CN116892121A - 季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套 - Google Patents

季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套 Download PDF

Info

Publication number
CN116892121A
CN116892121A CN202310476054.4A CN202310476054A CN116892121A CN 116892121 A CN116892121 A CN 116892121A CN 202310476054 A CN202310476054 A CN 202310476054A CN 116892121 A CN116892121 A CN 116892121A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pet
paa
solution
quaternary ammonium
ammonium salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310476054.4A
Other languages
English (en)
Inventor
刘毅
陈绪敏
石长灿
李徐坚
杨啸
季志孝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Research Institute Of Guoke Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering
Original Assignee
Wenzhou Research Institute Of Guoke Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Research Institute Of Guoke Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering filed Critical Wenzhou Research Institute Of Guoke Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering
Priority to CN202310476054.4A priority Critical patent/CN116892121A/zh
Publication of CN116892121A publication Critical patent/CN116892121A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
    • A61L29/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/04—Macromolecular materials
    • A61L29/041—Macromolecular materials obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M13/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M13/322—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with compounds containing nitrogen
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M13/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M13/322—Treating fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, with non-macromolecular organic compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with compounds containing nitrogen
    • D06M13/402—Amides imides, sulfamic acids
    • D06M13/418—Cyclic amides, e.g. lactams; Amides of oxalic acid
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M14/00—Graft polymerisation of monomers containing carbon-to-carbon unsaturated bonds on to fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials
    • D06M14/18—Graft polymerisation of monomers containing carbon-to-carbon unsaturated bonds on to fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials using wave energy or particle radiation
    • D06M14/26—Graft polymerisation of monomers containing carbon-to-carbon unsaturated bonds on to fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials using wave energy or particle radiation on to materials of synthetic origin
    • D06M14/30—Graft polymerisation of monomers containing carbon-to-carbon unsaturated bonds on to fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials using wave energy or particle radiation on to materials of synthetic origin of macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D06M14/32—Polyesters
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M15/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M15/01—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with natural macromolecular compounds or derivatives thereof
    • D06M15/03—Polysaccharides or derivatives thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2101/00—Chemical constitution of the fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, to be treated
    • D06M2101/16—Synthetic fibres, other than mineral fibres
    • D06M2101/30—Synthetic polymers consisting of macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D06M2101/32—Polyesters
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，涉及改性无纺布制备技术领域，包括S1溶液接枝法、S2修饰抗菌有效成分、S3PET‑g‑PAA@As获取、S4物理化学表征、S5生物学评价实验和S6动物实验。本发明针对当前固定血管通路与皮肤结合的PET‑CUFF易被细菌感染的问题，本项提出对PET‑CUFF进行季铵盐化改性，综合提升PET‑CUFF用于中心静脉半永久导管的持久抗菌性能，本项目的开展，有望从根本上解决PET‑CUFF抗菌问题，提升患者生存率和生活质量，具有重要的临床应用价值。

Description

季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套
技术领域
本发明涉及改性无纺布制备技术领域，具体为一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套。
背景技术
随着人口老龄化，糖尿病发病率上升，长期透析患者自体动静脉难以达到构建血管通路的要求，导管成为挽救患者生命的新“生命线”，直到上世纪80年代末，在医用材料专家的努力下，开发出带PET-CUFF的中心静脉半永久导管，带涤纶套深静脉导管，其涤纶套距皮肤隧道口2-3厘米，能与组织反应融合，可使导管位置固定、不漏血液，但是导管是外源性植入性医用材料，有不可避免的并发症，尽管现有研究中对导管的材料做了多种改进，并设计了抗菌涂层，但由于导管与其他植入性材料相比，使用时间长，开放操作机会多，患者存在易感染因素，改进后的抗菌材料仍无确切疗效。
其中，涤纶套(Cuff)是导管的一部分，是由涤纶制成的网状纤维状结构，涤纶材料，即聚对苯二甲酸乙二醇酯，也称PET。置入导管后，PET-CUFF与皮下组织迅速粘合，起到固定导管，防止微生物蔓延的作用，涤纶材料富有弹性，并兼具强度高、耐热、耐挠曲、耐腐蚀、吸水性低、生物相容性好等特点。但在临床应用中，仍然表现出抗感染、抗炎症以及抗并发症不足的缺点。目前绝大多数的抗菌材料修饰针对导管本身，而以PET-CUFF的抗菌修饰研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，包括下述操作步骤：
S1、溶液接枝法：
将PET清洗干净并烘干，然后用丙酮抽提，取出烘干，得到抽提后的PET，用一定浓度的二苯甲酮(BP)的丙酮溶液喷涂单面，并于于暗处自然晾干，将晾干后的PET放入石英玻璃反应槽，并在PET上滴加接枝反应液，通氮气除去反应槽内的氧气，在紫外光照射下反应10～50min，之后取出经水洗、丙酮抽提、烘干，得到表面接枝有羧基功能基团的PET纤维(PET-g-PAA)。
S2、修饰抗菌有效成分：
取一定量的PET-g-PAA，加入到在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的水溶液中，在室温下反应2h，之后加入一定量的氨基多糖季铵盐(Aminopolysaccharide quaternary ammonium salt)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续搅拌24-48h。
S3、PET-g-PAA@As获取：
反应结束后，用去离子水洗净，得到PET-g-PAA@As。
S4、物理化学表征：
PET-g-PAA@As进行物理化学表征。
S5、生物学评价实验：
PET-g-PAA@As进行生物学评价实验。
S6、动物实验：
PET-g-PAA@As进行动物实验。
进一步的，所述S1步骤中，选定市售的PET无纺布作为基材并用丙酮抽提，取出烘干的方式进行预处理，选定夺氢型光敏剂二苯甲酮(BP)为光敏剂，选定单体丙烯酸(AA)为赋予羧基基团的改性材料，首先将BP溶于丙酮，配制程浓度为25％BP丙酮溶液，再喷涂在PET纤维表面上，由于丙酮的快速挥发，BP会在纤维丝表面结晶析出，从而实现光引发剂的有效固定；之后，再将该负载BP的PET无纺布放入到一定浓度的AA水溶液中，进行紫外(UV)光照接枝反应，得到表面接枝有羧基功能基团的PET纤维(PET-g-PAA)。
进一步的，所述S2步骤中，本项目中选用氨基多糖季铵盐(As)，具有广谱抗菌的功能，能显著抑制和杀灭肠道内的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等常见致病微生物；同时，能够调节成纤维细胞增殖与角化的形成，加速创面愈合，并减少瘢痕形成，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)作为一种水溶性、无细胞毒性、生物相容性好的碳二亚胺作为偶联剂，提供了一种安全有效的交联氨基键的方法，而n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为稳定剂，提高了交联效率。与普通交联剂不同，EDC和NHS在羧基和氨基之间引入“零长度”的酰胺交联，此外，EDC和NHS只是催化剂，可以通过透析去除。然而，超过一定浓度的EDC和NHS可能存在细胞毒性的风险，因此，实验中需要使用的EDC/NHS最大浓度应小于0.3mol/L，可以认为在生物材料中是安全的。
进一步的，所述S2步骤中，通过EDC/NHS介导的聚合反应制备PET-g-PAA@As，在去离子水中制备浓度为0.1mol/L的4-吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH＝3.61±0.01)，将PET-g-PAA和As分别投加入该0.1mol/L MES溶液中，将该溶液搅拌均匀中，并移入冰/水浴中，制备混合PET-g-PAA和As的溶液，将一定量的NHS添加到混合上述溶液中，然后添加一定量的EDC，继续搅拌反应6h，即可得到PET-g-PAA@As。
进一步的，所述S4步骤中，采用SEM、FT-IR等表征方法对制备的材料进行形貌结构、化学组成进行表征，以及利用接触角进行亲疏水性能测试。
进一步的，所述S5步骤中，细胞毒性：L929成纤维细胞在37℃5％的CO2培养箱中培养2代后，用0.25％胰蛋白酶分离。计数后，将细胞转移至96孔板。每孔细胞数约为5×103个。24h后，细胞贴附于96孔板上。所有样品经紫外线照射消毒4h后，在37℃RPMI 1640细胞培养液中提取样品24h，样品溶液浓度为1.5mg/mL。然后去除培养液，将100μL样品浸提液加入平板孔中培养24h，每组加入6个复孔，培养12h，然后每孔加入CCK-8试剂(10μL)2h，测定450nm处吸光度。
进一步的，所述S5步骤中，细胞存活率：这一步的细胞预处理与细胞毒性实验相同。荧光染料溶液的配制如下:PBS溶液2.5mL、Calcein-AM 10μL和碘化丙啶(PI)7.5μL，形成终浓度为4μmoL/L的Calcein-AM和PI混合荧光染料溶液。将96孔板从培养箱中取出，废弃上清液，用PBS洗涤3次，然后加入50μL荧光染料溶液，37℃无光孵育15min。取出孔板，置于激光共聚焦显微镜下。采用490nm激发光观察细胞形态并拍照。显微镜视野内绿色荧光为Calcein-AM标记的活细胞，红色荧光为PI标记的死细胞。
进一步的，所述S5步骤中，溶血试验：通过测定材料在体外与红细胞接触引起的游离血红蛋白程度来评价材料的溶血率。简单地说，将10mg样品和4.5mL提取液添加到离心管(5mL)中，在37℃孵育24h，通过离心机获得提取液。在离心管中添加提取物并孵育30min(37℃)。然后向离心管中加入稀释的血液(200μL)，孵育60min，最后以3000rpm离心10min，取出上清。用紫外分光光度计(Varioskan LUX,ThermoFisher)测定545nm处的吸光度值。以去离子水和生理盐水作为阳性对照组和阴性对照组。根据吸光度计算溶血率。
进一步的，所述S5步骤中，(A)抗菌试验，选取金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC29213)作革兰氏阳性菌模型微生物。首先，将样品薄膜经紫外线消毒30min。然后低温贮藏的金黄色葡萄球菌(50μL)被添加到包含细菌培养基的无菌管(5mL)中孵化(37℃)24h。最后，在固体琼脂糖培养基上进行划痕操作，使每道划痕中均带有细菌悬浮液，之后再将样本放置在涂有细菌悬浮液的划痕之上，孵化24h(37℃)；(B)抑菌试验：取50微实验菌于5mL培养液37度摇床中振摇24h，将所得菌液定量后稀释至1.0×105CFU/mL备用。样品制备：制成直径为5mm，厚度不超过4mm圆片(块)。阴性对照为市售PET，实验组1为PET-g-PAA，实验组2为PET-g-PAA@As。准备1.0×105CFU/mL试验菌悬液，每组1mL将已制好的样品置于菌悬液中，摇床振荡作用3min，然后稀释1000倍后取100μL进行涂板，每个样品平行三组。置于37℃培养箱培育24h后测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。
进一步的，所述S6步骤中，动物(SD大鼠)伤口感染模型愈合实验：所进行的动物实验均是得到了温州医科大学附属第一医院动物中心的批准，并严格遵循美国国立卫生研究院(NIH)关于实验动物饲养与使用规范来组织进行的。实验组取用一定重量的PET-g-PAA@As样品，对照组选用纯PET，空白组则不放材料。在实验前将所述样品进行了UV辐射以进行灭菌处理。在大鼠背部用打孔器打大小相同的直径为10毫米的洞，然后将1×108的菌液(金黄色葡萄球菌)滴加50μL左右。一天后，将样品覆盖在皮肤伤口处，分别在3，7，14，21day观察伤口愈合情况并拍照记录。同时，为了避免大鼠相互舔或抓挠伤口组织，在手术后分笼对大鼠进行饲养；组织学分析：用消毒好的手术器具将上述动物实验中的创伤处接触材料的皮肤或组织，用4％多聚甲醛溶液对其进行固定处理，随后用梯度浓度的乙醇溶液对其进行脱水过程，再用石蜡将其包埋。用切片机将石蜡块以5微米厚度切片，直到可以切下完整的组织薄膜。将切好的白色薄膜组织切片置于载玻片上，用二甲苯脱蜡和乙醇脱水处理后，用苏木精-伊红(H&E)染色液对切片进行了染色。随后用无水乙醇和二甲苯进行脱水封片操作。最后，通过光学显微镜观察染色的组织，以进行不同阶段的伤口再生的组织学分析。
本发明提供了一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，具备以下有益效果：
1、本发明中PET的抗菌改性除了保证材料的力学、热学及抗菌性能外，还要充分考虑到材料对人体的安全性和对环境的友好性，同时，基于目前PET-Cuff已经成熟应用，我们采取后处理法的方式，以涤纶为基材，结合表面接枝的化学改性方法，氨基多糖季铵盐(Amino polysaccharide quaternary ammonium salt，As)接枝到涤纶套基材上，赋予半永久中心静脉导管涤纶套抗菌功能，并将制备好的季铵盐化的抗菌涤纶套通过细胞毒性实验、动物实验，验证实其安全性和抗菌有效性；
2、本发明针对当前固定血管通路与皮肤结合的PET-CUFF易被细菌感染的问题，本项提出对PET-CUFF进行季铵盐化改性，综合提升PET-CUFF用于中心静脉半永久导管的持久抗菌性能，本项目的开展，有望从根本上解决PET-CUFF抗菌问题，提升患者生存率和生活质量，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为紫外光引发接枝的技术路线图示意图；
图2为PET-g-PAA@As的制备路线示意图；
图3-1为PET和PET-g-PAA实物照片示意图；
图3-2为PET以及不同接枝率PET-g-PAA的SEM照片示意图；
图3-3为市售的PET无纺布和接枝后的PET-g-PAA的FT-IR谱图示意图；
图3-4为市售的PET无纺布和接枝后的PET-g-PAA的接触角测试示意图；
图4-1为空白对照、PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As的细胞毒性试验示意图；
图4-2为空白对照、PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As与DMEM培养基的浸提液处理L929细胞后，用LIVE/DEAD染色(绿色/红色)的荧光显微镜图像示意图；
图4-3为PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As的溶血率试验，以血液在去离子水中为阳性对照组，血液在生理盐水中为阴性对照组示意图；
图4-4为PET、PET-g-PAA@As的划痕抗菌试验示意图；
图4-5(A)为空白对照组、PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As与细菌共培养后的细菌菌落数，(B)为样品与细菌共培养后涂板，(a)空白对照，(b)PET，(c)ET-g-PAA，(d)PET-g-PAA@As示意图；
图5-1为空白对照组、PET、PET-g-PAA@As与感染伤口接触以及第3天、第7天、第14天、第21天的创面愈合过程照片示意图；
图5-2为空白对照组、PET、PET-g-PAA@As与感染伤口接触后的第3天、第7天、第14天、第21天的创面愈合情况的H&E染色评价示意图；。
具体实施方式
本发明提供一种技术方案：一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，包括下述操作步骤：
S1、溶液接枝法：
将PET清洗干净并烘干，然后用丙酮抽提，取出烘干，得到抽提后的PET，用一定浓度的二苯甲酮(BP)的丙酮溶液喷涂单面，并于于暗处自然晾干，将晾干后的PET放入石英玻璃反应槽，并在PET上滴加接枝反应液，通氮气除去反应槽内的氧气，在紫外光照射下反应10～50min，之后取出经水洗、丙酮抽提、烘干，得到表面接枝有羧基功能基团的PET纤维(PET-g-PAA)，其中S1选定市售的PET无纺布作为基材并用丙酮抽提，取出烘干的方式进行预处理，选定夺氢型光敏剂二苯甲酮(BP)为光敏剂，选定单体丙烯酸(AA)为赋予羧基基团的改性材料，首先将BP溶于丙酮，配制程浓度为25％BP丙酮溶液，再喷涂在PET纤维表面上，由于丙酮的快速挥发，BP会在纤维丝表面结晶析出，从而实现光引发剂的有效固定；之后，再将该负载BP的PET无纺布放入到一定浓度的AA水溶液中，进行紫外(UV)光照接枝反应，得到表面接枝有羧基功能基团的PET纤维(PET-g-PAA)(如图1所示)。
S2、修饰抗菌有效成分：
取一定量的PET-g-PAA，加入到在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的水溶液中，在室温下反应2h，之后加入一定量的氨基多糖季铵盐(Aminopolysaccharide quaternary ammonium salt)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续搅拌24-48h,其中S2项目中选用氨基多糖季铵盐(As)，具有广谱抗菌的功能，能显著抑制和杀灭肠道内的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等常见致病微生物；同时，能够调节成纤维细胞增殖与角化的形成，加速创面愈合，并减少瘢痕形成，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)作为一种水溶性、无细胞毒性、生物相容性好的碳二亚胺作为偶联剂，提供了一种安全有效的交联氨基键的方法，而n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为稳定剂，提高了交联效率。与普通交联剂不同，EDC和NHS在羧基和氨基之间引入“零长度”的酰胺交联，此外，EDC和NHS只是催化剂，可以通过透析去除。然而，超过一定浓度的EDC和NHS可能存在细胞毒性的风险，因此，实验中需要使用的EDC/NHS最大浓度应小于0.3mol/L，可以认为在生物材料中是安全的(如图2所示)，再者，通过EDC/NHS介导的聚合反应制备PET-g-PAA@As，在去离子水中制备浓度为0.1mol/L的4-吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH＝3.61±0.01)，将PET-g-PAA和As分别投加入该0.1mol/L MES溶液中，将该溶液搅拌均匀中，并移入冰/水浴中，制备混合PET-g-PAA和As的溶液，将一定量的NHS添加到混合上述溶液中，然后添加一定量的EDC，继续搅拌反应6h，即可得到PET-g-PAA@As。
S3、PET-g-PAA@As获取：
反应结束后，用去离子水洗净，得到PET-g-PAA@As。
S4、物理化学表征：
PET-g-PAA@As进行物理化学表征，其中S4采用SEM、FT-IR等表征方法对制备的材料进行形貌结构、化学组成进行表征，以及利用接触角进行亲疏水性能测试，(如图3-1所示)可以清楚的看到市售PET为纯白色的具有一定厚度的纤维丝无纺布；而经过光引发接枝的产物PET-g-PAA，其受光照射的一面呈现均匀的接枝层变化，且略微发黄，而背面并未发生接枝反应，这也是紫外光引发的接枝特点，因为紫外光的能量较低，只能透过浅表层，材料基本保留原始机械性能而未被破坏。同时，抗菌Cuff的应用形式也同样只需要单面抗菌，因此，该抗菌改性技术贴合实际应用；此外，为了观察光接枝材料PET-g-PAA的形貌变化，分别选取不同接枝率的产物进行SEM表征，从微观形貌进行分析。(如图3-2所示)中的结果可以观察到，未经接枝改性的PET，其纤维丝非常平整光滑，而经过聚丙烯酸接枝后的PET-g-PAA，其纤维丝结构发生了不同程度的变化。从电镜照片中可以看到，随着接枝率由40％增大到240％，纤维表面能够明显观察到接枝了一层聚合物，且随着接枝率的增加，该聚合物层越发明显，纤维丝表面也变得极不平整，而且连成一片。由于接枝层的增厚，无纺布浅表层的纤维基本被聚合物包裹，但依然能保持较好的纤维状结构，而且这些聚丙烯酸结构能够在水溶液中充分伸展开来。同时，可以看到，当接枝率过大，其聚合物接枝层依然完全覆盖原有纤维丝结构，同时也会产生很多丙烯酸交联副产物，这些都是不利于后续的抗菌修饰以及抗菌应用的。因此，接枝率需要控制在一定程度以内，基本以150％左右为宜，接着，我们对接枝PAA后的样品进行了FT-IR检测分析，进一步说明实验过程中的材料变化情况，(如图3-3所示)红外测试分析结果表明，经过光引发接枝后得到的PET-g-PAA，与原始基材PET无纺布对比，PET-g-PAA在2965cm-1和2910cm-1处属于C-H的振动吸收峰明显减弱甚至消失，说明光接枝材料的反应过程中由于使用夺氢型光敏剂的缘故，其C-H在反应过程中被一定程度的消耗，以至于其吸收峰减弱。同时，可以观察到，PET无纺布上比较明显的处在1470cm-1和1504cm-1属于苯环上C＝C的振动吸收峰，在PET-g-PAA的红外谱图中，由于较厚的接枝层覆盖的原因而发生明显减弱的趋势。此外，两种材料也同时具有1090cm-1和1240cm-1属于C-O的伸缩振动峰，和1712cm-1为C＝O的伸缩振动峰。这些都充分证明，PET无纺布上成功接枝了PAA聚合物，最后，我们对接枝前后的材料进行了亲疏水性能的测试分析，以证明其反应前后的基材表面的材料特征变化，(如图3-4所示)可以清楚的看到，原市售PET无纺布材料，在接触角测试中，其表面接触角达到127°，呈现出明显的疏水性；而接枝了聚丙烯酸后的PET-g-PAA，水珠可快速被材料吸收，表现出极佳的亲水性。
S5、生物学评价实验：
PET-g-PAA@As进行生物学评价实验，其中S5可细分为：
细胞毒性：L929成纤维细胞在37℃5％的CO2培养箱中培养2代后，用0.25％胰蛋白酶分离。计数后，将细胞转移至96孔板。每孔细胞数约为5×103个。24h后，细胞贴附于96孔板上。所有样品经紫外线照射消毒4h后，在37℃RPMI 1640细胞培养液中提取样品24h，样品溶液浓度为1.5mg/mL。然后去除培养液，将100μL样品浸提液加入平板孔中培养24h，每组加入6个复孔，培养12h，然后每孔加入CCK-8试剂(10μL)2h，测定450nm处吸光度；细胞存活率：这一步的细胞预处理与细胞毒性实验相同。荧光染料溶液的配制如下:PBS溶液2.5mL、Calcein-AM 10μL和碘化丙啶(PI)7.5μL，形成终浓度为4μmoL/L的Calcein-AM和PI混合荧光染料溶液。将96孔板从培养箱中取出，废弃上清液，用PBS洗涤3次，然后加入50μL荧光染料溶液，37℃无光孵育15min。取出孔板，置于激光共聚焦显微镜下。采用490nm激发光观察细胞形态并拍照。显微镜视野内绿色荧光为Calcein-AM标记的活细胞，红色荧光为PI标记的死细胞；
由于抗菌Cuff需要直接接触创面，因此必须具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性，否则会对机体造成伤害。(如图4-1所示)培养24～48h后，所有组包括PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As的细胞活力均大于80％，且未观察到明显的细胞毒性。但我们仍然发现，当PET接枝PAA后，该样本下的细胞存活率有所下降，这可能与聚丙烯酸内残存的单体有关系，这是制备过程中需要进一步提升的。值得注意的是，样品PET-g-PAA@As在本次细胞毒性试验中表现出的低细胞毒性，证明其可以安全使用。共培养24h后的定性细胞毒性研究结果(如图4-2所示)。绿色荧光对应对照活细胞。24h时，PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As的平均细胞存活率分别为93.2％、88.3％、和91.7％(图4-2中a-d)。观察期内，PET-g-PAA与PET-g-PAA@As的细胞存活率没有统计学意义上的差异。由此可见，PET-g-PAA@As对L929细胞无细胞毒性，表明本研究制备的PET-g-PAA@As具有良好的细胞相容性。
溶血试验：通过测定材料在体外与红细胞接触引起的游离血红蛋白程度来评价材料的溶血率。简单地说，将10mg样品和4.5mL提取液添加到离心管(5mL)中，在37℃孵育24h，通过离心机获得提取液。在离心管中添加提取物并孵育30min(37℃)。然后向离心管中加入稀释的血液(200μL)，孵育60min，最后以3000rpm离心10min，取出上清。用紫外分光光度计(Varioskan LUX,ThermoFisher)测定545nm处的吸光度值。以去离子水和生理盐水作为阳性对照组和阴性对照组。根据吸光度计算溶血率。由于抗菌Cuff直接接触伤口部位，如果材料导致红细胞破裂，往往会导致二磷酸腺苷被释放，加速血小板聚集，从而引发血栓。通过体外材料直接接触血液，对所制备的抗菌Cuff的溶血性进行评估，实验结果(如图4-3所示)，结果显示，与生理盐水对照相比，PET、PET-g-PAA、PET-g-PAA@As的平均溶血率均小于5％，溶血潜力较低。溶血率检测结果表明，PET-g-PAA@As具有良好的血液相容性。因此，制备的PET-g-PAA@As是适合作为皮肤伤口直接接触使用；
(A)抗菌试验，选取金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 29213)作革兰氏阳性菌模型微生物。首先，将样品薄膜经紫外线消毒30min。然后低温贮藏的金黄色葡萄球菌(50μL)被添加到包含细菌培养基的无菌管(5mL)中孵化(37℃)24h。最后，在固体琼脂糖培养基上进行划痕操作，使每道划痕中均带有细菌悬浮液，之后再将样本放置在涂有细菌悬浮液的划痕之上，孵化24h(37℃)；(B)抑菌试验：取50微实验菌于5mL培养液37度摇床中振摇24h，将所得菌液定量后稀释至1.0×105CFU/mL备用。样品制备：制成直径为5mm，厚度不超过4mm圆片(块)。阴性对照为市售PET，实验组1为PET-g-PAA，实验组2为PET-g-PAA@As。准备1.0×105CFU/mL试验菌悬液，每组1mL将已制好的样品置于菌悬液中，摇床振荡作用3min，然后稀释1000倍后取100μL进行涂板，每个样品平行三组。置于37℃培养箱培育24h后测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数；
众所周知，伤口愈合过程可能会受到细菌感染，这将延迟伤口愈合。我们对材料进行了划痕抗菌(如图4-4所示)以及共培养抑菌试验(如图4-5所示)。结果如图所示，在图4-4中，可以看到未经修饰的PET下方的三道菌液划痕，在经过24h之后已出现非常明显的菌落生长，且无断开；相比之下，经过抗菌修饰的PET-g-PAA@As组，其下方的三道划痕，在经过24h之后同样可以看到明显的菌落生长，但是可以清楚的看到菌液划痕与PET-g-PAA@As贴合紧密的地方，已完全没有菌落生长，出现了明显的划痕断口，这是因为抗菌成分接枝在材料表面，其抗菌作用主要在相互接触时才能够充分发挥作用。这与PET-Cuff的应用特点相似，只作用伤口接触的部分。由图4-5的结果所示，在体外抗菌实验中，PET在金黄色葡萄球菌中均无明显抗菌作用，与对照组相比杀菌率小于10％。而PET-g-PAA对金黄色葡萄球菌的杀菌率为30％，其原因在于聚丙烯酸中的羧基基团电离所产生的表面电荷会破坏细菌细胞壁，从而影响其活性，但程度有限。PET-g-PAA@As，对金黄色葡萄球菌的杀伤率达到90％以上，显著高于其它样品，说明氨基多糖季铵盐对于金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌性。结果表明，在金黄色葡萄球菌的抗菌实验中，实验组对金黄色葡萄球菌的杀菌率效果很显著(杀菌率大于90％)，显著高于对照组。体外抗菌实验对比得出实验组具有良好的抗菌性。
S6、动物实验：
PET-g-PAA@As进行动物实验，其中S6以动物(SD大鼠)伤口感染模型愈合实验：所进行的动物实验均是得到了温州医科大学附属第一医院动物中心的批准，并严格遵循美国国立卫生研究院(NIH)关于实验动物饲养与使用规范来组织进行的。实验组取用一定重量的PET-g-PAA@As样品，对照组选用纯PET，空白组则不放材料。在实验前将所述样品进行了UV辐射以进行灭菌处理。在大鼠背部用打孔器打大小相同的直径为10毫米的洞，然后将1×108的菌液(金黄色葡萄球菌)滴加50μL左右。一天后，将样品覆盖在皮肤伤口处，分别在3，7，14，21day观察伤口愈合情况并拍照记录。同时，为了避免大鼠相互舔或抓挠伤口组织，在手术后分笼对大鼠进行饲养；
伤口感染是要解决的严重问题，为了更好地评估材料的有效抗菌促愈合的功能，我们用大鼠全层皮肤缺损感染模型研究了PET-g-PAA@As对于伤口感染情况下，通过抗菌作用在促进伤口愈合方面的能力。伤口愈合的过程大致可分为三个阶段：止血/发炎阶段、增殖/分化阶段和重塑/成熟阶段。在炎症阶段，炎症细胞的增殖和浸润经常发生。通常观察到增生阶段上皮，成纤维细胞，胶原纤维的形成和新血管形成，以进一步分析伤口的愈合能力。在愈合过程的第一阶段，炎症细胞(例如巨噬细胞)在促进某些细胞的再生，调节细胞因子和增强血管生成方面很重要。它吞噬失活的细胞组织，进一步促进生长因子的释放并激活成纤维细胞的形成和迁移。(如图5-1所示)实验中，在大鼠背部用打孔器打大小相同的直径为10毫米的洞，使用PET无纺布作为对照组，PET-g-PAA@As为实验组，空白组则不放任何材料。在图4-4中可以看到，通过实际照片的观察发现，空白对照组的愈合情况来看，大鼠在7天之内发生感染情况，但之后由于其较好的自身愈合能力，伤口在14天左右已明显收缩变小，21天完全闭合；而对照组PET的实验中，将材料取出观察到，大鼠的伤口在第7天出现与空白组相似的感染情况，而且伤口在第14天左右的愈合情况不如空白组；相比之下，实验组PET-g-PAA@As在大鼠伤口处覆盖后，其在第七天的感染情况明显比空白组和对照组要好很多，而且在14天已基本愈合，其伤口恢复情况最佳。说明PET-g-PAA@As具有出色的抗菌能力，可以控制感染情况，从而有效促进和加速伤口愈合；
组织学分析：用消毒好的手术器具将上述动物实验中的创伤处接触材料的皮肤或组织，用4％多聚甲醛溶液对其进行固定处理，随后用梯度浓度的乙醇溶液对其进行脱水过程，再用石蜡将其包埋。用切片机将石蜡块以5微米厚度切片，直到可以切下完整的组织薄膜。将切好的白色薄膜组织切片置于载玻片上，用二甲苯脱蜡和乙醇脱水处理后，用苏木精-伊红(H&E)染色液对切片进行了染色。随后用无水乙醇和二甲苯进行脱水封片操作。最后，通过光学显微镜观察染色的组织，以进行不同阶段的伤口再生的组织学分析；
研究表明，炎症期表现为以中性粒细胞为主的炎性细胞的聚集和浸润；增生期表现为成纤维细胞数量增加、产生大量无序排列的弱胶原纤维；重塑期急性炎症明显减少，取而代之的是慢性炎症的标志——多核巨细胞的产生，胶原纤维明显增多。而HE染色可以反应出炎性细胞的浸润程度，因此，我们通过组织切片，进行了相关的HE染色分析，判断其感染和愈合情况。(如图5-2所示)在术后对应的时间点：当第3天时，空白组的炎症细胞浸润最为明显；PET组也明显的炎症细胞聚集；而PET-g-PAA@As组表现出较少的炎症细胞。当在第7天，空白组炎症细胞浸润明显减少，说明机体的自愈合能力比较强；而PET组则和之前没有发生太大变化；PET-g-PAA@As组则出现较好的恢复趋势，形成了相对规则的胶原纤维层。而在第14天，每组都出现了新生的角质层，说明机体在逐渐恢复愈合。在第21天，空白组、PET组、PET-g-PAA@As组都出现了连续且规则的新上表皮，表现出很好的恢复情况，而PET-g-PAA@As组此时的炎症细胞最少，且结构层完整，同时可以看到较多毛囊结构，说明PET-g-PAA@As明显优于PET组和空白组。
该季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，针对当前固定血管通路与皮肤结合的PET-CUFF易被细菌感染的问题，本项提出对PET-CUFF进行季铵盐化改性，综合提升PET-CUFF用于中心静脉半永久导管的持久抗菌性能，本项目的开展，有望从根本上解决PET-CUFF抗菌问题，提升患者生存率和生活质量，具有重要的临床应用价值。

Claims (10)

1.一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，包括下述操作步骤：
S1、溶液接枝法：
将PET清洗干净并烘干，然后用丙酮抽提，取出烘干，得到抽提后的PET，用一定浓度的二苯甲酮(BP)的丙酮溶液喷涂单面，并于于暗处自然晾干，将晾干后的PET放入石英玻璃反应槽，并在PET上滴加接枝反应液，通氮气除去反应槽内的氧气，在紫外光照射下反应10～50min，之后取出经水洗、丙酮抽提、烘干，得到表面接枝有羧基功能基团的PET纤维(PET-g-PAA)。
S2、修饰抗菌有效成分：
取一定量的PET-g-PAA，加入到在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的水溶液中，在室温下反应2h，之后加入一定量的氨基多糖季铵盐(Aminopolysaccharide quaternary ammonium salt)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续搅拌24-48h。
S3、PET-g-PAA@As获取：
反应结束后，用去离子水洗净，得到PET-g-PAA@As。
S4、物理化学表征：
PET-g-PAA@As进行物理化学表征。
S5、生物学评价实验：
PET-g-PAA@As进行生物学评价实验。
S6、动物实验：
PET-g-PAA@As进行动物实验。
2.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S1步骤中，选定市售的PET无纺布作为基材并用丙酮抽提，取出烘干的方式进行预处理，选定夺氢型光敏剂二苯甲酮(BP)为光敏剂，选定单体丙烯酸(AA)为赋予羧基基团的改性材料，首先将BP溶于丙酮，配制程浓度为25％BP丙酮溶液，再喷涂在PET纤维表面上，由于丙酮的快速挥发，BP会在纤维丝表面结晶析出，从而实现光引发剂的有效固定；之后，再将该负载BP的PET无纺布放入到一定浓度的AA水溶液中，进行紫外(UV)光照接枝反应，得到表面接枝有羧基功能基团的PET纤维(PET-g-PAA)。
3.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S2步骤中，本项目中选用氨基多糖季铵盐(As)，具有广谱抗菌的功能，能显著抑制和杀灭肠道内的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等常见致病微生物；同时，能够调节成纤维细胞增殖与角化的形成，加速创面愈合，并减少瘢痕形成，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)作为一种水溶性、无细胞毒性、生物相容性好的碳二亚胺作为偶联剂，提供了一种安全有效的交联氨基键的方法，而n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为稳定剂，提高了交联效率。与普通交联剂不同，EDC和NHS在羧基和氨基之间引入“零长度”的酰胺交联，此外，EDC和NHS只是催化剂，可以通过透析去除。然而，超过一定浓度的EDC和NHS可能存在细胞毒性的风险，因此，实验中需要使用的EDC/NHS最大浓度应小于0.3mol/L，可以认为在生物材料中是安全的。
4.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S2步骤中，通过EDC/NHS介导的聚合反应制备PET-g-PAA@As，在去离子水中制备浓度为0.1mol/L的4-吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH＝3.61±0.01)，将PET-g-PAA和As分别投加入该0.1mol/L MES溶液中，将该溶液搅拌均匀中，并移入冰/水浴中，制备混合PET-g-PAA和As的溶液，将一定量的NHS添加到混合上述溶液中，然后添加一定量的EDC，继续搅拌反应6h，即可得到PET-g-PAA@As。
5.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S4步骤中，采用SEM、FT-IR等表征方法对制备的材料进行形貌结构、化学组成进行表征，以及利用接触角进行亲疏水性能测试。
6.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S5步骤中，细胞毒性：L929成纤维细胞在37℃5％的CO2培养箱中培养2代后，用0.25％胰蛋白酶分离。计数后，将细胞转移至96孔板。每孔细胞数约为5×103个。24h后，细胞贴附于96孔板上。所有样品经紫外线照射消毒4h后，在37℃RPMI 1640细胞培养液中提取样品24h，样品溶液浓度为1.5mg/mL。然后去除培养液，将100μL样品浸提液加入平板孔中培养24h，每组加入6个复孔，培养12h，然后每孔加入CCK-8试剂(10μL)2h，测定450nm处吸光度。
7.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S5步骤中，细胞存活率：这一步的细胞预处理与细胞毒性实验相同。荧光染料溶液的配制如下:PBS溶液2.5mL、Calcein-AM 10μL和碘化丙啶(PI)7.5μL，形成终浓度为4μmoL/L的Calcein-AM和PI混合荧光染料溶液。将96孔板从培养箱中取出，废弃上清液，用PBS洗涤3次，然后加入50μL荧光染料溶液，37℃无光孵育15min。取出孔板，置于激光共聚焦显微镜下。采用490nm激发光观察细胞形态并拍照。显微镜视野内绿色荧光为Calcein-AM标记的活细胞，红色荧光为PI标记的死细胞。
8.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S5步骤中，溶血试验：通过测定材料在体外与红细胞接触引起的游离血红蛋白程度来评价材料的溶血率。简单地说，将10mg样品和4.5mL提取液添加到离心管(5mL)中，在37℃孵育24h，通过离心机获得提取液。在离心管中添加提取物并孵育30min(37℃)。然后向离心管中加入稀释的血液(200μL)，孵育60min，最后以3000rpm离心10min，取出上清。用紫外分光光度计(Varioskan LUX,ThermoFisher)测定545nm处的吸光度值。以去离子水和生理盐水作为阳性对照组和阴性对照组。根据吸光度计算溶血率。
9.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S5步骤中，(A)抗菌试验，选取金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC29213)作革兰氏阳性菌模型微生物。首先，将样品薄膜经紫外线消毒30min。然后低温贮藏的金黄色葡萄球菌(50μL)被添加到包含细菌培养基的无菌管(5mL)中孵化(37℃)24h。最后，在固体琼脂糖培养基上进行划痕操作，使每道划痕中均带有细菌悬浮液，之后再将样本放置在涂有细菌悬浮液的划痕之上，孵化24h(37℃)；(B)抑菌试验：取50微实验菌于5mL培养液37度摇床中振摇24h，将所得菌液定量后稀释至1.0×105CFU/mL备用。样品制备：制成直径为5mm，厚度不超过4mm圆片(块)。阴性对照为市售PET，实验组1为PET-g-PAA，实验组2为PET-g-PAA@As。准备1.0×105CFU/mL试验菌悬液，每组1mL将已制好的样品置于菌悬液中，摇床振荡作用3min，然后稀释1000倍后取100μL进行涂板，每个样品平行三组。置于37℃培养箱培育24h后测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。
10.根据权利要求1所述的一种季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套，其特征在于，所述S6步骤中，动物(SD大鼠)伤口感染模型愈合实验：所进行的动物实验均是得到了温州医科大学附属第一医院动物中心的批准，并严格遵循美国国立卫生研究院(NIH)关于实验动物饲养与使用规范来组织进行的。实验组取用一定重量的PET-g-PAA@As样品，对照组选用纯PET，空白组则不放材料。在实验前将所述样品进行了UV辐射以进行灭菌处理。在大鼠背部用打孔器打大小相同的直径为10毫米的洞，然后将1×108的菌液(金黄色葡萄球菌)滴加50μL左右。一天后，将样品覆盖在皮肤伤口处，分别在3，7，14，21day观察伤口愈合情况并拍照记录。同时，为了避免大鼠相互舔或抓挠伤口组织，在手术后分笼对大鼠进行饲养；组织学分析：用消毒好的手术器具将上述动物实验中的创伤处接触材料的皮肤或组织，用4％多聚甲醛溶液对其进行固定处理，随后用梯度浓度的乙醇溶液对其进行脱水过程，再用石蜡将其包埋。用切片机将石蜡块以5微米厚度切片，直到可以切下完整的组织薄膜。将切好的白色薄膜组织切片置于载玻片上，用二甲苯脱蜡和乙醇脱水处理后，用苏木精-伊红(H&E)染色液对切片进行了染色。随后用无水乙醇和二甲苯进行脱水封片操作。最后，通过光学显微镜观察染色的组织，以进行不同阶段的伤口再生的组织学分析。
CN202310476054.4A 2023-04-28 2023-04-28 季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套 Pending CN116892121A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310476054.4A CN116892121A (zh) 2023-04-28 2023-04-28 季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310476054.4A CN116892121A (zh) 2023-04-28 2023-04-28 季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116892121A true CN116892121A (zh) 2023-10-17

Family

ID=88309976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310476054.4A Pending CN116892121A (zh) 2023-04-28 2023-04-28 季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116892121A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69828050T2 (de) Ein Verfahren zur Herstellung eines Polyvinylalkohol-Kryogels
Shahriari-Khalaji et al. A poly-l-lysine-bonded TEMPO-oxidized bacterial nanocellulose-based antibacterial dressing for infected wound treatment
CN109943976A (zh) 一种多功能静电纺丝纤维敷料及其制备方法
CN104189958B (zh) 用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法
US20190216984A1 (en) Vascularized full thickness tissue-engineered skin assembled by hydrogel, nanofibrous scaffolds and skin cell layers and preparation method thereof
CN107823692B (zh) 一种创伤敷料复合纳米纤维膜及其制备方法
CN101856517A (zh) 基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用
SE541313C2 (en) Amphiphilic antimicrobial hydrogel
Chandika et al. Enhanced wound-healing capability with inherent antimicrobial activities of usnic acid incorporated poly (ε-caprolactone)/decellularized extracellular matrix nanofibrous scaffold
CN112876694A (zh) 丙烯酸/ε-聚赖氨酸黏附性抗菌水凝胶的制备方法及其应用
CN115671298A (zh) 一种ros响应的抗菌药物纳米载体及其制备方法
WO2024078355A1 (zh) 生物补片及其制备方法和用途
CN116892121A (zh) 季铵盐改性的具有抗菌功能的半永久中心静脉导管涤纶套
CN115584034B (zh) 一种用于伤口修复的可注射水凝胶材料及其制备方法
JPH06233809A (ja) 創傷被覆材
CN110898251A (zh) 具有pH响应性和内部接枝多孔贯通网状结构的复合水凝胶敷料及其制备方法
CN110585486B (zh) 羊膜复合材料及其制备方法和应用
Aramwit Bio-response to silk sericin
CN114874479A (zh) 一种海绵状大孔水凝胶的制备方法及在抗菌中的应用
Xu et al. Complexation‐Induced Resolution Enhancement Pleiotropic Small Diameter Vascular Constructs with Superior Antibacterial and Angiogenesis Properties
CN113384743A (zh) 一种具有促进组织修复及抗菌的温敏敷料的制备方法
CN115634305B (zh) 一种多功能静电纺复合纳米纤维材料及其制备方法和应用
CN114832142B (zh) 一种壳聚糖复合敷料及其制备方法
CN111494304B (zh) 一种多糖基杂化水凝胶及构建方法及应用
CN115054734B (zh) 一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication