CN116904386A - 用于细胞培养的美罗沙波 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及美罗沙波(亦称为“反向泊洛沙姆”)作为细胞培养基添加剂的用途。美罗沙波适用于泡沫减少以及剪切应力保护。

Description

用于细胞培养的美罗沙波
技术领域
本发明涉及美罗沙波(亦称为“反向泊洛沙姆”)作为细胞培养基添加剂的用途。所述美罗沙波适用于泡沫减少以及剪切应力保护。
背景技术
泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆188，用于许多工业应用、化妆品和药物。它们还用于细胞培养基过程。添加泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆188至细胞培养基显著改进细胞成活力。高细胞成活力对于最佳蛋白质生产是至关重要的。尚未充分理解泊洛沙姆改进细胞成活力的原因。据信泊洛沙姆减少剪切应力，并且以此方式保护细胞免于损伤。泊洛沙姆，作为一种非离子表面活性剂，可能在气泡/培养基界面处浓缩，以及能够阻止细胞附着至气泡，并且当气泡破裂时以此方式阻止细胞免于损伤。当气泡破裂时，它还可减少冲击。一些出版物声称泊洛沙姆改进氧气从气体转移到液相中的速率，但其它出版物与这些发现相矛盾。还表明，泊洛沙姆可“修复”细胞膜中的小缺陷。
遗憾的是，泊洛沙姆188显著促进在鼓泡生物反应器中产生的泡沫的稳定。因此，除了泊洛沙姆之外通常还使用消泡剂。消泡剂的实例优选是包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)以及任选的二氧化硅颗粒的试剂，亦称为例如二甲硅油或西甲硅油。
加入消泡剂没有解决所有问题，这是因为它通常手动加入，并且如果没有不断监测泡沫水平，泡沫溢出的风险持续存在。基于二氧化硅的消泡剂由于二氧化硅偏析而在它们作用期间被失活。此外，不能大量添加消泡剂，因为它们在较高浓度下可能有毒。二甲硅油是基于硅油的，不能在PES膜上过滤，因此不能用PES过滤灭菌，这就是为什么不能直接在细胞培养基配方中添加消泡剂C的原因。从更高细胞密度培养的角度来看，泡沫问题变得更加严重，因为需要更多氧气，这会导致更多鼓泡，从而产生更多泡沫。
因此，需要一种非发泡或低发泡的泊洛沙姆188替代品。
Schmolka I.R.(Schmolka,Journal of the American Oil Chemists'Society(1977),54(3),110-16)和Murhammer(D.W.Murhammer,C.F.Goochee,Biotechnol.Prog.1990,6,142-148)发布了有关泊洛沙姆188之外其它泊洛沙姆的性质的数据。他们还讨论了美罗沙波的性质。尽管他们发现在剪切应力保护和泡沫稳定方面表现出有希望的特征的一些候选物，但他们无法鉴定理想的候选物。有些对昆虫细胞有毒，并且大多数候选物仍然需要添加消泡剂。
因此，仍然需要找到一种泊洛沙姆188替代品，其不仅提供剪切应力保护，而且另一方面还减少泡沫的形成，并且对细胞无毒。
发明内容
已经发现，某些美罗沙波满足关于毒性、泡沫形成和剪切应力保护的所有要求。对于细胞培养的理想合适性的要求是一定的峰值分子量与PEO(聚环氧乙烷)部分的明确百分比的组合。这导致与泊洛沙姆188相当的剪切应力保护，即相似的活细胞密度、成活力和IgG生产力，同时消除了添加消泡剂的需要。使用这些美罗沙波，在过程中不形成泡沫或仅形成很少的泡沫，这使得不需要添加消泡剂。
本发明因此涉及包含美罗沙波的细胞培养基，所述美罗沙波具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和5000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比(％EO)。
在优选的实施方案中，峰值分子量Mp在1800和3500g/mol之间。
在另一优选的实施方案中，聚环氧乙烷百分比在55和80％之间。
在优选的实施方案中，细胞培养基包含对于液体培养基计算的0.1-10g/L的量的美罗沙波。在非常优选的实施方案中，美罗沙波的量为对于液体培养基计算的0.5-5g/L。
在一个实施方案中，细胞培养基是化学成分明确的培养基。
在一个实施方案中，细胞培养基是干粉或干压实的培养基。
在另一个实施方案中，细胞培养基至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲组分、一种或多种辅助因子和一种或多种核酸组分。
在优选的实施方案中，细胞培养基不包含任何消泡剂。
本发明还涉及一种用于培养细胞的方法，其中所述细胞在包含美罗沙波的液体培养基中培养，所述美罗沙波具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比。优选地，所述方法包括搅动和/或鼓泡。
在优选的实施方案中，峰值分子量Mp在1800和3500g/mol之间。
在另一优选的实施方案中，聚环氧乙烷百分比在55和80％之间。
在优选的实施方案中，与其它方面相同但包含泊洛沙姆188而不是上文定义的美罗沙波的细胞培养基相比，所述液体培养基中的消泡剂的量减少，非常优选的是所述培养基不包含任何消泡剂。
本发明还涉及一种用于减少搅动和/或鼓泡细胞培养中的泡沫形成的方法，其中所述细胞在包含美罗沙波的液体培养基中培养，所述美罗沙波具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比的美罗沙波的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，泡沫形成减少。优选地，所述培养基不包含任何消泡剂。
附图说明
图1显示了对于所选美罗沙波在37℃下连续空气鼓泡期间的泡沫演变。美罗沙波溶液在细胞培养基中制备，浓度为1000ppm。报告的曲线是从重复中选出作为各泊洛沙姆的最具代表性的趋势的一次测量的输出。详细信息可在实施例1中找到。
图2显示了对于所选美罗沙波在37℃下连续空气鼓泡期间的泡沫演变。美罗沙波溶液在细胞培养基中制备，浓度为2000ppm。报告的曲线是从重复中选出作为各泊洛沙姆的最具代表性的趋势的一次测量的输出。详细信息可在实施例1中找到。
图3显示了在细胞培养基中关于各美罗沙波溶液的平均最大泡沫高度。测量在37℃下进行。值是多次重复的平均值。浅灰色条，溶液浓度1000ppm；深灰色条，溶液浓度2000ppm。详细信息可在实施例1中找到。
图4显示了在细胞培养基中关于各美罗沙波溶液的平均平台高度。测量在37℃下进行。值是多次重复的平均值。浅灰色条，溶液浓度1000ppm；深灰色条，溶液浓度2000ppm。详细信息可在实施例1中找到。
图5显示了旋转管中分批进料期间CHOK1细胞的成活力(％)。每个值是每个条件的4次重复的平均值。
图6显示了旋转管中分批进料期间CHOK1细胞的活细胞密度(VCD)。每个值是每个条件的4次重复的平均值。
图7显示了旋转管中分批进料期间CHOK1细胞的IgG生产力。每个值是每个条件的4次重复的平均值。
图8显示了旋转管中分批进料培养期间CHOK1细胞的成活力(％)，以证实添加泊洛沙姆和/或美罗沙波的必要性。每个值是每个条件的4次重复的平均值。
图9显示了生物反应器中分批进料期间CHOK1细胞的成活力(％)。每个数据点是每个条件的3次重复的平均值。误差棒表示平均值的标准偏差。
图10显示了生物反应器中分批进料期间CHOK1细胞的活细胞密度(VCD)。每个数据点是每个条件的3次重复的平均值。
图11显示了生物反应器中分批进料期间CHOK1细胞的IgG生产力。每个数据点是每个条件的3次重复的平均值。误差棒表示平均值的标准偏差。对于某些数据点，误差棒不可见，这是因为误差太小。
图12显示了生物反应器中分批进料培养期间的泡沫演变。数据点是指每个被选为代表的样品一个生物反应器的泡沫水平。唯一需要添加消泡剂C以避免泡沫溢出的培养是泊洛沙姆188支持的培养。其它美罗沙波仅稳定极少量的泡沫，没有溢出的风险，并且不需要消泡剂C。
图5到12的详细信息可在实施例2中找到。在图5、6、7、10、11和12中误差棒表示平均值的标准偏差。涉及泊洛沙姆188的数据点通过虚线连接，以更好地将它们与其它样品区分开来。
图13显示对于美罗沙波8R6用尺寸排阻色谱法(参见方法1)测定的分子量分布。Mp表示特定美罗沙波的峰值分子量。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的组合物或方法步骤，因为它们可以改变。必须注意的是，如本说明书和随附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，对于“泊洛沙姆”的提及包括多种泊洛沙姆等等。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。为本文描述的发明的目的而定义以下术语。
本文使用的术语“生物反应器”是指支持生物活性环境的任何制造或改造的装置或系统。在一些情况下，生物反应器是在其中进行细胞培养过程的器皿或罐，所述细胞培养过程涉及生物体或从这样的生物体衍生的生化活性物质。这样的过程可以是需氧的或厌氧的。常用的生物反应器通常是圆筒状的，尺寸范围从几升到几立方米，并且通常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器可含有由非钢材料制成的一次性成分，并且是一次性的。在一些实施方案中，其是一次性的袋，其中维持生物活性环境。取决于具体的过程，预期生物反应器的总体积可以是范围从100mL至多达10,000升或更大的任何体积。
搅动细胞培养是通过在细胞培养期间持久地或一次或几次搅动在生物反应器中带有细胞的细胞培养基，在生物反应器中进行的细胞培养。
搅动可例如通过搅拌、摇动或振荡进行。在搅拌罐生物反应器中，根据器皿的几何形状，可配置一个或几个叶轮。将根据过程的主要混合任务和要求选择搅拌器类型。
鼓泡细胞培养是其中将气体引入到生物反应器中的细胞培养。这通常用喷射器(亦称为鼓泡器或充气器)进行。
通常，在鼓泡细胞培养中，用喷射器将空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合物引入到生物反应器中。用于细胞培养过程的典型喷射器包括钻孔环喷射器、烧结微喷射器、开管喷射器和混杂形式。表面通气也有助于氧传递，但在规模放大过程中表面通气的影响降低。在哺乳动物细胞培养过程中搅拌器和喷射器类型均通常根据细胞的剪切敏感性来选择(Nienow,A.W.,2006.Reactor engineering in large scale animal cell culture,Cytotechnology,50(1-3),第9页)。
根据本发明的细胞培养基是通常通过向细胞提供至少一种营养物来维持和/或支持体外细胞生长和/或支持特定生理状态的任何组分混合物。它可以是复合培养基或化学成分明确的培养基。细胞培养基可包含维持和/或支持体外细胞生长所需的所有组分，或仅一些组分，使得单独添加进一步的组分。根据本发明的细胞培养基的实例是包含维持和/或支持体外细胞生长所需的所有组分的完全培养基，以及培养基补充剂或进料。在优选的实施方案中，细胞培养基是完全培养基、灌注培养基或进料培养基。完全培养基，亦称为基础培养基，通常具有6.7和7.8之间的pH。进料培养基优选地具有低于8.5的pH。
通常，根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持生物反应器中的细胞生长。
进料或进料培养基是细胞培养基，其不是在细胞培养中支持初始生长和生产的基础培养基，而是在后期添加以防止营养物耗尽和维持生产阶段的培养基。与基础培养基相比，进料培养基可具有更高浓度的一些组分。例如，一些组分，例如营养物，包括氨基酸或碳水化合物，可以在基础培养基中的浓度的约5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100x、200X、400X、600X、800X或甚至约1000X，存在于进料培养基中。
哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞的体外生长的组分混合物。哺乳动物细胞的实例是人或动物细胞，优选地CHO细胞、COS细胞、I VERO细胞、BHK细胞、AK-1细胞、SP2/0细胞、L5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。
化学成分明确的细胞培养基是不包含任何化学成分不明确的物质的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学品的化学组成是已知的。化学成分明确的培养基不包含任何酵母、动物或植物组织；它们不包含饲养细胞、血清、水解产物、提取物或消化物或其它不充分明确的组分。化学成分不明确或不充分明确的化学组分是这样的组分，其化学组成和结构是未知的，以不同的组成存在，或仅能用巨量的实验工作确定——与蛋白质例如胰岛素、白蛋白或酪蛋白的化学组成和结构的评价相当。
粉状细胞培养基或干粉培养基是通常从研磨过程或冻干过程得到的细胞培养基。这意味着粉状细胞培养基是颗粒状的微粒培养基——不是液体培养基。术语“干粉”可与术语“粉末”互换使用；然而，本文使用的“干粉”仅仅是指颗粒状材料的总体外观，并且不意指该材料完全不含复合或附聚的溶剂，除非另外指明。
干颗粒状培养基是从湿法或干法制粒过程得到的干培养基，例如通过喷雾干燥、湿法制粒或干法压实，通常具有大于0.5mm，例如0.5和5mm之间的颗粒大小。干法压实通常在辊压机中进行。US 6,383,810B2公开了生产湿颗粒状的真核细胞培养基粉末的方法。该方法包括用溶剂润湿干粉细胞培养基，然后重新干燥湿润的培养基以获得干颗粒状的细胞培养基。优选地，干颗粒状培养基是从干粉培养基的碾压得到的培养基。本文使用的术语“干”仅仅是指颗粒状材料的总体外观，并且不意指该材料完全不含复合或附聚的溶剂，除非另外指明。
对于在细胞培养中的用途，即用于培养细胞，将液体细胞培养基添加至细胞。因此，干粉或干法压实的细胞培养基溶于合适量的液体，例如水或水性缓冲液，以产生液体细胞培养基，其可与细胞接触。由于液体细胞培养基的组成是直接影响细胞的因素，因此细胞培养基的浓度通常提供为重量/升例如mg/升，定义了待添加至细胞的液体培养基中的组分浓度。干粉或干法压实的培养基的成分的量需要调整，使得当溶于一定量的液体时，达到所得的液体培养基中组分的目标浓度。
待用根据本发明的培养基培养的细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，或真核细胞，例如植物或动物细胞。细胞可以是正常细胞、永生化细胞、患病细胞、转化细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚胎细胞，其中任何一种可以是已建立或转化的细胞系或从自然来源获得。
平均分子量通过SEC如下测定：
重量平均分子量：Mw＝∑i Ni Mi 2/(∑i Ni Mi)
数量平均分子量：Mn＝∑i Ni Mi/(∑i Ni)
峰值分子量：Mp＝在最大Ni处的分子量
Ni＝在级分i中聚合物物类的数量
Mi＝在级分i中聚合物物类的分子量
SEC条件：
校准标准：PEG(细节见实施例，方法1)
洗脱液：THF
流速：1ml/min
注射体积：100μl
柱：颗粒大小＝5μm，材料＝苯乙烯-二乙烯基苯
温度：40℃
细胞培养基可以呈水性液体形式，或使用时溶于水或水性缓冲液的干粉形式。
本领域技术人员能够选择合适的细胞培养基用于设想的特定目的。
根据本发明的细胞培养基，尤其是包含维持和/或支持体外细胞生长所需的所有组分的完全培养基，通常至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲组分、一种或多种辅助因子和一种或多种核酸组分。它们也可另外包含化学成分明确的生物化学成分，例如重组蛋白，例如重组胰岛素、rBSA、重组转铁蛋白、重组细胞因子等。
糖组分是所有单糖或二糖，例如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)。
根据本发明的氨基酸的实例是酪氨酸，蛋白质源性氨基酸，特别是必需氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，以及非蛋白质源性氨基酸，例如D-氨基酸，其中L-氨基酸是优选的。
术语氨基酸进一步包括氨基酸的盐，例如钠盐，或各自的水合物或盐酸盐。
例如，酪氨酸意指L-或D-酪氨酸，优选地L-酪氨酸，以及其盐或水合物或盐酸盐。
维生素的实例是维生素A(视黄醇、视黄醛、各种类视黄醇和四种类胡萝卜素)、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸、烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸、亚叶酸)、维生素B12(氰钴胺素、羟基钴胺素、甲钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素E(生育酚、生育三烯酚)和维生素K(叶绿醌、甲萘醌)。还包括维生素前体。
盐的实例是这样的组分，其包含无机离子，例如碳酸氢根、钙、氯离子、镁、磷酸根、钾和钠，或微量元素，例如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn。实例是硫酸铜(II)五水合物(CuSO4 .5H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2 .2H2O)、氯化钾(KCl)、硫酸铁(II)、柠檬酸铁铵(FAC)、无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化镁六水合物(MgCl2 .6H2O)、硫酸锌七水合物。
缓冲剂的实例是CO2/HCO3(碳酸盐)、磷酸盐、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。
辅助因子的实例是硫胺素衍生物、生物素、维生素C、NAD/NADP、钴胺素、黄素单核苷酸和衍生物、谷胱甘肽、血红素核苷酸磷酸盐和衍生物。
根据本发明的核酸组分是核碱基，例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，核苷，例如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷，以及核苷酸，例如一磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
与完全培养基相比，进料培养基可具有不同的组成。它们通常包含氨基酸、微量元素和维生素。它们也可包含糖组分，但有时为了生产原因，糖组分在单独的进料中添加。
许多生物药物生产平台基于分批进料细胞培养方案。目的通常是为了开发高滴度细胞培养过程，以满足日益增加的市场需求和降低制造成本。除了使用高性能重组细胞系之外，需要细胞培养基和过程参数的改进以实现最大生产潜力。
在分批进料过程中，基础培养基支持初始生长和生产，并且进料培养基防止营养物耗尽和维持生产阶段。选择培养基以适应不同生产阶段期间的不同代谢需求。过程参数设置，包括进料策略和控制参数，定义了适合细胞生长和蛋白质生产的化学和物理环境。
在灌注过程中，细胞培养基通过泵连续地从生物反应器中添加和去除，而细胞通过细胞保留装置保留在生物反应器中。灌注的优点是达到非常高的细胞密度的可能性(由于恒定的培养基交换)，以及生产非常脆弱的重组蛋白的可能性，这是因为产物可以每天从生物反应器中取出，从而减少重组蛋白对高温、氧化还原电位或释放的细胞酶的暴露时间。
用于灌注细胞培养的方法通常包括在包含具有培养基入口和收获物出口的生物反应器的生物反应器系统中培养细胞，其中
i.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过培养基入口将新的细胞培养基添加到生物反应器中；
ii.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过收获物出口将收获物从生物反应器中取出。收获物通常包含由细胞生产的目标产物、细胞和液体细胞培养基。
泊洛沙姆是两亲聚合物，具有两个亲水嵌段和在中间的疏水嵌段。泊洛沙姆是聚乙二醇(PEG)/聚丙二醇(PPG)三嵌段共聚物，其中一个PPG嵌段在两侧与PEG嵌段相接。聚乙二醇(PEG)部分通常亦称为聚环氧乙烷(PEO)部分。聚丙二醇(PPG)部分通常亦称为聚环氧丙烷(PPO)部分。
通常用于细胞培养应用的泊洛沙姆，CAS号9003-11-6，称为泊洛沙姆188并具有通式I
其中x和z优选独立地是75-85，并且y优选地是25-30。本发明的泊洛沙姆可在x＝z＝3-72和y＝5-12的范围内存在。
关于泊洛沙姆的进一步的信息可见于Hagers Handbuch der PharmazeutischenPraxis,第9卷“Stoffe P-Z”,1994,第282-284页。
与泊洛沙姆相比，美罗沙波具有反向序列。这就是为什么它们通常被称为“反向泊洛沙姆”的原因。美罗沙波的中心嵌段是PEO(聚环氧乙烷)，在两侧与PPO(聚环氧丙烷)嵌段相接(Schmolka 1977)。
本发明报告的美罗沙波可以在x＝z＝1-31和y＝13-173的范围内存在。
泊洛沙姆和美罗沙波具有相同的CAS号9003-11-6。
泊洛沙姆和美罗沙波的命名法相似，并且在上述Schmolka的综述(Schmolka1977)中进行了编码。第一个数字乘以100，是指PPO嵌段的分子量，并且最后一个数字乘以10，得到该分子的％EO。为了区分美罗沙波，通常在第一个和最后一个数字之间添加一个R，以指出它们的反向结构。
一些泊洛沙姆和美罗沙波是市售可得的。对于泊洛沙姆，或/>(例如/>溶液、凝胶或固体，例如/>F-68)，或对于美罗沙波，/>R。
或者，泊洛沙姆和美罗沙波可根据本领域已知的方法从原材料合成(参见，例如美国专利号3,036,118和3,740,421)。
表1概述了示例性的美罗沙波。
所有列举的美罗沙波通过测定它们的聚环氧乙烷百分比(％EO,w/w)和它们的分子量分布来表征。％EO使用1H NMR测定。分子量分布使用尺寸排阻色谱法测定(参见实施例，方法1)。峰值分子量(Mp)用于表征各聚合物。
表2显示了在实施例中用作参考的泊洛沙姆188的相同数据。
发明详述
本发明的主旨是某些美罗沙波显示用于细胞培养的改进性质的研究结果。它们不仅提供如同泊洛沙姆188一样的剪切保护，而且显示减少的泡沫形成。合适的美罗沙波还对于培养的细胞而言是无毒的。
泊洛沙姆188通常添加至细胞培养以防止由鼓泡和/或搅动引起的流体动力学应力。它减少表面张力，但也通常增加泡沫形成。因为细胞趋于粘附至气泡表面，它们随气泡上升至表面区域，陷入泡沫层中，并且死亡。现在已发现，使用具有不同组成的美罗沙波，有益的剪切应力保护性质可得到保持，但此外，泡沫形成减少。
因此，当使用根据本发明的细胞培养基时，减少泡沫形成的消泡剂例如消泡剂C的量可减少或甚至优选省略。在优选的实施方案中，根据本发明的培养基含有更少、优选地少至少25％(w/w)、更优选少于一半的消泡剂(例如消泡剂C)的量，最优选不含消泡剂，所述消泡剂的量用于在相同条件下相同的培养基的同等细胞培养，除了所述培养基不含本发明定义的美罗沙波而是含有泊洛沙姆188之外。典型的消泡剂由油(碳氢化合物或聚(二甲基硅氧烷))、分散的疏水固体颗粒或两者的混合物组成。消泡剂的实例优选地是包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)以及任选的二氧化硅颗粒的试剂，亦称为例如二甲硅油或西甲硅油，例如Dow-Corning Q7-2587(O/W乳剂，含30.4％ PDMS、1.2-2.1％ SiO2颗粒)、来自SigmaAldrich的消泡剂C(O/W乳剂，29.4％PDMS、1.2-2-1％ SiO2颗粒)和来自Gibco的Foam Away(在水中30％西甲硅油乳剂)。
优选地，根据本发明或用于本发明的细胞培养基不包含泊洛沙姆188。
已鉴定为特别合适的美罗沙波是具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和5000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比的美罗沙波。
在优选的实施方案中，峰值分子量Mp在1800和3500g/mol之间。
在另一优选的实施方案中，PEO百分比在55和80％之间。
非常优选的是，美罗沙波具有在1800和3500g/mol之间的峰值分子量Mp，以及PEO百分比在55和80％之间。
本领域技术人员知道如何使用美罗沙波作为细胞培养基的成分。他知道使用的合适的量和形式。通常，将美罗沙波作为细胞培养基的一部分应用至细胞培养。然而，它也可单独应用。
美罗沙波通常以固体，例如颗粒，或液体，例如油或表现得像糊状物的高粘性液体，或水性溶液的形式存在。
根据本发明的细胞培养基是包含具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的环氧乙烷百分比的美罗沙波的细胞培养基。
在优选的实施方案中，美罗沙波具有在1800和3500g/mol之间的峰值分子量Mp，以及PEO百分比在55和80％之间。
在另一个优选的实施方案中，与不包含本发明的美罗沙波而是包含泊洛沙姆188的细胞培养相比，细胞培养基不包含消泡剂或包含减少量的消泡剂，优选地少于50％。优选地，所述培养基也不包含泊洛沙姆188。
在细胞培养基中美罗沙波的浓度优选地为对于液体培养基计算的0.1-10g/L。在非常优选的实施方案中，美罗沙波的量为对于液体培养基计算的0.5-5g/L。美罗沙波可以是一种类型的如上文定义的美罗沙波，或两种或更多种的如上文定义的美罗沙波的混合物。
优选地，细胞培养基是干粉或干颗粒状培养基或液体培养基。在干培养基的情况下，在使用前将培养基溶于合适量的水或水性缓冲液中。
本发明的细胞培养基可用于任何类型的细胞培养。细胞培养是细胞在其中培养的任何设置。
细胞培养可在适合培养细胞的任何容器中进行，所述容器例如培养皿、接触板、瓶、管、孔、器皿、袋、烧瓶和/或罐。优选地，其在生物反应器中进行。通常，容器在使用前被灭菌。培养通常通过在合适的条件，例如合适的温度、渗透压、通气、搅动等之下在水性细胞培养基中孵育细胞进行，所述条件限制来自环境的外来微生物的污染。本领域技术人员知道用于支持或维持细胞的生长/培养的合适孵育条件。
因此，本发明还涉及用于培养细胞的方法，其中所述细胞在包含具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的环氧乙烷百分比的美罗沙波的液体培养基中培养。
细胞培养可以是适合培养细胞的任何设置。优选地，它是分批、分批进料或灌注细胞培养。
优选地，用于培养细胞的方法包括以下步骤：
a)提供生物反应器；
b)将待培养的细胞与根据本发明的细胞培养基混合；
c)孵育步骤b)的混合物。
在优选的实施方案中，所述方法不包括添加消泡剂。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供生物反应器；
b)将待培养的细胞与根据本发明的细胞培养基混合；
c)孵育步骤b)的混合物，
其中细胞培养基，在该情况下为进料培养基，在整个时间中连续地或在步骤c)的细胞孵育时间内一次或几次被添加至生物反应器。
进料培养基可以是根据本发明的细胞培养基，但它也可以是不包含美罗沙波的进料培养基。优选地，它不包含美罗沙波。
在一个实施方案中，生物反应器是灌注生物反应器。灌注生物反应器是其中可进行灌注细胞培养的生物反应器。它包含在细胞培养期间通常关闭的生物反应器器皿，在所述器皿中的搅拌器，用于引入新鲜培养基的管线，用于从生物反应器取出包含细胞、液体培养基和目标产物的收获物流的收获物管线，以及在收获物管线中在收获物的液体部分可被收集的同时保留细胞的细胞保留装置。提供关于有利设置的细节的关于灌注细胞培养的综述可见于“Perfusion mammalian cell culture for recombinant proteinmanufacturing–A critical review”Jean-Marc Bielser等,Biotechnology Advances 36(2018)1328–1340。
在灌注过程中，细胞培养基通过泵连续地加入和从生物反应器中去除，同时通过细胞保留装置将细胞保留在生物反应器中。灌注的优点是达到非常高的细胞密度的可能性(由于恒定的培养基交换)和生产非常脆弱的重组蛋白的可能性，这是因为产物可以每天从生物反应器中取出，从而减少重组蛋白对高温、氧化还原电位或释放的细胞蛋白酶的暴露时间。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在包含具有培养基入口和收获物出口的生物反应器的生物反应器系统中培养细胞，其中
i.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过培养基入口将新的根据本发明的细胞培养基添加到生物反应器中；
ii.在细胞培养过程期间连续地或一次或几次，优选连续地，通过收获物出口将收获物从生物反应器中取出。收获物通常包含由细胞生产的目标产物、细胞和液体细胞培养基。
与在相同条件下但用包含泊洛沙姆188而不是上文定义的美罗沙波的培养基进行的细胞培养相比，当使用根据本发明的细胞培养基时，培养显示同等性能和减少的泡沫形成。
因此，本发明还涉及用于在搅动和/或鼓泡细胞培养中减少泡沫形成的方法，其中在包含具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和5000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的环氧乙烷百分比的美罗沙波的液体培养基中培养细胞，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和5000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的环氧乙烷百分比的美罗沙波的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，泡沫形成减少。优选地，在用于减少泡沫形成的方法中不使用消泡剂。
本发明还涉及用于在搅动和/或鼓泡细胞培养中培养细胞的方法，其中在包含具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和5000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的环氧乙烷百分比的美罗沙波的液体培养基中培养细胞，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有在1000和8000g/mol之间、优选在1000和5000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的环氧乙烷百分比的美罗沙波的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，液体培养基中的消泡剂的量减少。优选地，消泡剂的量减少至少25％，优选地至少50％。最优选的是，在搅动和/或鼓泡细胞培养中培养细胞的方法中不使用消泡剂。
本发明的培养基和方法首次提供了这样的可能性，即，一方面提供剪切应力保护，另一方面避免了泡沫稳定的典型相关复杂化以及产生的添加消泡剂的要求。在不对泡沫形成和稳定性产生负面影响的情况下提供剪切应力保护。甚至有可能增加细胞培养基中美罗沙波的量，而不对泡沫形成产生负面影响。这为细胞培养专家设置理想的培养条件提供了更大的灵活性。
这些结果是无法预料的。例如，泊洛沙姆188和美罗沙波12R8具有相似的峰值分子量(Mp)、％EO、PPO嵌段的分子量以及细胞培养基中溶液的表面张力值，然而它们表现出非常不同的泡沫行为。从实施例2可以看出，美罗沙波12R8溶液产生的泡沫没有达到泡沫分析仪的柱顶，并且最终平衡到5和6cm之间的平台高度。与此相反，使用泊洛沙姆188的样品在很短的时间内达到分析仪柱的最大泡沫高度。
上文和下文引用的所有申请、专利和出版物以及2022年4月13日提交的相应专利申请EP22168244.6的全部公开内容通过引用结合到本文中。
实施例
方法1
所有尺寸排阻色谱法(SEC)测量如下进行：
校准标准：PEG(Mp:430、982、1960、3020、6690、12300、26100和44 000g/mol)
洗脱液：THF
流速：1mL/min
注射体积：100μL
柱：颗粒大小＝5μm，材料＝苯乙烯-二乙烯基苯
温度：40℃
检测器：折射率(RI)
对于所有美罗沙波和泊洛沙姆188测量分子量分布曲线，并测定Mp(峰最大值)(表1和2)。示例性的分布曲线显示在图13中，图13显示对于美罗沙波8R6用尺寸排阻色谱法测定的分子量分布。Mp表示特定美罗沙波的峰值分子量。
方法2：
在37℃下在细胞培养基中美罗沙波溶液的泡沫演变测量
在细胞培养基中制备美罗沙波溶液
以选择的浓度制备目标美罗沙波在不含泊洛沙姆188的细胞培养基4CHO(Merck KGaA)中的溶液，然后通过滚轮式混合器搅拌或混合至少2小时，直到完全分散。溶液按重量制备。根据生产商的说明书制备细胞培养基。
泡沫测量
通过使用动态泡沫分析仪DFA 100(Krüss GmbH)测试泡沫演变。
采用以下参数：
温度：37℃
发泡方法：流量控制(空气)
流速：0.3L/min
液体体积：15mL
柱：CY4575-40mm t.棱柱
过滤器：FL4551–纸,12-25μm,
高度照明：蓝色-λ＝469nm
样品架：SH4511-鼓泡
相机高度：60mm
相机位置：2
结构照明：30％
高度照明：20％
将溶液倾入泡沫分析仪DFA 100的玻璃柱中。将溶液加热直至37℃，因为这是生物反应器中使用的温度。
开始气流，并通过泡沫分析仪记录泡沫形成(泡沫高度、液体高度和泡沫结构)。
如果泡沫达到最大柱高(210mm)，气流自动停止以防止溢出，并在选定的时间内监测泡沫在没有气体鼓泡的情况下的衰减。如果泡沫没有到达柱顶，气体继续流动，持续选定的时间(通常为60分钟)，然后停止，并监测泡沫衰减。
方法3
静态表面张力测量
静态表面张力通过使用Force Tensiometer K100C(Krüss GmbH)测定。Wilhelmy板用于测量。
采用以下参数。
测量温度：37℃
测量时间：300秒
数据点：200
频率：1Hz
获取数据，直到对于200个数据点，测量的表面张力的标准偏差离其平均值小于0.07mN/m。
将溶液倾入Force Tensiometer K100C的玻璃器皿中。将溶液加热直至37℃，因为这是生物反应器中使用的温度。临在开始测量之前，将Wilhelmy板点燃直至发出红色光，以消除污染并确保接触角等于零。
方法4
在旋转管中分批进料细胞培养
进行分批进料细胞培养以评价在培养期间美罗沙波的保护性能。使用CHOK1 GS细胞。在旋转管(TPP,Art.No.87050)中以最终体积30mL在37℃、5％ CO2加湿气氛和320rpm转速(孵育箱挠度25mm)下进行培养。
在开始分批进料之前，细胞在含有2g/L泊洛沙姆188的细胞培养基4CHO(Merck KGaA,103795)中培养。向此培养基中加入HT补充物100x(次黄嘌呤钠(10mM)和胸苷(1.6mM),/>Life technologies,Art.No.11067-030)和L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Sigma Aldrich M5379)。对于每种条件，使用不含泊洛沙姆188的细胞培养基/>4CHO(Merck KGaA)，并加入选定的美罗沙波以达到1g/L的浓度。将溶液搅拌至少2小时，以允许完全分散。
在分批进料的第0天，在2000rpm下将细胞离心5分钟，然后重悬浮于不含泊洛沙姆188的4CHO+HT中并合并。
用0.2x106个细胞/mL，在不同的泊洛沙姆条件下(各4个重复)接种CHOK1 GS细胞。
用进料溶液向细胞进料。
从D3开始每日测量葡萄糖浓度。在整个发酵过程期间，按需要维持葡萄糖的连续进料。
培养进行17天。
每日进行用ViCell(Beckman Coulter)的VCD和成活力分析，以及通过使用Cedex(Bio HT Analyzer,Roche)的IgG测定。
在生物反应器中分批进料细胞培养
在生物反应器中进行分批进料细胞培养，以评估美罗沙波在CHOK1 GS细胞培养过程中的保护和低发泡性能。
玻璃生物反应器(Eppendorf,平行生物反应器系统，目录编号76DG08CC和76DG04CCBB)用于分批进料实验。生物反应器配备了L-Sparger和斜叶叶轮。
添加了泡沫捕集器以防止泡沫溢出。
在分批进料开始之前，在细胞培养基4CHO(配方中不含泊洛沙姆，Merck KGaA，4.74000.9999)中在美罗沙波和泊洛沙姆188溶液各自中分别培养和适应细胞。浓度为2g/L。向此培养基中加入HT补充物100x(次黄嘌呤钠(10mM)和胸苷(1.6mM),Life technologies,Art.No.11067-030)和L-甲硫氨酸亚砜亚胺(SigmaAldrich M5379)。
根据以下参数执行分批进料。
0.2-0.4％消泡剂C仅在泡沫开始收集在泡沫捕集器中时才添加。此事件仅发生在泊洛沙姆188上。对于测试的所有其它美罗沙波，没有发生明显的泡沫形成，因此无需添加消泡剂C。
实施例1：泡沫分析
研究了所选的美罗沙波的发泡行为。实验设置和程序在方法2中描述。
将由美罗沙波稳定的泡沫与由泊洛沙姆188(无动物细胞培养基的基准)稳定的泡沫进行比较。制备不同的溶液。将美罗沙波添加到4CHO细胞培养基(没有任何泊洛沙姆188存在)中，浓度为1000ppm(1g/L)和2000ppm(2g/L)。
图1中报告了美罗沙波浓度为1000ppm的培养基的泡沫演变图，并且图2中报告了美罗沙波浓度为2000ppm的培养基的泡沫演变图。
用泊洛沙姆188在两种浓度下稳定的泡沫在50s内达到210mm的最大泡沫高度(即泡沫分析仪柱的长度)。此时，仪器自动停止测量以防止溢出。
美罗沙波表现出显著不同的行为。由它们稳定的泡沫没有到达泡沫分析仪的柱顶，并且在整个测量时间内持续空气鼓泡。泡沫在气体鼓泡的最初几秒钟内迅速增长，对于1000ppm溶液达到在30和69mm之间的最大高度，并且对于2000ppm溶液达到在24和162mm之间的最大高度。然后泡沫高度迅速下降，对于1000ppm溶液，泡沫高度稳定在24和51mm之间的恒定高度，并且对于2000ppm溶液，泡沫高度稳定在24和63mm之间的恒定高度(见图1、2、3和4)。
泡沫高度的降低和恒定泡沫水平(即平台高度)的形成可根据由于鼓泡导致的泡沫形成和由于排水和气泡聚并导致的泡沫衰减之间的平衡来解释。
尽管与泊洛沙姆188相比，美罗沙波较不易稳定泡沫，但对于不同的美罗沙波，可观察到泡沫稳定能力的显著差异。与其它美罗沙波相比，美罗沙波9R8和12R8更有可能稳定泡沫，并导致更高的泡沫高度。特别是，美罗沙波8R6在两种浓度下都显示出最低的最大和平台泡沫高度。
泊洛沙姆188和美罗沙波9R8具有非常不同的泡沫行为。由泊洛沙姆188稳定的泡沫在少于一分钟内达到21cm的最大泡沫高度，相反，美罗沙波9R8在两种浓度下的泡沫的最大泡沫高度约为7cm，并在1000ppm时达到约5cm平台高度的平衡，在2000ppm时达到6cm平台高度的平衡。
另一个令人惊讶的观察结果是，浓度加倍后，平均最大泡沫高度和平台高度保持相似。仅对于美罗沙波12R8，2000ppm时的平均最大泡沫高度明显高于1000ppm时的平均最大泡沫高度。
这些意外的泡沫分析数据可以通过临在泡沫分析之前在37℃下使用相同的溶液进行的静态表面张力测量来解释。浓度增加没有导致表面张力的大幅降低，差异在1和2.5mN/m之间。对于美罗沙波12R8溶液测量了用双倍浓度时的表面张力的最大差异(即4mN/M)，所述样品也导致平均泡沫高度的最大差异。
每个样品的表面张力值与平均平台高度或平均最大泡沫高度之间没有发现显著相关性。原则上，较低的表面张力应导致较高界面面积的稳定，从而产生更多的气泡和更多的泡沫。然而，与其它样品相比，美罗沙波8R6溶液具有较低的表面张力(在1000ppm时(48.7±0.2)mN/m和在2000ppm时(46.5±0.3)mN/m)，但它导致最低的泡沫高度。
泊洛沙姆188和美罗沙波12R8具有相似的峰值分子量(Mp)、％EO、PPO嵌段的分子量和细胞培养基中溶液的表面张力值，但它们表现出非常不同的泡沫行为。美罗沙波12R8溶液产生的泡沫没有到达泡沫分析仪的柱顶，并且最终平衡到5和6cm之间的平台高度。
表3显示了1000和2000ppm浓度下细胞培养基中美罗沙波溶液的静态表面张力。报告的数据是37℃下重复测量的平均值与标准偏差。
实施例2：在分批进料培养中使用的美罗沙波
旋转管培养
进行分批进料细胞培养(见方法4)以研究与基准泊洛沙姆188相比，不同美罗沙波的剪切应力保护性质。
正如在泡沫分析数据中观察到的那样，与泊洛沙姆188相比，美罗沙波的泡沫高度要低得多，并且如果它们是剪切应力保护剂，它们将对细胞培养非常有吸引力。
按照方法4中描述的程序，CHOK1 GS细胞的分批进料培养在旋转管中进行17天。所有美罗沙波都在不含任何泊洛沙姆188的4CHO细胞培养基中进行测试。每种溶液的浓度为1g/L美罗沙波(即1000ppm)。
如图5、6和7所示，在美罗沙波中培养的细胞的成活力、活细胞密度和IgG生产力都与在泊洛沙姆188中培养的细胞的数据相当，即使在双倍浓度的188(2g/L)的情况下。
图6以更清晰的方式指出了不同样品之间的差异。直到第7天，所有样品在其误差范围内都具有可比的VCD。培养第10天后，在两种浓度的泊洛沙姆188中培养的细胞开始减少，相反，在其它美罗沙波中培养的细胞继续生长直到第13天。
在美罗沙波(特别是8R7和8R6)中培养的细胞的抗体产生与在泊洛沙姆188中培养的细胞相当。
本实验表明，所描述的美罗沙波是旋转管中分批进料培养的有效剪切应力保护剂，并且抗体生产力与用泊洛沙姆188培养相当。值得注意的是，观察到美罗沙波对细胞生长的支持程度非常好，特别是考虑到泊洛沙姆188对培养多么重要，即使在低剪切应力的条件下，如旋转管分批进料。图8指出了泊洛沙姆188的关键作用，其中将培养过程中没有任何泊洛沙姆的细胞成活力与包括1g/L泊洛沙姆188的条件进行比较。泊洛沙姆188或低发泡替代品(如本发明中描述的美罗沙波)对于在悬浮培养中实现细胞生长是必需的。
旋转管中的培养不允许比较由于其设置所致的不同条件的泡沫形成(不存在鼓泡，因此不会形成泡沫)。剪切应力保护与低发泡能力的组合的评估将通过生物反应器培养进行。
生物反应器培养
在生物反应器中进行分批进料细胞培养，以同时评估与基准泊洛沙姆188相比，不同美罗沙波的剪切应力保护和泡沫稳定性质。与旋转管培养相比，生物反应器中的培养涉及空气鼓泡和机械搅拌，这可能导致泡沫形成。因此，生物反应器适用于评估美罗沙波的性能。
按照方法4中描述的程序，CHOK1 GS细胞的分批进料培养在玻璃生物反应器中进行14天。所有美罗沙波都在不含任何泊洛沙姆188的4CHO细胞培养基中进行测试。每个条件具有浓度为2g/L(即2000ppm)的美罗沙波或泊洛沙姆188。
如图9、10和11所示，在美罗沙波8R7和8R6中培养的细胞的成活力、活细胞密度和IgG生产力与在泊洛沙姆188中培养的细胞的数据相当。在美罗沙波12R8中培养的细胞显示出较低的VCD和IgG滴度，但成活力相当。这一观察结果可能暗示，与其它条件相比，美罗沙波12R8是一种效率较低的剪切应力保护剂。这种剪切应力增加的培养设置使我们能够更深入地评估保护性能并区分美罗沙波。
在美罗沙波8R7和8R6中培养的细胞的抗体产生与在泊洛沙姆188中培养的细胞相当。
由美罗沙波和泊洛沙姆188稳定的泡沫之间的差异是惊人的。在整个培养过程中，在含有美罗沙波的生物反应器中形成的泡沫非常少。在第14天培养结束时记录最大泡沫水平，对于美罗沙波8R7为150mL，对于美罗沙波8R6为50mL，对于美罗沙波12R8为无。
相反，泊洛沙姆188仅在7天后就达到了800mL的泡沫水平，并且需要消泡剂C以避免泡沫溢出。如果不添加消泡剂C，溢出可能导致超压，泄漏，污染，并最终导致实验流产。从第10天开始，每天向含有泊洛沙姆188的三个生物反应器中添加消泡剂C。尽管如此，泡沫越来越稳定。由美罗沙波支持的培养不需要任何消泡剂C，并且它们不存在任何泡沫出来的风险。
证实了使用美罗沙波8R7和8R6导致与泊洛沙姆188相当的细胞生长和抗体生产力，同时大大减少了泡沫形成，避免了对消泡剂C的需求。使用选定的美罗沙波可对于生物工艺非常有用，降低风险并避免与消泡剂添加相关的问题。

Claims (15)

1.一种包含美罗沙波的细胞培养基，所述美罗沙波具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，特征在于所述峰值分子量Mp在1000和5000g/mol之间。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，特征在于所述聚环氧乙烷百分比在55和80％之间。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞培养基，特征在于细胞培养基包含对于液体培养基计算的0.1-10g/L的量的美罗沙波。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞培养基，特征在于细胞培养基是化学成分明确的培养基。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞培养基，特征在于细胞培养基是干粉或干压实的培养基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞培养基，特征在于细胞培养基至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲组分、一种或多种辅助因子和一种或多种核酸组分。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞培养基，特征在于它不包含任何消泡剂。
9.一种用于培养细胞的方法，其中所述细胞在包含美罗沙波的液体培养基中培养，所述美罗沙波具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比。
10.根据权利要求9所述的用于培养细胞的方法，特征在于所述方法包括搅动和/或鼓泡。
11.根据权利要求9或10所述的用于培养细胞的方法，特征在于所述峰值分子量Mp在1000和5000g/mol之间。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的用于培养细胞的方法，特征在于所述聚环氧乙烷百分比在55和80％之间。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的用于培养细胞的方法，特征在于与其它方面相同但包含泊洛沙姆188而不是美罗沙波的细胞培养基相比，所述液体培养基中的消泡剂的量减少。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的用于培养细胞的方法，特征在于所述液体培养基不包含任何消泡剂。
15.一种用于减少搅动和/或鼓泡细胞培养中的泡沫形成的方法，其中所述细胞在包含美罗沙波的液体培养基中培养，所述美罗沙波具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比，并且与在包含泊洛沙姆188而不是具有在1000和8000g/mol之间的峰值分子量Mp以及在55和95％(w/w)之间的聚环氧乙烷百分比的美罗沙波的细胞培养基中在相同条件下培养的细胞相比，泡沫形成减少。
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