CN116903719A - 基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽、自组装水凝胶及其制备工艺、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽,所述仿生多肽的氨基酸序列为。本发明还提供一种自组装水凝胶及其制备工艺、应用。本发明的基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽具有优异的成胶能力,在较低的多肽浓度下即可得到成胶时间短、更高存储模量、更高机械强度的水凝胶。本发明的多肽自组装环境简单,仅通过单一的多肽即可实现自组装。并且,本发明的自组装水凝胶的生物相容性好,可广泛应用于药物缓释和细胞培养等生物医学领域,为开展其生物医用研究奠定材料基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料领域,尤其涉及一种多肽、水凝胶及其制备工艺、应用。
背景技术
多肽作为一类生物活性分子,因其良好的生物相容性、可降解性及易于修饰的特点,已经在水凝胶制备、药物递送、组织工程、生物电子学等诸多领域都有着广泛的应用,成为了化学、生物、纳米技术和材料等学科的研究热点。仿生设计是获得不同类型多肽的重要方法,藤壶胶蛋白作为藤壶发生水下粘附过程的重要基础,其微观结构已被发现由自组装成的纳米纤维网络构成,这使其成为了良好的多肽仿生设计模板。
自组装作为制备水凝胶材料的重要手段,依托多肽的自组装性能开展水凝胶制备研究已较为常见,但将未改性的藤壶胶蛋白衍生多肽用于水凝胶制备的研究领域仍然是空白的,开展藤壶胶蛋白衍生多肽的自组装研究,有望为藤壶胶蛋白的水下粘附机制解释提供新的思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷,提供一种基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽、自组装水凝胶及其制备工艺、应用。为解决上述技术问题,本发明提出的技术方案为:
一种基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽,所述仿生多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
作为一个总的技术构思,本发明还提供一种自组装水凝胶,主要由上述的仿生多肽自组装而得。
作为一个总的技术构思,本发明还提供一种自组装水凝胶的制备工艺,包括以下步骤:将所述仿生多肽溶解得到多肽溶液,将所述多肽溶液静置自组装,即得到所述自组装水凝胶。
上述制备工艺中,优选的,静置自组装时不加入外源化学成胶因子。本发明不同于已有的水凝胶制备策略,未添加任何外源化学成胶因子,CCK-8实验和活死细胞成像结果显示所制备胶状物具有良好生物相容性。
上述制备工艺中,优选的,所述仿生多肽利用酸性或中性缓冲溶液溶解,溶解时利用超声处理。更优选的,所述酸性缓冲溶液的pH值为5.0,离子强度I为150mM;所述中性缓冲溶液为pH值为7.4、离子强度约为147mM的PBS溶液。
上述制备工艺中,优选的,所述多肽溶液中多肽浓度控制为4-12mM,静置自组装时控制自组装温度为4-50℃,时间为1-24h。更优选的,所述多肽溶液中多肽浓度控制为8mM,静置自组装时控制自组装温度为37℃,时间为16h。综合考虑温度的影响,考虑成胶效率、多肽浓度等多重因素,本发明最后选定8mM(约17.44mg/mL)的多肽浓度和37℃的自组装温度,在更低的浓度下即可得到高存储模量、更高机械强度的水凝胶产品。普遍的水凝胶成胶时间可达24h以上,甚至一周,本发明的水凝胶24h内便可成胶,成胶时间短。
作为一个总的技术构思,本发明还提供一种自组装水凝胶在药物缓释领域和细胞培养基质领域的应用。本发明的水凝胶含有丰富的孔洞结构,加之其易于降解的特性,使其成为了包裹小分子药物的理想材料,可通过水凝胶对小分子药物实现封包,在水凝胶逐渐降解的过程中,药物逐渐释放出来,达到药物缓释的效果。同时,水凝胶材料具有良好的生物相容性、粘弹性,同时其与天然的细胞外基质具有非常相似的生物物理学特性,可作为高效的3D细胞培养基质,通过在水凝胶中添加有助于细胞存活、增殖、功能实现和发育的内源因子,可通过水凝胶实现细胞的培养。
多肽自组装在水凝胶制备、药物递送、组织工程、生物电子学等诸多领域都有着广泛的应用,是化学、生物、纳米技术和材料等学科的研究热点。本发明以我国沿海广泛分布的白脊藤壶的cp19k蛋白为研究对象,通过大肠杆菌异源表达纯化来获得可溶性Balcp19k蛋白,再基于Balcp19k蛋白,仿照完整Balcp19k蛋白序列设计并合成了多条全新的衍生多肽,最终得到一种全新的仿生多肽以及由其自组装而得到的水凝胶,并研究衍生多肽在不同条件下的水凝胶形成能力以及性能数据。最终结果表明,在无外源性成胶因子时,多条衍生多肽自组装成水凝胶时,仅本发明特定序列的仿生多肽可形成水凝胶,得到疏松多孔微观形貌和纤维交织结构,且该仿生多肽的成胶能力明显优于完整的Balcp19k蛋白。
本发明的多肽序列信息完全来源于完整的藤壶胶蛋白,未添加任何生物活性片段对多肽进行修饰改性。本发明的仿生多肽在不添加外源成胶因子的前提下,通过改变自组装体系中的溶液条件、温度和多肽浓度等因素,即可得到一种成胶时间短、胶状物机械强度高的自组装水凝胶。具体自组装成胶时可采用如下工艺步骤:通过差量法称取固定量的仿生多肽冻干粉末于EP管中,加入缓冲溶液溶解样品得到多肽溶液,于超声清洗仪中超声处理15分钟促进样品溶解,溶解后置于相应温度环境中孵育,即可得到自组装水凝胶。
本发明的原理如下:1)仿生多肽溶液在孵育过程中,非共价相互作用(如氢键、范德华力、π-π相互作用和疏水相互作用等)能够作为推动力促进多肽分子发生自组装行为,多肽分子彼此相连形成尺寸更大的长度为微米级别的纳米纤维。随着时间的推移,不同纳米纤维进一步交错纠缠,最终聚集形成含水量高且高度有序的三维网络结,即“水凝胶”。2)影响多肽溶液凝胶化过程的可控因素包括:多肽的浓度、环境温度和溶液条件等,以上因素均对于衍生多肽溶液的凝胶化进程有较大影响。本发明分别探究了多肽浓度、环境温度、溶液条件对凝胶化进程的影响,衍生多肽浓度达到一定数值后,通过设置合适的环境温度、溶液条件,可大幅提升多肽分子运动速率,使多肽分子间的碰撞频率增加,从而可较大程度的缩短凝胶化进程所需时间。
本发明通过提升多肽溶液的浓度、提升孵育温度及采用合适的溶液条件以提供更好的自组装条件,可以尽可能的缩短凝胶化进行,并提升所制备水凝胶的机械强度。本发明所制备的水凝胶在更低的样品浓度下,表现出更高的存储模量,这表明本发明所制备的水凝胶具有更优异的力学性能。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明的基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽具有优异的成胶能力,在较低的多肽浓度下即可得到成胶时间短、更高存储模量、更高机械强度的水凝胶。本发明的多肽自组装环境简单,仅通过单一的多肽即可实现自组装。并且,本发明的自组装水凝胶的生物相容性好,可广泛应用于药物缓释和细胞培养等生物医学领域,为开展其生物医用研究奠定材料基础。此外,开展藤壶胶蛋白衍生多肽的自组装研究,有望为藤壶胶蛋白的水下粘附机制解释提供新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中不同浓度多肽溶液的凝胶化结果(图中左侧酸性条件,右侧为中性条件)。
图2为实施例1中不同温度条件下多肽溶液的凝胶化结果。
图3为实施例1中利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒评估P4-5水凝胶对细胞增殖活性的影响的结果示意图(图中左侧酸性条件,右侧为中性条件)。
图4为实施例1中利用活死细胞成像试剂盒检测P4-5水凝胶的细胞毒性的结果示意图。
图5为实施例1中P4-5多肽在酸性条件下制备的水凝胶的存储模量实验结果图。
图6为实施例2中不同溶液条件下所形成水凝胶的SEM图像(图中左侧为酸性条件,右侧为中性条件,同一张图片由上至下(即由(a)至(c))的温度分别为4℃、37℃和50℃)。
图7为对比例1中可溶性Balcp19k蛋白在不同条件下,在4℃下孵育7d后的凝胶化结果。
图8为对比例2中的多肽P1-2与实施例1中的多肽P4-5孵育36h后的凝胶化结构(图中(a)为多肽P1-2,(b)为多肽P4-5)。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
以下实施例的仿生多肽是基于Balcp19k蛋白的自组装性质和分段重复的序列特点而设计得到的全新的衍生多肽(简称为P4-5),序列如下实施例1中所示。同时,为了与P4-5进行对比,以下对比例中还提供与P4-5同时设计而得的衍生多肽(简称为P1-2),序列如下对比例2中所示。
实施例1:
一种基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽,所述仿生多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示,具体为SAVSASADNGLFKNLGKATTEV。
一种自组装水凝胶,主要由上述的仿生多肽自组装而得。
一种自组装水凝胶的制备工艺,包括以下步骤:分别使用pH为5.0、I=150mM的酸性条件和PBS中性缓冲溶液溶解上述仿生多肽样品,超声溶解,制备不同梯度浓度的多肽溶液。将所制备样品置于4℃、37℃和50℃的环境中孵育,期间每隔一定时间对自组装结果进行观察。
如图1所示,在4℃下,通过对不同溶液条件下、同一浓度、相同静置时间的多肽溶液进行对比,我们发现酸性和中性溶液条件下的多肽溶液条件下均表现出水凝胶形成能力,且在相同的静置时间下表现出较基本一致的凝胶化结果,这表明酸性和中性溶液条件下的多肽溶液凝胶化能力较为接近,溶液条件对其凝胶化进程无明显影响。两种溶液条件下的多肽溶液凝胶化过程所需时间均随其浓度的增加而不断降低。对于4mM和6mM的多肽溶液,它们在24h时未表现出明显的凝胶化能现象;而对于8mM的多肽溶液,其在24h内已表现出较为明显的凝胶化现象;而对于更高浓度的12mM的多肽溶液,其在6h时就已经表现出明显的凝胶化现象,且溶液透明度随着时间的推移不断降低,表明其凝胶化程度不断深入。由上述结果可知,浓度的增加可有效缩短多肽溶液凝胶化进程所需时间。此外,通过使用干净的镊子轻轻夹取所制备胶状物表面,发现所制备胶状物均为具有果冻般弹性的白色块状凝胶。
如图2所示,相比在4℃下,8mM的多肽溶液在37℃和50℃条件下凝胶化进程明显加快,并在1-2h左右便出现较为明显的凝胶化效果。分析其中的原因,多肽作为一种生物活性分子,低温环境会抑制其生物活性,而37℃及50℃相对较高的温度条件可有效提升多肽分子的运动速率,从而加速其自组装进程。因此,在37℃和50℃条件下其凝胶化进程相比4℃要快得多。而通过比较不同溶液条件下、相同处理时间的凝胶化结果,我们发现37℃的环境相较50℃更有利于自组装水凝胶的形成。
综合图1、图2可知,37℃的环境更有利于自组装水凝胶的形成,兼顾成胶效率和多肽用量的考虑,8mM的多肽浓度是较为合适的(多肽浓度不是最高,且24h内可以成胶),且在8mM的浓度下,2h左右便开始出现凝胶化现象,并随着时间的推移凝胶化程度不断增高,且在16h后基本不再发生变化,因此16h为更优的成胶时间。
利用8mM的P4-5多肽溶液,在酸性和中性条件下,在37℃条件下自组装16h后的得到水凝胶,对其进行细胞增殖活性的影响以及细胞毒性的实验,结果分别如图3、图4所示。利用8mM的P4-5多肽溶液,在酸性下,在37℃条件下自组装16h后的得到水凝胶,对其存储模量进行验证实验,结果如图5所示。
如图3所示,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒评估了P4-5水凝胶对细胞增殖活性的影响。对于PBS中性条件下制备的P4-5水凝胶,除了稀释2倍的浸提液之外,其它不同稀释倍数的浸提液对NIH/3T3细胞的百分比活性均未表现出明显的降低效果;而对于酸性条件下制备的P4-5水凝胶,其不同稀释程度的浸提液对NIH/3T3细胞的百分比活性表现出一定的促进细胞增殖效果。但两种溶液条件下表现出了不同的促进趋势,PBS中性条件下稀释8倍的浸提液表现出最高的相对细胞活性,而在酸性条件下稀释4倍的浸提液表现出最高的相对细胞活性。总的来说,P4-5水凝胶不会对NIH/3T3细胞的增殖产生抑制作用。
如图4所示,通过活死细胞成像试剂盒进一步检测了P4-5水凝胶的细胞毒性。与对照组相比(图中第一行,未添加浸提液),通过不同稀释倍数的P4-5水凝胶浸提液处理细胞之后,仅稀释2倍的浸提液产生少量的死细胞,这与CCK-8细胞活性检测的结果相一致。而对于其它组别,相应稀释倍数的浸提液对NIH/3T3细胞均没有表现出异常的细胞坏死现象,这表明不同稀释倍数的P4-5水凝胶浸提液不会对NIH/3T3细胞的正常生长繁殖产生影响。即所制备水凝胶无生物毒性。
如图5所示,利用P4-5多肽在酸性条件下制备的水凝胶,对其存储模量进行验证实验,图中(a)为固定频率和固定振幅应变下水凝胶的时间-模量-损耗角曲线;(b)为固定振幅应变下水凝胶的频率-模量-损耗角曲线;(c)为固定振幅应变下的水凝胶振幅-模量-损耗角曲线。对于其中的物理量,存储模量G',其描述的是测试样品的固体特性;而损耗模量G”,其可看作样品的液体特性。当G'>G”时,所测试样品更偏向于弹性固体的特性,此时可判定其为水凝胶;而当G'<G”时,所测试样品更偏向于黏性液体的特性,此时其仍处于溶液状态;而G'=G”,即两曲线存在交点时,代表着所测试样品在此时发生相态转变。此外,对于损耗角δ,其反映的是流体消耗能量的特征。由(a)可知,在所测试的时间范围内,所测试样品的存储模量G'恒大于损耗模量G”,这表明所测样品已经完全凝胶化,即酸性条件下8mM的P4-5溶液在37℃自组装16h后所形成的胶状物确为水凝胶。在(b)中,存储模量G'曲线与损耗模量G”曲线无交点且保持稳定,表明所制备水凝胶在0.1-100Hz的频率范围内具有较高的稳定性。低应变下存储模量G'曲线与损耗模量G”曲线维持平行的区域称为线性黏弹区,线性黏弹区越宽,则认为样品越稳定。在(c)中,所制备水凝胶在1%振幅应变范围内能够保持较高稳定性,而当外界影响超过这一限度时,样品内部结构发生一定程度破坏,并最终破碎甚至转变为液体。整体而言,本实施例制备得到的水凝胶其存储模量可达到104级别,因此其具有更高的存储模量。
实施例2:
取实施例1中的多肽,固定多肽样品的浓度为8mM,于4℃、37℃和50℃的温度条件,在孵育16h后对酸性和中性溶液条件下所形成水凝胶冷冻干燥处理48h,然后通过SEM观测手段对其微观形貌进行观测。
如图6所示,本实施例中,酸性和中性条件下的8mM的多肽溶液在4℃、37℃和50℃下孵育一定时间后所产生凝胶材料的冻干样品均形成了典型的微观孔洞结构,这些孔洞是水凝胶中的水被去除以后形成的。进一步观察,我们发现4℃条件下所形成孔洞结构直径相对较小,而37℃和50℃条件下所形成空洞结构直径相对较大。通过SEM结果我们进一步断定多肽溶液凝胶化的产物为水凝胶。
本实施例制备得到的水凝胶含有丰富的孔洞结构,加之其易于降解的特性,使其成为了包裹小分子药物的理想材料,通过水凝胶对小分子药物实现封包,在水凝胶逐渐降解的过程中,药物逐渐释放出来,达到药物缓释的效果。本实施例中尝试通过在制备水凝胶时加入抗癌药物阿霉素,阿霉素会伴随着成胶过程的深入而被封包于新形成的水凝胶中,而在水凝胶降解的过程中,会伴随着阿霉素的释放过程,实现缓释的效果。
对比例1:
直接将可溶性Balcp19k蛋白(现有产品,如来源于发明人以往的专利CN109627308A),分别在不同条件下(具体条件如图7中下方所示,各条件下左右两管的蛋白浓度分别为4mg/mL和8mg/mL),在4℃下孵育7d。结果如图7所示,大部分样品均直接以溶液形式顺离心管内壁流至底部(如图中红色箭头所指部位),并未以水凝胶形式留存在离心管尖端部位。这表明Balcp19k蛋白在上述条件下难以通过自组装实现凝胶化过程。
对比例2:
在设计得到的全新的衍生多肽P4-5时,我们还同步得到的其他仿生多肽,如多肽P1-2,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,具体为IKSKLKQVGATAGNAAVT。
利用上述多肽P1-2与实施例1中的多肽P4-5,控制其浓度均为10mM,在酸性或中性条件下,在4℃环境孵育36h。6h后,酸性条件下多肽P4-5溶液状态开始发生变化,初始的澄清透明溶液逐渐转变为白色,且随着时间的延长这种变化越发明显并伴随着凝胶化程度的不断加深。中性条件下,多肽P4-5溶液状态在12h时同样开始出现类似的溶液状态变化。
孵育36h后的最终结果如图8所示((a)中左侧为pH=5.0、I=150mM的酸性条件,右侧为PBS中性条件,(b)与(a)相同),由图8可知,多肽P4-5溶液具有明显的凝胶化,而多肽P1-2并未表现出明显的凝胶化现象,这表明实施例中设计的多肽P4-5的凝胶化性能更优。
Claims (8)
1.一种基于藤壶生物胶蛋白的仿生多肽,其特征在于,所述仿生多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种自组装水凝胶,其特征在于,主要由权利要求1中所述的仿生多肽自组装而得。
3.一种如权利要求2所述的自组装水凝胶的制备工艺,其特征在于,包括以下步骤:将所述仿生多肽溶解得到多肽溶液,将所述多肽溶液静置自组装,即得到所述自组装水凝胶。
4.根据权利要求3所述的制备工艺,其特征在于,静置自组装时不加入外源化学成胶因子。
5.根据权利要求3或4所述的制备工艺,其特征在于,所述仿生多肽利用酸性缓冲溶液或中性缓冲溶液溶解,溶解时利用超声处理。
6.根据权利要求3或4所述的制备工艺,其特征在于,所述多肽溶液中多肽浓度控制为4-12mM,静置自组装时控制自组装温度为4-50℃,时间为1-24h。
7.根据权利要求6所述的制备工艺,其特征在于,所述多肽溶液中多肽浓度控制为8mM,静置自组装时控制自组装温度为37℃,时间为16h。
8.一种如权利要求2所述的自组装水凝胶或权利要求3-7中任一项所述的制备工艺制备的自组装水凝胶在药物缓释领域和细胞培养基质领域的应用。
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