CN116903043A - 一种用于细胞分选的纳米磁珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于细胞分选的纳米磁珠及其制备方法。本发明的纳米磁珠的制备方法包括如下步骤：(1)在冰浴条件下配制含有三价铁和二价铁的水溶液；(2)采用碱性物质调节所述含有三价铁和二价铁的水溶液pH值至10～12；(3)在65～90℃下反应得到含有所述纳米磁珠的水溶液。本发明的制备方法可将纳米磁珠粒的中位粒径控制在50～200nm，且粒径均一性好，在保证细胞的分选效率的同时，对目标细胞的功能影响小，生物相容性好，在生物医药学领域具有很好的应用前景。此外，本发明的制备方法简单易操作，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种用于细胞分选的纳米磁珠及其制备方法。
背景技术
免疫磁珠细胞分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合的特性，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性抗体结合不具磁性，从而不在磁场中停留达到细胞分离的目的。磁珠细胞分选所需设备简单，对技术人员要求不高，分选所得细胞灵敏度高、纯度好且细胞活性和复苏率较好，对于下游应用影响较小，应用前景较广。
在选择细胞分选用磁珠时，需要考虑细胞分选效果，同时还需考虑磁珠对目标细胞的影响以及后期应用时可能存在的问题。粒径较大时，虽然其表达能够负载更多的标记细胞接受部位，但也会导致分离速度过慢，且在生物医药学应用中出现不易穿透生物组织而导致治疗效果不佳的问题。粒径较小时，可能会导致磁性较弱，且容易被细胞胞吞，很难利用磁分离将细胞分选出来，更重要的是，为达到较好的细胞捕获效果，需要在细胞表面附着更多的磁性颗粒，这样会导致更多细胞功能表位被占据，既影响后续检测，也会对细胞功能造成影响。另外，磁珠粒径的均一性对分选效果也有十分关键的作用。均一性高且粒径范围适宜的磁珠在细胞分选体系中具有更高的稳定性，发生团聚的概率大大降低，且能够有效控制磁珠表面标记的基团的数量，进而保证后期抗体偶联效果，从而能够实现更高效地分选细胞。
纳米磁珠的制备方法包括物理法和化学法。其中物理法以机械球磨法为主要代表，球磨法是将微米或亚微米的粒子进行长时间研磨，然后分散到油基介质中而得，这种制备方法得到的粒子的粒径分布比较宽，消耗的时间也比较长。化学法包括共沉淀法、高温分解法、微乳液法、溶胶-凝胶法、超声化学法、激光分解法和电化学沉积法等。共沉淀法的优点是反应原理简单、设备和原料相对廉价、适合批量生产，因此研究最为广泛。但是截止目前，未见能够很好的控制磁珠粒径范围及均一性的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于细胞分选的纳米磁珠的制备方法，通过该制备方法制备的纳米磁珠中位粒径控制在50～200nm，且粒径均一性好。
本发明的另一目的是提供采用上述制备方法制备的纳米磁珠，该纳米磁珠适用于细胞分选，能够在保证分选效果的前提下，对目标细胞功能影响小，生物相容性好。
本发明的再一目的是提供用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠，其能够高效分离T淋巴细胞，且对后期T淋巴细胞检测、应用基本无任何不利影响。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下配制含有三价铁和二价铁的水溶液；
(2)采用碱性物质调节所述含有三价铁和二价铁的水溶液pH值至10～12；
(3)在65～90℃下反应得到含有所述纳米磁珠的水溶液。
优选地，步骤(1)和步骤(2)均在氮气保护下进行。
优选地，步骤(1)中，三价铁和二价铁的摩尔比为(1～2)：1，例如1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1。
优选地，步骤(1)中，三价铁来自FeCl3·6H2O，二价铁来自FeCl2·4H2O。
优选地，步骤(2)中，所述碱性物质为NaOH或氨水；和/或，所述碱性物质以水溶液的形式进行投料，在投料前经氮气除氧。
优选地，步骤(2)中，所述碱性物质以浓度为6～10mol/L的NaOH溶液的形式进行投料，进一步优选NaOH溶液的浓度为7～9mol/L。
优选地，步骤(3)的反应温度为70～85℃，例如70℃、75℃、80℃、85℃。
优选地，步骤(3)在300～500rpm搅拌下反应，进一步优选在350～450rpm搅拌下反应。
优选地，步骤(3)的反应时间为1～3h，进一步优选为1.5～2.5h。
优选地，所述制备方法还包括后处理步骤，所述后处理步骤为对所述含有所述纳米磁珠的水溶液进行水洗，水洗后分离得到的固体即为所述纳米磁珠，将所述纳米磁珠保存于去离子水中。
本发明还提供一种用于细胞分选的纳米磁珠，所述用于细胞分选的纳米磁珠由上述制备方法制备得到，所述用于细胞分选的纳米磁珠的中位粒径为50～200nm。
本发明还提供一种用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠，所述用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠包所述用于细胞分选的纳米磁珠，所述用于细胞分选的纳米磁珠偶联有能够与T淋巴细胞特异性结合的抗体。
优选地，所述用于细胞分选的纳米磁珠表面包被有羧基葡聚糖，所述羧基葡聚糖与所述抗体偶联。
本发明还提供所述的用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠的制备方法，将羧基葡聚糖和所述用于细胞分选的纳米磁珠按照质量比为1：(3～10)混合，在40～60℃下反应，反应结束后，分离得到包被有羧基葡聚糖的纳米磁珠，使用MES缓冲液重悬，经EDC和NHS活化，然后与所述抗体在36～38℃反应，反应结束后采用封闭液封闭，得到的固体即为所述用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠，保存于保存液中。
优选地，所述羧基葡聚糖由葡聚糖和丁二酸酐在4-二甲氨基吡啶和二甲基亚砜存在的条件下以及氮气保护下，在50～70℃下反应得到。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的制备方法可将纳米磁珠粒的中位粒径控制在50～200nm，且粒径均一性好，在保证细胞的分选效率的同时，对目标细胞的功能影响小，生物相容性好，在生物医药学领域具有很好的应用前景。此外，本发明的制备方法简单易操作，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的纳米磁珠(裸磁珠)的粒径分布图；
图2为对比例1制备的纳米磁珠(裸磁珠)的粒径分布图；
图3为对比例2制备的纳米磁珠(裸磁珠)的粒径分布图；
图4为实施例1制备的纳米磁珠表面包被羧基葡聚糖后的粒径分布图(羧基葡聚糖和纳米磁珠的投料质量比为1:5)；
图5为实施例1制备的纳米磁珠表面包被羧基葡聚糖后的粒径分布图(羧基葡聚糖和纳米磁珠的投料质量比为1:10)；
图6为由实施例1和对比例1的磁珠制备的分选磁珠对人淋巴T细胞的分选效果对比图。
具体实施方式
在前期一系列实验研究中，发明人发现中位粒径在50～200nm的磁珠能够很好地平衡人淋巴T细胞分选效果以及分选后的人淋巴T细胞的功能，在保证人淋巴T细胞的分选效率的同时，对人淋巴T细胞的功能影响小，生物相容性好，在生物医药学领域具有很好的应用前景。
当中位粒径大于200nm时，虽然磁珠表面能够负载更多特异性结合表位供目的细胞识别，但过多的结合往往会导致对目的细胞产生过度刺激引起耗竭，影响其生物学功能，且在生物医药学应用中也有导致磁珠不易穿透生物组织的风险，引起栓塞进而影响后续治疗效果。当中位粒径小于50nm时，可能会导致磁性较弱，且容易被细胞胞吞，很难利用磁分离将细胞分选出来，更重要的是，为达到较好的细胞捕获效果，需要在细胞表面附着更多的磁性颗粒，这样会导致更多细胞功能表位被占据，既影响后续检测，也会对细胞功能造成影响。
而现有纳米磁珠的制备工艺虽然有很多，但是制备的磁珠的粒径范围不太合适，均一性也不是很好。例如专利CN101554574B中制备的磁珠粒径不超过20nm，在体系中的稳定性不佳，易发生沉聚，在细胞分选时易被细胞胞吞，磁分离难度较高，为达到较好的细胞捕获效果，需要在细胞表面附着更多的磁性颗粒，导致更多细胞功能表位被占据，既影响后续检测，又对细胞功能有潜在影响。
为了获得粒径合适(期望中位粒径控制在50～200nm)且均一性好的纳米磁珠(裸磁珠)，发明人进行了大量的研究和实验验证，总结得到本发明的技术方案。具体地，本发明将四氧化三铁磁核和羧基葡聚糖包被磁珠分为两步进行。在制备四氧化三铁磁核时，首先在冰浴下配制含有三价铁和二价铁的水溶液，然后调节pH值至10～12后在65～90℃下反应，由此得到具有超顺磁性且中位粒径控制在50～200nm且粒度均一的四氧化三铁磁核，也就是裸磁珠。后续在上述裸磁珠表面添加羧基葡萄糖时，可以控制磁珠表面羧基量，进而在后期抗体偶联后能够得到品质均一的纳米磁珠。实验证实，采用本方法制备的用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠对人淋巴T细胞分选具有很好的效果且对人淋巴T细胞功能基本无影响，其中的四氧化三铁磁核具有很好的生物相容性，后期在体内使用时无需去除。
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中所使用的试剂等均可通过市售获得。
本发明中所述室温是指25±5℃。
本发明中裸磁珠是指没有进行标记、包被、偶联任何物质的磁珠。
本发明中粒径分布测试采用马尔文Nano ZS90纳米粒度仪。
实施例1
1.用分析天平称取3.2245g(0.012mol)的FeCl3·6H2O置于50mL的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入17mL的去离子水，搅拌至氯化铁溶解得到氯化铁溶液。
2.在冰水浴中(温度维持在0～4℃)，持续向三口烧瓶中通N2除氧，大约30min。
3.分析天平称取1.5905g(0.008mol)的FeCl2·4H2O溶于3mL去离子水中得到亚铁溶液，在冰水浴中(温度维持在0～4℃)以及持续通N2的同时，使用注射器将上述亚铁溶液注入步骤1的氯化铁溶液中，继续搅拌30min，得到三价铁和二价铁混合液。
4.配制浓度为8mol/L的NaOH溶液，通N2除氧，大约15min，使用蠕动泵将该NaOH溶液以8mL/min的流速加入步骤3的三价铁和二价铁混合液中至溶液pH值为11，持续搅拌30min后，将温度升温到80℃，400rpm搅拌下反应2h，结束反应，用去离子水洗涤得到纳米磁珠，将纳米磁珠保存于去离子水中，其粒径分布见图1。本实施例的纳米磁珠粒径范围为40～120nm，中位粒径(D50)约为80nm，均一性好。
实施例2
1.用分析天平称取3.2245g(0.012mol)的FeCl3·6H2O置于50mL的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入17mL的去离子水，搅拌至氯化铁溶解得到氯化铁溶液。
2.在冰水浴中(温度维持在0～4℃)，持续向三口烧瓶中通N2除氧，大约30min。
3.分析天平称取2.1112g(0.0107mol)的FeCl2·4H2O溶于3mL去离子水中得到亚铁溶液，在冰水浴中(温度维持在0～4℃)以及持续通N2的同时，使用注射器将上述亚铁溶液注入步骤1的氯化铁溶液中，继续搅拌30min，得到三价铁和二价铁混合液。
4.配制浓度为8mol/L的NaOH溶液，通N2除氧，大约15min，使用蠕动泵将该NaOH溶液以8mL/min的流速加入步骤3的三价铁和二价铁混合液中至溶液pH值为11，持续搅拌30min后，将温度升温到80℃，400rpm搅拌下反应2h，结束反应，用去离子水洗涤得到纳米磁珠，将纳米磁珠保存于去离子水中。本实施例的纳米磁珠中位粒径(D50)约为149nm，均一性好。
实施例3
1.用分析天平称取32.245g(0.12mol)的FeCl3·6H2O置于500mL的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入200mL的去离子水，搅拌至氯化铁溶解得到氯化铁溶液。
2.在冰水浴中(温度维持在0～4℃)，持续向三口烧瓶中通N2除氧，大约30min。
3.分析天平称取15.905g(0.08mol)的FeCl2·4H2O溶于30mL去离子水中得到亚铁溶液，在冰水浴中(温度维持在0～4℃)以及持续通N2的同时，使用注射器将上述亚铁溶液注入步骤1的氯化铁溶液中，继续搅拌30min，得到三价铁和二价铁混合液。
4.配制浓度为8mol/L的NaOH溶液，通N2除氧，大约15min，使用蠕动泵将该NaOH溶液以8mL/min的流速加入步骤3的三价铁和二价铁混合液中至溶液pH值为11，持续搅拌30min后，将温度升温到80℃，400rpm搅拌下反应2h，结束反应，用去离子水洗涤得到纳米磁珠，将纳米磁珠保存于去离子水中。本实施例的纳米磁珠粒径范围为70～140nm，中位粒径(D50)约为82nm，均一性好。
对比例1
1.用分析天平称取3.2245g(0.012mol)的FeCl3·6H2O置于50mL的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入17mL的去离子水，搅拌至氯化铁溶解得到氯化铁溶液。
2.在室温下，持续向三口烧瓶中通N2除氧，大约30min。
3.分析天平称取1.5905g(0.008mol)的FeCl2·4H2O溶于3mL去离子水中得到亚铁溶液，在室温下以及持续通N2的同时，使用注射器将上述亚铁溶液注入步骤1的氯化铁溶液中，继续搅拌30min，得到三价铁和二价铁混合液。
4.配制浓度为8mol/L的NaOH溶液，通N2除氧，大约15min，使用蠕动泵将该NaOH溶液以8mL/min的流速加入步骤3的三价铁和二价铁混合液中至溶液pH值为11，将温度升温到80℃，400rpm搅拌下反应2h，结束反应，用去离子水洗涤得到纳米磁珠，将纳米磁珠保存于去离子水中，其粒径分布见图2。如图2所示，本对比例的纳米磁珠均一性不佳，中位粒径(D50)为244.9nm，超过130nm的大尺寸磁珠占比较高。
对比例2
1.用分析天平称取3.2245g(0.012mol)的FeCl3·6H2O置于50mL的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入17mL的去离子水，搅拌至氯化铁溶解得到氯化铁溶液。
2.在冰水浴中(温度维持在0～4℃)，持续向三口烧瓶中通N2除氧，大约30min。
3.分析天平称取1.5905g(0.008mol)的FeCl2·4H2O溶于3mL去离子水中得到亚铁溶液，在冰水浴中(温度维持在0～4℃)以及持续通N2的同时，使用注射器将上述亚铁溶液注入步骤1的氯化铁溶液中，继续搅拌30min，得到三价铁和二价铁混合液。
4.配制浓度为8mol/L的NaOH溶液，通N2除氧，大约15min，使用蠕动泵将该NaOH溶液以8mL/min的流速加入步骤3的三价铁和二价铁混合液中至溶液pH值为11，将温度升温到60℃，400rpm搅拌下反应2h，结束反应，用去离子水洗涤得到纳米磁珠，其粒径分布见图3。如图3所示，本对比例的磁珠均一性不佳，大尺寸磁珠占比较高(部分磁珠粒径超出1μm)，本对比例的磁珠不适合用于细胞分选。
分别采用实施例1和对比例1的磁珠制备用于分选人淋巴T细胞的纳米磁珠，制备方法如下：
(1)制备羧基葡聚糖：将4g葡聚糖和8g丁二酸酐溶于10mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，通N2除氧15min后，向溶液中加入1mL溶有10mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的DMSO溶液作为催化剂，将液体加热至60℃搅拌反应24h。反应结束后将液体滴入冰乙醇中沉淀，抽滤得到固体。用去离子水溶解固体后加入透析袋中，透析48h(期间换水每六小时一次)，冷冻干燥得到羧基葡聚糖。
(2)在磁珠表面包被羧基葡聚糖：按照羧基葡聚糖与纳米磁珠的质量比为1：5或1：10的比例将羧基葡聚糖水溶液和纳米磁珠加入烧瓶中，搅拌加热50℃反应4h，利用磁分离筛选磁珠得到羧基葡聚糖包被的磁珠。
(3)偶联CD4/CD8抗体(百英生物)：使用25mM pH5.0的MES缓冲液作为清洗液磁分离洗涤羧基葡聚糖包被的磁珠，并使用25mM pH5.0的MES缓冲液将清洗后的磁珠重悬至1mL。加入EDC 10μL(10mg/mL)，NHS 20μL(10mg/mL)，37℃活化羧基0.5h。磁分离除去上清液，使用25mM pH5.0的MES缓冲液再次重悬至1mL。加入60μgCD4/CD8抗体，37℃旋转培养仪反应6h。使用磁分离，加入封闭液(含有BSA的PBS溶液)，使用保存液(含Tween20的PBS溶液)洗涤并于保存液中保存。当羧基葡聚糖与实施例1的纳米磁珠的质量比为1：5时，包被羧基葡聚糖后的磁珠粒径分布如图4所示，分布均匀，中位粒径约为84nm，电位约为-42mV。将葡聚糖包被的磁珠放置在室温下一段时间测得粒径无太大变化(表1)，表明葡聚糖包被的磁珠具有良好的稳定性。
表1
| Time(day) | 1 | 7 | 30 | 60 |
| Size(nm) | 89.2 | 85.4 | 91.5 | 87.2 |
当羧基葡聚糖与实施例1的纳米磁珠的质量比为1：10时，包被羧基葡聚糖后的磁珠粒径分布如图5所示，分布均匀，中位粒径约为100nm，电位约为-44mV。羧基葡聚糖与实施例1的纳米磁珠的质量比为1：5和1：10制备的磁珠粒径和电位都在目标范围内，根据偶联的抗体不同的，选择不同质量比。
使用实施例1和对比例1的磁珠制备用于分选人淋巴T细胞的纳米磁珠(羧基葡聚糖与实施例1的纳米磁珠的质量比为1：5)分别进行人淋巴T细胞分选实验：
取5mL的单采血稀释5倍后加入15mL的人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll)，800g离心30min后，吸出白膜层，用PBS离心洗涤3次，得到PBMC细胞。进行细胞计数，取2×107个细胞平均分为两份，分别加入10μL的由实施例1、对比例1的磁珠制备的分选磁珠，在4℃下避光孵育30min后用美天旎Ms分选柱分离，得到A、B两份目的细胞，对其进行流式分析，结果如图6所示。图6中A图为由实施例1的磁珠制备的分选磁珠对人淋巴T细胞的分选效果，目的细胞CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+的细胞占比98％；B图为由对比例1的磁珠制备的分选磁珠对人淋巴T细胞的分选效果，目的细胞CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+的细胞占比91％。由实施例1的磁珠制备的分选磁珠对人淋巴T细胞的分选效果明显优于由对比例1的磁珠制备的分选磁珠。对比例1的磁珠的粒径明显大于实施例1，其表面负载过多特异性结合表位将影响目的细胞的生物学功能，磁珠过大不易穿透生物组织，存在引起栓塞的风险。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种纳米磁珠的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下配制含有三价铁和二价铁的水溶液；
(2)采用碱性物质调节所述含有三价铁和二价铁的水溶液pH值至10～12；
(3)在65～90℃下反应得到含有所述纳米磁珠的水溶液。
2.根据权利要求1所述的纳米磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)均在氮气保护下进行。
3.根据权利要求1所述的纳米磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，三价铁和二价铁的摩尔比为(1～2)：1；
和/或，步骤(1)中，三价铁来自FeCl3·6H2O，二价铁来自FeCl2·4H2O。
4.根据权利要求1所述的纳米磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱性物质为NaOH或氨水；和/或，所述碱性物质以水溶液的形式进行投料，在投料前经氮气除氧。
5.根据权利要求4所述的纳米磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱性物质以浓度为6～10mol/L的NaOH溶液的形式进行投料。
6.根据权利要求1所述的纳米磁珠的制备方法，其特征在于：步骤(3)的反应温度为70～85℃；和/或，步骤(3)在300～500rpm搅拌下反应；和/或，步骤(3)的反应时间为1～3h。
7.根据权利要求1所述的纳米磁珠的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括后处理步骤，所述后处理步骤为对所述含有所述纳米磁珠的水溶液进行水洗，水洗后分离得到的固体即为所述纳米磁珠，将所述纳米磁珠保存于去离子水中。
8.一种用于细胞分选的纳米磁珠，其特征在于，所述用于细胞分选的纳米磁珠由权利要求1至7中任一项所述的制备方法制备得到，所述用于细胞分选的纳米磁珠的中位粒径为50～200nm。
9.一种用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠，其特征在于，所述用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠包括权利要求8所述的用于细胞分选的纳米磁珠，所述用于细胞分选的纳米磁珠偶联有能够与T淋巴细胞特异性结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠，其特征在于，所述用于细胞分选的纳米磁珠表面包被有羧基葡聚糖，所述羧基葡聚糖与所述抗体偶联。
11.如权利要求9所述的用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠的制备方法，其特征在于，将羧基葡聚糖和所述用于细胞分选的纳米磁珠按照质量比为1：(3～10)混合，在40～60℃下反应，反应结束后，分离得到包被有羧基葡聚糖的纳米磁珠，使用MES缓冲液重悬，经EDC和NHS活化，然后与所述抗体在36～38℃反应，反应结束后采用封闭液封闭，得到的固体即为所述用于分选T淋巴细胞的纳米磁珠，保存于保存液中。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述羧基葡聚糖由葡聚糖和丁二酸酐在4-二甲氨基吡啶和二甲基亚砜存在的条件下以及氮气保护下，在50～70℃下反应得到。
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| CN202310830002.2A CN116903043A (zh) | 2023-07-07 | 2023-07-07 | 一种用于细胞分选的纳米磁珠及其制备方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117907593A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-04-19 | 妙顺（上海）生物科技有限公司 | 一种功能化纳米磁珠的制备方法及其产品 |
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2023
- 2023-07-07 CN CN202310830002.2A patent/CN116903043A/zh active Pending
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