CN116904339A - 贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法 - Google Patents

贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116904339A
CN116904339A CN202310392864.1A CN202310392864A CN116904339A CN 116904339 A CN116904339 A CN 116904339A CN 202310392864 A CN202310392864 A CN 202310392864A CN 116904339 A CN116904339 A CN 116904339A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus
strain
suspending agent
belicus
preparing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310392864.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116904339B (zh
Inventor
任璐
赵晓军
秦楠
吕红
殷辉
宁俊琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Agricultural University
Original Assignee
Shanxi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Agricultural University filed Critical Shanxi Agricultural University
Priority to CN202310392864.1A priority Critical patent/CN116904339B/zh
Publication of CN116904339A publication Critical patent/CN116904339A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116904339B publication Critical patent/CN116904339B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing liquids as carriers, diluents or solvents
    • A01N25/04—Dispersions, emulsions, suspoemulsions, suspension concentrates or gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
    • A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
    • A01N47/38—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N< containing the group >N—CO—N< where at least one nitrogen atom is part of a heterocyclic ring; Thio analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株悬浮剂的制备及其使用方法，贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.26795。本菌株悬浮剂的制备方法，包括制备种子液、制备发酵液和制备悬浮剂。在发现辣椒初果期有炭疽病发生时，使用本菌株悬浮剂100倍稀释液对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2‑3次，田间防效达到71.17%；本菌株悬浮剂100倍稀释液与浓度为0.1 g/L的咪鲜胺以质量比3:7混合后，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次，田间试验防治效果达82.41%。

Description

贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂的制备及其使用方法
技术领域
本发明属于植物病害综合防治技术领域，具体涉及一种防治辣椒炭疽病的贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂的制备和使用方法，同时还涉及贝莱斯芽胞杆菌与咪鲜胺协同防治辣椒炭疽病的使用方法。
背景技术
辣椒炭疽病是由炭疽属真菌引起的辣椒重要病害之一，能够引起辣椒炭疽病的致病菌包含炭疽属的至少4个复合种（Colletotrichum gloeosporioides、C. acutatum、C.truncatum、C. coccodes），其致病力程度不一，并不断有新种被发现。侵染引起辣椒炭疽病的病原种类在不同国家和地区有所不同，因此，辣椒炭疽病的致病菌具有明显的地域特点，山西省侵染辣椒的炭疽菌包括胶孢炭疽菌C. gloeosporioides复合种和C. acutatum复合种中的多个不同物种，其中，C. scovillei在山西省不同地理隔离的辣椒产区均有发生，是导致山西省辣椒炭疽病的主要致病菌。
辣椒炭疽病属世界性病害，在中国和世界各地辣椒产区都时有发生，其传染性强，破坏性大，防治难度大，可造成严重减产。该病害多发生在果实采收前后，造成果实腐烂，会严重降低辣椒的品质和适销性，从而给农业生产带来巨大损失。生产上为防治辣椒炭疽病，常采用农业防治、化学防治、生物防治等多种综合防治措施。在化学防治中，喷施杀菌剂，如咪鲜胺、吡唑醚菌酯、多菌灵和咯菌腈等均能较好地防治炭疽病。其中，咪鲜胺属于甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂，其广谱、低毒，具有保护和治疗作用，主要通过抑制甾醇的生物合成而起作用，对多种病害有良好防效。然而，由于长期使用杀菌剂，容易使病原菌产生抗药性。同时，化学农药的长期不合理和大量使用，危害人、畜健康，对土壤、水体造成严重污染，破坏生态平衡。使用生物农药进行防治具有对环境无污染、经济有效且提高作物产量等优势，在植物病害的防治方面已有巨大成绩。其中，芽胞杆菌Bacillus是一种革兰阳性细菌，其生长繁殖迅速，可以有效定殖在植物根际，能产生多种活性代谢物质，在生物农药方面都有着广阔的应用前景。目前，用于我国农药登记的微生物农药涉及9种芽胞杆菌，包括枯草芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌和荧光假单胞菌等。悬浮剂兼具乳油和可湿性粉剂的优点，对环境无污染、成本较低且使用方便，因此，成为新型高效、安全环境友好型生物农药的首选剂型。用芽胞杆菌生物菌剂防治植物病害对于保障农产品产量和品质以及食品安全具有重
大意义。
目前，生产中使用生物农药仍有一些问题待研究解决，如在生产应用实践中其生防效果不稳定等，须寻找相应的对策。由此提出，将生防菌制剂与低剂量的化学农药联用进行植物病害的防治，既能提高生防菌对生态环境的稳定性，同时也能一定程度上减少化学杀菌剂的用量，降低了病原菌抗药性及环境污染等问题。通过试验研究发现，本发明的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7悬浮剂对辣椒炭疽病有良好的田间防效，同时，LY7菌株悬浮剂与咪鲜胺有良好的生物相容性，即咪鲜胺与LY7菌株混配不会对LY7菌株造成明显影响，将两者联用对辣椒炭疽病具有明显的协同增效作用。田间防效试验证明，将生防菌剂与化学杀菌剂混配使用是一个良好的病害综合防治措施。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株及其悬浮剂的制备方法，其次是利用贝莱斯芽胞杆菌LY7制备的悬浮剂对辣椒炭疽病的防治效果，同时公开了贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂与咪鲜胺联合使用防治辣椒炭疽病的协同增效作用。
本发明的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株，于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 26795，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株于2019年8月在山西省晋中市东阳镇山西农业大学东阳试验基地种植的辣椒（Capsicum annuumL.，品种：中椒108）叶片中分离筛选到的。该菌株采用牛肉浸膏和蛋白胨固体培养基培养后，菌株在培养基上呈乳白色，菌落表面干燥，中心较厚边缘较薄，中心突起且有褶皱，菌落边缘不规则且一周具有褶皱，无异味等特征（图1）；通过扫描电镜观察贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的菌体呈杆状，且周生鞭毛，其大小约为1.5~2.0 µm×0.5~1.0 µm（图2）。对贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的16SrRNA和gyrA序列进行PCR扩增和电泳检测，得到16S rRNA和gyrA序列长度分别为1465 bp、706 bp。经同源性比对结果发现，贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株同源性与贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis的同源性最高，达99%，鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis（图2和图3）。贝莱斯芽胞杆菌LY7在20~45℃的条件下均可正常生长； 当温度超过45℃时存活率开始下降，55℃和60℃时LY7菌株活菌率分别为66.92%和39.23%；在80℃时，活其菌率仅为6.54%；所以贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的最高耐受温度为45℃，之后随温度的升高，其存活率逐渐降低（图4）。
所述的贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备种子液：将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株在NA培养基上培养48 h，挑取一环单菌落接种于LB培养液中，28-30℃、160 -180r·min-1振荡培养22-26 h得到LY7种子液，所述的LB培养液配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0；
（2）制备发酵液：将（1）制备的种子液与YSP培养液按体积比1：100混合，制成发酵液，所述的YSP培养液的配方为：蛋白胨10.0 g，乳糖20.0 g，酵母粉1.5 g，牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0；28-30℃、转速160-180 r·min-1发酵时间70-74 h，发酵液中贝莱斯芽胞杆菌LY7活菌体数不少于109cfu/mL；
（3）制备贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉：将步骤（2）制备的发酵液采用冷冻干燥法制成贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉；
（4）制备悬浮剂：悬浮剂配方由下列重量比的成分组成：贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉10份，防腐剂对羟基苯甲酸甲酯0.6份，润湿分散剂亚甲基双萘磺酸钠2份、木质素磺酸钙1.5份、吐温-80 1.5份，增稠剂羧甲基纤维素钠0.3份，防冻剂丙三醇4份，紫外保护剂山梨糖醇0.3份，用蒸馏水补足至100份。
所述的贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂的使用方法，包括：
（1）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍，在7月初辣椒炭疽病发病初期用药1次，每隔7-10天用药一次，连续用药2-3次。
（2）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍，咪鲜胺原液稀释至咪鲜胺浓度为0.1g/L，以质量比3份贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释剂和7份咪鲜胺稀释剂混合后，在7月初辣椒炭疽病发病初期用药1次，每隔10天用药一次，连续用药2次。
贝莱斯芽胞杆菌LY7抑菌试验及菌药联用田间药效试验
1、测定对辣椒炭疽病优势致病菌Colletotrichum scovillei的抑制作用
（1）试验方法
将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株在NA培养基上活化后，接种环挑取一环菌落接种至装有100 mL LB培养液的250 mL三角瓶中，160 r/min，28℃恒温振荡培养12 h，制得种子液。再按1%的接种量转接至LB培养液中，160 r/min，28℃培养36 h，冷冻离心后收集菌体，再用无菌水将菌体重新悬浮并将其浓度调为1×108CFU/mL，置于4℃冰箱中保存备用。
采用牛津杯法，在无菌培养皿中先倒入10 mLPDA培养基，以皿中心为中心点十字垂直交叉在距离中心30 mm 处的四点放入无菌牛津杯再倒入10 mLPDA培养基对牛津杯起固定作用，待凝固后制成牛津杯平板。在皿中央接病原菌菌饼，四牛津杯中分别注入菌液100 μL，以只接病原菌作为对照，放置于25 ℃恒温培养箱中培养。待对照菌落直径长至约6cm时，用游标卡尺测量菌落直径和抑菌带，并计算菌丝生长抑制率。
采用生长速率法，以不同浓度的发酵上清液为不同处理，测定贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株发酵液的抑菌率。将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株发酵液冷冻离心，去除菌体得到上清液，再利用0.22 μm微孔滤膜进行过滤处理，以体积比为1:9与PDA培养基进行混配制备稀释10倍、20倍、50倍、100倍、200倍的混合培养基。冷却后将直径为5 mm的Colletotrichum scovillei菌饼接种其中央，封皿置于25℃恒温培养箱倒置培养，以无菌水代替上清液制备PDA培养基为对照组，试验重复3次。待对照组病原菌直径约6 cm时，利用十字交叉法测量各处理组病原菌直径计算抑菌率。平均抑制率＝［（对照组菌落直径平均值－处理组菌落直径平均值）/（对照菌落直径平均值－5.0）］×100%。
（2）试验结果
牛津杯法测定得出贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株对Colletotrichum scovillei的抑制率为83.52%。图5所示，5个不同稀释倍数的发酵液上清液对辣椒炭疽病菌的抑制率之间差异显著；稀释10×的上清液抑制率最高，抑制率为53.86%，稀释稀释200×的上清液仍对辣椒炭疽病菌有抑制作用，抑制率为12.84%。
、咪鲜胺对辣椒炭疽病菌Colletotrichum scovillei毒力测定
（1）试验方法
用无菌水将咪鲜胺配成5个有效浓度梯度，将杀菌剂与 PDA培养基按比例为1:9（V:V）混匀制成含药平板，以无菌水代替药剂作为对照，每组处理浓度3次重复。将5 mm辣椒炭疽病菌Colletotrichum scovillei菌饼接种于PDA培养基中央，封口后置于25℃恒温培养箱培养，至对照菌落直径约6 cm时，采用十字交叉法测量并记录各处理菌落直径，计算平均抑菌率。将抑制率换算成抑制几率值。分别根据杀菌剂质量浓度对数（x）与抑制几率值（y），采用SPSS数据处理系统计算出化学农药的回归方程y＝ax＋b、EC50及相关系数r。
（2）试验结果：
通过分析得出咪鲜胺的毒力回归方程，EC50值和相关系数（表1）。咪鲜胺对Colletotrichum scovillei的EC50值为0.135 μg/mL。
表1 咪鲜胺对C. scovillei的室内毒力
3、贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株与咪鲜胺生物相容性测定
（1）试验方法
采用稀释涂布平板法，对贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株与咪鲜胺进行相容性测定。以测定咪鲜胺EC50值的浓度梯度为测定浓度梯度，并制作相应浓度的含药培养基，将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株发酵液以稀释10倍进行梯度稀释，选择合适梯度稀释液吸取20 μL注入含药培养基用无菌涂布棒将其均匀涂布，以等量无菌水代替杀菌剂为空白对照，试验重复3次，记录活菌数。通过以下公式计算存活率，测定菌药生物相容性。
平均存活率＝［（对照组活菌数平均值－处理组活菌数平均值）/对照活菌数平均值］×100%。
（2） 试验结果
贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株与咪鲜胺进行相容性测定，结果表明，咪鲜胺与LY7的相容性较好，在咪鲜胺浓度分别为0.033 μg/mL和0.5 μg/mL时，对LY7菌株的抑制率为8.15%和19.76%（表2）。
表2 咪鲜胺对贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的影响
4、贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株毒力测定
（1）试验方法
将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株种子液以1%的接种量转接至不同LB培养液中，振荡培养36 h，发酵液冷冻离心收集沉淀得到菌体，再用无菌水将菌体重新悬浮并将其浓度调为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108CFU/mL的菌悬液。测定菌悬液抑菌能力，每处理3次重复，求取贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的回归方程y=ax+b、EC50值及相关系数r。
（2）试验结果
表3为贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株毒力测定的结果，其中1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108CFU/mL对C. scovillei抑制率分别为56.98%、66.32%、75.28%、83.04%和90.41%，贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株浓度越大抑制率越大，各浓度间存在显著差异；并得出贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的EC50为3.1×103CFU/mL。
表3 贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株对C. scovillei的毒力测定
5、贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株和咪鲜胺最佳混配筛选
（1）试验方法
采用Horsfall法评价不同复配组合的增效作用，根据杀菌剂咪鲜胺与贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株的毒力测定结果，以EC50为各药液浓度配制。将咪鲜胺与贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株以体积比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10配成不同配比的复配液。以加入等量无菌水作为空白对照，每试验3次重复。待对照菌落长至约6 cm时，测量不同处理的菌落直径，计算平均抑制率、预期抑制生长率及毒性比率。根据毒性比率值，判断不同配方的协同作用效果。
毒性比率>1，表示为增效作用；毒性比率<1，表示为拮抗作用；毒性比率=1，表示为相加作用。其计算公式为：
毒性比率＝实际抑制生长率／预期抑制生长率。
预期抑制生长率＝生防菌LY7菌悬液EC50剂量实际抑制率×配比中的百分率+咪鲜胺EC50剂量实际抑制率×配比中的百分率。
（2）试验结果
表4所示为贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株和咪鲜胺最佳混配筛选结果，比较不同处理的增效比可得出，不同菌药配比贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株和咪鲜胺单独使用有不同程度的提高；菌药配比为3:7时增效比最大，为1.50；之后依次是2:8、6:4，对应的增效比率为1.44、1.42，但与3:7的增效比率无显著性差异。实际抑制率和增效比率综合考虑菌药配比3:7时为最佳混配组合。
表4 贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株与咪鲜胺混配对C. scovillei的毒力测定
6、贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂与咪鲜胺田间防效试验
（1）试验方法
在协同防治中，先制备不同处理液：将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂分别稀释100倍、200倍和400倍，把咪鲜胺原液稀释至咪鲜胺浓度为0.1 g/L，把上述三个贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释液分别与0.1g/L咪鲜胺以3:7混配成三个处理液，以单独施用50%咪鲜胺600倍稀释液和贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂100倍稀释液为药剂对照，以清水做空白对照。当发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，开始施药，共施用2次药，每处理重复4次，施药完后7 d调查病情指数，计算防治效果：
辣椒炭疽病的分级标准参照GB/T17980.33-2000如下：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占果实面积的2%以下；
3级：病斑面积占果实面积的3%~8%；
5级：病斑面积占果实面积的9%~15%；
7级：病斑面积占果实面积的16%~25%；
9级：病斑面积占果实面积的25%以上。
病情指数=［（Σ（各级病叶数×相对级数）/（调查总果数×9）］× 100
防治效果%=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数× 100
（2）试验结果
表5为不同处理对辣椒炭疽病防治效果，可得出贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂100倍稀释液对辣椒炭疽病的防效可达71.17%，与单独使用杀菌剂咪鲜胺没有显著差异，LY7悬浮剂100倍稀释液与咪鲜胺混配防效值为82.41%；LY7悬浮剂200倍稀释液与咪鲜胺混配和LY7悬浮剂400倍稀释液与咪鲜胺混配防效分别为73.60%、72.59%。三个混配处理组均显著高于单独使用咪鲜胺。
表5 菌药联用对辣椒炭疽病的防治效果
本发明具有的优点和有益效果：（1）本发明的贝莱斯芽胞杆菌LY7发酵液对辣椒炭疽病优势致病菌Colletotrichum scovillei具有良好的抑制作用，实验室接种表明，贝莱斯芽胞杆菌LY7发酵液原液对辣椒炭疽病的抑制率达83.52%，10倍稀释后对辣椒炭疽病菌的抑制率为53.86%。（2）本发明的贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂100倍稀释液在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次，田间防效达到71.17%%，与当前防治效果较好的50%咪鲜胺600倍稀释液无显著差异。（3）本发明的贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂100倍稀释液与浓度为0.1 g/L的咪鲜胺以质量比3:7混合后，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次，田间试验防治效果达82.41%，显著优于50%咪鲜胺600倍稀释液的防治效果，说明贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株与咪鲜胺具有良好的生物相容性和混合增效作用，其制剂与咪鲜胺混配在辣椒炭疽病的防治中具有很大应用价值。（4）本发明的贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株悬浮剂制备工艺简单，发酵条件不苛刻，其菌剂配方所用原料来源广、成本低、容易实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisLY7在NA培养基上的菌落形态。
图2为本发明贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisLY7的扫描电镜照片。
图3为本发明贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisLY7基于16S rRNA序列的NJ系统发育树。
图4为本发明贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisLY7基于gyrA序列的NJ系统发育树。
图5为本发明贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisLY7存活率与温度的关系图。
图6为本发明贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisLY7发酵液10倍稀释处理在PDA培养基上对辣椒炭疽病菌抑菌效果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本发明的防治辣椒炭疽病的贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 26795，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2
本发明的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株制备悬浮剂的方法，包括如下步骤：
（1）制备种子液：将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株在NA培养基上培养48 h，挑取一环单菌落接种于LB培养液中，28℃、160r·min-1振荡培养22 h得到LY7种子液，所述的LB培养液配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0；
（2）制备发酵液：将（1）制备的种子液与YSP培养液按体积比1：100混合，制成发酵液，所述的YSP培养液的配方为：蛋白胨10.0 g，乳糖20.0 g，酵母粉1.5 g，牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0；28℃、转速160 r·min-1发酵时间70 h，发酵液中贝莱斯芽胞杆菌LY7活菌体数不少于109cfu/mL；
（3）制备贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉：将步骤（2）制备的发酵液采用冷冻干燥法制成贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉；
（4）制备悬浮剂：悬浮剂配方由下列重量比的成分组成：贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉10份，防腐剂对羟基苯甲酸甲酯0.6份，润湿分散剂亚甲基双萘磺酸钠2份、木质素磺酸钙1.5份、吐温-80 1.5份，增稠剂羧甲基纤维素钠0.3份，防冻剂丙三醇4份，紫外保护剂山梨糖醇0.3份，用蒸馏水补足至100份。
实施例3
本发明的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株制备悬浮剂的方法，包括如下步骤：
（1）制备种子液：将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株在NA培养基上培养48 h，挑取一环单菌落接种于LB培养液中，30℃、180r·min-1振荡培养26 h得到LY7种子液，所述的LB培养液配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0；
（2）制备发酵液：将（1）制备的种子液与YSP培养液按体积比1：100混合，制成发酵液，所述的YSP培养液的配方为：蛋白胨10.0 g，乳糖20.0 g，酵母粉1.5 g，牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0；30℃、转速180 r·min-1发酵时间74 h，发酵液中贝莱斯芽胞杆菌LY7活菌体数不少于109cfu/mL；
（3）制备贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉：将步骤（2）制备的发酵液采用冷冻干燥法制成贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉；
（4）制备悬浮剂：悬浮剂配方由下列重量比的成分组成：贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉10份，防腐剂对羟基苯甲酸甲酯0.6份，润湿分散剂亚甲基双萘磺酸钠2份、木质素磺酸钙1.5份、吐温-80 1.5份，增稠剂羧甲基纤维素钠0.3份，防冻剂丙三醇4份，紫外保护剂山梨糖醇0.3份，用蒸馏水补足至100份。
实施例4
本发明的贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂的使用方法包括：
（1）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次；
（2）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍、咪鲜胺原液稀释至咪鲜胺浓度为0.1g/L，以质量比3份贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释剂和7份咪鲜胺稀释剂混合后，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次。
实施例5
本发明的贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂的使用方法包括：
（1）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药3次；
（2）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍、咪鲜胺原液稀释至咪鲜胺浓度为0.1g/L，以质量比3份贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释剂和7份咪鲜胺稀释剂混合后，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次。

Claims (3)

1.一株贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株，于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 26795，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.利用权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LY7菌株制备悬浮剂的方法，包括如下步骤：
（1）制备种子液：将贝莱斯芽胞杆菌LY7菌株在NA培养基上培养48 h，挑取一环单菌落接种于LB培养液中，28-30℃、160 -180r·min-1振荡培养22-26 h得到LY7种子液，所述的LB培养液配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0；
（2）制备发酵液：将（1）制备的种子液与YSP培养液按体积比1：100混合，制成发酵液，所述的YSP培养液的配方为：蛋白胨10.0 g，乳糖20.0 g，酵母粉1.5 g，牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0；28-30℃、转速160-180 r·min-1发酵时间70-74 h，发酵液中贝莱斯芽胞杆菌LY7活菌体数不少于109cfu/mL；
（3）制备贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉：将步骤（2）制备的发酵液采用冷冻干燥法制成贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉；
（4）制备悬浮剂：悬浮剂配方由下列重量比的成分组成：贝莱斯芽胞杆菌LY7菌粉10份，防腐剂对羟基苯甲酸甲酯0.6份，润湿分散剂亚甲基双萘磺酸钠2份、木质素磺酸钙1.5份、吐温-80 1.5份，增稠剂羧甲基纤维素钠0.3份，防冻剂丙三醇4份，紫外保护剂山梨糖醇0.3份，用蒸馏水补足至100份。
3.权利要求2所述的贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂的使用方法包括：
（1）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2-3次；
（2）将贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释100倍、咪鲜胺原液稀释至咪鲜胺浓度为0.1 g/L，以质量比3份贝莱斯芽胞杆菌LY7悬浮剂稀释剂和7份咪鲜胺稀释剂混合后，在发现辣椒在初果期有炭疽病发生时，对辣椒进行叶面喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2次。
CN202310392864.1A 2023-04-13 2023-04-13 贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法 Active CN116904339B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310392864.1A CN116904339B (zh) 2023-04-13 2023-04-13 贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310392864.1A CN116904339B (zh) 2023-04-13 2023-04-13 贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116904339A true CN116904339A (zh) 2023-10-20
CN116904339B CN116904339B (zh) 2024-06-21

Family

ID=88363535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310392864.1A Active CN116904339B (zh) 2023-04-13 2023-04-13 贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116904339B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102307028B1 (ko) * 2021-05-04 2021-10-01 전라북도 순창군(농업기술센터장) 고추 탄저병을 방제하고 고추의 발아와 생육을 촉진하는 바실러스 벨레젠스 Sucnchang SRC210201 균주, 이를 이용한 고추 탄저병 방제방법, 고추 종자 발아 및 생육 촉진방법
CN113717901A (zh) * 2021-09-30 2021-11-30 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用
CN113755358A (zh) * 2020-11-30 2021-12-07 山西农业大学 一种贝莱斯芽孢杆菌zj1菌株和发酵液制备及使用方法
CN114854618A (zh) * 2022-03-02 2022-08-05 上海交通大学 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755358A (zh) * 2020-11-30 2021-12-07 山西农业大学 一种贝莱斯芽孢杆菌zj1菌株和发酵液制备及使用方法
KR102307028B1 (ko) * 2021-05-04 2021-10-01 전라북도 순창군(농업기술센터장) 고추 탄저병을 방제하고 고추의 발아와 생육을 촉진하는 바실러스 벨레젠스 Sucnchang SRC210201 균주, 이를 이용한 고추 탄저병 방제방법, 고추 종자 발아 및 생육 촉진방법
CN113717901A (zh) * 2021-09-30 2021-11-30 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用
CN114854618A (zh) * 2022-03-02 2022-08-05 上海交通大学 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU REN 等: "Capsicum Endophytic Bacterial Strain LY7 and Prochloraz Synergistically Control Chilli Anthracnose", 《J. FUNGI》, 22 February 2024 (2024-02-22), pages 1 - 18 *
宁俊琪: "辣椒内生细菌LY7与咪鲜胺协同防治辣椒炭疽病研究", 《万方》, 31 January 2024 (2024-01-31) *
程欢欢 等: "辣椒炭疽病生防芽孢杆菌的筛选及田间防效", 《河南农业大学学报》, 31 August 2019 (2019-08-31), pages 568 - 573 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116904339B (zh) 2024-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107254427B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌菌株jn5及其应用
JP3428658B2 (ja) 抗菌性微生物製剤、その製造方法及び処理方法
CN103215209B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN107736379B (zh) 解淀粉芽孢杆菌在防治植物真菌病害中的应用
CN102876615B (zh) 沼泽红假单胞菌菌株及应用、菌剂药剂及其制备方法和应用
CN113969247B (zh) 一种抑制烟草病害病原菌的细菌及应用
CN104651260B (zh) 一种短短芽孢杆菌bbc-3及其应用与菌剂制备
CN111647518B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂及制备方法
CN110295129B (zh) 一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用
CN113005056A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌hy19及其应用
CN116333934A (zh) 贝莱斯芽孢杆菌在制备具有促进植物生长作用的菌剂中的应用
CN113604376B (zh) 一株甘蔗内生枯草芽孢杆菌及其应用
CN102154178B (zh) 一种防治辣椒疫病的短芽孢杆菌及生物制剂的制备方法与应用
CN107629985B (zh) 一株对植物病原真菌具拮抗作用的植物内生细菌
EP3608397A1 (en) Strain belonging to genus mitsuaria and microbial pesticide using said strain
CN114946885B (zh) 一种抗玉竹叶斑病微生物农药
CN116904339B (zh) 贝莱斯芽胞杆菌ly7菌株悬浮剂的制备及其使用方法
CN115747130B (zh) 一种促进莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基及其制剂和应用
CN105018395A (zh) 一株短小芽孢杆菌及其在防治苹果斑点落叶病中的应用
CN111349589B (zh) 一种防治金线莲茎腐病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN111471627B (zh) 一株粘质沙雷氏菌bsz及应用
CN116445345B (zh) 特基拉芽胞杆菌lms3及其在防治藜麦黑茎病中的应用
CN114149935A (zh) 一种产酶溶杆菌及其应用
KR102075073B1 (ko) 식물병 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 세라시아 sp. KUDC3025 균주, 및 이의 이용
WO2007055064A1 (ja) 土壌病害防除剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant