro1水平预期低于未处理对照细胞中的对照Miro1水平。对于来自受试者的生物样品细胞，相比于未处理对照细胞中的对照Miro1水平，用线粒体应激物处理的细胞中相似或更高的Miro1水平可以指示与缺陷性线粒体自噬过程相关的神经变性障碍。
在一些实施方案中，提供了一种用于鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法，所述方法包括：a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；和b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中，其中所述生物样品和所述对照生物样品包含iPSC或分化自iPSC的细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的本文所述化合物或其药学上可接受的盐来治疗处于发展Miro1相关障碍的风险中的受试者。在某些实施方案中，所述化合物是如表1中所描述的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，提供了一种用于鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法，所述方法包括：a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中；以及c)通过施用治疗有效量的本文所述化合物或其药学上可接受的盐来治疗处于发展Miro1相关障碍的风险中的受试者。在一些实施方案中，所述化合物是式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述化合物是如表1中所描述的化合物或其药学上可接受的盐。
Miro1相关障碍是与Miro1蛋白的异常降解和/或清除有关的任何疾病或障碍并且包括本文所述神经变性障碍中的任一种。在一些实施方案中，所述Miro1相关障碍是药物诱导的帕金森症、进行性核上性麻痹、血管性帕金森症、路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮层基底节变性、多系统变性(夏-德综合征)、帕金森病、阿尔茨海默病、皮克病、额颞叶痴呆、多系统萎缩、血管性痴呆、或进行性核上性麻痹(斯蒂尔-理查森综合征)。在一些实施方案中，所述Miro1相关障碍是帕金森病。在一些实施方案中，所述Miro1相关障碍是阿尔茨海默病。在一些实施方案中，所述Miro1相关障碍是皮克病。在一些实施方案中，所述Miro1相关障碍是额颞叶痴呆。在一些实施方案中，所述Miro1相关障碍是多系统萎缩。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的受试者的神经变性障碍的方法，所述方法包括：a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者用于治疗；和c)向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述神经变性障碍是药物诱导的帕金森症、进行性核上性麻痹、血管性帕金森症、路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮层基底节变性、多系统变性(夏-德综合征)、帕金森病、阿尔茨海默病、皮克病、额颞叶痴呆、多系统萎缩、血管性痴呆、或进行性核上性麻痹(斯蒂尔-理查森综合征)。在一些实施方案中，所述化合物是式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述化合物是如表1中所描述的化合物或其药学上可接受的盐。实施例65说明了本公开文本的一种化合物实施例15，其显示出处于发展额颞叶痴呆(FTD)风险中的P301L tau供体的成纤维细胞中Miro1缺陷的剂量依赖性拯救。
任何本文所述的合适生物样品都可以用在所述方法中。在一些实施方案中，生物样品和对照生物样品包含成纤维细胞。例如，皮肤成纤维细胞可以直接获自受试者。在一些实施方案中，所述生物样品和所述对照生物样品包含iPSC或分化自iPSC的细胞。
iPSC可以直接获自受试者或根据本领域已知的任何方法从获自受试者的其他细胞类型培养。参见Shi,Y.等人Nature Reviews Drug Discovery第16卷,第115-130页(2017)，和其中引用的参考。例如，iPSC可以从直接获自受试者的成纤维细胞去分化。此外，iPSC可以再分化为各种不同的细胞类型，包括神经元细胞、皮肤细胞、血液细胞和肝细胞。
可以在不直接从受试者获得靶细胞类型的情况下以便利的方式将此类分化自受试者的iPSC的细胞用于确定个性化疗法。在说明性例子中，皮肤成纤维细胞可以获自处于发展帕金森病的风险中的受试者。皮肤成纤维细胞可以去分化为iPSC，然后iPSC可以再分化为运动神经元。在用或不用线粒体应激物处理的情况下，可以在本文所述测定中测试分化自iPSC的运动神经元是否有Miro1缺陷以便鉴定受试者是否对Miro1减少疗法(诸如含有本公开文本化合物的疗法)有反应。
用于将Miro1水平与对照Miro1水平比较的方法是本领域已知的。当检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高时，可以比较Miro1水平与对照Miro1水平的比率。在一些实施方案中，Miro1水平与对照Miro1水平的比率是约0.5至约10，诸如约0.5至约5、约0.6至约6、约0.7至约4、约0.7至约3、约0.8至约3或约0.9至约2。例如，所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率可以是约0.5至约10。在另一个例子中，所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率可以是约0.7至约4。
可以在本文所述方法中使用本领域已知的任何线粒体应激物。合适的线粒体应激物包括线粒体去极化剂，诸如氰化羰基4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)和氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)；线粒体电子传递链抑制剂，包括复合物I抑制剂(诸如鱼藤酮、粉蝶霉素A、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)和百草枯)、复合物III抑制剂(诸如抗霉素A)、复合物V抑制剂(诸如寡霉素A)；以及线粒体膜钾离子载体，诸如缬氨霉素；代谢调节剂，包括胰岛素信号传导调节剂(诸如二甲双胍)，和细胞生长和代谢所需的mTOR主信号传导途径的抑制剂(诸如雷帕霉素)。在一些实施方案中，线粒体应激物是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)。在一些实施方案中，线粒体应激物是氰化羰基4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)。
D.治疗方法
本文提供了一种治疗神经变性障碍的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的T型钙通道拮抗剂或其药物组合物。在一些实施方案中，T型钙通道拮抗剂是式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述方法递送足以治疗以下进一步描述的病症的一种或多种症状的治疗有效量的本公开文本化合物或其药物组合物。
本公开文本的方法中包括的神经变性障碍包括但不限于具有与帕金森病相关障碍中所见症状相似的症状的神经系统障碍。在一些情况下，神经系统障碍可能显示出与帕金森病、非典型帕金森病或帕金森叠加疾病(Parkinson’s plus disease)相似的症状。例子包括但不限于药物诱导的帕金森症、进行性核上性麻痹、血管性帕金森症、路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮层基底节变性、多系统变性(夏-德综合征)、阿尔茨海默病、皮克病、额颞叶痴呆、多系统萎缩、血管性痴呆和进行性核上性麻痹(斯蒂尔-理查森综合征)。本发明的方法中还包括的其他病症包括年龄相关痴呆和伴有失忆的其他痴呆和病症，包括血管性痴呆、弥漫性白质疾病(宾斯旺格病(Binswanger's disease))、内分泌或代谢来源的痴呆、头部创伤和弥漫性脑损伤导致的痴呆、拳击性痴呆和额叶痴呆。在一些情况下，神经系统障碍可能不会对多巴胺能治疗有良好的反应并且可能由各种血管、药物相关、感染、有毒、结构和其他已知次要原因引起。药物诱导的帕金森症可能由阻断具有高亲和力的突触后多巴胺D2受体的药剂(诸如抗精神病和止吐药物以及丙戊酸钠、抗抑郁药、利血平、四苯喹嗪等)引起。
许多受试者适合于用本公开文本的T型钙通道拮抗剂治疗。合适的受试者包括展示出以下的任何受试者：帕金森病的症状，诸如运动迟缓、重复运动、震颤、肢体强直、步态和平衡问题、由于眼部肌肉无力眼睛无法聚焦、无力、感觉丧失、诸如快速眼动睡眠行为障碍的非运动表现、神经精神症状(包括心境紊乱和认知变化、焦虑、情感淡漠、思维能力、注意力或警惕水平变化和幻视)、智力和功能退化、健忘、人格变化、影响心血管、呼吸、尿生殖、胃肠和泌汗功能的自主神经功能障碍、呼吸和吞咽困难、无法出汗、直立性低血压、疼痛、便秘和嗅觉丧失(例如，嗅觉减退)。在一些实施方案中，受试者可能经历明显的言语或语言障碍、明显的额叶症状和步态冻结。
在一些实施方案中，受试者可能不展示任何明显的帕金森病症状。在一些情况下，有需要的受试者可能显示出增加的易感染性、体温过低、骨骼更虚弱、关节僵硬、关节炎、弯腰姿势、运动减慢、整体能量降低、便秘、尿失禁、失忆、思维更缓慢、反射更缓慢、平衡困难、视觉敏锐度降低、周边视觉减弱、听力损失、皮肤起皱、头发变灰、体重减轻、肌肉组织损失。
在一些实施方案中，受试者选自已被诊断为患有阿尔茨海默病的受试者；已遭受一次或多次中风的受试者；已遭受创伤性头部损伤的受试者；具有高血清胆固醇水平的个体；患有包括脑组织中沉积在内的蛋白质病的受试者；已有一个或多个心脏事件的受试者；经历心脏手术的受试者；和患有多发性硬化的受试者。
在一些实施方案中，受试者展示出与包括诸如以下的神经系统疾病相关的症状：肌萎缩侧索硬化、变性共济失调、皮质基底节变性、关岛型ALS-帕金森-痴呆复合征、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿病、帕金森病、突触核蛋白病、原发性进行性失语、纹状体黑质变性、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)/3型脊髓小脑性共济失调和橄榄体脑桥小脑变性、抽动秽语病(Gilles De La Tourette's disease)、延髓和假性延髓麻痹、脊髓性和脊髓延髓肌萎缩(肯尼迪病)、原发性侧索硬化、家族性痉挛性截瘫、韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)、库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander disease)、泰-萨克斯病(Tay-Sach's disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、家族性痉挛病、沃尔法特-库格尔贝格-韦兰德病(Wohlfart-Kugelberg-Welander disease)、痉挛性轻截瘫、进行性多灶性白质脑病以及朊病毒病(包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob)、格斯特曼-施特劳斯勒尔-沙因克尔疾病(Gerstmann--Scheinkerdisease)、库鲁病(Kuru)和致死性家族性失眠)。还有由以下导致的其他神经变性障碍：脑缺血或梗死，包括栓塞性闭塞和血栓性闭塞以及任何类型的颅内出血(包括但不限于硬膜外、硬膜下、蛛网膜下和脑内)以及脊柱内病变(包括但不限于挫伤、穿透、剪切、压迫和撕裂)。
V.实施例
缩写.使用某些缩写和首字母缩略词来描述实验细节。虽然本领域技术人员理解这些缩写和首字母缩略词的大多数，但还是在以下列出了许多这些缩写和首字母缩略词。
缩写 含义
ACN 乙腈
Bn 苄基
Boc 叔丁氧基羰基
Bu 丁基
nBuLi 正丁基锂
cBu 环丁基
CDCl3 氯仿-d
cHex 环己基
cPr 环丙基
DCM 二氯甲烷
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMSO 二甲基亚砜
DMF 二甲基甲酰胺
EA 乙酸乙酯
EDCI N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐
Et 乙基
iBu 异丁基
iPr 异丙基
LC 液相色谱法
Me 甲基
m/z 质荷比
MS或ms 质谱
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
Ph 苯基
Ph3P 三苯基膦
制备型HPLC 制备型高效液相色谱(也称为制备型HPLC)
RT 室温
tBu 叔丁基
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TMS 三甲基甲硅烷基
TMSCl 三甲基氯硅烷
δ 参考残余非氘代溶剂峰的百万分率
实施例1.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基) 乙基)乙酰胺
步骤1. 5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶的合成
向6-溴-4-甲基吡啶-3-胺(1.0g)在乙酸(60mL)中的溶液中添加亚硝酸钠(0.37mL)，同时在冰浴中冷却。将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应浓缩并且然后用饱和NaHCO3水溶液处理。将水性混合物用EA萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(442mg)。LC/MS ESI(m/z):198[M+H]+。
步骤2.1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
在-78℃下向5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(3.3g)在无水THF(100mL)中的溶液中添加n-BuLi(20.0mL，在THF中2N)。将混合物在-78℃下搅拌1h。然后在-78℃下将DMF(3.87mL)添加至混合物中并且将混合物在-78℃下搅拌1h。将反应温热至室温并且用NH4Cl溶液淬灭。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈白色固体的1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1.0g)。LC/MS ESI(m/z):148[M+H]+。
步骤3. 1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
向1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1g)在DMF(15mL)中的溶液中添加Cs2CO3(4.4g)和碘甲烷(1.1g)。将混合物在25℃下搅拌12h。然后将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到呈黄色固体的1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(400mg)[1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),9.35(s,1H),8.43(s,2H),4.25(s,3H)。]和2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(200mg)[1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),9.27(s,1H),8.80(s,1H),8.43(d,J＝1.2Hz,1H),4.31(s,3H)。]。LC/MS ESI(m/z):162[M+H]+。
步骤4.(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(235mg)在DCM(15mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(230mg)和CuSO4(349mg)。将反应在室温下搅拌过夜。将溶液通过硅藻土垫过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(340mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.06(s,1H),8.83(s,1H),8.34(s,1H),8.17(s,1H),4.25(s,3H),1.31(s,9H)ppm。LC/MS ESI(m/z):265[M+H]+。
步骤5.(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(347mg)在无水THF(20mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(在醚中3.0M，2.2mL)。将反应在-60℃下搅拌2h。然后将反应用饱和NH4Cl淬灭，并且用EtOAc萃取。将有机层分离，用另外的饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈淡黄色油状物的(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(314mg)。LC/MS ESI(m/z):281[M+H]+。
步骤6.(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(57mg)在二噁烷(2.0mL)中的溶液中添加HCl-二噁烷(在二噁烷中4M，1.0mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。然后将混合物浓缩以提供粗品(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐，将其用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):177[M+H]+。
步骤7.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将粗品(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(70mg)、2-[4-(丙-2-基)苯基]乙酸(77.88mg)、EDCI(91.38mg)、HOBt(64.41mg)和DIEA(0.08mL)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌3h。将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以提供残余物。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 35％；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(17.1mg)。LC/MS ESI(m/z):337(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H),7.98(s,1H),7.50(s,1H),7.20(s,4H),6.62(d,J＝7.6Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),4.18(s,3H),3.60-3.52(m,2H),2.95-2.88(m,1H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.26(d,J＝8.0Hz,6H)ppm。
实施例2.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基) 乙基)乙酰胺
步骤1.(R,E)-2-甲基-N-((2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(210mg)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(190mg)和CuSO4(520mg)，并且将反应在室温下搅拌过夜。然后，将混合物过滤，并且将滤液在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到呈白色固体的(R,E)-2-甲基-N-((2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(421mg，粗品)。LC/MS ESI:265(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.25(s,1H),8.71(s,1H),8.59(s,1H),8.49(s,1H),4.31(s,3H),1.21(s,9H)。
步骤2.(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
/>
在-78℃下向(R,E)-2-甲基-N-((2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(274mg)在THF(8.0mL)中的溶液中添加甲基溴化镁(1.38mL，在醚中3M)，并且将混合物在-78℃下搅拌4h。然后将混合物用NH4Cl溶液淬灭并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(285mg)。LC/MS ESI:281(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.20(s,1H),7.90(s,1H),7.49(d,J＝0.8Hz,1H),4.65-4.62(m,1H),4.43(d,J＝6.0Hz,1H),4.28(d,J＝3.0Hz,3H),1.57(d,J＝6.7Hz,3H),1.25(s,9H)。
步骤3.(R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(215mg)在二噁烷(6mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(2mL)，并且将反应在室温下搅拌1h。然后将反应浓缩并且直接用于下一步骤中。LC/MS ESI:177(M+H)+。
步骤4.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将(R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(135mg)、EDCI(177mg)、HOBt(125mg)和2-(4-异丙基苯基)乙酸(151mg)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(5.0mL)中，并且然后将DIEA(0.51mL，3.064)添加至溶液中。将反应在室温下搅拌1h并且用乙酸乙酯从水中萃取。将有机层分离，用饱和NaCl水溶液洗涤并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C180250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mmI.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；流速：50mL/min；背压：100巴；柱温：35℃；波长：220nm)纯化以得到(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-甲基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(46.5mg)。LC/MS ESI:337(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.11(s,1H),7.89(s,1H),7.38(s,1H),7.18(s,4H),6.64(d,J＝6.8Hz,1H),5.24-5.16(m,1H),4.27(s,3H),3.54-3.52(m,2H),2.93-2.86(m,1H),1.45(d,J＝6.8Hz,3H),1.24(d,J＝6.9Hz,6H)。
实施例3.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基) 乙基)乙酰胺
步骤1. 1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯和2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯的合成
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向1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2.0g)在无水DMF(20mL)中的溶液中添加Cs2CO3(5.5g)和碘甲烷(1.8g)，并且将反应在室温下搅拌18h。然后将水和EtOAc添加至反应混合物中。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯(1.2g)和2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯(0.54g)。
1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯：LC/MS ESI(m/z):192[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.17(d,J＝1.2Hz,1H),8.44(t,J＝1.0Hz,1H),8.41(d,J＝0.9Hz,1H),4.17(s,3H),3.92(s,3H)。
2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲酸甲酯：LC/MS ESI(m/z):192[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.23(d,J＝1.2Hz,1H),8.78(s,1H),8.28(t,J＝1.0Hz,1H),4.28(s,3H),3.89(s,3H)。
步骤2.(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇的合成
在0℃下向1-甲基-1H-吡唑并[43-c]吡啶-6-甲酸甲酯(350mg)在THF(5mL)中的溶液中添加氢化铝锂(208.42mg)，并且将混合物在25℃下搅拌2h。然后将混合物用NaOH水溶液(2M)淬灭并且用DCM萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到呈黄色油状物的(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇(160mg)，将其直接用于下一步骤中。LC/MSESI(m/z):164[M+H]+
步骤3. 1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲醛的合成
向(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇(160mg)在DCM(5mL)中的溶液中添加二氧化锰(426.3mg)。将混合物在25℃下搅拌3h。然后将混合物过滤，并且将滤液在真空中浓缩以提供残余物，将残余物直接用于下一步骤中反应。LC/MS ESI(m/z):265[M+H]+
步骤4.甲基(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在室温下向(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇(140mg)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(105.3mg)和硫酸铜(II)(693.3mg)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝2:1)纯化以得到呈黄色固体的(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(110mg)。LC/MS ESI(m/z):265[M+H]+。
步骤5.(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在N2下向(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(110mg)在THF(5mL)中的溶液中添加CH3MgBr(0.41mL，在醚中3M)，并且将混合物在-78℃下搅拌1h。LC/MS显示反应完成。然后将反应混合物用冰水淬灭并且用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM/MeOH＝10:1)纯化以得到呈浅黄色油状物的(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(80mg)。LC/MS ESI(m/z):281[M+H]+。
步骤6.(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
在室温下向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(85mg)在二噁烷(3.0mL)中的溶液中添加在二噁烷(253.9mg)中的4NHCl，并且将混合物在室温下搅拌2h。LC/MS显示反应完成。除去溶剂以得到(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(85mg)。LC/MS ESI(m/z):177[M+H]+。
步骤7.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(91mg)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加2-(4-异丙基苯基)乙酸(92mg)、HATU(392mg)和三乙胺(156mg)，并且将混合物在室温下搅拌2h。LC/MS显示反应完成。然后将反应混合物用冰水淬灭并且用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝3:1)并且然后用制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺(28mg)。LC/MS ESI(m/z):337[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(s,1H),8.14(s,1H),7.36(s,1H),7.20-7.11(m,4H),6.87(d,J＝7.5Hz,1H),5.28-5.24(m,1H),4.06(s,3H),3.57(s,2H),2.89 -2.85(m,1H),1.50(t,J＝8.0Hz,3H),1.23(t,J＝8.0Hz,6H)。
实施例4.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基) 乙基)乙酰胺
步骤1.(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇
在0℃下向2-甲基-2H-吡唑并[4，3-c]吡啶-6-甲酸甲酯(530mg)在THF(10mL)中的溶液中添加氢化铝锂(315.6mg)，并且将混合物在25℃下搅拌3h。然后将混合物用NaOH水溶液(2M)淬灭并且用DCM萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇(280mg，无色油状物)，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):164[M+H]+。
步骤2. 2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲醛
向(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)甲醇(280mg)在DCM(5mL)中的溶液中添加二氧化锰(0.12mL)，并且将混合物在25℃下搅拌3h。然后将混合物过滤，并且将滤液在真空中浓缩以提供粗品2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲醛，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):162[M+H]+。
步骤3.(R,E)-2-甲基-N-((2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺
将2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-甲醛(280mg)、(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(316mg)和五水硫酸铜(465mg)在DCM(5.0mL)中的溶液在25℃下搅拌3h。然后将混合物过滤并且浓缩以得到黄色油状物，将其通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝50:1至20:1)纯化以得到呈黄色固体的(R,E)-2-甲基-N-((2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(400mg)。LC/MS ESI(m/z):265[M+H]+
步骤4.(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺
在-70℃下向(R,E)-2-甲基-N-((2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(180mg)在THF(5mL)中的溶液中添加CH3MgBr(在醚中3M，2.0mL)，并且将混合物在-70℃下搅拌2h。然后将反应混合物用饱和氯化铵水溶液(5mL)淬灭并且用EtOAc(10mL)萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到黄色油状物，将其通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝50:1至20:1)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(40mg)。LC/MS ESI(m/z):281[M+H]+
步骤5.(R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐
向2-甲基-N-[(1R)-1-{2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基}乙基]丙烷-2-亚磺酰胺(40mg)在二噁烷(2mL)中的溶液中添加HCl/二噁烷(在二噁烷中4N，1mL)，并且将混合物在25℃下搅拌30min。然后将混合物浓缩以得到呈白色固体的(R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(30mg，粗品)。LC/MS ESI(m/z):177[M+H]+
步骤6.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺
将(R)-1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(30mg)、2-[4-(丙-2-基)苯基]乙酸(33.4mg)、HATU(97mg)和TEA(0.07mL)在DCM(2.0mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物产物，将其通过制备型HPLC[柱：Shim-pack GIST C18 250*21mm；流动相：10％至85％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈无色油状物的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-甲基-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺(14mg)。LC/MS ESI(m/z):337(M+H)+；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.02(s,1H),8.06(s,1H),7.40(s,1H),7.20(s,4H),6.67(d,J＝7.6Hz,1H),5.26-6.19(m,1H),4.25(s,3H),3.57-3.56(m,2H),2.94-2.87(m,1H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝8.0Hz,6H)。
实施例5.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙 基)乙酰胺
4,6-二氯-N-甲氧基-N-甲基烟酰胺的合成。
在室温下向4,6-二氯烟酸(5.0g)在DCM(70mL)中的溶液中添加HATU(10.9g，28.6)，并且将反应搅拌10min。然后在室温下添加N-甲氧基甲胺、HCl(3.0g)和TEA(10.8mL)，并且将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物用水淬灭并且用EA萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩以得到呈黄色油状物的4,6-二氯-N-甲氧基-N-甲基烟酰胺(6.0g)。LC/MS ESI:234(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.58(s,1H),7.96(s,1H),3.49(s,3H),3.32(s,3H)。
1-(4,6-二氯吡啶-3-基)乙-1-酮的合成
将4,6-二氯-N-甲氧基-N-甲基烟酰胺(6.0g)溶解在无水THF(86mL)中并且在0℃-5℃下搅拌10min。然后将MeMgBr(14mL，在醚中3M)缓慢添加至溶液中。在0℃-5℃下2h后，起始材料被消耗，并且将反应用饱和氯化铵水溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且蒸发以得到油状物。将油状物通过硅胶柱色谱纯化，得到1-(4,6-二氯吡啶-3-基)乙-1-酮(4.3g)。LC/MS ESI:190(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),7.46(s,1H),2.68(s,3H)。
步骤3.(E)-1-(4-氯-6-苯乙烯基吡啶-3-基)乙-1-酮和(E)-1-(6-氯-4-苯乙烯基吡啶-3-基)乙-1-酮的合成
向1-(4,6-二氯吡啶-3-基)乙-1-酮(228mg)和(E)-苯乙烯基硼酸(266mg)在DMF(6.0mL)中的混合物中添加Pd(PPh3)4(100mg)和2N Cs2CO3(1.8mL)。向反应充入N2三次并且在80℃下搅拌6h，将50mL的EA添加至反应中。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤。将滤液在真空中浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(在PE中的10％ EA)纯化以得到呈异构体的混合物的(E)-1-(4-氯-6-苯乙烯基吡啶-3-基)乙-1-酮和(E)-1-(6-氯-4-苯乙烯基吡啶-3-基)乙-1-酮。LC/MS ESI(m/z):258(M+H)+。
1-(4-氯-6-((E)-苯乙烯基)吡啶-3-基)乙-1-酮肟的合成(N201201-118)
向(E)-1-(4-氯-6-苯乙烯基吡啶-3-基)乙-1-酮和(E)-1-(6-氯-4-苯乙烯基吡啶-3-基)乙-1-酮(1.5g，异构体的混合物)在EtOH(25mL)和H2O(5mL)中的溶液中添加羟胺盐酸盐(0.80g)和Na2CO3(1.2g)。将反应在65℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到1-(4-氯-6-((E)-苯乙烯基)吡啶-3-基)乙-1-酮肟(307mg)。LC/MS ESI:273(M+H)+。
(E)-3-甲基-6-苯乙烯基异噁唑并[4,5-c]吡啶的合成(N201201-122)
向1-(4-氯-6-((E)-苯乙烯基)吡啶-3-基)乙-1-酮肟(307mg)在DMSO(15mL)中的溶液中添加K2CO3(466.741mg)，并且将反应在100℃下搅拌2h。在冷却至室温后，添加水和EtOAc。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(E)-3-甲基-6-苯乙烯基异噁唑并[4,5-c]吡啶(235mg)。LC/MS ESI:237M+H)+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(d,J＝0.7Hz,1H),7.877.83(m,2H),7.70(d,J＝7.3Hz,2H),7.467.42(m,3H),7.36(d,J＝7.3Hz,1H),2.64(s,3H)。
3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-甲醛的合成
在-78℃下将臭氧鼓泡通过(E)-3-甲基-6-苯乙烯基异噁唑并[4,5-c]吡啶(486mg)在无水DCM(20mL)中的溶液10min。然后将臭氧气体用氮气吹扫十分钟，并且在室温下添加PPh3(644mg)。将反应搅拌另外的40分钟。将溶剂过滤，并且将滤液在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-甲醛(150mg)。LC/MS ESI:163(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.27(s,1H),9.15(d,J＝0.4Hz,1H),8.14(d,J＝0.8Hz,1H),2.74(s,3H)。
(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
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向3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-甲醛(150mg)在无水DCM(15mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(145.8mg)和CuSO4(738mg)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应过滤并且将滤液在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(197mg)。LC/MS ESI:266(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.10(d,J＝0.9Hz,1H),8.86(s,1H),8.19(d,J＝0.9Hz,1H),2.72(s,3H),1.32(s,9H)ppm。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(N201201-131)的合成
在-78℃下在N2下向(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(197mg)在无水THF(10mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(1.2mL，在醚中3.0M)。在使得内部反应温度从不高于-60℃的速率下添加格氏试剂。在添加后，在-78℃下将反应混合物搅拌2h，然后温热至室温并且用饱和氯化铵水溶液淬灭。将有机层分离，并且将水层用乙酸乙酯萃取一次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以提供残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(187mg)。LC/MS ESI:282(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(d,J＝1.0Hz,1H),7.47(d,J＝1.2Hz,1H),4.724.63(m,2H),2.64(s,3H),1.57(d,J＝6.5Hz,3H),1.26(s,9H)。
(R)-1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(172mg)在二噁烷(6.0mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(2.0mL)。将反应在室温下搅拌20min，并且将混合物浓缩以提供(R)-1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐作为残余物，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI:178(M+H)+。
(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺的合成
将(R)-1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(108mg)溶解在无水DCM(10mL)中并且然后添加2-(4-异丙基苯基)乙酸(119.5mg)、HATU(347.6mg)和DIPEA(0.2mL)。将反应在室温下搅拌1h，并且将混合物用水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：Shim-pack GIST C18 250*21mm；流动相：10％至95％ MeCN与H2O(0.1％NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基异噁唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺(93.7mg)。LC/MS ESI:338(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H),7.34(s,1H),7.23-7.18(m,4H),6.60(d,J＝7.3Hz,1H),5.29-5.22(m,1H),3.57(s,2H),2.95-2.90(m,1H),2.63(s,3H),1.46(d,J＝6.9Hz,3H),1.26(d,J＝6.9Hz,6H)。
实施例6.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙 基)乙酰胺
2,5-二氯-N-甲氧基-N-甲基异烟酰胺的合成。
在室温下向2,5-二氯异烟酸(5.0g)在DCM(70mL)中的溶液中添加HATU(10.9g)，并且将反应在室温下搅拌10min。然后将盐酸盐N-甲氧基甲胺(3.0g)和TEA(10.8mL)添加至反应混合物中，并且将混合物溶液在室温下搅拌2h。将反应用水淬灭并且用EA萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的2,5-二氯-N-甲氧基-N-甲基异烟酰胺(6.0g)。
1-(2,5-二氯吡啶-4-基)乙-1-酮的合成。(N201201-101)
将2,5-二氯-N-甲氧基-N-甲基异烟酰胺(5.0g)溶解在无水四氢呋喃(71mL)中并且在0-5℃下在N2下搅拌10min。然后，将CH3MgBr(11mL，在醚中3.0M)缓慢添加至溶液中，并且将反应在0-5℃下搅拌2h。将反应用饱和氯化铵水溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到油状物，将油状物通过硅胶柱色谱纯化以得到1-(2,5-二氯吡啶-4-基)乙-1-酮(3.4g)。LC/MS ESI(m/z):189.9[M+H]+
(E)-1-(5-氯-2-苯乙烯基吡啶-4-基)乙-1-酮的合成
向1-(2,5-二氯吡啶-4-基)乙-1-酮(1.1g)、(E)-苯乙烯基硼酸(1.3g)在DMF中的溶液中添加2.0N Cs2CO3(6.0mL)和Pd(PPh3)4(420mg)。将反应混合物在80℃下搅拌5小时。添加EA(50mL)和H2O(40mL)。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(用在PE中的10％ EA洗脱)纯化以得到呈黄色固体的(E)-1-(5-氯-2-苯乙烯基吡啶-4-基)乙-1-酮(900mg)。
1-(5-氯-2-((E)-苯乙烯基)吡啶-4-基)乙-1-酮肟的合成
向1-(5-氯-2-苯乙烯基吡啶-4-基)乙-1-酮(1.48g)在EtOH(25mL)和H2O(5mL)中的溶液中添加NH2OH·HCl(0.8g)和Na2CO3(1.21g)。将反应在65℃下搅拌过夜。然后将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到1-(5-氯-2-((E)-苯乙烯基)吡啶-4-基)乙-1-酮肟(294mg)。LC/MS ESI(m/z):273[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),8.71(s,1H),7.76-7.70(m,3H),7.57(s,1H),7.49(t,J＝7.4Hz,2H),7.40(t,J＝11.7Hz,2H),2.18(s,3H)ppm。
(E)-3-甲基-5-苯乙烯基异噁唑并[5,4-c]吡啶的合成
向1-(5-氯-2-((E)-苯乙烯基)吡啶-4-基)乙-1-酮肟(294mg)在DMSO(10mL)中的溶液中添加K2CO3(448.2mg)。将反应在100℃下搅拌2h。在冷却至室温后，将水和EtOAc添加至反应混合物中。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色固体的(E)-3-甲基-5-苯乙烯基异噁唑并[5,4-c]吡啶(231mg)。LC/MS ESI(m/z):237[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.17(s,1H),8.06(s,1H),7.69(t,J＝11.2Hz,3H),7.50-7.39(m,3H),7.33(t,J＝7.3Hz,1H),2.63(s,3H)。
3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-甲醛的合成(N201201-109/115)
在-78℃下将臭氧鼓泡通过(E)-3-甲基-5-苯乙烯基异噁唑并[5,4-c]吡啶(483mg)在无水DCM(10mL)中的溶液10min。然后将过量的臭氧气体用氮气吹扫，随后添加三苯基膦(644mg)。将混合物搅拌另外的40min并且然后在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-甲醛(200mg)。LC/MS ESI(m/z):163[M+H]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.23(s,1H),9.16(s,1H),8.35(d,J＝0.9Hz,1H),2.70(s,3H)。
(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-甲醛(0.23g)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.26g)和CuSO4(1.15g)，并且将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应溶液过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(309mg)。LC/MS ESI(m/z):266[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.33(d,J＝1.1Hz,1H),8.69-8.62(m,2H),2.69(s,3H),1.24(s,9H)ppm。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下向(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(337mg)在无水四氢呋喃(5.0mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(1.7mL，在Et2O中3.0M)。在使得内部反应温度从不高于-60℃的速率下添加格氏试剂。在添加后，将混合物在-78℃下搅拌3h，然后温热至室温。将反应用饱和氯化铵水溶液淬灭。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(226mg)。LC/MS ESI(m/z):282[M+H]+。
(R)-1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(219mg)在二噁烷(3mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(1mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。然后将混合物在真空中浓缩以得到(R)-1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的粗产物，将其按原样用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):178[M+H]+。
(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将(R)-1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(137mg)溶解在无水DCM(15mL)中并且然后将2-[4-(丙-2-基)苯基]乙酸(151.6mg)、HATU(587.9mg)和TEA(0.32mL)添加至溶液中。将反应在室温下搅拌1h并且然后用水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈无色油状物的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基异噁唑并[5,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(146.8mg)。LC/MS ESI(m/z):338[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),7.48(s,1H),7.20-7.16(m,4H),6.55(d,J＝7.6Hz,1H),5.32-5.25(m,1H),3.55(s,2H),2.92-2.89(m,1H),2.60(s,3H),1.47(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,6H)。
实施例7.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基) 乙基)乙酰胺
甲基1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
将1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(480mg)、1-碘丙烷(0.35mL)和Cs2CO3(1.6g)在DMF(1.0mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈白色固体的1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(185mg)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.22(s,1H),9.06(s,1H),8.39(d,J＝1.2Hz,1H),8.24(s,1H),4.51(t,J＝7.2Hz,2H),2.06-2.04(m,2H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H)。和呈白色固体的2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(125mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.18(s,1H),9.32(s,1H),8.32(d,J＝1.2Hz,1H),8.20(s,1H),4.49(t,J＝7.2Hz,2H),2.12-2.08(m,2H),0.98(t,J＝7.2Hz,3H)。
(R,E)-2-甲基-N-((1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成(N201201-161)
向1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(185mg)在无水DCM(11mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(154.0mg)和CuSO4(234.1mg)。将反应在室温下搅拌过夜。将固体用硅藻土过滤。然后，将滤液浓缩以提供残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(233mg)。LC/MS ESI(m/z):293[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H),8.64(s,1H),8.54(s,1H),8.40(s,1H),4.57(t,J＝6.9Hz,2H),1.94-1.89(m,2H),1.22(s,9H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成(N201201-166)
在N2下向(R,E)-2-甲基-N-((1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(233mg)在无水THF(10mL)中的溶液中逐滴添加3M CH3MgBr(1.328mL，在醚中3M)，并且将反应在-60℃下搅拌2h。将反应用NH4Cl水溶液淬灭并且用EA萃取。将合并的萃取物用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(146mg)。LC/MS ESI(m/z):309[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(s,1H),8.19(d,J＝0.6Hz,1H),7.80(d,J＝0.6Hz,1H),5.63(d,J＝7.5Hz,1H),4.62-4.44(m,2H),1.93-1.84(m,2H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H),1.14(s,9H),0.83(t,J＝7.4Hz,3H)ppm。
(R)-1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(95mg)在二噁烷(3mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(1.0mL)。将反应在室温下搅拌30min。然后将混合物浓缩以提供(R)-1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙胺盐酸盐，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):205[M+H]+。
(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙胺盐酸盐(82mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.12mL，溶液A)。向2-(4-异丙基苯基)乙酸(78.7mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(167.9mg)并且在室温下搅拌3min(溶液B)。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。将混合物用水稀释，并且将水相用DCM(10mL x3)萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC Triart C18250*20mm I.D.5um；流动相：10％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：14mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-丙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。LC/MS ESI(m/z):365[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(s,1H),7.98(s,1H),7.49(s,1H),7.19(s,4H),6.62(d,J＝7.8Hz,1H),5.28-5.21(m,1H),4.42(t,J＝7.0Hz,2H),3.56 -3.55(m,2H),2.92-2.88(m,1H),2.00-1.96(m,2H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,6H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例8.(R)-N-(1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基 苯基)乙酰胺
5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶的合成
在冰浴中向6-溴-4-甲基吡啶-3-胺(1.0g)在乙酸(60mL)中的溶液中添加亚硝酸钠(0.37mL)。将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应浓缩并且然后用饱和NaHCO3水溶液处理。将水性混合物用EA萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(442mg)。LC/MS ESI(m/z):198[M+H]+。
1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
在-78℃下向5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(3.3g)在无水THF(100mL)中的溶液中添加n-BuLi(20.0mL，在THF中2N)。将混合物在-78℃下搅拌1h。然后在-78℃下将DMF(3.87mL)添加至混合物中并且将混合物在-78℃下搅拌1h。将反应温热至室温并且用NH4Cl溶液淬灭。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈白色固体的1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1.0g)。LC/MS ESI(m/z):148[M+H]+
1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
将1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(480mg)、碘乙烷(0.35mL)和Cs2CO3(1.6g)在DMF(1.0mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。然后将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈白色固体的1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(185mg)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.11(s,1H),9.39(s,1H),8.53-8.39(m,2H),4.65(q,J＝7.2Hz,2H),1.47(t,J＝7.2Hz,3H)。和呈白色固体的2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(125mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):10.05(s,1H),9.36-9.23(m,1H),8.85(s,1H),8.43(d,J＝1.2Hz,1H),4.60(q,J＝7.2Hz,2H),1.55(t,J＝7.2Hz,3H)。
(R,E)-N-((1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(186mg)在无水DCM(10mL)中的溶液中添加2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(157.6mg)和CuSO4(239.4mg)。将反应在室温下搅拌过夜。然后将混合物过滤，并且将滤液在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶纯化以得到呈白色固体的(R,E)-N-((1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(207mg)。LC/MS ESI(m/z):279[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(s,1H),8.64(s,1H),8.54(d,J＝1.2Hz,1H),8.39(d,J＝0.6Hz,1H),4.66-4.61(m,2H),1.47(t,J＝7.2Hz,3H),1.22(s,9H)ppm。
(R)-N-((R)-1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向(R,E)-N-((1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(207mg)在无水THF(15mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(1.24mL，在醚中3.0M)。将反应在-60℃下搅拌2h。然后将反应用饱和NH4Cl溶液淬灭。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色油状物的(R)-N-((R)-1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(103mg)：LC/MS ESI(m/z):295[M+H]+。
(R)-1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-N-((R)-1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(142mg)在二噁烷(3mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(1mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。然后将混合物浓缩以提供(R)-1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):191[M+H]+。
(R)-N-(1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙胺盐酸盐(134mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.5mL)以提供溶液A。向2-(4-异丙基苯基)乙酸(95.9mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(225mg)并且在室温下搅拌3min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：Xbudge prep C18 250*19mm 5um OBD；流动相：10％至95％ MeCN与H2O(0.1FA)；流速：20mL/min；波长：205nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺(44.8mg)。LC/MS ESI(m/z):351[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H),7.97(s,1H),7.49(s,1H),7.19(s,4H),6.62(d,J＝7.2Hz,1H),5.28-5.21(m,1H),4.52(q,J＝7.3Hz,2H),3.55(s,2H),2.92-2.87(m,1H),1.56(t,J＝7.3Hz,3H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,6H)。
实施例9.(R)-N-(1-(1-乙基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基 苯基)乙酰胺
步骤1. 1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
将1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(760mg)、1,1,1-三氟-2-碘乙烷(0.51mL)和Cs2CO3(2.5g)在DMF(10mL)中的溶液在100℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈黄色固体的1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(500mg)。LC/MS ESI(m/z):230[M+H]+。
步骤2.(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
将1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(500mg)、(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(396.7mg)和五水硫酸铜(1.0g)在DCM(15mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈黄色固体的(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(450mg)。LC/MS ESI(m/z):333[M+H]+。
步骤3.(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下向(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(450mg)在THF(5mL)中的溶液中添加CH3MgBr(在醚中3.0M，1.35mL)。将混合物在-78℃下搅拌2h。将混合物用NH4Cl溶液淬灭并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化以得到呈黄色固体的(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(350mg)。LC/MS ESI(m/z):349[M+H]+。
步骤4.(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(300mg)在二噁烷(2.0mL)中的溶液中添加HCl/二噁烷(在二噁烷中4N，2.0mL)。将混合物在25℃下搅拌30min。将混合物浓缩以得到呈白色固体的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(300mg，粗品)。LC/MSESI(m/z):245[M+H]+。
步骤5.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(300mg)、2-[4-(丙-2-基)苯基]乙酸(240.8mg)、HATU(560.49mg)和DIEA(0.41mL)在DCM(10mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水洗涤。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：50％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：20mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPakIA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(128.6mg)。LC/MS ESI(m/z):405(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.85(s,1H),8.08(s,1H),7.54(s,1H),7.24-7.12(m,4H),6.58(d,J＝7.6Hz,1H),5.27-5.24(m,1H),5.03(q,J＝8.4Hz,2H),3.59-3.51(m,2H),2.95-2.85(m,1H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.8ppm。
实施例10.(R)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三 氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺
1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醛的合成
向1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醛(594mg)在无水DMF(10mL)中的溶液中添加Cs2CO3(1.97g)和碘甲烷(630.3mg)，并且在室温下将反应搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl溶液洗涤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醛(285mg)。1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醛：LC/MS ESI(m/z):162[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.15(d,J＝1.3Hz,1H),9.06(s,1H),8.81(s,1H),8.41(d,J＝2.1Hz,1H),4.12(d,J＝1.2Hz,3H)。
2-甲基-2H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醛：LC/MS ESI(m/z):162[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.07(s,1H),9.01(d,J＝2.1Hz,1H),8.86(d,J＝2.1Hz,1H),8.75(s,1H),4.25(s,3H)。
(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醛(285mg)在无水DCM(15mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(278.6mg)和CuSO4(423.4mg)，并且将反应在室温下搅拌过夜。将溶液通过硅藻土垫过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(158mg)。LC/MS ESI(m/z):265[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.06(d,J＝1.9Hz,1H),8.74(s,1H),8.51(d,J＝1.9Hz,1H),8.13(s,1H),4.20(s,3H),1.29(s,9H)ppm。
步骤3.(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(407mg)在无水THF(30mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(9.0mL，在醚中3.0M)并且将反应在-78℃下搅拌6h。将反应用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物分离，用饱和NaCl溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(236mg)。LC/MS ESI(m/z):281[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,J＝2.0Hz,1H),8.04-7.95(m,2H),4.79-4.73(m,1H),4.16(s,3H),3.43(d,J＝2.7Hz,1H),1.63(d,J＝6.7Hz,3H),1.21(s,9H)。
步骤4.(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(77mg)在二噁烷(3mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(1.0mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。然后将混合物浓缩以提供(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐并且直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):177[M+H]+。
步骤5.(R)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(107mg)在无水DMF(4.0mL)中的溶液中添加DIEA(0.5mL)以提供溶液A。向2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酸(134.8mg)在无水DMF(4.0mL)中的溶液中添加HATU(230.9mg)并且在室温下搅拌10min以提供溶液B。然后将溶液B添加至溶液A中并且在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl溶液洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。然后将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC Triart C18 250*20mm I.D.5um；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到(R)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺(67.3mg)。LC/MSESI(m/z):403[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(s,1H),7.94(s,1H),7.88(s,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.22(d,J＝8.2Hz,2H),5.71(d,J＝7.4Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),4.14(s,3H),3.56(s,2H),1.52(d,J＝7.0Hz,3H),1.37-1.34(m,2H),1.02-1.01(m,2H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.08(s)。
实施例11.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基) 乙基)乙酰胺
(R,E)-2-甲基-N-((2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在室温下向2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(34mg)在CH2Cl2(2mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(28.3mg)和五水硫酸铜(129.5mg)。将反应在室温下搅拌过夜，并且LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取。将合并的萃取物浓缩，并且残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝3:1)纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(25mg，黄色固体)。LC/MS ESI(m/z):293[M+H]+。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在氮气下向(R,E)-2-甲基-N-((2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(100mg)在THF(3.0mL)中的溶液中添加CH3MgBr(0.45mL；在醚中3M)。将混合物在-78℃下搅拌2h，并且LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝3:1)纯化以得到呈黄色固体的(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(80mg)。LC/MS ESI(m/z):309[M+H]+。
(R)-1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
在室温下向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(80mg)在二噁烷(3mL)中的溶液中添加HCl-二噁烷(0.18mL，在二噁烷中4N)。将混合物在室温下搅拌2h，并且LC/MS显示反应完成。将溶剂浓缩以得到(R)-1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(120mg，黄色固体)，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):204[M+H]+。
步骤4.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
向2-(4-异丙基苯基)乙酸(50mg)在DMF(3.0mL)中的溶液中添加(R)-1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(57.0mg)、HATU(160mg)和DIEA(108.6mg)。将混合物在室温下搅拌2h，并且LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝1:1)纯化并且进一步通过制备型HPLC[柱：YMC-Triart C18 250*20.0mm；流动相：80％至5％ H2O(0.1％ FA)，20％至95％ MeCN；流速：20mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPakIA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到呈无色油状物的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(2-丙基-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(6.7mg)。LC/MS ESI(m/z):365[M+H]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),7.89(s,1H),7.39(s,1H),7.17(s,4H),6.66(d,J＝7.7Hz,1H),5.23-5.15(m,1H),4.42(t,J＝7.1Hz,2H),3.53-3.52(m,2H),2.90-2.85(m,1H),2.08-2.02(m,2H),1.44(t,J＝6.9Hz,3H),1.24(d,J＝6.9Hz,6H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例12.(R)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三 氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺
(R)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(41.2mg)在无水DMF(5.0mL)中的溶液中添加DIEA(0.21mL)以提供溶液A。向2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酸(51.9mg)在无水DMF(5.0mL)中的溶液中添加HATU(88.9mg)并且在室温下搅拌5min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：14mL/min；波长：220nm/254nm)和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到(R)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺(28.5mg)。LC/MS ESI(m/z):403[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.80(s,1H),7.97(s,1H),7.49(s,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.24(d,J＝8.1Hz,2H),6.74(d,J＝7.6Hz,1H),5.27-5.20(m,1H),4.17(s,3H),3.57(s,2H),1.47(d,J＝6.8Hz,3H),1.36-1.34(m,2H),1.04-1.00(m,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.07(s)。
实施例13.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基) 乙基)乙酰胺
5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-醇的合成
将3,6-二氯哒嗪-4-甲酸甲酯(500mg)、硫酸甲基肼(417g)和DIEA(1.1g)在MeOH(20mL)中的溶液在70℃下搅拌12h。将混合物浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝50:1至10:1)纯化以提供呈橙色固体的5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-醇(400mg)。LC/MS ESI(m/z):185(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.90(s,1H),8.23(s,1H),3.96(s,3H)。
三氟甲磺酸5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-基酯的合成
向5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-醇(2.0g)在DCM(30mL)中的溶液中添加N-双(三氟甲烷磺酰基)苯胺(7.7g)、TEA(4.5mL)和DMAP(264.7mg)。将混合物在25℃下搅拌12h并且然后用水洗涤。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:DCM＝50:1至0:1)纯化以得到呈白色固体的三氟甲磺酸5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-基酯(600mg)。LC/MS ESI(m/z):317[M+H]+。
5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪的合成
将三氟甲磺酸5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-3-基酯(1.1g)、Pd(PPh3)4(0.20g)和三乙基硅烷(1.12mL)在DMF(2mL)中的溶液在60℃下搅拌12h。将混合物用水和DCM稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:DCM＝50:1至0:1)纯化以得到呈白色固体的5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪(400mg)。LC/MS ESI(m/z):169[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.00(s,1H),7.79(s,1H),4.28(s,3H)。
1-甲基-5-乙烯基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪的合成
向5-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪(400mg)、乙烯基硼酸频哪醇酯(0.80mL)、K3PO4(1.2g)和二氯[1,1'-双(二环己基膦基)二茂铁]钯(II)(179.3mg)在二噁烷(20mL)和H2O(4mL)中的溶液中充入N2并且在100℃下在N2下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过色谱(PE:DCM＝50:1至0:1)纯化以得到呈黄色固体的1-甲基-5-乙烯基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪(400mg，粗品)，将其用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):161[M+H]+。
1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-甲醛的合成
在-78℃下将臭氧鼓泡通过1-甲基-5-乙烯基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪(382mg)在无水DCM(10mL)中的溶液10min。将过量的臭氧用氮气吹扫10min，并且然后添加PPh3(751mg)并且在室温下搅拌40min。将反应混合物在真空中浓缩以得到粗产物，将其用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):163[M+H]+。
(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-甲醛(400mg)在无水DCM(10mL)中的溶液中添加CuSO4(1.18g)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(358.8mg)，并且将反应在室温下搅拌过夜。将溶液通过硅藻土垫过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(255mg)。LC/MSESI(m/z):266[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.26(s,1H),8.59(s,1H),8.24(s,1H),4.42(s,3H),1.32(s,9H)。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在氮气下向(R,E)-2-甲基-N-((1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(205mg)在无水THF(15mL)中的溶液中逐滴添加3M CH3MgBr(1.29mL，在醚中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h。然后将反应用饱和NH4Cl溶液淬灭并且用EA萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(50mg)。LC/MS ESI(m/z):282[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(s,1H),7.87(s,1H),4.95(t,J＝6.8Hz,1H),4.35(s,3H),1.71(d,J＝6.8Hz,3H),1.26(s,9H)ppm。
(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(55mg)在二噁烷(1.5mL)中的溶液中添加4M HCl-二噁烷(1mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。然后将混合物浓缩以提供(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙-1-胺盐酸盐作为残余物，然后将其用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):178[M+H]+。
(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙基)乙酰胺的合成(N201201-266)
向(R)-1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙-1-胺盐酸盐(61mg)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(242.6mg，0.31mL)以提供溶液A。向2-(4-异丙基苯基)乙酸(55.8mg)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(131mg)并且在室温下搅拌5min以提供溶液B。将溶液B添加至溶液A中并且在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ TFA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(1-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]哒嗪-5-基)乙基)乙酰胺(14.6mg)。LC/MS ESI(m/z):338[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.75(s,1H),7.19(s,4H),6.68(d,J＝7.6Hz,1H),5.48-5.41(m,1H),4.34(s,3H),3.55-3.54(m,2H),2.93-2.86(m,1H),1.60(d,J＝6.9Hz,3H),1.24(d,J＝6.9Hz,6H)ppm。
实施例14.(R)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)- 2-(4-异丙基苯基)乙酰胺
4-甲基苯磺酸2,2-二氟丙酯的合成
向2,2-二氟丙-1-醇(2.0g)在无水DCM(40mL)中的溶液中添加TEA(8.7mL)。在0℃下将TsCl(11.9g)添加至反应溶液中，并且将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应用水稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到4-甲基苯磺酸2,2-二氟丙酯(5g)。LC/MS ESI(m/z):251[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝8.3Hz,2H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),4.09(t,J＝11.1Hz,2H),2.47(s,3H),1.64(t,J＝18.7Hz,3H)ppm；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-98.43(s)。
1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
向1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(498mg)在无水DMF(30mL)中的溶液中添加Cs2CO3(1.3g)和4-甲基苯磺酸2,2-二氟丙酯(1.0g)。将反应在100℃下搅拌过夜，并且然后将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(181mg)。LC/MS ESI(m/z):226[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.23(s,1H),9.13(s,1H),8.41(d,J＝1.2Hz,1H),8.29(s,1H),4.88(t,J＝12.1Hz,2H),1.67(t,J＝18.7Hz,3H)ppm。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-93.83(s)。
(R,E)-N-((1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(209mg)在无水DCM(14mL)中的溶液中添加CuSO4(444.4mg)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(146.2mg)。将反应在室温下搅拌过夜，然后将溶液通过硅藻土垫过滤，并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-N-((1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(229mg)。LC/MS ESI(m/z):329[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.84(s,1H),8.36(d,J＝1.1Hz,1H),8.23(d,J＝0.6Hz,1H),4.86(t,J＝12.1Hz,2H),1.66(t,J＝18.4Hz 3H),1.31(s,9H).ppm。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-93.83(s)。
(R)-N-((R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在氮气下向(R,E)-N-((1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(229mg)在无水THF(9.0mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(1.2mL，在醚中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h。然后将反应溶液用NH4Cl水溶液淬灭并且用EA萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，干燥，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色油状物的(R)-N-((R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(193mg)。LC/MS ESI(m/z):345[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.97(s,1H),8.06(d,J＝0.5Hz,1H),7.62(d,J＝0.9Hz,1H),4.79(t,J＝12.0Hz,2H),4.73-4.66(m,1H),4.49(d,J＝6.2Hz,1H),1.68-1.56(m,6H),1.25(s,9H).ppm。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-93.56(d,J＝5.5Hz)。
(R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-N-((R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(153mg)在二噁烷(3.0mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(1.5mL)。将反应在室温下搅拌30min，并且然后将混合物浓缩以提供粗品(R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):241[M+H]+
(R)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(123mg)在无水DMF(3mL)中的溶液中添加DIEA以提供溶液A。向2-(4-异丙基苯基)乙酸(80.75mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(156mg)并且在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液B添加至溶液A中并且在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x 21.3mmI.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到(R)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺(98.6mg)。LC/MS ESI(m/z):401[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),8.04(s,1H),7.51(s,1H),7.19(s,4H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),5.29-5.22(m,1H),4.78(t,J＝12.0Hz,2H),3.55-3.54(m,2H),2.94-2.87(m,1H),1.66-1.56(m,3H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,6H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-93.56(s)。
实施例15.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙 基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺
(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺的合成
将2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酸(96.4mg)和HATU(269.5mg)在3mL DMF中的溶液在室温下搅拌15min(溶液A)。将DIEA(0.48mL)添加至在2mL DMF中的(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(参见实施例9，150mg)中，直至通过湿pH纸得出溶液的pH高于7(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将反应搅拌1小时，之后LCMS显示反应完成。将反应用EA和水稀释。将两相分离，将水相用DCM(10mL x 2)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，用在DCM中的甲醇(0-7％)洗脱以得到粗产物，将粗产物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus TriartC18 250*20mm；流动相：28％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.2mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；流速：50mL/min；波长：210nm)纯化以得到呈白色固体的N-[(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙基]-2-[4-(三氟甲基)苯基]乙酰胺(92.1mg)。LC/MS ESI(m/z):431[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.87(s,1H),8.10(s,1H),7.63-7.51(m,3H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),6.72(d,J＝6.9Hz,1H),5.26-5.24(m,1H),5.04(q,J＝8.3Hz,2H),3.63(s,2H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H)。19F-NMR(377MHz,CDCl3):δ-62.54,-70.81。
实施例16.(R)-2-(6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)- 1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(1,1-二氟乙基)-5-甲基吡啶的合成
在0℃下向1-(5-甲基吡啶-2-基)乙-1-酮(2.0g)在DCM(30mL)中的溶液中添加DAST(19.6mL)。将混合物在25℃下搅拌48h。将混合物用NaHCO3溶液淬灭。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EA＝1:0至20:1)纯化以得到呈无色油状物的2-(1,1-二氟乙基)-5-甲基吡啶(1.1g)。LC/MS ESI(m/z):158[M+H]+。
5-(溴甲基)-2-(1,1-二氟乙基)吡啶的合成
向2-(1,1-二氟乙基)-5-甲基吡啶(1.02g)在CCl4(30mL)中的溶液中添加NBS(1.28g)和AIBN(0.048mL)。将反应在80℃下搅拌过夜。将反应过滤，并且将滤液在真空中浓缩以提供残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝1:0至10:1)纯化以得到5-(溴甲基)-2-(1,1-二氟乙基)吡啶(780mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝1.6Hz,1H),7.85-7.83(m,1H),7.66-7.64(m,1H),4.49(s,2H),2.07-1.97(m,3H)；LC/MS ESI(m/z):237[M+H]+。
2-(6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)乙腈的合成
向5-(溴甲基)-2-(1,1-二氟乙基)吡啶(780mg)在DMF(15mL)中的溶液中添加TMSCN(1.6mL)和K2CO3(685mg)。将反应在50℃下搅拌过夜。将反应用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到2-[6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙腈(194mg)。LC/MS ESI(m/z):183[M+H]+。
2-(6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)乙酸的合成
将2-[6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙腈(194mg)在浓HCl水溶液(3.0mL)中的溶液在100℃下搅拌2h。将混合物添加至水中并且用EA萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以提供呈白色固体的2-(6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)乙酸(110mg，粗品)。LC/MS ESI(m/z):200[M-H]-。
(R)-2-(6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-[6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙酸(110mg)和HATU(312mg)在DMF(2.0mL)中的溶液在室温下搅拌15min。然后添加(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(173.6mg)和DIEA(0.542mL，3.281)。将混合物在室温下搅拌1小时，并且LC/MS显示反应完成。将反应用EA和水稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(10mL x3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*20mm，流动相：15％至95％ MeCN与H2O(1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对IPA+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；流速：50mL/min；波长：210nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(121mg)。LC/MS ESI(m/z):428[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H),8.54(s,1H),8.13(s,1H),7.78(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.60(dd,J＝4.2,3.2Hz,2H),6.96(t,J＝14.2Hz,1H),5.28-5.24(m,1H),5.07(q,J＝8.3Hz,2H),3.62(s,2H),2.05-1.95(m,3H),1.52(t,J＝6.3Hz,3H)。19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.76,-90.68。
实施例17.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙 基)-2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酰胺
步骤1.(1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙氧基)三甲基硅烷的合成
在0℃下向5-溴噻吩-2-甲醛(8.4mL，70.7mmol)在1,2-二甲氧基乙烷(30mL)中的溶液中添加(三氟甲基)三甲基硅烷(13.7mL，91.9mmol)和氟化铯(0.26mL，7.01mmol)。将混合物在室温下搅拌3h，并且TLC显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝3:1)纯化以得到呈无色油状物的(1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙氧基)三甲基硅烷(19.6g)。
步骤2. 1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙-1-醇的合成
在0℃下向(1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙氧基)三甲基硅烷(19.4g，58.2mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中添加HCl(9.7mL，116.4mmol，12mol/L)。将混合物在室温下搅拌3h，并且TLC显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈无色油状物的1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙-1-醇(14.8g)。
步骤3. 1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮的合成
在0℃下向1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙-1-醇(17.3g，66.3mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)(30.9mL，99.4mmol)。将混合物温热至室温并且搅拌3h。TLC显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(100％ PE)纯化以得到呈浅黄色油状物的1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮(10.4g)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.64(dd,J＝2.5,1.3Hz,1H),7.17-7.12(m,1H)；19F NMR(377MHz,CDCl3):δ-72.2。
步骤4. 2-溴-5-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)噻吩的合成
在氩气气氛下将甲基三苯基碘化磷(1.8g，4.6mmol)溶解在THF(25mL)中。将悬浮液冷却0℃，然后逐滴添加n-BuLi(2.5mL，2.5N)。将混合物在0℃下搅拌10分钟，并且然后将反应冷却至-78℃。添加在THF(1.0mL)中的1-(5-溴噻吩-2-基)-2,2,2-三氟乙酮(1.0g，3.9mmol)。将混合物在-78℃下搅拌30min并且然后在室温下搅拌过夜。将反应用饱和NH4Cl淬灭并且用石油醚(10mL)萃取。将有机层用饱和NaCl洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且过滤。将滤液浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈无色油状物的2-溴-5-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)噻吩(435mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.00-6.98(m,1H),6.96-6.93(m,1H),5.82(s,1H),5.75(s,1H)。19F NMR(377MHz,CDCl3):δ-65.9。
步骤5. 2-溴-5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩的合成
在0℃下在氮气下向烘箱干燥的含有在无水四氢呋喃(5mL)中的2-溴-5-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)噻吩(200mg，0.78mmol)和甲基二苯基硫鎓四氟硼酸盐(291mg，1.0mmol)的20mL小瓶中添加双(三甲基甲硅烷基)氨基钠(在THF中1M，1.2mL)。将反应混合物在0℃下搅拌10min并且然后在室温下搅拌1h。将反应用250μL的甲醇淬灭并且将粗混合物在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过自动快速柱色谱(洗脱剂：在EA中的100PE％至50％ PE)纯化以提供呈无色油状物的2-溴-5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩(70mg)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ6.90(d,J＝3.6Hz,1H),6.86(d,J＝4.0Hz,1H),1.42-1.39(m,2H),1.15-1.11(m,2H)；19FNMR(377MHz,CDCl3):δ-70.4。
步骤6. 2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酸乙酯的合成
将配有搅拌棒的Schlenk管排空，并且用氮气回填。添加Pd2(烯丙基)2Cl2(3.65mg，0.01mmol)、BINAP(18.7mg，0.03mmol)、DMAP(6.1mg，0.05mmol)和丙二酸单乙酯钾盐(128mg，0.75mmol)。然后添加2-溴-5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩(136mg，0.5mmol)和均三甲苯(2mL)。将反应混合物在室温下在N2下在密封管中搅拌10min，然后在120℃下加热过夜。在完成后，将反应冷却至室温并且用EA(30mL)稀释。将得到的混合物用饱和NaCl洗涤并且浓缩。将残余物通过快速柱色谱(用在EA中的5％-10％PE洗脱)纯化以得到呈黄色液体的2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酸乙酯(50mg)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ6.95(d,J＝3.6Hz,1H),6.78(d,J＝4.0Hz,1H),4.21-4.16(m,2H),3.76(s,2H),1.40-1.37(m,2H),1.28(t,J＝6.8Hz,3H),1.16-1.12(m,2H)ppm；19FNMR(377MHz,CDCl3):δ-70.34ppm。
步骤7. 2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酸的合成
向2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酸乙酯(50mg，0.18mmol)在乙醇(10mL)中的混合物中添加NaOH(7.2mg，0.18mmol)，并且将混合物在回流下搅拌16h。在冷却至室温后，通过添加1N氯化氢将反应的pH调节至2。然后将反应混合物用乙酸乙酯(2x20mL)萃取，并且将合并的萃取物用饱和NaCl洗涤。将有机相浓缩以得到呈棕色固体的2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酸(40mg)。1HNMR(400MHz,CDCl3):6.96(d,J＝3.6Hz,1H),6.80(d,J＝3.6Hz,1H),3.82(s,2H),1.41-1.38(m,2H),1.16-1.14(m,2H)；19FNMR(377MHz,CDCl3):δ-70.4。
步骤8.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酰胺的合成
将2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酸(158mg)和HATU(360mg)在DMF(2.5mL)中的溶液在室温下搅拌15min。然后添加(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(200mg)和DIEA(0.63mL)，并且将混合物搅拌1小时。LC/MS显示反应完成。将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；流速：50mL/min；波长：210nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(5-(1-(三氟甲基)环丙基)噻吩-2-基)乙酰胺(80.9mg)。LC/MS ESI(m/z):477[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.12(s,1H),7.60(s,1H),6.97(d,J＝3.5Hz,2H),6.79(d,J＝3.5Hz,1H),5.28-5.24(m,1H),5.05(q,J＝8.3Hz,2H),3.78-3.68(m,2H),1.51(d,J＝6.8Hz,3H),1.39-1.35(m,2H),1.13-1.11(m,2H)；19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.32,-70.81。
实施例18.(R)-N-(1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙 基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺
1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
向1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(546mg)在无水DMF(1.5mL)中的溶液中添加Cs2CO3(1.45g)和(1-氟环丙基)甲基4-甲基苯磺酸盐(1.09g)并且将反应在室温下搅拌4h。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以提供残余物，将残余物通过硅胶柱纯化以得到1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(192mg)。LC/MS ESI(m/z):230[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.23(s,1H),9.18(d,J＝0.7Hz,1H),8.41(d,J＝1.1Hz,1H),8.27(s,1H),4.88(d,J＝21.2Hz,2H),1.29-1.10(m,2H),1.05-0.91(m,2H)。
(R,E)-N-((1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(192mg)在无水DCM(8.0mL)中的溶液中添加CuSO4(419.4mg)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(138.0mg)。将反应在室温下搅拌过夜。然后将溶液通过硅藻土垫过滤，并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-N-((1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(294mg)。LC/MS ESI(m/z):323[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.17(d,J＝0.8Hz,1H),8.83(s,1H),8.35(d,J＝1.1Hz,1H),8.20(d,J＝0.5Hz,1H),4.86(d,J＝21.0Hz,2H),1.31(s,9H),1.22-1.13(m,2H),1.01-0.93(m,2H)ppm。
(R)-N-((R)-1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在氮气下向(R,E)-N-((1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(290mg)在无水THF(12mL)中的溶液中逐滴添加CH3MgBr(1.499mL，在醚中3.0M)，并且将反应在-78℃下搅拌2h。然后将反应溶液用NH4Cl水溶液淬灭。将两相分离，并且将水相用EA萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩以提供残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R)-N-((R)-1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(228mg)。LC/MSESI(m/z):339[M+H]+。
(R)-1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
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向(R)-N-((R)-1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(212mg)在二噁烷(5mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(2.5mL)。将反应在室温下搅拌30min。将混合物浓缩并且直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):235[M+H]+
(R)-N-(1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(170mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(487mg)以提供溶液A。向2-(4-异丙基苯基)乙酸(107.8mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(252.9mg)并且在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液B添加至溶液A中，并且将得到的混合物在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到(R)-N-(1-(1-((1-氟环丙基)甲基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺(162.2mg)。LC/MS ESI(m/z):395[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(s,1H),8.03(s,1H),7.54(s,1H),7.19(s,4H),6.74(d,J＝6.9Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),4.80(d,J＝21.1Hz,2H),3.55(s,2H),2.93-2.86(m,1H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H),1.24(d,J＝6.9Hz,6H),1.18-1.13(m,2H),0.95 -0.93(m,2H)ppm；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-183.10(s)。
实施例19.(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡 唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
步骤1. 2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯
向1-溴-4-(1,1-二氟乙基)苯(0.54mL)、丙二酸单乙酯钾盐(924.0mg)、烯丙基氯化钯二聚体(26.5mg)、BINAP(135.2mg)和DMAP(442.2mg)在1,3,5-三甲基苯(10mL)中的溶液充入N2并且在140℃下搅拌1h。然后将混合物在120℃下搅拌另外12h。将反应用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝20:1)纯化以得到呈无色油状物的2-[4-(1,1-二氟乙基)苯基]乙酸乙酯(180mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47(d,J＝8.4Hz,2H),7.34(d,J＝8.0Hz,2H),4.20-4.12(m,2H),3.64(s,2H),1.91(t,J＝18.4Hz,3H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤2. 2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸
向2-[4-(1,1-二氟乙基)苯基]乙酸乙酯(150mg)在MeOH(0.5mL)中的溶液中添加NaOH(在H2O中2M，2.0mL)，并且将混合物在25℃下搅拌12h。将混合物调节至pH＝3并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤，并且浓缩以得到呈白色固体的2-[4-(1,1-二氟乙基)苯基]乙酸(110mg)。LC/MS ESI(m/z):199[M-H]-。
步骤3.(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
将(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(140mg)、2-[4-(1,1-二氟乙基)苯基]乙酸(114.8mg)、HATU(239.8mg)和DIEA(0.28mL)在DMF(5.0mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18250*20mm；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(109.9mg)。LC/MS ESI(m/z):427(M+H)+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.91(s,1H),8.12(s,1H),7.59(s,1H),7.46(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),6.77(s,1H),5.28-5.24(m,1H),5.05(q,J＝8.4Hz,2H),3.61(s,2H),1.91(t,J＝18.0Hz,3H),1.50(d,J＝6.8Hz,3H)ppm；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.78,-87.35ppm。
实施例20.(R)-2-(6-异丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并 [3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
6-(丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯的合成
向6-溴烟酸甲酯(7.0g)在二噁烷/水(20mL，9:1)中的溶液中添加4,4,5,5-四甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(6.1mL)、Pd(PPh3)4(0.75g)、PPh3(1.70g)和K2CO3(13.44g)。向混合物充入N2并且在80℃下在氮气下搅拌过夜，此时LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈白色固体的6-(丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯(4.9g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.36-8.82(m,1H),8.24(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),7.54(d,J＝8.3Hz,1H),6.00(d,J＝0.5Hz,1H),5.53-5.02(m,1H),3.94(s,3H),2.23(d,J＝0.5Hz,3H)ppm。
6-异丙基烟酸甲酯的合成
向6-(丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯(2.5g)在MeOH(20mL)中的溶液中添加10％ Pd/C(1.46mL)。将混合物在室温下在氢气下搅拌2h，并且LC/MS显示反应完成。将反应过滤，并且将溶剂浓缩以提供残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈无色油状物的6-异丙基烟酸甲酯(2.0g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.01(d,J＝2.1Hz,1H),8.29(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,1H),3.93(s,3H),3.13(m,1H),1.32(d,J＝6.9Hz,6H)ppm。
(6-异丙基吡啶-3-基)甲醇的合成
向6-异丙基烟酸甲酯(1.5g)在THF(10mL)中的溶液中添加LiAlH4(0.95g)并且将混合物在室温下搅拌4h。LC/MS显示反应完成。然后将反应混合物用冰水淬灭，并且用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝1:1)纯化以得到呈无色油状物的(6-异丙基吡啶-3-基)甲醇(1.0g)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.41(d,J＝1.7Hz,1H),7.63(dd,J＝8.0,2.3Hz,1H),7.23(d,J＝8.0Hz,1H),5.24(t,J＝5.7Hz,1H),4.48(d,J＝5.6Hz,2H),3.05-2.95(m,1H),1.22(d,J＝6.9Hz,6H)；LC/MS ESI(m/z):152[M+H]+。
步骤4. 5-(溴甲基)-2-异丙基吡啶的合成
向(6-异丙基吡啶-3-基)甲醇(1.0g)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三溴化磷(1.24mL)。将混合物在室温下搅拌过夜，此时LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈无色油状物的5-(溴甲基)-2-异丙基吡啶(1.1g)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61-8.47(m,1H),7.86-7.69(m,1H),7.30(t,J＝11.2Hz,1H),4.72(s,2H),3.12-2.90(m,1H),1.22(d,J＝6.9Hz,6H)；LC/MS ESI(m/z):214[M+H]+。
步骤5. 2-(6-异丙基吡啶-3-基)乙腈的合成
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向5-(溴甲基)-2-异丙基吡啶(1.1g)在DMF(15mL)中的溶液中添加KCN(1.67g)。将混合物在50℃下搅拌3h。LC/MS和TLC显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈无色油状物的2-(6-异丙基吡啶-3-基)乙腈(120mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(d,J＝1.7Hz,1H),7.65(d,J＝8.1Hz,1H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),3.74(s,2H),3.21-2.91(m,1H),1.31(d,J＝6.9Hz,6H)ppm；LC/MS ESI(m/z):161[M+H]+。
步骤6. 2-(6-异丙基吡啶-3-基)乙酸盐酸盐的合成
向2-(6-异丙基吡啶-3-基)乙腈(120mg)在水(3.0mL)中的溶液中添加12N HCl(1.4g)。将混合物在100℃下搅拌2h，并且LC/MS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将水相蒸发至干燥以得到呈棕色固体的2-(6-异丙基吡啶-3-基)乙酸盐酸盐(130mg)，将其直接用于下一步骤中；LC/MS ESI(m/z):180[M+H]+。
步骤7.(R)-2-(6-异丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(140mg)、2-(6-异丙基吡啶-3-基)乙酸盐酸盐(102.0mg)、HATU(239.8mg)和DIEA(0.28mL)在DMF(4.0mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。将混合物用水和DCM稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：10％至85％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2和B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(6-异丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(67.9mg)。LC/MS ESI(m/z):406(M+H)+；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.87(s,1H),8.50(s,1H),8.09(s,1H),7.81-7.74(m,1H),7.56(s,1H),7.27(s,1H),6.98-6.90(m,1H),5.29-5.22(m,1H),5.11-5.02(m,2H),3.60(s,2H),3.27-3.17(m,1H),1.50(d,J＝6.8Hz,3H),1.34-1.32(m,6H)；19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.79。
实施例21.(R)-2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟 乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
步骤1. 1-(5-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈
向NaOH(10.1g)在H2O(20mL)中的溶液中添加2-(5-溴吡啶-2-基)乙腈(5.0g)、1,2-二溴乙烷(2.2mL)、四丁基溴化铵(7.9mL)和CH3CN(80mL)。将混合物在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EA＝1:0至50:1)纯化以得到呈白色固体的1-(5-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(4.5g)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66-8.62(m,1H),8.08(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.51(dd,J＝8.4,0.6Hz,1H),1.91-1.78(m,2H),1.73-1.61(m,2H)。
步骤2. 1-(5-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲醛
在0℃下向1-(5-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(4.5g)在THF(80mL)中的溶液中添加二异丁基氢化铝(在THF中1.0M，40.3mL)并且将反应混合物在0℃下搅拌2h。将反应用MeOH(20mL)和1N HCl(30mL)淬灭并且用EtOAc萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到呈黄色油状物的1-(5-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲醛(1.8g)。LC/MS ESI(m/z):246[M+H]+。
步骤3. 5-溴-2-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶
向1-(5-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲醛(1.8g)在DCM(30mL)中的溶液中添加DAST(3.2mL)。将混合物在25℃下搅拌12h。然后将反应在0℃下用NaHCO3溶液淬灭并且用水洗涤。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EtOAc＝1:0至50:1)纯化以得到呈无色油状物的5-溴-2-[1-(二氟甲基)环丙基]吡啶(700mg)。LC/MS ESI(m/z):248[M+H]+。
步骤4. 2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸乙酯
向5-溴-2-[1-(二氟甲基)环丙基]吡啶(700mg)、丙二酸1-乙酯3-钾盐(720mg)、烯丙基氯化钯二聚体(103.2mg)、BINAP(527.1mg)和DMAP(344.7mg)在均三甲苯(10mL)中的溶液充入N2三次并且在140℃下搅拌1h。然后将混合物在120℃下搅拌另外12h。将混合物浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EtOAc＝1:0至20:1)纯化以得到呈黄色油状物的2-{6-[1-(二氟甲基)环丙基]吡啶-3-基}乙酸乙酯(430mg)。LC/MS ESI(m/z):256[M+H]+。
步骤5. 2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸
向2-{6-[1-(二氟甲基)环丙基]吡啶-3-基}乙酸乙酯(430mg)在MeOH(1.0mL)中的溶液中添加NaOH(在H2O中1M，4.0mL)，并且将混合物在25℃下搅拌30min。然后将混合物浓缩，用水稀释并且用EtOAc萃取。将水相用1N HCl水溶液调节至pH＝4并且然后冻干以得到呈白色固体的2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(230mg)。LC/MS ESI(m/z):226[M-H]-。
步骤6.(R)-2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
将2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(130mg)、(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(153.7mg)、HATU(239.3mg)和DIEA(0.284mL)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将合并的萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：Shim-packGIST C18 250*20mm；流动相：10％至95％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(6-(1-(二氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(89.4mg)。LC/MSESI(m/z):454(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.43(s,1H),8.11(s,1H),7.62(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),7.58(s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝7.4Hz,1H),6.18(t,J＝57.1Hz,1H),5.27-5.24(m,1H),5.06(q,J＝8.3Hz,2H),3.55(s,2H),1.51(d,J＝6.8Hz,3H),1.40-1.11(m,4H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.80,-119.76。
实施例22.(R)-2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)- 1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲腈的合成
在室温下向含有1,2-二溴乙烷(6.17mL)和2-(4-溴苯基)乙腈(10g)在甲苯(40mL)中的溶液的250mL圆底烧瓶中添加50％ NaOH水溶液(40mL)和四丁基溴化铵(3.17mL)。将反应混合物在室温下剧烈搅拌24h。然后将反应倒入450mL冰水溶液中，并且将此溶液用EA(130mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(150mL×2)洗涤，用盐水洗涤(150mL)，并最终经无水Na2SO4干燥，过滤。在真空中除去溶剂以提供粗产物，将粗产物通过硅胶快速色谱纯化以得到呈黄色油状物的1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲腈(7.75g)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51-7.44(m,2H),7.21-7.11(m,2H),1.81-1.67(m,2H),1.45-1.31(m,2H)ppm。
1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲醛的合成
在0℃下将1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲腈(4.0g)和二异丁基氢化铝(36.02mL)在THF(30mL)中的混合物搅拌1小时，并且允许将反应混合物温热至室温。在反应完成后，将反应混合物冷却至0℃并且用MeOH淬灭。将反应在15min内缓慢温热至室温并且然后添加1MHCl。将反应用EA萃取并且用NaCl溶液洗涤。将有机相浓缩以提供呈黄色油状物的1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲醛(3.79g，粗品)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.16(s,1H),7.51-7.46(m,2H),7.20-7.15(m,2H),1.60-1.56(m,2H),1.41-1.37(m,2H)ppm。
1-溴-4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯的合成
向1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲醛(3.79g)在DCM(40mL)中的溶液中添加DAST(22g)，并且将反应在室温下搅拌过夜。将反应用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mLx 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈黄色油状物的1-溴-4-[1-(二氟甲基)环丙基]苯(2.2g)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56-7.35(m,2H),7.29-7.26(m,2H),5.58(t,J＝56.0Hz,1H),1.21-1.07(m,2H),0.99-0.86(m,2H)ppm。19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-117.06ppm。
2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)乙酸乙酯的合成
向1-溴-4-[1-(二氟甲基)环丙基]苯(636mg)在均三甲苯(10mL)中的溶液中添加二烯丙基二氯化钯(18.8mg)、BINAP(96.2mg)、DMAP(31.4mg)和丙二酸单乙酯钾盐(657.2mg)。向反应充入N2三次并且在120℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈黄色油状物的2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)乙酸乙酯(267mg)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(d,J＝8.0Hz,2H),7.26-7.20(m,2H),5.64(t,J＝56.0Hz,1H),4.20-4.10(m,2H),3.60(s,2H),1.26(t,J＝4.0Hz,3H),1.16-1.12(m,2H),0.98-0.92(m,2H)ppm。19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-117.51ppm。
2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)乙酸的合成
在25mL圆底烧瓶中将2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)乙酸乙酯(66mg)和1MNaOH水溶液(2.0mL)和MeOH(2.0mL)合并以提供无色溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后添加水(20mL)并且将水层用EA洗涤。将水层用1M HCl水溶液酸化至pH<3，并且将混合物用EA萃取。将来自酸性水层的合并的EtOAc萃取物用饱和NaCl洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以提供呈白色固体的2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)乙酸(244mg，粗品)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(d,J＝8.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),5.63(t,J＝56.0Hz,1H),3.64(s,2H),1.16-1.11(m,2H),0.97-0.92(m,2H)ppm；19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-117.43ppm。
(R)-2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吲唑-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)乙酸(164mg)和HATU(413.5mg)在DMF(5.0mL)中的溶液在室温下搅拌15min。然后添加(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吲唑-5-基)乙-1-胺盐酸盐(230.2mg)和DIEA(0.72mL)。将反应搅拌1小时，并且LC/MS指示反应完成。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-ActusTriart C18 250*20mm；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈棕黄色固体的(R)-2-(4-(1-(二氟甲基)环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吲唑-5-基)乙基)乙酰胺(160mg)。LC/MS ESI(m/z):453(M+H)+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.88(s,1H),8.11(s,1H),7.57(s,1H),7.36(d,J＝8.1Hz,2H),7.23(d,J＝8.2Hz,2H),6.75(s,1H),5.63(t,J＝57.3Hz,1H),5.26-5.23(m,1H),5.04(q,J＝8.3Hz,2H),3.57(s,2H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H),1.14(dd,J＝6.3,4.7Hz,2H),0.95(d,J＝2.1Hz,2H)；19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.81,-117.15。
实施例23.(R)-2-(6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4- c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
5-溴-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶的合成
将5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(4.0g)、4-氟-l-碘苯(6.95g)、2-异丁酰环己酮(1.69mL)、CuI(0.77g)和Cs2CO3(12.5g)在30mL的DMA中的悬浮液用氮气脱气15min。然后将反应混合物温热至100℃并且搅拌过夜。然后将反应混合物冷却并且用DCM稀释。将有机相用1N NaOH和水洗涤，用Na2SO4干燥并且浓缩至干燥。将固体残余物悬浮在醚中，搅拌30min，并且过滤以收集呈白色固体的所需产物5-溴-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.66g)。LC/MS ESI(m/z):292(M+H)+；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H),8.24-8.14(m,1H),7.91(d,J＝4.0Hz,1H),7.76 -7.63(m,2H),7.33 -7.27(m,2H)ppm；19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-113.02。
1-(4-氟苯基)-5-乙烯基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶的合成
向5-溴-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(2.24g)在二噁烷/水5:1(100mL)中的溶液中添加2-乙烯基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(1.95mL)、K3PO4(4.07g)和Pd(dppf)Cl2(0.56g)。向反应充入N2(3x)并且在100℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物使用硅胶柱色谱(用在石油醚中的10％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到1-(4-氟苯基)-5-乙烯基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.21g)。LC/MS ESI(m/z):240(M+H)+；1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ9.17(s,1H),8.26(d,J＝10.0Hz,1H),7.76-7.65(m,3H),7.32-7.27(m,2H),7.03-6.88(m,1H),6.31(d,J＝16.0Hz,1H),5.50(d,J＝12.0Hz,1H)ppm。
1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
向1-(4-氟苯基)-5-乙烯基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.2g)在THF(80mL)和H2O(10mL)中的溶液中添加高碘酸钠(6.4g)和二水合锇酸钾(0.18g)。将反应在室温下搅拌0.5h并且然后用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物使用硅胶柱色谱(用在石油醚中的14％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(701mg)。LC/MS ESI(m/z):242(M+H)+。
(R,E)-N-((1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
将1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(700mg)、(R)-(+)-2-甲基-2-丙烷亚磺酰胺(457mg)和CuSO4(1.4g)在DCM(20mL)中的混合物在室温下搅拌过夜。LC/MS显示反应完成。将反应混合物用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EA＝5:1)纯化以提供(R,E)-N-((1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(811mg)；LC/MS ESI(m/z):345(M+H)+。
步骤5.(R)-N-((R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向(R,E)-N-((1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(300mg)在THF(10mL)中的溶液中添加CH3MgBr(4.1mL，在Et2O中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h。将反应用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(DCM:MeOH＝15:1)纯化以得到呈黄色固体的(R)-N-((R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(602mg)；LC/MS ESI(m/z):361(M+H)+。
步骤6.(R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-N-((R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(602mg)在二噁烷(10mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(5.0mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。将反应在真空中蒸发。将得到的固体过滤，用EtOAc洗涤并且然后在真空中干燥以提供呈白色固体的(R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(545mg，粗品)。LC/MS ESI(m/z):257(M+H)+。
步骤7.(R)-2-(6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸(250mg，粗品)和HATU(321.9mg)在DMF(5.0mL)中的混合物在室温下搅拌15min。然后，添加(R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(205.4mg，粗品)和DIEA(0.56mL)直至通过使用pH纸得出溶液的pH高于7。在搅拌1小时后，LC/MS显示反应完成。将反应用EA和水稀释，并且将两相分离。将水相用DCM(10mL×3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物沉淀在CH3CN中并且用CH3CN洗涤以提供149.8mg呈白色固体的产物。LC/MS ESI(m/z):416(M+H)+。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.07(s,1H),8.34(s,1H),8.20(s,1H),7.74 -7.67(m,2H),7.58-7.50(m,2H),7.337.26(m,2H),7.10(d,J＝8.0Hz,1H),6.74(d,J＝7.0Hz,1H),5.35-5.17(m,1H),3.53(s,2H),2.11-2.02(m,1H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H),1.04-0.97(m,4H)。19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-113.66。
实施例24.(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑 并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺
2-氯-5-氟吡啶1-氧化物的合成
向2-氯-5-氟吡啶(19.28mL)在30％H2O2(96mL)中的溶液中添加TFA(175mL)，并且将反应在70℃下搅拌过夜。将反应在真空中浓缩并且用甲苯稀释。然后将反应溶液再次在真空中浓缩并且用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩以得到2-氯-5-氟吡啶1-氧化物(26.2g)作为粗产物。LC/MSESI(m/z):148[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35-8.28(m,1H),7.52-7.43(m,1H),7.11-7.01(m,1H)ppm。
2-氯-5-氟-4-硝基吡啶1-氧化物的合成
在室温下向2-氯-5-氟吡啶1-氧化物(10g)在H2SO4(102mL)中的溶液中缓慢添加KNO3(27.4g)。将反应在110℃下在氮气下搅拌16h。将反应倒入0℃的冰中并且通过逐滴添加30％氢氧化铵中和，同时将温度用冰浴保持低于15℃。通过过滤收集沉淀的淡黄色晶体。然后将沉淀物通过快速硅胶色谱纯化以得到2-氯-5-氟-4-硝基吡啶1-氧化物(1.6g)。LC/MS ESI(m/z):193[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(d,J＝5.7Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H)。
2-氯-4-硝基-5-((2，2，2-三氟乙基)氨基)吡啶1-氧化物的合成
向2-氯-5-氟-4-硝基吡啶1-氧化物(1.89g)在THF(24mL)中的溶液中添加2,2,2-三氟乙-1-胺(1.568mL)，并且将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物在高真空中进一步浓缩以得到2-氯-4-硝基-5-((2,2,2-三氟乙基)氨基)吡啶1-氧化物(2.1g)。LC/MS ESI(m/z):272[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.33(s,1H),8.16(s,1H),7.98(brs,1H),3.98-3.87(m,2H)。
6-氯-N3-(2,2,2-三氟乙基)吡啶-3,4-二胺的合成
在0℃下向2-氯-4-硝基-5-((2,2,2-三氟乙基)氨基)吡啶1-氧化物(2.0g)在冰乙酸(21mL)中的溶液中缓慢添加Fe(0.209mL)。将反应在室温下搅拌1h并且将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物在真空中浓缩以得到6-氯-N3-(2,2,2-三氟乙基)吡啶-3,4-二胺(2.28g，粗品)。LC/MS ESI(m/z):226[M+H]+。
6-氯-3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶的合成
在0℃下在氮气下向6-氯-N3-(2,2,2-三氟乙基)吡啶-3,4-二胺(2.67g)和H2SO4(1.8mL)在30mL水中的溶液中缓慢添加在水(17mL)中的NaNO2(1.63g)。将反应混合物在0℃下搅拌4h，并且然后将反应用饱和NaHCO3中和至pH 8。将得到的固体收集并且通过硅胶柱纯化以得到6-氯-3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶(872mg)。LC/MSESI(m/z):237[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.96(s,1H),8.06(s,1H),5.38-5.32(m,2H)。19FNMR(377MHz,CDCl3)δ-70.30(s)。
3-(2,2,2-三氟乙基)-6-乙烯基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶的合成
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向6-氯-3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶(872mg)在二噁烷-水(25mL)中的溶液中添加乙烯基硼酸频哪醇酯(149.55mg)、K3PO4(1.9g)和Pd(dcpf)Cl2(276.38mg)。向反应充入N2并且在100℃下在氮气下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释并且通过硅藻土过滤。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到3-(2,2,2-三氟乙基)-6-乙烯基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶(807mg)。LC/MS ESI(m/z):229[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),7.93(d,J＝0.9Hz,1H),7.01-6.94(m,1H),6.38-6.33(m,1H),5.57-5.54(m,1H),5.38-5.32(m,2H)。
3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-甲醛的合成
向3-(2,2,2-三氟乙基)-6-乙烯基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶(802mg)在THF-水(8:1，30mL)中的溶液中添加NaIO4(4.5g)和锇酸钾(1.3g)，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应通过硅藻土过滤并且用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-甲醛(584mg)。LC/MS ESI(m/z):231[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.29(s,1H),9.29(s,1H),8.72(s,1H),5.46-5.40(m,2H)。
(R,E)-2-甲基-N-((3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-甲醛(584mg)在无水DCM(15mL)中的溶液中添加CuSO4(1.2g)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(399.8mg)。将反应在室温下搅拌过夜。将溶液通过硅藻土垫过滤，并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(840mg)。LC/MS ESI(m/z):334[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.26(s,1H),8.90(s,1H),8.74(d,J＝0.8Hz,1H),5.45-5.36(m,2H),1.32(s,9H)。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在氮气下向(R,E)-2-甲基-N-((3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺在无水THF(26mL)中的溶液中逐滴添加MeMgBr(4.20mL，在醚中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h。然后将反应溶液用NH4Cl水溶液淬灭并且用EA萃取。将合并的萃取物分离，用盐水洗涤，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(690mg)。LC/MS ESI(m/z):350[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),7.98(d,J＝0.7Hz,1H),5.43-5.31(m,2H),4.80-4.72(m,1H),4.51(d,J＝6.7Hz,1H),1.61(d,J＝6.7Hz,3H),1.25(s,9H)。
(R)-1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(680mg)在二噁烷(6.0mL)中的溶液中添加4N HCl-二噁烷(2.0mL)，并且将反应在室温下搅拌1h。然后将混合物在真空中浓缩并且直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):246[M+H]+。
(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺的合成(N201201-361)
向(R)-1-[3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基]乙-1-胺盐酸盐(150mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.607mL)以提供溶液A。向2-(4-环丙基苯基)乙酸(129.3mg)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(255.85mg)并且在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液B添加至溶液A中，并且将混合物在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 35％；波长：220nm)纯化以得到(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(3-(2,2,2-三氟乙基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)乙酰胺(89.3mg)。LC/MS ESI(m/z):404[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ9.06(s,1H),7.90(s,1H),7.16(d,J＝8.1Hz,2H),7.05(d,J＝8.1Hz,2H),6.48(d,J＝7.6Hz,1H),5.375.31(m,3H),3.56(s,2H),1.92-1.86(m,1H),1.48(d,J＝6.9Hz,3H),0.98-0.96(m,2H),0.70-0.68(m,2H)ppm；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.30(s)。
实施例25.(R)-2-(6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并 [3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸乙酯的合成
向2-(6-氯吡啶-3-基)乙酸乙酯(1.5g)、环丙基硼酸(1.94g)和碳酸钾(1.04g)在二噁烷(40mL)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(0.87g)并且向混合物充入N2三次并且在110℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，将反应用EA(30mL)和水(40mL)稀释，并且将两层分离。然后将水层用EA(30mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水(每个40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩。将粗产物通过硅胶色谱(5％-18％ EA/PE)纯化以得到呈无色油状物的2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸乙酯(1.21g)。LC/MS ESI(m/z):192(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.33(d,J＝4.0Hz,1H),7.51-7.48(m,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),3.70(s,3H),3.57(s,2H),2.06-2.01(m,1H),1.05-0.92(m,4H)。
2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸的合成
向250mL圆底烧瓶中添加2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸甲酯(1.2g)和50mL的MeOH。将NaOH水溶液(1N，50mL)添加至混合物中，得到无色溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并且将水层用EA萃取。将水层用1N HCl水溶液酸化至pH<3。然后将水相用EA萃取。将来自酸化水相的EtOAc萃取物用饱和NaCl溶液洗涤，过滤，并且浓缩以提供呈白色固体的2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸(2.31g，粗品)。
(R)-2-(6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-(6-环丙基吡啶-3-基)乙酸(250mg，粗品)和HATU(321.9mg)在DMF(5.0mL)中的溶液在室温下搅拌15min。然后添加(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(179.2mg)和DIEA(0.56mL)。将混合物搅拌1小时，并且LC/MS显示反应完成。将反应用EA和水稀释。将两相分离，将水相用DCM(10mL x2)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以提供残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*20mm；流动相：10％至95％ MeCN与H2O(1％ NH3.H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(141.8mg)。LC/MSESI(m/z):404(M+H)+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.86(s,1H),8.38(s,1H),8.08(s,1H),7.64(s,1H),7.54(d,J＝4.0Hz,1H),7.10(d,J＝8.0Hz,1H),6.84(s,1H),5.32-5.20(m,1H),5.14-4.95(m,2H),3.65-3.47(m,2H),2.17(s,1H),1.49(d,J＝8.0Hz,3H),1.11-1.01(m,4H)；19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.78。
实施例26.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙 基)-2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺
6-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯的合成
向6-溴烟酸甲酯(5.47g)、4,4,6-三甲基-2-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧硼杂环己烷(7.87g)、PdCl2(dppf)(1.85g)、K2CO3(26.8mL，在水中2M)在乙腈(104mL)中的混合物充入N2三次并且在80℃下加热90分钟。LC/MS显示所需产物形成。将反应混合物冷却至室温并且在水和乙酸乙酯之间分配。将两相分离并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(0-20％乙酸乙酯/PE)纯化以提供呈无色油状物的6-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯(3.6g)。LC/MS ESI(m/z):232[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ9.22(d,J＝2.4Hz,1H),8.75-8.74(m,1H),8.34-8.31(m,1H),8.25(d,J＝1.2Hz,1H),7.58(d,J＝11.6Hz,1H),3.97(s,3H)；19FNMR(376.48MHz,CDCl3):-63.98ppm。
6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸甲酯的合成
在0℃下在氮气下向6-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯(2.47g)和甲基二苯基硫鎓四氟硼酸盐(4.0g)在无水四氢呋喃(30mL)中的悬浮液中添加双(三甲基甲硅烷基)氨基钠(在THF中2M)。将反应混合物在0℃下搅拌10min并且然后在室温下搅拌1h。添加甲醇(250μL)以淬灭反应。将粗混合物在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(在PE中的10％ EA)纯化以提供呈白色固体的6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸甲酯(1.3mg)。LC/MS ESI(m/z):246[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ9.09(d,J＝2.4Hz,1H),8.26-8.23(m,1H),7.64(d,J＝8.4Hz,1H),3.95(s,3H),1.54-1.53(m,2H),1.50-1.49(m,2H)ppm；19FNMR(376.48MHz,CDCl3):δ-67ppm。
6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸的合成
向6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸甲酯(345mg)在MeOH(20mL)中的溶液中添加4.0mL的NaOH(2.0M)。将混合物在65℃下搅拌2小时，并且TLC指示反应完成。将溶剂在真空中浓缩并且将反应混合物的pH用1N HCl调节至2-3。将反应用EA(50mL)萃取，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到呈白色固体的6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸(300mg)。LC/MS ESI(m/z):232[M+H]+。
2-重氮-1-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酮的合成
将在DCM(10mL)中的6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸(300mg)冷却至0℃。添加草酰氯(1.1mL)和DMF(2滴)并且将得到的溶液在室温下搅拌2小时。然后将挥发物在真空中除去。将残余物再溶解在DCM(10mL)中并且冷却至0℃。缓慢添加TMSCHN2(1.28mL，在己烷中的2M溶液)和TEA(0.33mL)，并且将得到的溶液在5℃下保持12小时。然后将反应过滤，并且将滤液在减压下浓缩以得到呈棕色残余物的2-重氮-1-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙烯酮，将其直接用于下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):256[M+H]+。
步骤5. 2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸甲酯的合成
向2-重氮-1-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酮(600mg，粗品)在甲醇(20mL)中的混合物中添加Ag2O(175mg)。将反应在65℃下搅拌2小时。TLC显示追踪产物已形成，并且添加另外142mg Ag2O。将混合物在65℃下搅拌另外2小时。将反应在真空中浓缩并且将残余物通过硅胶柱色谱(在PE中的10％ EA-20％ EA)纯化以得到呈黄色油状物的2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸甲酯(100mg)。LC/MS ESI(m/z):260[M+H]+。
步骤6. 2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸的合成
向2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸甲酯(100mg)在MeOH(10mL)中的溶液中添加2.0mL的NaOH(2.0M)。将混合物在65℃下搅拌2小时。完成后，在减压下除去反应并且将反应的pH用1N HCl调节至2-3。将反应混合物用EA(50mL x 3)萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(70mg)。LC/MS ESI(m/z):246[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.43(d,J＝1.6Hz,1H),7.78-7.75(m,1H),7.59-7.56(m,1H),3.69(s,2H),1.43-1.40(m,2H),1.32-1.29(m,2H)ppm。19FNMR(CDCl3,-376.48):δ-69.78ppm。
步骤7.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺的合成
向2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(125.0mg)在DMF(1.0mL)中的混合物中添加HATU(213mg)，并且将混合物在室温下搅拌5min以提供溶液A。向另一个含有(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙胺盐酸盐(186mg)的圆烧瓶中添加DMF(1.0mL)和DIEA(197mg)，并且将混合物搅拌1min(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加EA(50mL)和水(40mL)，并且将有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-ActusTriart C18 250*21mm；流动相：10％至85％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到白色固体(106.9mg)。LC/MS ESI(m/z):472(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.90(s,1H),8.43(d,J＝2.0Hz,1H),8.11(s,1H),7.64-7.62(m,1H),7.58(s,1H),7.52-7.49(m,1H),6.84(d,J＝7.6Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),5.08-5.02(m,2H),3.56(s,2H),1.51(d,J＝6.4Hz,3H),1.41-1.37(m,4H)；19FNMR(377MHz,CDCl3):δ-67.70,-70.79。
实施例27.(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡 啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(4-环丙基苯基)乙酸乙酯的合成
向4-溴苯乙酸乙酯(2.0g)、环丙基硼酸(0.92g)、三环己基膦(0.23g)和K3PO4(6.11g)在甲苯/水(40mL，20:1)中的溶液中添加乙酸钯(II)(0.09g)。向反应混合物充入N2并且在100℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，将反应用EA和水稀释，并且将两层分离。将水层用EA(20mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水(每个40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩。将残余物通过硅胶色谱(5％-18％ EA/PE)纯化以得到呈淡黄色油状物的2-(4-环丙基苯基)乙酸乙酯(1.368g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.16(d,J＝8.0Hz,1H),7.02(d,J＝8.0Hz,1H),4.15(q,J＝8.0Hz,2H),3.56(s,2H),1.90-1.84(m,1H),1.24(t,J＝8.0Hz,3H),0.95-0.92(m,2H),0.7-0.63(m,2H)。
步骤2. 2-(4-环丙基苯基)乙酸的合成
向2-(4-环丙基苯基)乙酸乙酯(1.24g)在THF(20.0mL)和MeOH(8.0mL)中的溶液中添加2.5M LiOH水溶液(12mL)，并且将得到的溶液在室温下搅拌2小时。在完成后，将混合物用1N HCl水溶液酸化，并且将水相用DCM萃取。将合并的有机层经NaSO4干燥，过滤，并且浓缩以提供呈黄色固体的2-(4-环丙基苯基)乙酸(1.04g)，将其用于下一步骤中。
步骤3.(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-(4-环丙基苯基)乙酸(100mg)和HATU(323.7mg)在DMF(5.0mL)中的溶液在室温下搅拌15min。然后添加(R)-1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(206.6mg)和DIEA(0.56mL)。将反应在室温下搅拌1小时，并且LC/MS显示反应完成。将反应用EA和水稀释。然后将两相分离。将水相用EA(10mL×3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*20mm；流动相：20％至80％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]纯化以得到呈白色固体的化合物(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(1-(4-氟苯基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(140mg)。LC/MS ESI(m/z):415(M+H)+；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.06(s,1H),8.20(s,1H),7.76-7.65(m,2H),7.60(s,1H),7.32-7.26(m,2H),7.15(d,J＝8.1Hz,2H),7.07-7.01(m,2H),6.61(s,1H),5.29-5.24(m,1H),3.64-3.44(m,2H),1.93-1.82(m,1H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H),1.02-0.88(m,2H),0.75-0.61(m,2H)。19F-NMR(377MHz,CDCl3)δ-113.57。
实施例28.(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4- c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(151mg)在无水DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(0.61mL，3.71mmol)以得到溶液A。向2-(4-环丙基苯基)乙酸(130.8mg)在DMF中的溶液中添加HATU(258.6mg)并且在室温下搅拌5min以得到溶液B。将溶液B添加至溶液A中并且在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC[柱：YMC-Actus Triart C18 250*20mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm]和SFC(柱：ChiralPakIA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(97mg)。LC/MS ESI(m/z):403[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.86(s,1H),8.08(s,1H),7.53(s,1H),7.16-7.03(m,4H),6.53(d,J＝7.6Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),5.06-5.00(m,2H),3.54-3.53(m,2H),1.93-1.86(m,1H),1.45(d,J＝6.8Hz,3H),1.03-0.90(m,2H),0.69-0.68(m,2H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.81(s)。
实施例29.(R)-2-(4-(1-氟环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑 并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
1-(2-溴-1-氟乙基)-4-甲基苯的合成
向冰冷却的1-乙烯基-4-甲基苯(9.45g)在DCM(80.0mL)中的溶液中添加三乙胺三氢氟酸(40mL)和N-溴丁二酰亚胺(17.0g)。在0℃下搅拌30min后，将反应混合物温热至室温并且搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水(500mL)中并且用NH4OH水溶液中和。将两相分离，并且将水相用DCM(600mL)萃取。将合并的有机层用0.1M HCl(600mL)、5％ NaHCO3和水(200mL)洗涤，并且经Na2SO4干燥。然后将有机层过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱(在PE中的5％ EA)纯化以得到呈无色油状物的1-(2-溴-1-氟乙基)-4-甲基苯(13.69g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(d,J＝8.0,2H),7.16(d,J＝8.0Hz,2H),5.66-5.63(m,1H),5.54-5.51(m,1H),3.70-3.61(m,3H),2.35-2.32(m,1H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-172.35(s)。
1-(1-氟乙烯基)-4-甲基苯的合成
将1-(2-溴-1-氟乙基)-4-甲基苯(2.0g)溶解在戊烷(60ml)中，并且在0℃下缓慢添加tBuOK(2.09g)。将反应混合物在回流下搅拌1h。在冷却至室温后，将混合物倒入冰水(50ml)中。在分离相后，将水相用戊烷(300ml)萃取。将合并的有机层用5％NaHCO3(50ml)、0.05M HCl(25ml)和水(50ml)洗涤。将有机相干燥(NaSO4)并且过滤。将滤液在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱(在PE中的5％ EA)纯化以得到呈无色液体的1-(1-氟乙烯基)-4-甲基苯(711mg)。1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.26(d,J＝8.0Hz,2H),5.36-5.22(m,1H),4.90-4.85(m,1H),2.33(s,3H)；19F-NMR(377MHz,DMSO)δ-107.97。
1-(2,2-二氯-1-氟环丙基)-4-甲基苯的合成
将1-(1-氟乙烯基)-4-甲基苯(500mg)、CHCl3(10mL)、NaOH(40％，10mL)和苄基三乙基氯化铵(30mg)的混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入H2O(50mL)中并且然后用CHCl3(3×20mL)萃取。将CHCl3层用H2O(3×20mL)洗涤，干燥(MgSO4)并且过滤。将滤液在减压下浓缩以提供呈无色液体的粗品1-(2,2-二氯-1-氟环丙基)-4-甲基苯(500mg)，将其直接用于下一个反应中。1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ7.40(t,J＝12.7Hz,2H),7.28(d,J＝8.0Hz,2H),2.86-2.63(m,1H),2.39-2.35(m,1H),2.33(s,3H)。
1-(1-氟环丙基)-4-甲基苯的合成
在0℃下向1-(2,2-二氯-1-氟环丙基)-4-甲基苯(500mg)在THF(10mL)中的混合物中添加四氢化铝锂(436mg)，并且将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入H2O(50mL)中并且然后用EA(3×20mL)萃取。将合并的EA层用H2O(3×20mL)洗涤，干燥(MgSO4)并且过滤。将滤液在减压下浓缩以提供呈无色液体的粗品1-(1-氟环丙基)-4-甲基苯(250mg)，将其直接用于下一步骤中。1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ7.25-7.04(m,4H),2.38 -2.25(m,3H),1.51-1.33(m,2H),1.10-1.01(m,2H)。
步骤5. 1-(溴甲基)-4-(1-氟环丙基)苯的合成
向1-(1-氟环丙基)-4-甲基苯(200mg)在CCl4(4mL)中的溶液中添加AIBN(0.02mL)和NBS(355.5mg)。将反应在80℃下搅拌16h。将反应用DCM和水稀释。将有机层分离并且在真空中浓缩以得到油状物，将油状物通过柱色谱纯化以得到呈无色油状物的1-(溴甲基)-4-(1-氟环丙基)苯(170mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.40(d,J＝8.2Hz,2H),7.23(d,J＝8.2Hz,2H),4.55(s,2H),1.52-1.37(m,2H),1.14-1.04(m,2H)。
步骤6. 2-(4-(1-氟环丙基)苯基)乙腈的合成
向1-(溴甲基)-4-(1-氟环丙基)苯(100.0mg，粗品)在DMSO(5.0mL)中的溶液中添加NaCN(107.0mg)，并且将反应混合物在40℃下搅拌过夜。然后将反应混合物倒入水(10mL)中并且用EA(20mL)萃取。将有机层分离，干燥(NaSO4)，过滤并且在真空中浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱(在PE中的5％ EA)纯化以得到呈无色油状物的2-(4-(1-氟环丙基)苯基)乙腈(30mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(dd,J＝22.6,8.2Hz,4H),3.75(s,2H),1.55-1.43(m,2H),1.11-1.00(m,2H)。
步骤7. 2-(4-(1-氟环丙基)苯基)乙酸的合成
向2-[4-(1-氟环丙基)苯基]乙腈(30mg)在H2O(3mL)中的溶液中添加过氧化钠(40mg)。将混合物在50℃下搅拌24h。然后将混合物在60℃下搅拌24h。将混合物的pH用1NHCl溶液调节至4并且用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的2-[4-(1-氟环丙基)苯基]乙酸(30mg)。LC/MS ESI(m/z):193[M-H]-；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.29(d,J＝8.2Hz,2H),7.24(d,J＝8.2Hz,2H),3.66(s,1H),1.53-1.48(m,1H),1.48-1.42(m,2H),1.10-1.01(m,2H)。
步骤8.(R)-2-(4-(1-氟环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-[4-(1-氟环丙基)苯基]乙酸(30mg)、(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(49.0mg)、HATU(64.6mg)和DIEA(0.077mL)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将合并的有机萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18250*21mm；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-(1-氟环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(26.9mg)。LCMS ESI(m/z):421(M+H)+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.12(s,1H),7.59(s,1H),7.31-7.27(m,2H),7.24(d,J＝8.4Hz,2H),6.71(s,1H),5.35-5.20(m,1H),5.18-4.93(m,2H),3.59(s,2H),1.52-1.46(m,5H),1.10-1.02(m,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.78,-179.26。
实施例30. 2-(4-(2,2-二氟环丙基)苯基)-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H- 吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺非对映异构体A
步骤1. 1-溴-4-(2,2-二氟环丙基)苯
将1-溴-4-苯乙烯(2.50mL)、三甲基(溴二氟甲基)硅烷(4.46mL)和四丁基溴化铵(0.178mL)在甲苯(50mL)中的溶液在110℃下搅拌12h。将混合物浓缩至残余物，并且将残余物通过硅胶色谱(PE:EA＝1:0至50:1)纯化以得到呈无色油状物的外消旋1-溴-4-(2,2-二氟环丙基)苯(4.2g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50-7.43(d,J＝8.5Hz,2H),7.10(d,J＝8.5Hz,2H),2.78-2.61(m,1H),1.92-1.74(m,1H),1.66-1.56(m,1H)。
步骤2. 2-(4-(2,2-二氟环丙基)苯基)乙酸乙酯
向1-溴-4-(2,2-二氟环丙基)苯(4g)、丙二酸1-乙酯3-钾盐(4.38g)、烯丙基氯化钯二聚体(0.13g)、BINAP(0.64g)和DMAP(2.10g)在均三甲苯(10mL)中的溶液充入N2。将混合物在140℃下搅拌1h并且然后在120℃下搅拌12h。将混合物浓缩以得到残余物，并且将残余物通过硅胶色谱(PE:EtOAc＝1:0至50:1)纯化以得到呈白色固体的2-[4-(2,2-二氟环丙基)苯基]乙酸乙酯(1.54g)。LCMS ESI(m/z):241(M+H)+。
步骤3. 2-(4-(2,2-二氟环丙基)苯基)乙酸
向外消旋2-[4-(2,2-二氟环丙基)苯基]乙酸乙酯(1.3g)在MeOH(4.0mL)中的溶液中添加NaOH(在H2O中1M，30mL)，并且将混合物在25℃下搅拌12h。然后将反应混合物浓缩，用H2O稀释并且用EtOAc洗涤。将水相用1N HCl调节至pH＝3并且用EtOAc萃取。将合并的有机萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的外消旋2-(4-(2,2-二氟环丙基)苯基)乙酸。[LC/MS ESI(m/z):211[M-H]-；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27-7.23(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(d,J＝8.4Hz,2H),3.64(s,2H),2.81-2.64(m,1H),1.90-1.71(m,1H),1.65-1.60(m,1H)。将外消旋2-(4-(2,2-二氟环丙基)苯基)乙酸通过手性制备型SFC(柱：ChiralPak AD，250×21.2mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2和B针对MeOH；梯度：B 15％；波长：220nm)拆分以得到呈白色固体的2-[4-(2,2-二氟环丙基)苯基]乙酸对映异构体P1(200mg)和2-[4-(2,2-二氟环丙基)苯基]乙酸对映异构体P2(240mg)。
步骤4A.2-(4-((R或S)-2,2-二氟环丙基)苯基)-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
/>
将2-[4-(2,2-二氟环丙基)苯基]乙酸对映异构体P2(120mg)、(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(165.7mg)、HATU(236.5mg)和DIEA(0.28mL)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将合并的有机萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：GEMINI C18 250*21.2mm 5um；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的2-(4-((R或S)-2,2-二氟环丙基)苯基)-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(79.6mg)。LCMS ESI(m/z):439(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),8.12(s,1H),7.59(s,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),6.70(d,J＝7.2Hz,1H),5.33-5.16(m,1H),5.15-4.93(m,2H),3.58(s,2H),2.88-2.60(m,1H),1.92-1.75(m,1H),1.70-1.58(m,1H),1.50(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.79,-125.90,-142.41。
实施例31. 2-(4-(2,2-二氟环丙基)苯基)-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H- 吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺非对映异构体B
步骤4B.2-(4-((R或S)-2,2-二氟环丙基)苯基)-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
将2-[4-(2,2-二氟环丙基)苯基]乙酸对映异构体P1(100mg)、(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(138.1mg)、HATU(197.1mg)和DIEA(0.23mL)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将合并的有机萃取物干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：55％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：20mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到2-(4-((R或S)-2,2-二氟环丙基)苯基)-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(50.7mg，白色固体)。LCMS ESI(m/z):439(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),8.12(s,1H),7.58(s,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(d,J＝8.4Hz,2H),6.72(s,1H),5.38-5.20(m,1H),5.14-4.95(m,2H),3.58(s,2H),2.86-2.62(m,1H),1.95-1.76(m,1H),1.70-1.58(m,1H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.80,-125.92,-142.30。
实施例32.(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑 并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-溴-5-氟-N-甲氧基-N-甲基异烟酰胺的合成
向2-溴-5-氟异烟酸(10g)在DCM(400mL)中的溶液中添加HATU(22.47g)、TEA(18.9mL)和N,O-二甲基羟胺盐酸盐(4.88g)。将反应在氮气气氛下在20℃下搅拌16h。将溶剂在减压下蒸发以提供残余物。将残余物溶解在EA(500mL)中，用水(500mL)洗涤两次并且然后用盐水(500mL)洗涤。将有机层分离，用Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过Biotage(具有PE的0％至15％ EA)纯化以得到呈黄色油状物的2-溴-5-氟-N-甲氧基-N-甲基异烟酰胺(10.3g)：LCMS ESI(m/z):262.9(M+H)+。
1-(2-溴-5-氟吡啶-4-基)乙-1-酮的合成
将2-溴-5-氟-N-甲氧基-N-甲基异烟酰胺(10.3g)悬浮在THF(200mL)中并且在0℃下搅拌5min。在氮气气氛下将甲基溴化镁(19.58mL，在醚中3.0M)缓慢添加至反应混合物中，并且将反应在20℃下搅拌16h。将反应用饱和氯化铵淬灭。将两相分离，并且将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以提供残余物，将残余物通过Biotage(具有PE的0％至10％ EA)纯化以得到呈无色油状物的1-(2-溴-5-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(8.3g)。LCMS ESI(m/z):218.0(M+H)+。
5-溴-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶的合成
向1-(2-溴-5-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(8.3g)在乙二醇(50mL)中的溶液中添加水合肼(4.793mL)并且将反应在氮气气氛下在120℃下搅拌72h。完成后，将反应用EA(200mL)稀释，并且将得到的混合物用水(2L)和盐水(500mL)洗涤两次。将有机层分离，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以提供残余物，将残余物通过Biotage(具有PE的0％至20％ EA)纯化以得到呈白色固体的5-溴-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(2.7g)。LCMS ESI(m/z):212(M+H)+；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.80(d,J＝0.9Hz,1H),7.80(d,J＝0.9Hz,1H),2.60(s,3H)。
5-溴-3-甲基-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶的合成
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向5-溴-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(5.30g)在无水DMF(26mL)中的溶液中添加三氟甲磺酸2,2,2-三氟乙酯(4.3mL)和Cs2CO3(9.82g)。将反应在氮气气氛下在25℃下搅拌16h。完成后，将反应混合物倒入H2O中并且用EA萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且在真空中蒸发。将残余物通过Biotage(具有PE的0％至10％ EA；80g柱筒)纯化以得到呈白色固体的5-溴-3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(5.72g)。LCMS ESI(m/z):294(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(s,1H),7.79(d,J＝0.9Hz,1H),5.02-4.87(m,2H),2.57(s,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.91(s)。
3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛的合成
向5-溴-3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(2g)在无水DMF(60mL)中的溶液中添加Na2CO3(1.082g)、Pd(dppf)2Cl2(498mg)和Et3SiH(2.2mL)。向反应充入N2并且在100℃下在CO(7巴)气氛下搅拌16h。完成后，将水添加至反应中。将反应混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到黑色油状物，将黑色油状物通过Biotage(具有PE的0％至20％ EA；40g柱筒)纯化。收集级分并且蒸发以得到呈黄色固体的3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1.2g)。LCMS ESI(m/z):244(M+H)+1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.24(s,1H),9.04(s,1H),8.37(d,J＝0.6Hz,1H),5.10-4.98(m,2H),2.66(s,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.80(s)。
(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
向3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1.2g)在无水DCM(15mL)中的溶液中添加CuSO4(2.36g)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.78g)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将溶液通过硅藻土垫过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(1.5g)。LCMS ESI(m/z):347(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.02(s,1H),8.85(s,1H),8.31(d,J＝1.1Hz,1H),5.07-4.95(m,2H),2.66(s,3H),1.31(s,9H)。
(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺的合成
在-78℃下在氮气下向(R,E)-2-甲基-N-((3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(1.6g，4.62mmol)在无水THF(17mL)中的溶液中逐滴添加甲基溴化镁(7.699mL，在醚中的3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h。然后将反应溶液用NH4Cl水溶液淬灭。将两相分离，并且将水相用EA萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的(R)-2-甲基-N-((R)-1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(1.5g，4.139mmol)。LCMS ESI(m/z):363(M+H)+
(R)-1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐的合成
向(R)-2-甲基-N-[(R)-1-[3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙基]丙烷-2-亚磺酰胺(1.0g，2.76mmol)在二噁烷(4.0mL)中的溶液中添加4NHCl-二噁烷(2.0mL)，并且将反应在室温下搅拌1h。然后将混合物浓缩以提供残余物，将其直接用于下一步骤中。LCMS ESI(m/z):259(M+H)+。
(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(238mg)在无水DMF(1.5mL)中的溶液中添加DIEA(0.6mL)以提供溶液A。向2-(4-异丙基苯基)乙酸(126.4mg)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(296.5mg)并且在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释。将两相分离，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)和SFC(柱：ChiralPak IG，250×21.2mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(100.2mg)。LCMS ESI(m/z):419.5(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(s,1H),7.47(s,1H),7.19(s,4H),6.58(s,1H),5.34-5.20(m,1H),5.01-4.87(m,2H),3.55(d,J＝1.8Hz,2H),2.95-2.85(m,1H),2.56(s,3H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,6H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.92。
实施例33.(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑 并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
向(R)-1-[3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(242mg)在无水DMF(1.5mL)中的溶液中添加DIEA(0.6mL)以提供溶液A。向2-(4-环丙基苯基)乙酸(111.58mg)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加HATU(264.83mg)并且在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释。将有机层用NaCl水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：40％至90％ MeCN与H2O(0.1％NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)和SFC(柱：ChiralPak IG，250×21.2mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％NH3H2O；梯度：B 45％；流速：50mL/min；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-环丙基苯基)-N-(1-(3-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(86.7mg)。LCMS ESI(m/z):417.5(M+H)+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(s,1H),7.44(d,J＝0.9Hz,1H),7.15(d,J＝8.1Hz,2H),7.04(d,J＝8.1Hz,2H),6.52(d,J＝7.4Hz,1H),5.31-5.22(m,1H),5.00-4.87(m,2H),3.54(d,J＝2.4Hz,2H),2.55(s,3H),1.93-1.84(m,1H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.00-0.92(m,2H),0.72-0.64(m,2H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.92(s)。
实施例34.(R)-2-(5-环丙基吡啶-2-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并 [3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(5-环丙基吡啶-2-基)乙酸甲酯的合成
向2-(5-溴吡啶-2-基)乙酸甲酯(1g)在甲苯-水(10:1，16.5mL)中的溶液中添加环丙基三氟硼酸钾(1.29g)、Cs2CO3(4.25g)、Pd(OAc)2(0.20g)和二(金刚烷-1-基)(丁基)膦(0.31g)。向反应充入N2并且在110℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将两相分离，并且将有机层用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将得到的残余物通过硅胶柱色谱纯化以提供呈油状物的2-(5-环丙基吡啶-2-基)乙酸甲酯(582mg)。LCMS ESI(m/z):192(M+H)+。
2-(5-环丙基吡啶-2-基)乙酸的合成
向2-(5-环丙基吡啶-2-基)乙酸甲酯(582mg)在MeOH-H2O(2:1，9.5mL)中的溶液中添加NaOH(183mg)。将反应在室温下搅拌3h。然后在减压下除去MeOH并且将水层的pH用2MHCl调节至5，同时在冰浴中冷却。稍后将乙酸乙酯添加至酸性水中，并且通过过滤收集得到的沉淀物。然后将水层用DCM-MeOH(10:1)萃取，并且将合并的有机层在真空中浓缩。将残余物和沉淀物二者合并以得到呈白色固体的2-(5-环丙基吡啶-2-基)乙酸(354mg)。LCMS ESI(m/z):178(M+H)+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.64(d,J＝2.0Hz,1H),8.05-8.00(m,1H),7.73(d,J＝8.3Hz,1H),4.06(s,2H),2.18-2.08(m,1H),1.15-1.08(m,2H),0.93-0.85(m,2H)。
(R)-2-(5-环丙基吡啶-2-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(308mg)在无水DMF(1.5mL)中的溶液中添加DIEA(1mL)以提供溶液A。向2-(5-环丙基吡啶-2-基)乙酸(150mg)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(405.76mg)并且在室温下搅拌5min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中，并且将反应混合物在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释。将有机层用NaCl水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：10％至90％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(5-环丙基吡啶-2-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(135.4mg)。LCMS ESI(m/z):404.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.94(s,1H),8.36(d,J＝1.9Hz,1H),8.09(s,1H),7.82(d,J＝7.2Hz,1H),7.60(s,1H),7.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.40(d,J＝8.2Hz,1H),5.32-5.18(m,1H),5.11-4.98(m,2H),3.87(d,J＝2.3Hz,2H),2.00-1.90(m,1H),1.53(d,J＝6.9Hz,3H),1.17-1.06(m,2H),0.81-0.72(m,2H)；19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.81(s)。
实施例35.(R)-2-(5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙 基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
5-溴-3-氯-N-甲氧基-N-甲基吡啶甲酰胺的合成
向5-溴-3-氯吡啶-2-甲酸(4.76g)在DCM(10mL)中的溶液中添加HATU(9.94g)、甲氧基(甲基)胺(3.396mL)和TEA(8.4mL)。将反应在室温下搅拌2h。然后将反应用DCM和水稀释，将两相分离。将有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过使用硅胶柱色谱(用石油醚中的乙酸乙酯(15％)洗脱)纯化以得到呈白色固体的5-溴-3-氯-N-甲氧基-N-甲基吡啶甲酰胺(5.11g)。LCMS ESI(m/z):281(M+H)+。
1-(5-溴-3-氯吡啶-2-基)乙-1-酮的合成
在-78℃下在N2下向5-溴-3-氯-N-甲氧基-N-甲基吡啶甲酰胺(5.48g)在THF(65mL)中的溶液中添加甲基溴化镁(32.6mL，在Et2O中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h。完成后，将反应用DCM和水稀释。将两相分离并且将水相用DCM(30mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(用石油醚中的乙酸乙酯(6％)洗脱)纯化以得到呈白色固体的1-(5-溴-3-氯吡啶-2-基)乙-1-酮(602mg)。LCMS ESI(m/z):234(M+H)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝1.6Hz,1H),7.98(d,J＝1.9Hz,1H),2.67(s,3H)。
5-溴-3-氯-2-(1,1-二氟乙基)吡啶的合成
向1-(5-溴-3-氯吡啶-2-基)乙-1-酮(2g)在1,2-二氯乙烷(40mL)中的溶液中添加DAST(11.27mL)。将混合物在80℃下在密封管中搅拌12h。将混合物用饱和碳酸氢钠淬灭并且用DCM萃取。将合并的有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EA＝20:1)纯化以得到呈黄色油状物的5-溴-3-氯-2-(1,1-二氟乙基)吡啶(1.0g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(d,J＝2.0Hz,1H),7.98(d,J＝2.0Hz,1H),2.06(t,J＝18.8Hz,3H)。
2-(5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)乙酸乙酯的合成
向5-溴-3-氯-2-(1,1-二氟乙基)吡啶(200mg)、丙二酸单乙酯钾盐(199.1mg)、烯丙基氯化钯二聚体(34.24mg)、BINAP(97.11mg)和DMAP(95.27mg)在均三甲苯(10mL)中的溶液充入N2并且在140℃下搅拌1h。然后将混合物在120℃下搅拌12h。将混合物浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶色谱(PE:EA＝10:1)纯化以提供呈黄色油状物的2-[5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙酸乙酯(50mg)。LCMS ESI(m/z):264(M+H)+。
步骤5. 2-(5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)乙酸的合成
向2-[5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙酸乙酯(50mg)在MeOH(1.0mL)中的溶液中添加NaOH(在H2O中1M，1.0mL)。将混合物在25℃下搅拌12h。然后将混合物浓缩，用水稀释，并且用EtOAc萃取。将水层的pH用1N HCl调节至3并且用DCM萃取。将合并的有机层干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的2-[5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙酸(25mg)。LCMS ESI(m/z):234(M-H)-。
步骤6.(R)-2-(5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成
将2-[5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]乙酸(80mg)、(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(107.80mg)、HATU(142.0mg)和DIEA(0.168mL)在DMF(1.0mL)中的溶液在25℃下搅拌2h。将反应用水稀释并且用DCM萃取。将合并的有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-ActusTriart C18 250*20mm；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(5-氯-6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(82.3mg)。LCMS ESI(m/z):462(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.97(s,1H),8.40(s,1H),8.17(s,1H),7.80(d,J＝1.6Hz,1H),7.67(s,1H),7.02(d,J＝14.4Hz,1H),5.38-5.24(m,1H),5.19-5.00(m,2H),3.61(s,2H),2.07(t,J＝18.8Hz,3H),1.57(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.73,-89.61。
实施例36.(R)-2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H- 吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
步骤1：3-氯-2-环丙基-5-甲基吡啶。将2-溴-3-氯-5-甲基吡啶(4.2g)、环丙基硼酸(1.92g)、Pd(PPh3)4(2.35g)和K3PO4(12.95g)在甲苯(80mL)/H2O(8mL)中的溶液在110℃下在N2下搅拌12小时。通过LCMS监测反应完成。将混合物在真空中浓缩以得到残余物，并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈无色油状物的3-氯-2-环丙基-5-甲基吡啶(1.4g)。LCMS ESI(m/z):168(M+H)+。
步骤2：5-(溴甲基)-3-氯-2-环丙基吡啶。将3-氯-2-环丙基-5-甲基吡啶(960mg)、NBS(1.12g)和AIBN(0.042mL)在四氯化碳(15mL)中的溶液在80℃下在N2下搅拌12小时。将反应过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝30:1)纯化以得到呈无色油状物的5-(溴甲基)-3-氯-2-环丙基吡啶(700mg)。LCMS ESI(m/z):246(M+H)+。
步骤3：2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)乙腈。将5-(溴甲基)-3-氯-2-环丙基吡啶(600mg，2.43mmol)和NaCN(239mg)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌12小时。通过LCMS监测反应完成。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将混合物干燥，过滤并且浓缩以得到呈黄色油状物的2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)乙腈(380mg)。LCMS ESI(m/z):193(M+H)+。
步骤4：2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)乙酸。向2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)乙腈(380mg)在MeOH(2mL)中的溶液中添加NaOH(10mL，20.0mmol，2N)。将混合物在25℃下搅拌12小时，并且通过LCMS反应完成。然后将反应用EtOAc萃取。将水层用1N HCl溶液调节至pH＝3并且冻干以得到白色固体。将白色固体溶解在MeOH/DCM(10:1)中，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)乙酸(150mg)。LCMS ESI(m/z):210(M-H)-。
步骤5：(R)-2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。将2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)乙酸(150mg)、(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(258.89mg)、HATU(296mg)和DIEA(0.35mL)在DMF(5mL)中的溶液在25℃下搅拌12小时。将混合物用水稀释并且用DCM萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(5-氯-6-环丙基吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(203mg)：LCMS ESI(m/z):438(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.97(s,1H),8.22(d,J＝2.0Hz,1H),8.15(s,1H),7.64(s,1H),7.61(d,J＝2.0Hz,1H),7.03-6.89(m,1H),5.36-5.21(m,1H),5.16-5.01(m,2H),3.51(s,2H),2.56-2.42(m,1H),1.54(d,J＝6.8Hz,3H),1.12-1.07(m,2H),1.06-1.01(m,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.73。
实施例37.(R)-2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)- 1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
步骤1：4-溴-2-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺。向4-溴-2-氯苯甲酸(2.0g)在DCM(25mL)中的溶液中添加HATU(4.20g)、甲氧基(甲基)胺盐酸盐(4.54g)和TEA(3.5mL)。然后将反应在室温下搅拌过夜，并且通过LCMS监测反应完成。将反应用DCM和水稀释，并且将有机层分离，用饱和NaCl溶液洗涤，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(用在石油醚中的25％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到呈淡黄色油状物的4-溴-2-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(2.209g)。LCMS ESI(m/z):279[M+H]+。
步骤2：1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮。向4-溴-2-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(1.07g)在THF(10mL)中的溶液中添加MeMgBr(6.4mL，在Et2O中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2h并且然后在室温下搅拌过夜。将反应用DCM和水稀释，并且将两相分离。将水相用DCM(30mL x 3)进一步萃取。将合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈淡黄色固体的1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮(820mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(s,1H),7.50-7.44(m,2H),2.64(s,3H)。19FNMR(377MHz,CDCl3)δ-87.65。
步骤3：4-溴-2-氯-1-(1,1-二氟乙基)苯。向1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮(2.2g)在BAST(2.6mL)中的溶液中添加两滴甲醇。添加完成后，将反应混合物放置在氮气气氛下并且加热至70℃过夜。将反应混合物冷却至室温并且用50ml水淬灭。将得到的混合物用50ml醚萃取两次。将合并的醚相用水洗涤两次，用碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用10％柠檬酸水溶液洗涤一次，用盐水洗涤一次，并且然后经硫酸镁干燥。在减压下除去溶剂并且通过硅胶柱色谱(在PE中的2％ EA)纯化以得到呈无色油状物的4-溴-2-氯-1-(1,1-二氟乙基)苯(1.71g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝4.0Hz,1H),7.50-7.43(m,2H),2.02(t,J＝18.4Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-87.65。
步骤4：2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯。向4-溴-2-氯-1-(1,1-二氟乙基)苯(1.5g)在均三甲苯(2mL)中的溶液中添加二烯丙基二氯化钯(1.56mg)、BINAP(0.22g)、DMAP(0.72g)和丙二酸单乙酯钾盐(1.50g)。将反应用N2装填并且在120℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(30mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝20:1)纯化以得到呈淡黄色油状物的2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯(590mg，2.246mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.38(s,1H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),4.17(q,J＝20.0Hz,2H),3.61(s,2H),2.03(t,J＝36.0Hz,3H),1.27(t,J＝16.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-87.45。
步骤5. 2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸。在25mL圆底烧瓶中添加2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯(590mg)、1M NaOH水溶液(10mL)和MeOH(10mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。通过LCMS监测反应完成。然后添加水(50mL)，并且将水层用EA洗涤。将水层用1M HCl水溶液酸化至pH<3，并且将混合物用EA萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以提供呈绿黄色固体的2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸(465mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(s,1H),7.23(d,J＝8.0Hz,1H),3.67(s,2H),2.03(t,J＝36.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-87.53。LCMS ESI(m/z):233(M-H)+。
步骤6.(R)-2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。将2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸(120mg)和HATU(292mg)在2mL DMF中的溶液在室温下搅拌15min(溶液A)。向另一个器皿中添加(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(186mg)和DMF(2.0mL)。添加DIEA(0.566mL)直至通过湿pH纸得出溶液的pH高于7(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将反应搅拌1小时，之后LCMS显示反应完成。将反应用EA和水稀释，将两相分离，并且将水相用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：35％至95％MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：20mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(130mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H),8.14(s,1H),7.62(s,1H),7.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.36(s,1H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),6.85(d,J＝8.0Hz,1H),5.32-5.25(m,1H),5.10-5.03(m,2H),3.57(s,2H),2.02(t,J＝16.0Hz,3H),1.53(d,J＝8.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.76,-87.39。LC/MS ESI(m/z):461[M+H]+。
实施例38.(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)- 1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
4-溴-2-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺。向4-溴-2-氟苯甲酸(1.0g)在DCM(15mL)中的溶液中添加HATU(2.26g)、甲氧基(甲基)胺盐酸盐(4.54g)和TEA(1.9mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并且然后用DCM和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl溶液洗涤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(用在石油醚中的17％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到呈黄色油状物的标题化合物4-溴-2-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(1.166g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.29(m,3H),3.55(s,3H),3.34(s,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-110.95。LCMS ESI(m/z):262(M+H)+。
1-(4-溴-2-氟苯基)乙-1-酮。向4-溴-2-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(1.116g)在THF(10mL)中的溶液中添加MeMgBr(7.1mL，在Et2O中3.0M)。将反应在-78℃下搅拌2小时并且然后在室温下搅拌过夜。如通过LCMS监测反应完成。将反应用DCM和水稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(30mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈淡黄色固体的1-(4-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(667mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(t,J＝8.0Hz,1H),7.40-7.34(m,2H),2.63(d,J＝4.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-107.01(s)。
4-溴-1-(1,1-二氟乙基)-2-氟苯的合成。向1-(4-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(667mg)在BAST(0.8mL)中的溶液中添加两滴甲醇。添加完成后，将反应混合物放置在氮气气氛下并且加热至70℃过夜。将反应混合物冷却至室温并且用10ml水淬灭。将得到的混合物用20ml醚萃取两次。将合并的醚相用水洗涤两次，用碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用10％柠檬酸水溶液洗涤一次，用盐水洗涤一次，并且然后经硫酸镁干燥。在减压下除去溶剂并且通过硅胶柱(在PE中的3％ EA)纯化以得到呈无色油状物的4-溴-1-(1,1-二氟乙基)-2-氟苯(294mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44-7.40(m,1H),7.36-7.31(m,2H),2.02-1.93(m,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-87.13,-112.27。
2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)乙酸乙酯。向4-溴-1-(1,1-二氟乙基)-2-氟苯(290mg)在均三甲苯(5mL)中的溶液中添加BINAP(45mg)、丙二酸1-乙酯3-钾盐(310mg)、DMAP(148mg，1.21mmol)和二烯丙基二氯化钯(1.6mg)。将反应用N2装填并且在120℃下搅拌过夜。如通过LCMS监测反应完成。将反应用EA和水稀释，将两相分离，并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(在石油醚中的4％乙酸乙酯)纯化以得到呈淡黄色油状物的2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)乙酸乙酯(121mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.451-7.47(m,1H),7.11-1.07(m,2H),4.17(q,J＝8.0Hz,2H),3.63(s,2H),2.03-1.94(m,3H),1.27(t,J＝8.0Hz,3H)。19FNMR(377MHz,CDCl3)δ-86.88,-114.99。
2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)乙酸。向25mL圆底烧瓶中添加2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)乙酸乙酯(121mg)、1M NaOH水溶液(3mL)和MeOH(3mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后添加水(10mL)，并且将水层用EA洗涤。将水层用1M HCl水溶液酸化至pH<3，并且将混合物用EA萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到呈黄色固体的2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)乙酸(100mg)。LCMS ESI(m/z):217(M-H)+。
(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。将2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)乙酸(100mg)和HATU(261mg)在2mL DMF中的溶液在室温下搅拌15min(溶液A)。将DIEA(0.46mL)添加至在2mL DMF中的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(167mg)中，并且通过湿pH纸得出溶液的pH高于7(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将反应在室温下搅拌1小时，此时LCMS显示反应完成。将反应用EA和水稀释。将两相分离，并且将水相用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：30％至95％ MeOH与H2O(0.1％ FA)；流速：20mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)-3-氟苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(59mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.91(s,1H),8.12(s,1H),7.60(s,1H),7.48(t,J＝8.0Hz,1H),7.09(t,J＝8.0Hz,2H),6.83(d,J＝4.0Hz,1H),5.31-5.24(m,1H),5.09-5.03(m,2H),3.59(s,2H),1.98(t,J＝16.0Hz,3H),1.51(d,J＝4.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.78,-86.83,-114.72。LC/MS ESI(m/z):445[M+H]+。
实施例39.(R)-2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H- 吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-环丙基-3-氟-5-甲基吡啶。向2-溴-3-氟-5-甲基吡啶(3.75g)在甲苯:H2O(50mL，10:1)中的溶液中添加K3PO4(12.57g)、环丙基硼酸(2.54g)和Pd(PPh3)4(2.28g)。将反应在110℃下在N2下搅拌过夜，并且将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的2-环丙基-3-氟-5-甲基吡啶(2.2g)：LCMS ESI(m/z):152(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.13 -7.06(m,1H),2.30-2.24(m,4H),1.12 -0.92(m,4H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-131.54(s)。
5-(溴甲基)-2-环丙基-3-氟吡啶。向2-环丙基-3-氟-5-甲基吡啶(2.2g)在CCl4(55mL)中的溶液中添加NBS(3.63g)和AIBN(0.22mL)，并且将反应在80℃下在氮气下搅拌过夜。将反应用DCM和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在30℃下在真空中浓缩。通过LCMS监测反应完成。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈紫色油状物的5-(溴甲基)-2-环丙基-3-氟吡啶(897mg)。LCMS ESI(m/z):230.0(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(s,1H),7.36 -7.29(m,1H),4.43(s,2H),2.36-2.29(m1H)1.16-1.00(m 4H)。19F NMR(377MHzCDCl3)δ-129.72(s)。
2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)乙腈。向5-(溴甲基)-2-环丙基-3-氟吡啶(897mg)在DMF(5mL)中的溶液中添加NaCN(385mg)，并且将反应在室温下搅拌30min。如通过LCMS监测反应完成。然后将反应用DCM和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色油状物的2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)乙腈(513mg)：LCMS ESI(m/z):177(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23-8.14(m,1H),7.36-7.28(m,1H),3.73(s,2H),2.40-2.25(m,1H),1.15-1.09(m,2H),1.09-1.01(m,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-128.87(s)。
2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)乙酸。将2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)乙腈(589mg)溶解在2M NaOH(5mL)中并且在100℃下搅拌1h。将反应溶液用2M HCl酸化至pH＝1并且用EA(50mL x 3)萃取。将有机层浓缩以得到呈黄色固体的2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)乙酸(553mg)并不经进一步纯化用在下一步骤中。LCMS ESI(m/z):196(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),8.15(s,1H),7.56-7.48(m,1H),3.63(s,2H),2.32-2.21(m,1H),1.04-0.93(m,4H)。19F NMR(377MHz,DMSO)δ-131.95(s)。
(R)-2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(206mg)在无水DMF(1.5mL)中的溶液中添加DIEA(1mL)以提供溶液A。向2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)乙酸(110mg)在无水DMF(1.5mL)中的溶液中添加HATU(236mg)，并且将混合物在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中，并且将反应在室温下搅拌1h。然后将混合物用EA和水稀释，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：20mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(6-环丙基-5-氟吡啶-3-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(145mg)。LCMS ESI(m/z):422(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.11(d,J＝6.0Hz,2H),7.56(s,1H),7.30-7.27(m,1H),6.74(d,J＝7.6Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),5.08-5.02(m,2H),3.52(s,2H),2.31-2.27(m,1H),1.49(d,J＝6.4Hz,3H),1.12-0.97(m,4H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.79(s),-130.20(s)。
实施例40.(R)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)- 2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺
5-溴-1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶。向2,2-二氟丙基4-甲基苯磺酸盐(3.0g)在DMF(30mL)中的溶液中添加5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(2.19g)和Cs2CO3(3.61g)。将反应在90℃下在氮气下搅拌过夜。然后将反应用EA和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的5-溴-1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.2g)。LCMS ESI(m/z):276(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(s,1H),8.05(s,1H),7.84(d,J＝1.0Hz,1H),4.79(t,J＝12.2Hz,2H),1.63(t,J＝18.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-93.76(s)。
1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛。向5-溴-1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(1.3g)在无水DMF(50mL)中的溶液中添加Na2CO3(0.75g)、Pd(dppf)Cl2(0.34g)和Et3SiH(1.10g)。然后将反应在100℃下在CO(5巴)下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色固体的1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(828mg)。LCMS ESI(m/z):226(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.23(s,1H),9.13(s,1H),8.41(d,J＝1.2Hz,1H),8.29(s,1H),4.88(t,J＝12.2Hz,2H),1.67(t,J＝18.8Hz,3H)。19FNMR(377MHz,CDCl3)δ-93.83(s)。
(R,E)-N-((1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺。向1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1.04g)在无水DCM(15mL)中的溶液中添加CuSO4(2.21g)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.73g)。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜，并且将溶液通过硅藻土垫过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化以得到呈白色固体的(R,E)-N-((1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.4g)。LCMS ESI(m/z):329(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.84(s,1H),8.36(d,J＝1.0Hz,1H),8.23(s,1H),4.86(t,J＝12.2Hz,2H),1.65(t,J＝18.8Hz,3H),1.31(s,9H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-93.82(s)。
(R)-N-((R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺。在-78℃下在氮气下向(R,E)-N-((1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.4g)在无水THF(20mL)中的溶液中逐滴添加MeMgBr(在醚中3.0M，7.11mL)。然后将反应在-78℃下搅拌2h，并且然后将反应溶液用饱和氯化铵淬灭并且用EA萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色油状物的(R)-N-((R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.1g)。LCMS ESI(m/z):264(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.97(s,1H),8.06(d,J＝0.8Hz,1H),7.62(d,J＝1.0Hz,1H),4.79(t,J＝12.0Hz,2H),4.72-4.66(m,1H),1.65-1.58(m,6H),1.25(s,9H)。19FNMR(377MHz,CDCl3)δ-93.55(d,J＝5.6Hz)。
(R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐。向(R)-N-((R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.1g)在二噁烷(6mL)中的溶液中添加HCl-二噁烷(3mL，4N)，并且将反应在室温下搅拌1h。然后将混合物浓缩，并且将残余物直接用于下一步骤中。LCMS ESI(m/z):241(M+H)+。
(R)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(264mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(655mg)以提供溶液A。向2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酸(173mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(354mg)并且将混合物在室温下搅拌15min以提供溶液B。然后将溶液A添加至溶液B中，并且将混合物在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 150*20mm*5um；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：25mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺(188mg)。LCMS ESI(m/z):427(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(s,1H),8.67(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(s,1H),7.687.60(m,3H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),5.19-5.00(m,3H),3.62(s,2H),1.68(t,J＝19.2Hz,3H),1.44(d,J＝7.2Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-62.53(s),-93.63(s)。
实施例41.(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑 并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
向(R)-1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(359mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.63mL)以提供溶液A。向2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸(230mg)在无水DMF(3mL)中的溶液中添加HATU(481mg)，并且将混合物在室温下搅拌15min以提供溶液B。然后将溶液A添加至溶液B中，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 GEMINI 250*20mm 10um；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2-二氟丙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(207mg)。LCMS ESI(m/z):423(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.89(s,1H),8.04(s,1H),7.51-7.46(m,3H),7.33(d,J＝8.2Hz,2H),6.69(d,J＝8.0Hz,1H),5.29-5.22(m,1H),4.79(t,J＝12.0Hz,2H),3.60(s,2H),1.91(t,J＝18.4Hz,3H),1.62-1.57(m,3H),1.47(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-87.38(s),-93.61(s)。
实施例42.(R)-2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡 唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
4-(溴甲基)-2-氟-1-(三氟甲基)苯。在0℃下向(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)甲醇(1g)在DCM(10mL)中的溶液中添加PBr3(1mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用盐水洗涤，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的4-(溴甲基)-2-氟-1-(三氟甲基)苯(542mg)。LCMS ESI(m/z):无MS信号。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(t,J＝7.4Hz,2H),4.45(s,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-61.43,-113.43。
2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙腈的合成。向4-(溴甲基)-2-氟-1-(三氟甲基)苯(542mg)和TMSCN(0.32mL)在无水MeCN(5mL)中的溶液中添加TBAF(2.5mL，在THF中1M)。将反应混合物在室温下搅拌18h并且然后用DCM和水稀释。将有机层分离，用盐水洗涤，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙腈(262mg)。LCMS ESI(m/z):无MS信号。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85(t,J＝8.0Hz,1H),7.53(d,J＝11.8Hz,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,1H),4.22(s,2H)。19F NMR(377MHz,DMSO)δ-59.99,-115.24。
2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙酸。将2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙腈(262mg)溶解在浓缩氯化氢(4.0mL)中并且在100℃下搅拌1h。将反应溶液用水稀释并且用EA萃取。将有机层分离并且在真空中浓缩以得到呈无色油状物的2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙酸(149mg)，将其不经进一步纯化用于下一步骤中。LCMS ESI(m/z):443(2M-H)-。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.78(t,J＝8.0Hz,1H),7.50(d,J＝12.2Hz,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,1H),3.81(s,2H)。
(R)-2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(196mg)在无水DMF中的溶液中添加DIPEA(0.53mL)以提供溶液A。向2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)乙酸(119mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(224mg)，并且将混合物在室温下搅拌15min以提供溶液B。然后将溶液A添加至溶液B中，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱和制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(1％ FA)；流速：28mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(3-氟-4-(三氟甲基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(119mg)。LCMS ESI(m/z):449(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.25(s,1H),8.71(d,J＝7.6Hz,1H),8.31(s,1H),7.72-7.68(m,2H),7.40-7.29(m,2H),5.66-5.59(m,2H),5.10-5.07(m,1H),3.64(s,2H),1.45(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,DMSO)δ-59.72,-69.80,-116.73。
实施例43.(R)-2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡 唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
4-(溴甲基)-2-氯-1-(三氟甲基)苯。在0℃下向[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]甲醇(1g)在DCM(4mL)中的溶液中添加PBr3(0.9mL)，并且将反应在室温下搅拌30min。将反应用EA和水稀释，并且将有机层分离，用饱和盐水洗涤，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的4-(溴甲基)-2-氯-1-(三氟甲基)苯(690mg)。LCMSESI(m/z):无MS信号。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89-7.82(m,2H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),4.77(s,2H)。19F NMR(377MHz,DMSO-d6)δ-61.16(s)。
2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)乙腈的合成。将4-(溴甲基)-2-氯-1-(三氟甲基)苯(700mg)和TMSCN(0.384mL)溶解在无水MeCN(5mL)中并且在室温下搅拌30min。然后添加TBAF(3mL，在THF中1M)，并且将反应在室温下搅拌3h。将反应用DCM和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)乙腈(292mg)。LCMS ESI(m/z):218(M-H)-。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,J＝8.2Hz,1H),7.74(s,1H),7.57(d,J＝8.2Hz,1H),4.21(s,2H)。19F NMR(377MHz,DMSO-d6)δ-61.17(s)。
2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)乙酸。将2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)乙腈(290mg)溶解在浓盐酸(2.5mL)中并且在100℃下搅拌1h。将反应溶液用水稀释并且用EA萃取，并且将有机层分离，并且在真空中浓缩以得到呈无色油状物的2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)乙酸(250mg)，不经进一步纯化。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.46(s,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(s,1H),7.46(d,J＝8.0Hz,1H),3.75(s,2H)。
(R)-2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(353mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.96mL)以提供溶液A。向2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)乙酸(230mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(403mg)，并且将混合物在室温下搅拌15min以提供溶液B。然后将溶液A添加至溶液B中，并且将反应在室温下搅拌2h。将反应用EA和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(柱：AZZOTA C18 GEMINI 250*20mm 10um；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(3-氯-4-(三氟甲基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(347mg)。LCMS ESI(m/z):465(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.11(s,1H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(s,1H),7.44(s,1H),7.29(d,J＝8.6Hz,1H),6.81(d,J＝7.6Hz,1H),5.31-5.23(m,1H),5.08-5.02(m,2H),3.59(s,2H),1.51(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-62.46(s),-70.79(s)。
实施例44.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙 基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺
1-溴-4-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)苯的合成。在氩气气氛下向火焰干燥的具有甲基三苯基碘化磷Ph3PCH3I(15.2g，0.04mol)的烧瓶中添加THF(60mL)。将得到的悬浮液冷却至0℃并且逐滴添加n-BuLi(15.6mL，2.5N)。将混合物在0℃下搅拌10分钟，然后冷却至-78℃。添加在THF(10mL)中的1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙-1-酮(8.2g，0.03mol)并且将混合物在-78℃下搅拌30min并且然后在室温下搅拌过夜。将其用饱和NH4Cl淬灭并且用PE(300mL)萃取。将有机层用饱和NaCl洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且将滤液浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈无色油状物的1-溴-4-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)苯(6.1g，74％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):7.53-7.50(m,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),5.97(d,J＝1.2Hz,1H),5.77-5.76(m,1H)ppm。19FNMR(376.48MHz，CDCl3):-64.9ppm。
1-溴-4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯。在0℃下在氮气下向烘箱干燥的含有在无水四氢呋喃(40mL)中的1-溴-4-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)苯(2.2g)和甲基二苯基硫鎓四氟硼酸盐(3.3g)的100mL器皿中添加在THF(7.0mL)中的双(三甲基甲硅烷基)氨基钠2M。将反应混合物在0℃下搅拌10min并且然后在室温下搅拌1h。向溶液中添加2.5mL的甲醇，并且将粗混合物在真空中浓缩。将残余物溶解在PE(100mL)中并且用水(30mL x 2)和盐水洗涤。收集合并的有机层并且在真空中浓缩。将粗残余物通过自动快速硅胶色谱(PE 100％)纯化以得到呈无色油状物的1-溴-4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯(1.4g)。1HNMR(400MHz,CDCl3):7.49-7.44(m,2H),7.34-7.32(m,2H),1.42-1.33(m,2H),1.02-0.95(m,2H)。19FNMR(376.48MHz,CDCl3):-70.2ppm。
2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)丙二酸二甲酯。向含有在PhMe(50mL)中的丙二酸二乙酯(0.77g)和1-溴-4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯(1.4g)的100mL圆底烧瓶中添加K3PO4(3.4g)、Pd(OAc)2(40mg)和JohnPhos(CAS#224311-51-7，90mg)。将反应混合物在125℃下在N2下搅拌4.0h并且通过LCMS检测。反应完成后，将粗混合物过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过自动快速硅胶色谱(用在EA中的100％ PE至50％ PE洗脱)纯化以得到呈白色固体的2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)丙二酸二甲酯(693mg)。LCMS ESI(m/z):317(M+H)+。1HNMR(400MHz,CDCl3):7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),4.65(s,1H),3.75(s,6H),1.36-1.33(m,2H),1.02(m,2H)。19FNMR(376.48MHz,CDCl3):-70.0ppm。
2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)丙二酸。向2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)丙二酸二甲酯(540mg)在甲苯(10mL)中的溶液中添加8mL的32％ NaOH。将混合物在100℃下搅拌24h。在冷却至室温后，将水层用甲苯洗涤并且用2N HCl调节至pH＝1。将水层用EA萃取并且用盐水洗涤。将合并的有机层浓缩以得到黄色固体(450mg)，其不经进一步纯化用在下一步骤中。LCMS ESI(m/z):287(M-H)+；
2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酸。将2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)丙二酸(400mg)在甲苯(6mL)和6N HCl(6mL)中的混合物在100℃下搅拌16h。将有机层收集并且用饱和盐水洗涤并且在真空中浓缩以得到呈黄色固体的2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酸(250mg)，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。1HNMR(400MHz,CD3OD):7.41(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(d,J＝8.0Hz,2H),3.60(s,2H),1.34-1.31(m,2H),1.06-1.03(m,2H)ppm。19FNMR(376.48MHz,CD3OD):-71.5ppm。
(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(272mg)在无水DMF(2.0mL)中的溶液中添加DIEA(0.85mL)以提供溶液A。向2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酸(209mg)在DMF(1.5mL)中的混合物中添加HATU(358mg)，并且将反应在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中，并且将反应在室温下搅拌1h。然后将反应用EA和水稀释，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱(柱：AZZOTA C18 GEMINI 250*20mm 10um；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺(126mg)：LCMS ESI(m/z):471(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),8.11(s,1H),7.57(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.24(d,J＝8.0Hz,2H),6.71(d,J＝7.6Hz,1H),5.27-5.24(m,1H),5.07-5.01(m,2H),3.58(s,2H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H),1.38 -1.31(m,2H),1.01(s,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.11(s),-70.82(s)。
实施例45.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙 基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺
5-溴-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶。向5-溴-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(10g)在DMF(50mL)中的溶液中添加2,2,2-三氟乙基三氟甲磺酸(8.7mL)和Cs2CO3(19.7g)。将反应在室温下搅拌过夜，并且然后将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl溶液洗涤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(用在石油醚中的40％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到呈白色固体的标题化合物5-溴-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(7.5g)。LC/MS ESI(m/z):280[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(s,1H),8.11(s,1H),7.87(s,1H),5.05(q,J＝8.2Hz,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.79(s)。
1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛。向5-溴-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶(5g)在DMF(28mL)中的溶液中添加Na2CO3(2.84g)、Pd(dppf)Cl2(0.52g)和Et3SiH(5.8mL)。然后将反应在80℃下在一氧化碳下搅拌3h。将反应用EA和水稀释，并且将有机层分离，用盐水洗涤，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(2.34g)。LC/MS ESI(m/z):230[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.24(s,1H),9.13(s,1H),8.43(s,1H),8.34(s,1H),5.15(q,J＝8.2Hz,2H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.72(s)。
(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺。向1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(2.39g)在DCM(15mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.64g)和CuSO4(4.16g)。然后将反应在30℃下搅拌18h，并且将混合物通过硅藻土过滤。将有机层在真空中浓缩并且通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(3.23g)。LC/MS ESI(m/z):333[M+H]+。
(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙-1-胺。在-45℃下向(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(600mg)在DCM(10.0mL)中的溶液中逐滴添加EtMgBr(0.72mL，在醚中3mol/L)。将反应混合物在-45℃下搅拌30分钟并且然后用水淬灭。分离各层，并且将有机层在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(在CH2Cl2中的0-10％ MeOH)纯化以得到呈油状物的2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙基)丙烷-2-亚磺酰胺(350mg)。LCMS ESI(m/z):363[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(s,1H),8.10(d,J＝4.0Hz,1H),7.57(t,J＝16.0Hz,1H),5.08-4.94(m,2H),4.51(d,J＝8.0Hz,1H),4.38(d,J＝8.0Hz,1H),1.96-1.87(m,2H),1.26(s,9H),0.91(t,J＝8.0Hz,3H)。
(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙-1-胺。向2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙基)丙烷-2-亚磺酰胺(300mg)在二噁烷(5mL)中的溶液中添加HCl(1mL，在二噁烷中4N)。将混合物在室温下搅拌2h。LCMS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭并且用EA萃取两次。将合并的萃取物浓缩以得到呈油状物的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙-1-胺(200mg)。LCMS ESI(m/z):259[M+H]+。
(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺。向2-[4-(三氟甲基)苯基]乙酸(186mg)在DMF(3.0mL)中的溶液中添加HATU(347mg)和N,N-二异丙基乙胺(0.41mL)。允许将溶液在室温下搅拌10min，之后添加(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]丙-1-胺(214mg)。将混合物在室温下搅拌过夜，并且将反应用水(5mL)稀释并且用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以提供粗产物，将其通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 GEMINI250*20mm 10um；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：205nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)丙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺(114mg)。LC/MS ESI(m/z):445[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),8.11(s,1H),7.59-7.55(m,3H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),6.68(d,J＝8.0Hz,1H),5.05-5.03(m,3H),3.63(s,2H),2.42-1.65(m,2H),0.81(d,J＝8.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-62.54,-70.80。
实施例46.(R)-2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H- 吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)乙酸乙酯。向6-溴-2,3-二甲基-2H-吲唑(500mg)在均三甲苯(6mL)中的溶液中添加BINAP(84mg)、3-乙氧基-3-氧代丙酸钾(570mg)、DMAP(273mg)和烯丙基氯化钯(II)(17mg)。将反应在白天在140℃下搅拌并且在120℃下搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并且将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈黄色固体的2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)乙酸乙酯(240mg)。LCMS ESI(m/z):233.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(d,J＝11.2Hz,2H),6.97(d,J＝8.6Hz,1H),4.19-4.11(m,2H),4.08(s,3H),3.69(s,2H),2.59(s,3H),1.24(t,J＝7.1Hz,3H)。
2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)乙酸。向2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)乙酸乙酯(120mg)在EtOH(2mL)中的溶液中添加2M NaOH(1mL)，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应用水(0.5mL)和EA稀释。将水相用2M HCl调节至pH＝1，并且用EA萃取。发现产物溶解在水相中。将水相分离并且在真空中浓缩以得到呈粗白色固体的2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)乙酸和NaCl(174mg)，将其不经纯化用在下一步骤中。LCMS ESI(m/z):205.2(M+H)+。
(R)-2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(310mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.845mL)以提供溶液A。向粗品2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)乙酸(174mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(356mg)，并且将反应在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中，并且将混合物在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(117mg)。LCMS ESI(m/z):431.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.22(s,1H),8.53(d,J＝8.0Hz,1H),8.24(s,1H),7.63(s,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.34(s,1H),6.89(d,J＝8.8Hz,1H),5.64-5.57(m,2H),5.10-5.06(m,1H),4.01(s,3H),3.53(s,2H),2.57(s,3H),1.43(d,J＝7.2Hz,3H)。19F NMR(377MHz,DMSO-d6)δ-69.77(s)。
实施例47.(R)-2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡 唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲腈。在室温下向含有1,2-二溴乙烷(1.24mL)和2-(4-溴苯基)乙腈(2g)在甲苯(20mL)中的溶液的250mL圆底烧瓶中添加50％ NaOH水溶液(20mL)和四丁基溴化铵(0.63mL)。将反应混合物在室温下剧烈搅拌过夜，并且然后将反应倒入450mL冰水中。将得到的混合物用EA(130mL×3)萃取。将合并的有机层用水(150mL×2)和盐水(150mL)洗涤，并且最终经无水Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂，并且将残余物通过硅胶快速色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈黄色油状物的1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲腈(1.5g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),1.74(q,J＝5.2Hz,2H),1.38(q,J＝5.2Hz,2H)。
2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙酸乙酯。向1-(4-溴苯基)环丙烷-1-甲腈(500mg)在均三甲苯(10mL)中的溶液中添加二烯丙基二氯化钯(1.56mg)、BINAP(95mg)、DMAP(311.58mg)和丙二酸单乙酯钾盐(651mg)。将反应用N2装填并且在120℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释，并且将两相分离。将水相用DCM(10mL×3)萃取，并且将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈黄色油状物的2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙酸乙酯(200mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32-7.23(m,4H),4.15(q,J＝7.2Hz,2H),3.60(s,2H),1.71(q,J＝5.2Hz,2H),1.39(q,J＝5.2Hz,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H)。
2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙酸。在25mL圆底烧瓶中添加2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙酸乙酯(330mg)、2M NaOH水溶液(2.0mL)和MeOH(2.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后添加水(20mL)，并且将水层用EA洗涤。将水层用1M HCl水溶液酸化至pH<3，并且将混合物用EA萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以提供呈粗白色固体的2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙酸(280mg)，其可以不经纯化用在下一步骤中。
(R)-2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。将2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)乙酸(200mg)和HATU(567mg)在4mL DMF中的溶液在室温下搅拌15min以提供溶液A。将DIEA(1.0mL)添加至在2mL DMF中的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(362mg)中直至通过湿pH纸得出溶液的pH高于7(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将反应在室温下搅拌1小时，此时LCMS指示反应完成。将反应混合物用EA和水稀释。将两相分离，并且将水相用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：25％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：30mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(4-(1-氰基环丙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(256mg)。LCMS ESI(m/z):428(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H),8.14(s,1H),7.62(s,1H),7.30-7.22(m,4H),6.80(d,J＝6.8Hz,1H),5.29-5.25(m,1H),5.07(q,J＝8.0Hz,2H),3.57(s,2H),1.73-1.70(m,2H),1.51(d,J＝6.8Hz,3H),1.43-1.34(m,2H)。19FNMR(377MHz,CDCl3)δ-70.76ppm。
实施例48.(R)-2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(1-(1-(2, 2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)乙酸。向25mL圆底烧瓶中添加2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)乙腈(200mg)、6M NaOH水溶液(2.0mL)和EtOH(2.0mL)，并且将混合物在80℃下搅拌过夜。将反应冷却至室温，并且在真空中蒸发乙醇。添加水(20mL)，并且将水层用EA洗涤。将水层用1M HCl水溶液酸化至pH<3，并且将混合物用EA萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以提供2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)乙酸(200mg，粗品)，将其直接用于下一步骤中。
(R)-2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。将2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)乙酸(200mg)和HATU(528mg)在DMF(5.0mL)中的溶液在室温下搅拌15min。添加(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(337mg)和DIEA(0.92mL)。将反应搅拌1小时，并且LC/MS指示反应完成。将反应用EA和水稀释。将两相分离，并且将水相用EA(10mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：30％至95％MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：30mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(263mg)。LCMS ESI(m/z):443(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.92(s,1H),8.13(s,1H),7.61(s,1H),7.02-6.96(m,3H),6.82(d,J＝8.0Hz,1H),5.31-5.24(m,1H),5.06(q,J＝8.0Hz,2H),3.56(s,2H),1.51(d,J＝8.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-49.97ppm,-70.78ppm。
实施例49.(R)-2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H- 吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)乙酸乙酯。向5-溴-1,3-二甲基-1H-吲唑(500mg)在均三甲苯(5mL)中的溶液中添加BINAP(84mg)、3-乙氧基-3-氧代丙酸钾(572mg)、DMAP(274mg)和烯丙基氯化钯(II)(16mg)。将反应在白天在140℃下搅拌并且在120℃下在氮气下搅拌过夜。将反应在真空中浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的标题化合物2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)乙酸乙酯(342mg)：LCMS ESI(m/z):233.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(s,1H),7.33-7.26(m,2H),4.21-4.08(m,2H),3.98(s,3H),3.72(s,2H),2.55(s,3H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H)。
2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)乙酸。向2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)乙酸乙酯(385mg)在EtOH(4.0mL)中的溶液中添加2M NaOH(2mL)，并且将反应在100℃下搅拌1h。将反应用水(0.5mL)稀释并且用EA洗涤。将水相用2M HCl调节至pH＝1，用EA萃取，并且将得到的有机相在真空中浓缩以得到呈白色固体的2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)乙酸(320mg)。LCMS ESI(m/z):205.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.47(s,1H),7.41(d,J＝8.6Hz,1H),7.20(d,J＝8.6Hz,1H),3.86(s,3H),3.58(s,2H),2.38(s,3H)。
(R)-2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(232mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.63mL)以提供溶液A。向2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)乙酸(130mg)在无水DMF中的溶液中添加HATU(266mg)，并且将反应在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。然后将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 GEMINI 250*20mm 10um；流动相：15％至80％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(1,3-二甲基-1H-吲唑-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(109mg)。LCMS ESI(m/z):431.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(s,1H),8.08(s,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.29(d,J＝2.4Hz,2H),6.59(d,J＝7.6Hz,1H),5.30-5.27(m,1H),5.05-4.99(m,2H),4.00(s,3H),3.69(s,2H),2.54(s,3H),1.45(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.81(s)。
实施例50.(R)-2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)- 1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
5-溴-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈。在0℃下向5-溴-1H-吲哚-3-甲腈(500mg)在DMF(8mL)中的溶液中添加NaH(273mg，在矿物油中60％)，并且将反应在相同温度下搅拌30min。然后将碘甲烷(0.2mL)添加至反应中，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应用水淬灭并且用EA萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈白色固体的5-溴-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈(507mg)。LCMS ESI(m/z):235.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.23(s,1H),7.74(d,J＝1.6Hz,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.48-7.35(m,1H),3.80(s,3H)。
2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸乙酯。向5-溴-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈(507mg)在均三甲苯(10mL)中的溶液中添加BINAP(81mg)、3-乙氧基-3-氧代丙酸钾(554mg)、DMAP(265mg)和烯丙基氯化钯(II)(15.6mg)，并且将反应在白天在140℃下在氮气下搅拌并且在120℃下搅拌过夜。将反应在真空中浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱纯化以得到呈无色油状物的2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸乙酯(270mg)。LCMS ESI(m/z):243.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.65(s,1H),7.54(s,1H),7.35(d,J＝8.6Hz,1H),7.32-7.27(m,1H),4.16(q,J＝7.2Hz,2H),3.84(s,3H),3.74(s,2H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H)。
2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸。向2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸乙酯(270mg)在MeOH:THF:H2O(1:1:1，9mL)中的溶液中添加LiOH水溶液(234mg)，并且将反应在室温下搅拌2h。将反应用水(0.5mL)稀释并且用EA洗涤。将水相分离，将pH用2M HCl调节至1，并且用EA萃取。将有机层经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩以得到呈灰色固体的2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸(246mg)。LCMS ESI(m/z):215.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.14(s,1H),7.53-7.43(m,2H),7.17(d,J＝8.4Hz,1H),3.78(s,3H),3.63(s,2H)。
(R)-2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(204mg)在无水DMF中的溶液中添加DIEA(0.56mL)以提供溶液A。向2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸(120mg)在DMF中的溶液中添加HATU(234mg)并且在室温下搅拌15min以提供溶液B。将溶液A添加至溶液B中并且在室温下搅拌1h。将反应用EA和水稀释。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(AZZOTA C18 GEMINI 250*20mm 10um；流动相：15％至75％ MeCN与H2O(0.1％NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)和SFC(柱：ChiralPak IA，250x21.3mm I.D.5μm；流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 35％；流速：45mL/min；波长：220nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(142mg)。LCMS ESI(m/z):441.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H),8.08(s,1H),7.61(s,1H),7.57-7.55(m,2H),7.35 -7.30(m,1H),7.30(d,J＝8.4Hz 1H),6.65(d,J＝7.2Hz,1H),5.34-5.22(m,1H),5.14-4.97(m,2H),3.85(s,3H),3.71(s,2H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.81(s)。
实施例51.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙 基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺
5-溴-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶。向5-溴-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(1.50g)在DCM(10.0mL)中的溶液中添加2,2,2-三氟乙基三氟甲磺酸(1.21mL)和Cs2CO3(2.98g)，并且将反应在室温下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用盐水洗涤，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(用在石油醚中的40％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到呈白色固体的5-溴-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(2.00g)。LCMSESI(m/z):279[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.74(s,1H),7.76(s,1H),7.65(d,J＝4.0Hz,1H),6.57(d,J＝4.0Hz,1H),5.29(q,J＝8.0Hz,2H)。19F NMR(377MHz,DMSO-d6)δ-70.45(s)。
1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-甲醛。在CO气氛下向5-溴-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(800mg)在DMF(15mL)中的溶液中添加三乙基硅烷(0.69mL)、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯(II)(210mg)和DIEA(0.95mL)，并且将反应在100℃下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl溶液洗涤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(用在石油醚中的20％乙酸乙酯洗脱)纯化以得到呈白色固体的1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-甲醛(400mg)。
(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺。向1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-甲醛(400mg)在DCM(5.0mL)溶液中添加CuSO4(839mg)和2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(276mg)，并且将反应在室温下搅拌过夜。将反应用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和盐水溶液洗涤，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(用在石油醚中的40％乙酸乙酯洗脱)纯化。将有机层收集，在真空中浓缩，并且干燥以得到呈白色固体的(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(440mg)。LCMS ESI(m/z):332[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(d,J＝2.4Hz,1H),8.52(s,1H),8.32(s,1H),7.70(d,J＝4.0Hz,1H),6.77(d,J＝4.0Hz,1H),5.39-5.37(m,2H),1.14(s,9H)。19F NMR(377MHz,DMSO-d6)δ-70.39ppm。
2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺。在-45℃下向(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)亚甲基)丙烷-2-亚磺酰胺(400mg)在THF(10.0mL)中的溶液中逐滴添加MeMgBr(0.400mL，在醚中3M)。将反应混合物在-78℃下搅拌30分钟并且然后用水稀释。分离各层，并且将有机层浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(在DCM中的0-10％ MeOH)纯化以得到呈无色油状物的2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(320mg)。LCMS ESI(m/z):348[M+H]+。
(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐。向2-甲基-N-((R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰胺(320mg)在二噁烷(2.00mL)中的溶液中添加在二噁烷(1.00mL)中的4N HCl。将混合物在室温下搅拌2小时，并且LCMS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭并且用EA萃取两次。将合并的萃取物浓缩以得到呈白色固体的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(220mg)。LCMS ESI(m/z):244[M+H]+。
(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺。向2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酸(227mg)在DMF(5mL)中的溶液中添加HATU(422mg)和DIEA(358mg)。允许将溶液在室温下搅拌10min，之后添加(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(225mg)。将混合物在室温下搅拌过夜，并且LCMS显示检测到所需MS。将反应用水(5mL)稀释并且用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC TA C18 250*21.2mm 5um；流动相：5％至95％ MeCN与H2O(0.1％FA)；流速：20mL/min；波长：205nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)乙基)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺(200mg)。LC/MS ESI(m/z):430[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),7.51(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.39-7.29(m,2H),6.67-6.58(m,1H),5.25-5.21(m,1H),4.74(q,J＝8.0Hz,2H),3.63(s,2H),1.51(d,J＝8.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-62.52,-71.50。
实施例52.(R)-2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙 基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
4-溴-2-氯-1-(1,1-二氟乙基)苯的合成。向1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮(4g)在BAST(15mL)中的溶液中添加MeOH(0.3mL)。将混合物在70℃下在微波管中搅拌12小时。将混合物用NaHCO3溶液淬灭并且用DCM萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶色谱(100％ PE)纯化以得到呈无色油状物的4-溴-2-氯-1-(1,1-二氟乙基)苯(3.5g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(s,1H),7.53-7.41(m,2H),2.01(t,J＝18.4Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-87.64ppm。
2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯的合成。将4-溴-2-氯-1-(1,1-二氟乙基)苯(3.5g)、3-乙氧基-3-氧代丙酸钾(3.50g)、Pd2(烯丙基)2Cl2(0.10g)、BINAP(0.51g)和DMAP(1.67g)在均三甲苯(40mL)中的溶液在140℃下搅拌1h。然后将混合物在120℃下搅拌12小时，并且将混合物浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈无色油状物的2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯(1.8g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.38(s,1H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),4.17(q,J＝7.2Hz,2H),3.61(s,2H),2.03(t,J＝18.4Hz,3H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H)。
2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯的合成。将2-(3-氯-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯(1.0g)、Zn(CN)2(1.02g)、S-Phos(0.32g)和Pd2(dba)3(0.36g)在DMF(2.0mL)中的溶液在150℃下在微波中搅拌30min。将混合物浓缩并且通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1)纯化以得到呈黄色油状物的2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯(400mg，1.579)。
2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸的合成。向2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸乙酯(400mg)在MeOH(2.0mL)中的溶液中添加1M NaOH(3mL)，并且将混合物在25℃下搅拌12h。在真空中除去MeOH，并且将残余物水溶液用EA洗涤。将水相用1N HCl溶液调节至pH＝4并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到呈无色油状物的2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸(50mg)，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。LCMS ESI(m/z):449(2M-H)-。
(R)-2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺的合成。将2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)乙酸(50mg)和HATU(110mg)在DMF(2.0mL)中的溶液在25℃下搅拌10min。将(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(70.5mg)和DIEA(0.110mL)添加至混合物中。将混合物在25℃下搅拌2小时，并且将混合物用水稀释并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(YMC-Actus Triart C18150*20mm*5um；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(3-氰基-4-(1,1-二氟乙基)苯基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(57.4mg)。LCMS ESI(m/z):452(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.94(s,1H),8.12(s,1H),7.67(s,1H),7.64-7.57(m,3H),6.86(d,J＝7.6Hz,1H),5.31-5.22(m,1H),5.07(q,J＝8.4Hz,2H),3.62(s,2H),2.04(t,J＝18.4Hz,3H),1.53(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(400MHz,CDCl3)δ-70.78,-87.16ppm。
实施例53.(R)-2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙 基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)甲醇。在0℃下向1,2-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-甲酸甲酯(1.0g)在THF(40mL)中的溶液中添加4.90mL 1M氢化铝锂。2小时后，将十水硫酸钠和柠檬酸添加至反应中以破坏过量的氢化铝锂。1小时后，添加甲醇(25ml)并且将细悬浮液滤出。将滤液在减压下蒸发以得到棕色固体。添加EA(50ml)并且将悬浮液在超声浴中处理。滤出固体，并且将此程序重复两次。将黄色滤液在减压下蒸发以得到呈白色固体的粗品(1,2-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基)甲醇(700mg)。LC/MS ESI(m/z):177[M+H]+。
5-(氯甲基)-1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑。将(1,2-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基)甲醇(700mg)在SOCl2(5.0mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。将混合物浓缩至干燥以得到呈黄色油状物的粗产物，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):195[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,1H),7.55(s,2H),4.67(s,2H),3.84(s,3H),3.07(s,3H)。
2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)乙腈。向5-(氯甲基)-1,2-二甲基-1H-1,3-苯并二唑(230mg)在CH3CN(2.0mL)中的溶液中添加1.4mL在THF中的1M TBAF和TMSCN(0.18mL)。将得到的溶液在室温下搅拌2h。TLC和LCMS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EA萃取两次。将合并的萃取物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱(DCM/MeOH＝10/1)纯化以得到呈无色油状物的2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)乙腈(170mg)。LC/MS ESI(m/z):186[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.60(s,1H),7.29(d,J＝8.0Hz,1H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),3.86(s,2H),3.74(s,3H),2.62(s,3H)。
2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)乙酸。将2-(1,2-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基)乙腈(100mg)在浓缩HCl(0.5mL)中的溶液在90℃下搅拌2小时，直至根据LC/MS反应完成。然后将混合物浓缩至干燥以得到呈油状物的粗品2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)乙酸，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):205[M+H]+。
(R)-2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。向2-(1,2-二甲基-1H-1,3-苯并二唑-5-基)乙酸(80mg)和HATU(193mg)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加DIEA(152mg)。允许将溶液在室温下搅拌10min，之后添加(R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基]乙-1-胺盐酸盐(124mg)。将混合物在室温下搅拌16h，并且LCMS检测所需质量。将反应用水(5mL)稀释并且用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*21mm；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ NH3H2O)；流速：15mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(77.5mg)。LC/MS ESI(m/z):431[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),8.07(s,1H),7.60(s,1H),7.52(s,1H),7.30-7.21(m,2H),6.55(d,J＝8.0Hz,1H),5.30-5.23(m,1H),5.06-5.03(m,2H),3.76(s,3H),3.71(d,J＝4.0Hz,2H),2.67(s,3H),1.42(d,J＝8.0Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.80(s)。
实施例54.(R)-2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙 基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺
5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚。在0℃下向5-溴-2-甲基-1H-吲哚(3.0g)在DMF(15mL)中的溶液中添加NaH(在矿物油中的60％悬浮液，1.71g)。将混合物在0℃下搅拌30min，之后添加碘甲烷(3.04g)。使得反应温热至室温，并且搅拌过夜。然后将反应用H2O淬灭，并且用Et2O(3x40mL)萃取。将合并的有机层用H2O(50mL)洗涤，然后经Na2SO4干燥。将粗材料通过硅胶柱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈黄色固体的5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚(3.142g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝1.6Hz,1H),7.23-7.17(m,1H),7.09(d,J＝8.6Hz,1H),6.17(s,1H),3.62(s,3H),2.40(s,3H)。LC/MS ESI(m/z):224[M+H]+。
5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲醛。在0℃下将POCl3(1.66mL)添加至DMF(5mL)中并且搅拌30min。然后将在DMF(5mL)中的5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚(2g)添加至以上混合物中，同时在冰水浴中冷却。然后将反应并且在50℃下搅拌过夜。将反应冷却至室温并倒入冰水中。将NaOH水溶液(2M)添加至混合物中以将pH调节至9，然后用乙酸乙酯萃取。将有机层用水洗涤并且经Na2SO4干燥。在减压下浓缩得到呈黄色固体的粗品5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲醛(2.17g，粗品)，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):252[M+H]+。
5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲腈。向5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲醛(2.17g，粗品)在DMF(10mL)中的溶液中添加吡啶(0.84mL)和NH2OH·HCl(712mg)并且将反应在60℃下搅拌30min。LCMS和TLC指示反应完成，并且然后将混合物冷却至0℃。依序添加CDI(4.2g)和TEA(1.44mL)。将反应在60℃下搅拌过夜并且然后用EA和水稀释。将有机层分离，用饱和NaCl水溶液洗涤并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(在PE中的23％EA)纯化以得到呈黄色固体的5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲腈(1.57g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(d,J＝1.2Hz,1H),7.29(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H),7.11(d,J＝8.8Hz,1H),3.63(s,3H),2.51(s,3H)。LC/MS ESI(m/z):249[M+H]+。
2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸乙酯。向5-溴-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲腈(1.57g)在均三甲苯(15mL)中的溶液中添加二烯丙基二氯化钯(0.10g)、BINAP(0.24g)、DMAP(0.72g)和丙二酸单乙酯钾盐(1.61g)。将反应用N2装填并且在120℃下搅拌过夜。将反应浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈白色固体的2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸乙酯(884mg)。LC/MS ESI(m/z):257[M+H]+。
2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸。向2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸乙酯(884mg)在MeOH(3mL)和THF(3mL)中的溶液中添加在H2O(3mL)中的LiOH(724mg)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后添加水(15mL)，并且将水层用EA洗涤。将水层用1M HCl水溶液酸化至pH<3，将混合物用EA萃取，并且将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩以得到呈白色固体的粗品2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸(530mg)。LC/MS ESI(m/z):229[M+H]+。
(R)-2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺。将粗品2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)乙酸(200mg)和HATU(500mg)在2mL DMF中的溶液在室温下搅拌15min(溶液A)。将DIEA(0.87mL)添加至在2mL DMF中的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(319mg)，直至通过湿pH纸得出溶液的pH高于7(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将反应在室温下搅拌1小时，此时LCMS显示反应完成。将反应用EA和水稀释。将两相分离，并且将水相用EA(10mL x 2)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：AZZOTA C18 30*250mm*10um；流动相：20％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：30mL/min；波长：220nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-2-(3-氰基-1,2-二甲基-1H-吲哚-5-基)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基)乙酰胺(63.3mg)。LC/MS ESI(m/z):455[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.97(s,1H),8.11(s,1H),7.59(s,1H),7.49(s,1H),7.30-7.27(m,1H),7.20(d,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝7.6Hz,1H),5.35-5.25(m,1H),5.16-4.99(m,2H),3.71(s,3H),3.69(d,J＝3.2Hz,2H),2.59(s,3H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-70.78(s)。
实施例55.(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基- 1-d)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺
1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲酸。向1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛(1.8g)在DMSO(20mL)中的溶液中添加KH2PO4(1.4mL)在H2O(10mL)中的溶液和氯化钠(2.13g)在H2O(10mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌12h。将混合物用1N NaOH溶液稀释并且用EA萃取。然后将水相用1N HCl调节至pH＝4并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到呈黄色固体的1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲酸(2.2g，粗品)。LCMS ESI(m/z):246(M+H)+。
N-甲氧基-N-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲酰胺。将1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲酸(2.2g)、N,O-二甲基羟胺盐酸盐(0.96g)、HATU(4.43g)和TEA(3.8mL)在DMF(20mL)中的溶液在25℃下搅拌12h。将反应用水稀释并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩并且将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝20:1)纯化以得到呈黄色固体的N-甲氧基-N-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲酰胺(2g)。LCMS ESI(m/z):289(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(s,1H),8.24(s,1H),8.19(s,1H),5.12(q,J＝8.4Hz,2H),3.78(s,3H),3.46(s,3H)。
向1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛-d。向N-甲氧基-N-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲酰胺(2000mg)在THF(30mL)中的溶液中添加LiAlD4(437mg)。将混合物在25℃下搅拌12h。将混合物用水和2N NaOH水溶液淬灭并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝20:1)纯化以得到呈白色固体的1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛-d(820mg)。LCMS ESI(m/z):231(M+H)+
(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基-d)丙烷-2-亚磺酰胺。向1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-甲醛-d(820mg)在DCM(10mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(561mg)和五水硫酸铜(II)(209mg)。将混合物在25℃下搅拌12h。将混合物过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝20:1)纯化以得到呈黄色固体的(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基-d)丙烷-2-亚磺酰胺(740mg)。LCMS ESI(m/z):234(M+H)+
2-甲基-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基-1-d)丙烷-2-亚磺酰胺。在-78℃下向(R,E)-2-甲基-N-((1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)亚甲基-d)丙烷-2-亚磺酰胺(640mg)在THF(15mL)中的溶液中添加甲基溴化镁(3.200mL，在Et2O中3.0M)。将混合物在-78℃下搅拌2h。将混合物用NH4Cl水溶液淬灭并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到黄色固体。将黄色固体通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH＝20:1)纯化以得到呈白色固体的2-甲基-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基-1-d)丙烷-2-亚磺酰胺(380mg)。LCMS ESI(m/z):350(M+H)+。
(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐。向2-甲基-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基-1-d)丙烷-2-亚磺酰胺(280mg)在二噁烷(2mL)中的溶液中添加HCl/二噁烷(2mL，在二噁烷中4M)。将混合物在25℃下搅拌2h。将混合物浓缩以得到呈白色固体的(R)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-胺盐酸盐(300mg，粗品)。LCMS ESI(m/z):246(M+H)+
(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基-1-d)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺。向1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙-1-d-1-胺盐酸盐(300mg)和2-[4-(三氟甲基)苯基]乙酸(300mg)在DMF(5mL)中的溶液中添加HATU(558mg)和DIEA(0.6mL)。将混合物在25℃下搅拌3h。将反应用水稀释并且用EA萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型HPLC(YMC-ActusTriart C18 150*20mm*5um；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：25mL/min；波长：205nm/254nm)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-5-基)乙基-1-d)-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺(241.8mg)。LCMS ESI(m/z):432(M+H)+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,1H),8.11(s,1H),7.61-7.56(m,3H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),6.69(s,1H),5.05(q,J＝8.4Hz,2H),3.64(s,2H),1.48(s,3H)。19F NMR(377MHz,CDCl3)δ-62.54,-70.81ppm。
实施例56. 2-(4-异丙基苯基)-N-[(1R)-1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基) 乙基]乙酰胺
根据美国专利号7,875,636的实施例16合成标题化合物。
实施例57.(R)-N-(1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)-2-(4-异 丙基苯基)乙酰胺
2-硫氧代-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯的合成。在0℃下向4,5-二羟基吡啶-2-甲酸甲酯(1.0g)和DIEA(1.95mL)在DCM(15mL)中的溶液中添加硫光气(0.90mL)，并且将混合物在25℃下搅拌2小时。将混合物浓缩以得到棕色油状物，将其通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈白色固体的2-硫氧代-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(1.0g)。
2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯的合成。向2-硫氧代-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲酸(1.0g)在DCM(30mL)中的溶液中添加氟化氢-吡啶(70％ HF)(3.0mL)，然后在-78℃下添加1,3-二溴-5,5-二甲基乙内酰脲(4.1g)。将混合物在-78℃下搅拌20min，并且然后将冷却浴用冰-NaCl替代并且将混合物在-10℃下搅拌1小时。将混合物用50％ NaOH溶液(10mL)淬灭，直至pH是中性的。然后添加Na2S2O3(10％溶液，20mL)，并且将混合物用DCM(20mL×3)萃取。将合并的有机层干燥，过滤并且浓缩以得到黄色油状物。将黄色油状物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈白色固体的2,2-二氟-2H-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(850mg)。
(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)甲醇的合成。在0℃下向2,2-二氟-2H-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(480mg)在THF(10mL)中的溶液中添加二异丁基氢化铝(6.6mL，1M)。将混合物在0℃下搅拌2小时，并且将混合物用饱和氯化铵水溶液(5mL)淬灭并且用DCM(5mL×3)萃取。将合并的有机层干燥，过滤并且浓缩以得到呈无色油状物的粗品{2,2-二氟-2H-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基}甲醇(230mg)，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。
2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲醛的合成。向{2,2-二氟-2H-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基}甲醇(230mg)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加氧化锰(106mg)，并且将混合物在25℃下搅拌12小时。然后将混合物过滤，并且将滤液浓缩以得到粗品2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲醛，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。
(R,E)-N-((2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成。向2,2-二氟-2H-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-甲醛(250mg)在DCM(10mL)中的溶液中添加CuSO4(640mg)和(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(210mg)。将反应在25℃下搅拌36小时，并且将混合物过滤并且将滤液浓缩以得到棕色油状物。将棕色油状物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1)纯化以得到呈白色固体的(R,E)-N-((2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(240mg)。
(R)-N-((R)-1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成。在-78℃下向(R,E)-N-((2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(240mg)在THF(5mL)中的溶液中添加甲基溴化镁(1.1mL，在THF中3M)。将混合物在-78℃下搅拌1小时，并且将混合物用饱和氯化铵水溶液(5mL)淬灭并且用EtOAc(10mL×2)萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到黄色油状物。将黄色油状物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝5:1至1:1)纯化以得到呈白色固体的(R)-N-((R)-1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(190mg)。
(R)-1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐的合成。向(R)-N-((R)-1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(100mg)在二噁烷(1.0mL)中的溶液中添加HCl/二噁烷(4N，1mL)。将混合物在25℃下搅拌1小时，并且将混合物浓缩以得到呈白色固体的(R)-1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(70mg，粗品)。
(R)-N-(1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺。向(R)-1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙-1-胺盐酸盐(70mg)在DMF(5.0mL)中的溶液中添加2-[4-(丙-2-基)苯基]乙酸(67.9mg)、EDCI HCl(79.6mg)、HOBT(56.1mg)和DIEA(0.23mL)。将反应在25℃下搅拌3小时，并且将混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将有机层干燥，过滤并且浓缩以得到黄色油状物。将黄色油状物通过制备型HPLC[YMC-Actus Triart C180250*21mm；流动相：30％至95％ MeCN与H2O(0.1％FA)]纯化以得到呈白色固体的(R)-N-(1-(2,2-二氟-[1,3]二氧并[4,5-c]吡啶-6-基)乙基)-2-(4-异丙基苯基)乙酰胺(51.6mg)。LCMS ESI(m/z):363(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(s,1H),7.24-7.15(m,4H),6.98(s,1H),6.53(d,J＝6.8Hz,1H),5.18-4.97(m,1H),3.56(s,2H),2.98-2.80(m,1H),1.40(d,J＝6.8Hz,3H),1.26(s,3H),1.24(s,3H)。
实施例58.(R)-N-(1-(5-氯噻唑-2-基)乙基)-2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺
(R,E)-N-((5-氯噻唑-2-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成。在室温下向5-氯-1,3-噻唑-2-甲醛(160mg)在CH2Cl2(3.0mL)中的溶液中添加(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(131mg)和CuSO4(865mg)。将混合物在室温下搅拌2小时，并且LCMS显示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝3:1)纯化以得到呈黄色固体的(R,E)-N-((5-氯噻唑-2-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(246mg)。
(R)-N-((R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的合成。在-78℃下在N2下向(R,E)-N-((5-氯噻唑-2-基)亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(246mg)在THF(5.0mL)中的溶液中逐滴添加甲基溴化镁(0.98mL，在THF中2.5mol/L)。将混合物在-78℃下搅拌1小时，并且LCMS指示反应完成。将反应混合物用冰水淬灭，并且然后用EtOAc萃取两次。将合并的萃取物浓缩并且将残余物通过硅胶柱色谱(PE:EA＝1:1)纯化以得到呈黄色油状物的(R)-N-((R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(220mg)。LC/MSESI(m/z):267[M+H]+。
(R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙胺盐酸盐的合成。在室温下向(R)-N-((R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(220mg)在二噁烷(5.0mL)中的溶液中添加在二噁烷(0.82mL，4M)中的HCl。将混合物在室温下搅拌2小时，并且LCMS指示反应完成。除去溶剂以得到呈黄色油状物的粗品(R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙胺盐酸盐(117mg)。LC/MS ESI(m/z):163[M+H]+。
6-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯的合成。向6-溴烟酸甲酯(5.47g)、4,4,6-三甲基-2-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧硼杂环己烷(7.87g)、Pd(dppf)Cl2(1.85g)、K2CO3(26.8mL，在水中2M)在乙腈(104mL)中的混合物充入N2并且在80℃下加热90分钟。将反应混合物冷却至室温并且在水和乙酸乙酯之间分配。将两相分离，并且将水相用DCM(10mL x 3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过硅胶柱色谱(0-20％乙酸乙酯/PE)纯化以提供呈无色油状物的6-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯(3.0g)：LC/MS ESI(m/z):232[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.22(d,J＝2.4Hz,1H),8.75-8.74(m,1H),8.34-8.31(m,1H),8.25(d,J＝1.2Hz,1H),7.58(d,J＝11.6Hz,1H),3.97(s,3H)；19F NMR(376.48MHz,CDCl3):-63.98ppm。
6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸甲酯的合成。在0℃下在氮气下向6-(3,3,3-三氟丙-1-烯-2-基)烟酸甲酯(2.47g)和甲基二苯基硫鎓四氟硼酸盐(4.0g)在无水四氢呋喃(30mL)中的悬浮液中添加4.27mL NaHMDS(在THF中2M)。将反应混合物在0℃下搅拌10min并且然后在室温下搅拌1h。然后添加甲醇(0.25mL)以淬灭反应。将粗混合物在真空中浓缩并且将残余物通过硅胶柱色谱(在PE中的10％ EA)纯化以得到呈白色固体的6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸甲酯(345mg)。LC/MS ESI(m/z):246[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ9.09(d,J＝2.4Hz,1H),8.26-8.23(m,1H),7.64(d,J＝8.4Hz,1H),3.95(s,3H),1.54-1.53(m,2H),1.50-1.49(m,2H)ppm。19FNMR(376.48MHz,CDCl3):δ-67ppm。
6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸的合成。向6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸甲酯(345mg)在MeOH(20mL)中的溶液中添加4.0mL的2.0M NaOH。将混合物在65℃下搅拌2小时，并且TLC显示起始材料全部消耗。在真空中除去MeOH并且将反应的pH用1N HCl调节至2-3。将反应用EA(50mL)萃取。将EA萃取物用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的粗品6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸(300mg)。LC/MS ESI(m/z):232[M+H]+。
2-重氮-1-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酮的合成。将在DCM(10mL)中的6-(1-(三氟甲基)环丙基)烟酸(300mg)冷却至0℃。添加草酰氯(1.1mL)和DMF(2滴)并且将得到的溶液在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩，并且将残余物再溶解在DCM(10mL)中并且冷却至0℃。缓慢添加(重氮甲基)三甲基硅烷(1.28mL，在己烷中的2M溶液)和TEA(0.33mL)，并且将得到的溶液在5℃下保持12小时。然后将反应过滤，并且将滤液在减压下浓缩以得到约600mg呈棕色残余物的2-重氮-1-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酮，将其直接用在下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):256[M+H]+。
2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸甲酯的合成。向2-重氮-1-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酮(600mg，粗品)在甲醇(20mL)中的混合物中添加Ag2O(175mg)。将反应在65℃下搅拌2小时，并且TLC显示追踪产物形成。添加另外的Ag2O(142mg)，并且将混合物在65℃下搅拌另外2小时。将反应在真空中浓缩并且将残余物通过硅胶柱色谱(在PE中的10％ EA-20％ EA)纯化以得到100mg呈黄色油状物的2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸甲酯。LC/MS ESI(m/z):260[M+H]+。
2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸的合成。向2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸甲酯(100mg)在MeOH(10mL)中的溶液中添加2.0mL的2.0M NaOH。在将混合物在65℃下搅拌2小时后，在减压下除去一些挥发物，并且将反应的pH通过1N HCl调节至2-3。然后将混合物用EA(50mL x 3)萃取，并且将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的粗品2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(50mg)，将其不经进一步纯化用在下一步骤中。LC/MS ESI(m/z):246[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.43(d,J＝1.6Hz,1H),7.78-7.75(m,1H),7.59-7.56(m,1H),3.69(s,2H),1.43-1.40(m,2H),1.32-1.29(m,2H)ppm。19FNMR(CDCl3,-376.48):δ-69.78ppm。
(R)-N-(1-(5-氯噻唑-2-基)乙基)-2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺的合成。向2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(50mg)在DMF(1.0mL)中的混合物中添加HATU(85mg)，并且将混合物在室温下搅拌5min(溶液A)。向另一个烧瓶中添加(R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙胺盐酸盐(40mg)和DMF(0.5mL)。然后添加DIEA，直至(R)-1-(5-氯噻唑-2-基)乙胺溶解在DMF中并且pH约是8(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将混合物在室温下搅拌2小时。然后添加EA(50mL)和H2O(30mL)，并且将两相分离。将水相进一步用DCM(10mL x 3)萃取，并且将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将残余物通过制备型HPLC(柱：Xbudge prep C18 250*19mm 5um OBD；流动相：10％至55％ MeCN与H2O(0.1％ NH4OH)；流速：20mL/min；波长：205nm/254nm)和SFC(柱：流动相：A针对CO2并且B针对MEOH+0.1％ NH3H2O；梯度：B 40％；流速：50mL/min；波长：220nm)纯化以提供25mg呈白色固体的(R)-N-(1-(5-氯噻唑-2-基)乙基)-2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.43(d,J＝2.0Hz,1H),7.65-7.63(m,1H),7.55-7.53(m,1H),7.46(s,1H),6.24-6.23(m,1H),5.32-5.25(m,1H),3.57(s,2H),1.56(d,J＝6.8Hz,3H),1.43-1.41(m,2H),1.40-1.39(m,2H)ppm。19FNMR(376.48,CDCl3):δ-67.8ppm。
实施例59.(R)-N-(1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基)-2-(6-(1-(三氟 甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺
向2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酸(40mg)在DMF(1.5mL)中的混合物中添加HATU(68mg)，并且将混合物在室温下搅拌5min(溶液A)。向在DMF(0.5mL)中的(R)-1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙胺盐酸盐(49mg)中添加DIEA，直至(R)-1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙胺溶解在DMF中并且pH约是8(溶液B)。将溶液B添加至溶液A中，并且将混合物在室温下搅拌2小时。添加EA(50mL)和H2O(40mL)，并且将有机层用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：Xbudge prep C18250*19mm 5um OBD；流动相：10％至55％ MeCN与H2O(0.1％ FA)；流速：20mL/min；波长：205nm/254nm)纯化以得到呈黄色固体的(R)-N-(1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基)-2-(6-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶-3-基)乙酰胺(23.3mg)。LC/MS ESI(m/z):448[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.43(d,J＝2.0Hz,1H),8.23(d,J＝2.8Hz,1H),7.65-7.62(m,1H),7.52-7.50(m,1H),7.25-7.18(m,2H),6.87(d,J＝7.2Hz,1H),5.13-5.06(m,1H),4.38(q,J＝8.0Hz,2H),3.55(s,2H),1.43-1.38(m,5H),1.36-1.35(m,2H)ppm。19FNMR(376.48,CDCl3):δ-67.7ppm,-73.9ppm。
实施例60.T型钙通道拮抗剂的体外膜片钳数据
在Charles River进行膜片钳测定。在补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素和500μg/mL G418的杜氏改良型Eagle培养基/营养混合物F-12(D-MEM/F-12)中培养HEK293细胞。在测试前，将培养盘中的细胞用汉克平衡盐溶液(Hank’sBalanced Salt Solution)洗涤两次，用accutaseTM处理并且重悬在培养基(在20mL中的约20x106个细胞)中。允许悬浮液中的细胞在组织培养箱中恢复10分钟，所述组织培养箱设置在37℃，空气湿度为95％：5％ CO2气氛。即将在SyncroPatch 384PE系统(SP384PE)中使用之前，将细胞在细胞外缓冲液(HB-PS)中洗涤两次以除去培养基并且重悬在20mL的HB-PS中。将细胞外缓冲液加载到Nanion 384孔膜片钳(NPC-384，4xM)芯片(每孔60μL)的孔中。然后，将细胞悬浮液吸移进芯片的孔(每孔20μL)中。在确立全细胞配置后，使用SP384PE系统中的膜片钳放大器记录膜电流。
本公开文本的说明性化合物在膜片钳测定中显示出对T型钙通道的抑制。
表4.Cav3.2活性
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实施例61.T型钙通道拮抗剂减少Miro1
根据描述于以下中的蛋白质印迹方法进行在化合物施用后Miro1减少的确定：Hsieh C-H、Li L、Vanhauwaert R、Nguyen KT、Davis MD、Bu G等人Miro1 MarksParkinson’s Disease Subset and Miro1 Reducer Rescues Neuron Loss inParkinson’s Models.Cell Metab.2019；1131-1140。
测试几种已知化合物的Miro1减少能力，包括贝尼地平(1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶-二甲酸甲基1-(苯基甲基)-3-哌啶基酯)；MK-8998((R)-2-(4-异丙基苯基)-N-(1-(5-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-2-基)乙基)乙酰胺)；ABT-639(5-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-六氢-1H-吡咯并[1,2-a]吡嗪-2-羰基]-4-氯-2-氟-N-(2-氟苯基)苯磺酰胺)；ACT-709478(N-(1-((5-氰基吡啶-2-基)甲基)-1H-吡唑-3-基)-2-(4-(1-(三氟甲基)环丙基)苯基)乙酰胺)和唑尼沙胺(1,2-苯并异噁唑-3-甲基磺酰胺)。结果在下文中示出。
表5.钙通道拮抗剂的Miro1减少作用
具有T型钙通道活性的化合物展示了减少Miro1。
实施例62.减少Miro1的示例性化合物
a)Miro1成纤维细胞测定
成纤维细胞激发和Miro1蛋白质印迹：皮肤成纤维细胞获自人帕金森病(PD)患者。将CCCP以40μM应用于成纤维细胞持续24h，之后在具有0.25mM PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解细胞。通过在4℃下以17,000x g离心10min来澄清裂解物，并且将上清液在SDS-PAGE中运行以进行蛋白质印迹。电泳后，将硝酸纤维素膜(Bio-Rad)用在湿转移中。首先将转移的膜在含有5％脱脂牛奶和0.1％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭1h，并且然后与以下一抗在4℃下在封闭缓冲液中孵育过夜：以1:1,000与兔抗Miro1(HPA010687，Sigma-Aldrich)、以1:5,000与小鼠抗ATP5β(AB14730，Abcam)、以1:3,000与小鼠抗β-肌动蛋白(A00702，Genscript)或以1:1,000与兔抗VDAC(4661S，Cell SignalingTechnology)。将West Dura ECL试剂(GE Healthcare)以1:5-10,000用于用HRP缀合的山羊抗小鼠或抗兔、抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的ECL免疫印迹。将膜暴露于UltraCruz放射自显影胶片(Santa Cruz Biotechnology)并且在Konica MinoltaSRX-101A显影器上显影。
在以上PD成纤维细胞测定中测试可降低Miro1水平的T型钙通道拮抗剂。以下展示了剂量依赖性Miro1减少。
表6.成纤维细胞中的Miro1减少
化合物 成纤维细胞IC50(nM)
贝尼地平 2565
ABT-639 5408
ACT-709478 3932
MK-8998 693
b)Miro1神经元测定
神经元激发和线粒体蛋白质印迹：将iPSC来源的神经元细胞匀浆、旋转并且分离为“胞质级分”上清液和“线粒体级分”沉淀物。然后将样品在SDS-PAGE中运行以用于蛋白质印迹。
实施例63.在贝尼地平的情况下的体内Miro1减少
如以下中所描述使用帕金森病(PD)苍蝇模型：Hsieh C-H、Li L、Vanhauwaert R、Nguyen KT、Davis MD、Bu G等人Miro1 Marks Parkinson’s Disease Subset and Miro1Reducer Rescues Neuron Loss in Parkinson’s Models.Cell Metab.2019；1131-1140。评价平均表现指数(PI)(负趋地性)。简而言之，将成年苍蝇轻触到改良的25ml攀爬管的底部并且在45秒之后记录其攀爬过程。评估三群苍蝇，并且对于每个群体，在每次实验中对苍蝇检查3次。将记录值用于计算平均PI。
向PD苍蝇喂食钙通道阻断剂拯救运动缺陷。在PD苍蝇模型(突变SNCA苍蝇)中测试贝尼地平并且检查苍蝇的运动。持续10天喂食2.5μM贝尼地平显著改善了运动减少，表明Miro1和钙在PD机制中的参与(图1)。
实施例64.患者来源的样品中的Miro1减少
去极化后无法从患者来源的细胞中清除Miro1与帕金森病的风险相关。本文数据支持可能将Miro1用于检测帕金森病的症状前期。
材料和方法
iPSC在MTA下获自国家神经障碍和中风研究所(National Institute ofNeurological Disorders and Stroke)(NINDS)人和细胞库或与多个储存iPSC的机构有合作关系、具有批准的研究协议并且确保供体同意的帕金森进展标志物倡议(Parkinson’sProgression Markers Initiative)(PPMI)。
细胞培养和蛋白质印迹
将诱导多能干细胞在mTeSR Plus试剂盒(05825，Stemcell Technologies)中培养并且保持在具有湿润气氛的37℃，5％ CO2培养箱中。每1-2天更新培养基并且每4-6天分离。将CCCP(C2759，Sigma-Aldrich)每次以40mM在二甲基亚砜(DMSO)中新鲜制备并且以40mM在新鲜培养基(1:1000稀释)中应用6h。随后将细胞在具有蛋白酶抑制剂混合物(539134，Calbiochem)的NP40细胞裂解缓冲液(FNN0021，ThermoFisher Scientific)中裂解。通过在4℃下以17,000g离心10min除去细胞碎片。将细胞裂解物以1:1与2X Laemmli缓冲液(4％ SDS，20％甘油，120mM Tris-HCl，0.02％溴酚蓝，700mM 2-巯基乙醇)混合并且煮沸5min，之后加载到SDS-PAGE中。将10％聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:双丙烯酰胺＝29:1)和Tris-甘氨酸-SDS缓冲液(24.8mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％ SDS)用于电泳。电泳后，通过Bjerrum Schafer-Nielsen缓冲液[48mM Tris，39mM甘氨酸，20％甲醇(v/v)，pH 9.2]将硝酸纤维素膜(1620115，Bio-Rad)用在半干转移中。首先在4℃下将转移的膜在含有5％脱脂牛奶和0.1％tween-20的磷酸盐缓冲盐水中封闭过夜，并且然后与以下一抗在4℃下在封闭缓冲液中孵育过夜：以1:1,000与小鼠抗Miro1(WH0055288M1，Sigma-Aldrich)、以1:1,000与小鼠抗ATP5b(AB14730，AbCam)或以1:1-3,000与兔抗GAPDH(5174S，Cell SignalingTechnology)。以1:10-20,000使用HRP缀合山羊抗小鼠(115-035-003，JacksonImmunoResearch)或山羊抗兔(111-035-144，Jackson ImmunoResearch Laboratories)。将Pierce ECL蛋白质印迹底物(32109，ThermoScientfic)用于ECL免疫印迹。使用Bio-RadChemiDoc XRS系统扫描膜。将实验重复多于三次。细胞传代数量在12-17范围内，这对表型没有影响。
蛋白质印迹数据的量化
所有实验以盲法形式进行。通过ImageJ(版本1.48V，NIH)测量蛋白质条带的强度。将每个条带的强度相对于来自相同印迹的加载对照GAPDH的强度归一化，并且表达为来自相同实验的“用DMSO治疗的健康-1”的强度的分数；此对照包括在每个独立实验中。通过将用CCCP治疗的Miro1强度的平均值除以用DMSO治疗的相同受试者的Miro1的平均值来计算Miro1的比率，并且导入至热图。进行学生t检验以比较相同受试者(“用DMSO的情况”对比“用CCCP的情况”)内的归一化Miro1条带强度。分别对P值>0.05的受试者连同在CCCP后显示显著Miro1上调的受试者的数量或在CCCP后Miro1减少的P<0.05的受试者的数量计数，并且在图2C中的费舍尔精确检验中使用。n＝3-55个独立实验。
使用多变量回归或方差分析来确定多个影响Miro1比率的变量间的相互作用并且通过图3、图4中的线性拟合来计算P值。在分析过程中，检测Hoehn和Yahr量表(Hoehn andYahr Scale)和简易精神状态检查(Mini-Mental Status Examination)以显示相互作用。随后生成偏回归图以便于了解多变量回归问题中单独变量与反应变量之间的关系。生成七个偏回归图，一个是针对回归问题中的每个单独变量(Hoehn和Yahr量表、简易精神状态检查、发作年龄)、其相互作用项和截距。在用于相互作用项的所有偏回归图中，线性拟合的Hoehn和Yahr量表以及简易精神状态检查的图显示出显著性(P＝0.012)。图5示出了此图和另外的代表性偏回归图。
酶联免疫吸附测定
所有实验作为盲法测试进行。将在DMSO中的40mM CCCP或相同体积的单独DMSO应用于iPSC持续6h，并且然后将细胞在具有蛋白酶抑制剂混合物(539134，Calbiochem)的NP40细胞裂解缓冲液(FNN0021，ThermoFisher Scientific)中裂解。通过在4℃下以17,000g离心10min除去细胞碎片。根据制造商的说明使用Rhot1 ELISA试剂盒(EKL54911，Biomatik)。通过Biomatik验证特异性和稳定性。通过Biomatik和us(图2E-图2G)二者确定动态检测范围、灵敏度(检测下限-LLOD)和精密度(测定间和测定内)，并且结果是可比较的。简而言之，添加50ml由以上制备的细胞裂解物或标准品的连续稀释液(0-40ng/ml)并且在37℃下孵育2h。然后将每孔在37℃下与100ml检测试剂A孵育1h。接下来，洗涤板，并且将每孔在37℃下与100ml检测试剂B孵育1h。再次洗涤板，并且在37℃下将90ml底物溶液添加至每孔持续15-25min。通过50ml终止溶液终止比色反应并且通过微板读取器(Infinite200Pro，Tecan)在450nm处读取吸光度。每板中包括用于生成标准曲线的实验并且在附图中示出了代表性标准图。每个数据点来自3至4个独立实验，每次有2个技术重复。进行学生t检验以比较相同受试者(DMSO对比CCCP)内的Miro1信号。在每个实验中通过蛋白质印迹检测加载对照GAPDH并且对于每个细胞系“DMSO”与“CCCP”之间的加载方面无显著区别。
统计
在此实施例中，除非另有说明，否则数据点的分布表达为箱须图或点图。使用Prism、Excel或Python的statsmodels包进行统计分析。对于所有实验，进行3与55个之间的独立实验。实验重复的数量(n)可以在图例中找到。没有排除的数据。对于所有附图，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
结果
使用的方法描述于Hsieh,C.H.、Li,L.、Vanhauwaert,R.、Nguyen,K.T.、Davis,M.D.、Bu,G.等人(2019).Cell Metab.30,1131-1140中。培养iPSC，并且应用线粒体解偶联剂CCCP来将线粒体膜电位去极化。在CCCP治疗后6h在健康对照中，如通过蛋白质印迹(图2A、图2B)所检测，Miro1被显著降解；此时间点在多个线粒体标志物被降解时线粒体自噬完成之前。将此方法应用于获自PPMI和NINDS人和细胞库的全部87个iPSC系。此队列包括9个野生型对照(8名健康受试者和1个经校正的野生型)、30名不存在其他神经系统障碍体征的携带SNCA、LRRK2或GBA突变的PD患者、42名无症状遗传携带者(称为“风险”)以及6名展现出前驱症状(诸如嗅觉减退或RBD)但无PD诊断的个体(分别称为“嗅觉减退风险”和“RBD风险”)。57名个体具有阳性家族史。以盲法方式进行实验。细胞传代数量在12-17范围内，这对表型没有影响。值得注意的是，在CCCP治疗后6h，在25个PD(83.3％)和36个风险(遗传携带者)系中，在降解Miro1方面的一致损害是明显的(85.7％；图2)。
相比而言，在每个单一对照受试者中去极化后，Miro1被高效除去(0％；图2C)。当将每个个体的Miro1比率(“用CCCP的情况”的Miro1强度除以“用DMSO的情况”的Miro1强度)导入热图时，清楚地展示了此表型。大多数PD和风险受试者显示出高的Miro1比率，而所有健康受试者展示出低的Miro1比率(图2D)。患者和无表现携带者的iPSC中Miro1表型的频率显著高于健康受试者(图2C)。LRRK2突变和嗅觉减退均呈阳性的个体具有显著较高的Miro1表型率(图2C)。
还用可替代方法分析蛋白质印迹结果：酶联免疫吸附测定(ELISA；图2E-图G)。检查在图2D中使用的七个细胞系。对于每个单独系，Miro1对线粒体去极化反应的ELISA结果与蛋白质印迹的结果一致(图2D、图2H)，证明了用于检测iPSC中的Miro1的两种方法的鲁棒性。测量患者细胞中的Miro1的两种方法可以用于临床实践。Miro1比率(“用CCCP的情况”的Miro1强度除以“用DMSO的情况”的Miro1强度)还与PD和遗传风险显著相关(图3A)，但不与年龄(在采样时)或性别显著相关(图3B-图3D)。影响Miro1比率的年龄、性别和遗传背景间没有相互作用(图3B-图3D)。综合来看，这些观察结果显示，在线粒体去极化后无法除去Miro1是此风险个体队列中的共同细胞缺陷。
进行整体结果的截面分析。在使用iPSC的此队列与使用成纤维细胞的先前队列之间比较全部PD患者中Miro1缺陷的频率(Hsieh,C.H.、Li,L.、Vanhauwaert,R.、Nguyen,K.T.、Davis,M.D.、Bu,G.等人(2019).Cell Metab.30,1131-1140)，并且发现在很大程度上一致(在iPSC中83.3％，在成纤维细胞中94％)。然后检查特定亚组中的频率(样品量≥5；图3A、图4A)。在使用iPSC的此队列中携带LRRK2或GBA突变的PD患者中的Miro1缺陷率稍低于使用成纤维细胞的先前队列(针对LRRK2和GBA，分别地，iPSC：83.3％和93.3％；成纤维细胞：100％和100％)。比较PD患者与在相同基因中携带突变的无症状遗传携带者中iPSC中的Miro1表型的出现。值得注意的是，携带LRRK2或GBA突变的无表现遗传携带者显示出与在相同基因中携带突变的有症状患者相似的Miro1缺陷率(针对LRRK2和GBA，分别地，携带者：86.4％和83.3％；PD：83.3％和93.3％)。最后，鉴于此PD队列(12名健康受试者和71名PD患者)的大的样品量，使用成纤维细胞的蛋白质印迹数据检查影响Miro1表型的PD患者的遗传背景、人口统计学和临床表现间是否存在相互作用。尽管包括年龄、性别、统一PD评分量表、Hoehn和Yahr量表和简易精神状态检查在内的每个单独变量不影响Miro1比率，但在Hoehn和Yahr量表与简易精神状态检查之间存在显著的相互作用(图4B-图4D、图5)，表明Miro1比率可能响应于伴有认知损害的PD进展。
实施例65.额颞叶痴呆受试者的细胞中Miro1缺陷的拯救
实施例15的化合物拯救处于发展额颞叶痴呆(FTD)风险中的P301L tau供体中的Miro1缺陷。方法：从MAPT/Tau基因中致病性P301L突变(额颞叶痴呆(FTD)的高度渗透性风险因素)的无症状风险携带者获得成纤维细胞。NINDS系ID：ND32956，收集自47岁的男性高加索人。将成纤维细胞接种在96孔测定板中。24小时后，将细胞用媒介物(DMSO)或剂量反应的实施例15化合物预处理。预处理6h后，将细胞用线粒体应激物FCCP激发14小时。激发14小时后，将细胞固定在多聚甲醛中并且按照标准免疫细胞化学方案使用特定抗体对Miro1染色。在Yokogawa CQ1共焦高内涵成像平台上获取图像并且将来自Miro1抗体的信号量化。将平均Miro1信号强度从约400个细胞/条件量化。
与实施例64中所展示的方法相似，与从未处理成纤维细胞测量的对照Miro1水平相比，可以基于在用FCCP处理成纤维细胞后的Miro1水平计算Miro1比率。在P301L tau供体成纤维细胞中测量到约1的Miro1水平，证明在成纤维细胞中观察到响应于FCCP缺少Miro1减少。相比而言，在健康供体成纤维细胞中测量到约0.3的Miro1水平，证明健康成纤维细胞中的响应于FCCP的Miro1减少。
关于Miro1比率，通过用实施例15处理，将P301L tau供体成纤维细胞以剂量依赖性方式转化呈健康供体表型。实施例15的化合物完全拯救了P301L tau供体成纤维细胞中响应于FCCP的Miro1减少缺陷，IC50＝584nM。这些结果表明，本公开文本的化合物(诸如实施例15)可以用来治疗无症状的Miro1相关障碍(诸如FTD)。
实施例66.钙通道拮抗剂的体外稳定性
确定本公开文本钙通道拮抗剂的体外肝微粒体稳定性。此类方法在本领域中是已知的。参见Knights,KM等人Current Protocols in Pharmacology 2016,74:7.8.1-7.8.24；Hill,JR.Current Protocols in Pharmacology 2004,7:7.8。
实施例67.钙通道拮抗剂的体内药代动力学
大鼠实验
使禁食的6至8周龄之间的雄性Sprague-Dawley大鼠服用本公开文本的钙通道拮抗剂以评价体内药代动力学。将每种化合物配制在5％ DMAC+5％ Solutol HS15+90％盐水中以产生用于给药的溶液。对大鼠经由足背静脉(N＝3)以1mg/kg(1mL/kg)静脉内(IV)给药或经由口服管饲(N＝3)以10mg/kg(10mL/kg)口服(PO)给药。
血液采集：将动物手动控制，并且经由颈静脉将大约200μL血液/时间点采集到预冷却的EDTA-K2管中并且放置在湿冰上。在样品采集后15min内，将血液样品在4℃下离心(2000g，5min)以获得血浆。将血浆样品储存在大约-70℃，直至分析。
在说明性实施例中，在IV或PO给药后，在大鼠血液中发现的实施例15化合物的平均浓度如下表所示。
表7.实施例15在雄性Sprague-Dawley大鼠中的24小时时间过程
(BQL＝低于定量水平)
与美国专利号7,875,636中的实施例16相比，实施例15化合物展现出更高的AUC和Cmax，具有约两倍的半衰期(t1/2)。
狗
对狗进行体内实验以评价本公开文本的某些钙通道拮抗剂。例如，在成年雄性非幼稚比格(beagle)犬(N＝6，8-10kg)中评价实施例15(1mg/kg IV和3mg/kg PO)。允许IV组的狗自由获取食物和水，使PO组的狗禁食过夜并且在给药后喂食4h。经由头静脉注射向IV组施用实施例15。经由口服管饲向PO组施用3mg/kg实施例15。在使用前，在5％二甲基乙酰胺、5％ Solutol HS15、90％盐水中以1mg/mL制备给药配制品。
血液采集：将动物手动控制，并且经由头静脉将大约0.5mL血液/时间点采集到预冷却的EDTA-K2管中。在样品采集的15分钟内，将血液样品在湿冰上冷却，直至在4℃下离心以获得血浆。观察到实施例15的可接受的Cmax(>1g/L)和口服生物利用度(F>50％)。
实施例68.钙通道拮抗剂的脑渗透
在两个实验(每个时间点N＝3)中以1mg/kg IV或10mg/kg PO向6-8周的雄性C57BL/6小鼠一次给药实施例15，并且然后在长达24小时的不同时间测量化合物浓度。在使用前，在5％二甲基乙酰胺、5％ Solutol HS15、90％盐水溶液中以0.2mg/mL(IV)或1mg/mL(PO)制备实施例15的给药溶液。通过尾静脉注射IV或通过口服管饲PO施用化合物。
血液采集：在指定的时间点手动控制动物，经由面部静脉将大约110μL血液样品采集到K2EDTA管中。在15分钟内，将血液样品放置在冰上并且以2000g离心5min以获得血浆样品。
脑采集：在血液采集后，将动物经由CO2安乐死。采集全脑，用冷盐水冲洗，在过滤纸上干燥，称重并且通过放置到干冰中速冻。
使用小鼠血浆/脑PK和相对小鼠血浆和脑匀浆结合来计算实施例15的脑渗透性。实施例15在IV和PO实验二者中展现出可测量的脑穿透性。例如，在给药后4小时：实施例15脑浓度>100ng/mL(IV)；实施例15脑浓度>1000ng/mL(PO)。
尽管出于清楚理解的目的，前述发明已通过说明和举例的方式被稍微详细地描述，但本领域技术人员应理解，可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修改。另外，将本文提供的每篇参考文献通过引用以其整体并入，其程度就如同每篇参考文献均单独地通过引用并入一样。在本申请与本文提供的参考文献存在冲突的情况下，应以本申请为准。

Claims (49)

1.一种式(II)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
环B是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基、-(CH2)n-(C3-C7环烷基)、4至7元杂环基或-(CH2)n-(4至7元杂环基)，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基，或R4a和R4b连同它们所附接的碳原子一起形成C3-C5环烷基；
R6是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
X1和X5各自独立地是N或CR8，条件是X1和X5中的至少一个是CR8；
X2、X3和X4各自独立地是N、NR9、O、S或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N、NR9、O或S；
R8是H、卤素、CN、OR11、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基或C1-C6卤代烷基；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代；并且
n是1、2或3；
条件是所述化合物不具有以下结构：
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中
X1是CR8。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中
R8是H。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中
X2、X3和X4各自独立地是N、NR9或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N或NR9。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，所述化合物具有式(III)的结构：
或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中
R1和R2各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中
R1和R2各自独立地是H、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C2-C3烷氧基烷基、C1-C3卤代烷基或C3-C5环烷基，其中所述环烷基任选地被1、2或3个卤素、CN、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷基氨基或C1-C3卤代烷基取代。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中
R4a和R4b各自独立地是H或CH3。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中
R6是H或C1-C3烷基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中
R6是CH3。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，所述化合物具有式(IV)的结构：
或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中
R9是C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中
R9是C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中
环B是苯基或5至6元杂芳基。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其中
环B是苯基或吡啶基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，所述化合物具有式(V)的结构：
或其药学上可接受的盐。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，所述化合物具有表1或表2中的化合物中任一个的结构。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
20.一种治疗有需要的受试者的神经变性障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
21.一种降低细胞中Miro1水平的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的T型钙通道拮抗剂接触。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述T型钙通道拮抗剂对T型钙通道的选择性是相对于L型、N型、P型和/或R型钙通道中的一种或多种至少约1.2倍或更多。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述T型钙通道拮抗剂具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐，其中
环A和环B各自独立地是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基；
R5是H或C1-C6烷基；
R6a和R6b各自独立地是H或C1-C6烷基；
R7是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R8是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；并且
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代。
24.根据权利要求23所述的方法，其中
环A是9至10元杂芳基。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中
环B是苯基或5至6元杂芳基。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述T型钙通道拮抗剂具有式(II)的结构：
或其药学上可接受的盐，其中
环B是C6-C10芳基或5至10元杂芳基；
R1、R2和R3各自独立地是H、卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、苯基、5至6元杂芳基、C3-C7环烷基、-(CH2)n-(C3-C7环烷基)、4至7元杂环基或-(CH2)n-(4至7元杂环基)，其中所述苯基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OR11、NR12aR12b、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
R4a和R4b各自独立地是H或C1-C6烷基，或R4a和R4b连同它们所附接的碳原子一起形成C3-C5环烷基；
R6是H、C1-C6烷基、或C1-C6卤代烷基；
X1和X5各自独立地是N或CR8，条件是X1和X5中的至少一个是CR8；
X2、X3和X4各自独立地是N、NR9、O、S或CR9，条件是X2、X3和X4中的至少一个是N、NR9、O或S；
R8是H、卤素、CN、OR11、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基或C1-C6卤代烷基；
R9是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素、CN、OH、NH2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C1-C6卤代烷基取代；
每个R11、R12a和R12b独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或4至7元杂环基，其中所述环烷基或杂环基任选地被1、2或3个卤素或CN取代；并且
n是1、2或3。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述T型钙通道拮抗剂具有式(III)的结构：
或其药学上可接受的盐。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述T型钙通道拮抗剂具有式(IV)的结构：
或其药学上可接受的盐。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述T型钙通道拮抗剂具有式(V)的结构：
或其药学上可接受的盐。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述细胞是肌细胞。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述降低Miro1水平是在体外或离体的。
33.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述降低Miro1水平是在体内的。
34.一种用于鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法，所述方法包括：
a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；和
b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中；
其中所述生物样品和所述对照生物样品包含iPSC或分化自iPSC的细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率是约0.5至约10。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率是约0.7至约4。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述线粒体应激物是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)。
38.一种用于鉴定受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中的方法，所述方法包括：
a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；
b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者处于发展Miro1相关障碍的风险中；以及
c)通过施用治疗有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐来治疗处于发展Miro1相关障碍的风险中的所述受试者。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率是约0.5至约10。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率是约0.7至约4。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述线粒体应激物是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述生物样品和所述对照生物样品包含成纤维细胞。
43.一种用于治疗有需要的受试者的神经变性障碍的方法，所述方法包括：
a)检测获自所述受试者并且用线粒体应激物处理的生物样品中的Miro1水平是否与获自所述受试者并且未处理的对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高；
b)如果所述生物样品中的Miro1水平与所述对照生物样品中的对照Miro1水平相比相似或更高，则鉴定所述受试者用于治疗；和
c)向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率是约0.5至约10。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述Miro1水平与所述对照Miro1水平的比率是约0.7至约4。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述线粒体应激物是氰化羰基3-氯苯腙(CCCP)。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物样品和所述对照生物样品包含成纤维细胞。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其中所述神经变性障碍是药物诱导的帕金森症、进行性核上性麻痹、血管性帕金森症、路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮层基底节变性、多系统变性(夏-德综合征)、帕金森病、阿尔茨海默病、皮克病、额颞叶痴呆、多系统萎缩、血管性痴呆、或进行性核上性麻痹(斯蒂尔-理查森综合征)。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中所述受试者无所述神经变性障碍的症状。
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