CN116891542B - 一种具有抑菌效果的阳离子型羧甲基壳聚糖及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及壳质多糖技术领域，具体涉及一种具有抑菌效果的阳离子型羧甲基壳聚糖及其应用。阳离子型羧甲基壳聚糖制备方法包括：（1）将环氧氯丙烷加入N,N‑二甲基正辛胺中，环氧氯丙烷与N,N‑二甲基正辛胺的质量比为0.75:1‑1:1，40‑45℃下加热搅拌反应3‑5h，得到环氧烷基季铵盐；（2）将步骤（1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4:1‑5.2:1，控制温度在40‑50℃，反应72‑96h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖。本发明制备的阳离子型羧甲基壳聚糖对白色念珠菌具有良好的抑菌效果，季铵盐取代度低，细胞毒性较小。
Description
技术领域
本发明涉及壳质多糖技术领域，具体涉及一种具有抑菌效果的阳离子型羧甲基壳聚糖及其应用。
背景技术
白色念珠菌属于白假丝酵母菌，是念珠菌属最常见的致病菌，日常存在于人体口腔、上呼吸道、肠道、阴道等粘膜部位，当人体出现菌群失调，特别是免疫力下降时，可引起皮肤、口腔、粘膜和内脏的急、慢性感染。白色念珠菌感染会引起阴道炎，产生妇科疾病，危害女性身体健康。目前对于白色念珠菌的治疗主要是用抗菌药物、激素和疫抑制剂，但长期应用会使机体免疫力下降，产生耐药菌。因此，有必要研发新的具有耐药性的材料和产品，用于白色念珠菌的抗菌治疗。羧甲基壳聚糖是来源于海洋的天然碱性多糖甲壳素的衍生物，属于大分子多糖，但是天然多糖的抑菌效果较差，不能满足实际应用中抗菌要求。
中国发明专利“一种羧甲基壳聚糖季铵盐温敏凝胶及其制备方法”（公开号为CN108653197 A），公开了一种具有抗菌性能的羧甲基壳聚糖季铵盐温敏凝胶，采用羧甲基壳聚糖和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵反应制备羧甲基壳聚糖季铵盐，季铵盐取代度≥75%，该方法需要在羧甲基壳聚糖的结构上引入大量的季铵盐基团才能实现抗菌效果。但是引入大量的季铵盐基团会增大羧甲基壳聚糖的细胞毒性，不适合应用于人体表面，且会增加制备成本。中国发明专利“羧甲基壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料及其制备方法”（公开号为CN 101735486 A），公开了一种羧甲基壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料，采用羧甲基壳聚糖和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵反应制备羧甲基壳聚糖季铵盐，季铵盐取代度75%~90%，同样需要在羧甲基壳聚糖的结构上引入大量的季铵盐基团才能实现抗菌效果。该方法制备的羧甲基壳聚糖季铵盐具有较强的细胞毒性，不适合用于人体破损皮肤及粘膜。白色念珠菌感染引起的妇科炎症往往会伴随粘膜破损等状况，因此要求所用的材料应具有低细胞毒性的特点，否则会对人体造成强烈刺激从而引发过敏和炎症等问题。
发明内容
针对现有壳聚糖材料具有较强的细胞毒性，不适合用于人体破损皮肤及粘膜的技术问题，本发明提供一种具有抑菌效果的阳离子型羧甲基壳聚糖及其应用，利用来源于海洋的天然碱性多糖甲壳素的衍生物羧甲基壳聚糖为原料，通过特定制备步骤及原料配比，合成阳离子型羧甲基壳聚糖。
第一方面，本发明提供一种具有抑菌效果的阳离子型羧甲基壳聚糖，采用如下制备方法制得：
（1）将环氧氯丙烷加入N,N-二甲基正辛胺中，环氧氯丙烷与N,N-二甲基正辛胺的质量比为0.75:1-1:1，40-45℃下加热搅拌反应3-5h，得到环氧烷基季铵盐；
（2）将步骤（1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4:1-5.2:1，控制温度在40-50℃，反应72-96h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖。
进一步的，阳离子型羧甲基壳聚糖的制备方法为：
（1）将环氧氯丙烷加入到N,N-二甲基正辛胺中，环氧氯丙烷与N,N-二甲基正辛胺的质量比为0.75:1，45℃下加热搅拌反应3h，得到环氧烷基季铵盐；
（2）将步骤（1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4:1，控制温度在50℃，反应72h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖。
进一步的，羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为85%-99%。
进一步的，羧甲基壳聚糖在5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s。
进一步的，步骤（1）反应结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐。
进一步的，步骤（2）反应结束后用乙醇沉淀、洗涤、真空干燥，得到阳离子型羧甲基壳聚糖。
第二方面，本发明还提供一种上述阳离子型羧甲基壳聚糖在制备妇科护理产品中的应用，如妇科洗液或妇科凝胶等。
进一步的，妇科护理产品对白色念珠菌具有抑制效果。
进一步的，妇科护理产品对白色念珠菌感染引起的妇科炎症具有治疗效果。
本发明的有益效果在于：
本发明通过对羧甲基壳聚糖进行特定结构的分子修饰，合成出一种新的阳离子型羧甲基壳聚糖。制备的阳离子型羧甲基壳聚糖对白色念珠菌具有良好的抑菌效果，季铵盐取代度低，细胞毒性较小，可以与粘膜接触，能够制备成凝胶或洗液等产品用于女性的私处清洁护理，解决白色念珠菌感染引起的妇科问题。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1阳离子型羧甲基壳聚糖Q1的制备
按照如下方法制备阳离子型羧甲基壳聚糖Q1：
（1）将3g环氧氯丙烷滴加到4g N,N-二甲基正辛胺中，45℃下加热搅拌3h，结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐；
（2）称取2g羧甲基壳聚糖（脱乙酰度99%，5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s）溶解于90mL去离子水中，加入0.5g步骤（1）得到的环氧烷基季铵盐（羧甲基壳聚糖：环氧烷基季铵盐投料质量比为4:1），控制温度在50℃，反应72h，反应结束后用乙醇沉淀、洗涤三次，经真空干燥得到阳离子型羧甲基壳聚糖Q1，经检测环氧烷基季铵盐取代度为7%。
实施例2 阳离子型羧甲基壳聚糖Q2的制备
按照如下方法制备阳离子型羧甲基壳聚糖Q2：
（1）将5g环氧氯丙烷滴加到5g N,N-二甲基正辛胺中，40℃下加热搅拌5h，结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐；
（2）称取3.9g羧甲基壳聚糖（脱乙酰度85%，5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s）溶解于90mL去离子水中，加入0.75g步骤（1）得到的环氧烷基季铵盐（羧甲基壳聚糖：环氧烷基季铵盐投料质量比为5.2:1），控制温度在40℃，反应96h，反应结束后用乙醇沉淀、洗涤三次，经真空干燥得到阳离子型羧甲基壳聚糖Q2，经检测环氧烷基季铵盐取代度为5.5%。
对比例1 羧甲基壳聚糖季铵盐Q3的制备
参考申请号为200910213899.4的中国发明专利的方法制备羧甲基壳聚糖季铵盐Q3，制得羧甲基壳聚糖季铵盐的重均分子量为4×105，羧化度为70%，季铵盐取代度为80%。
测试例1 白色念珠菌抑菌测试
实验依据：GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C4。
实验条件：温度19~21℃，相对湿度50%~53%。
实验菌株：白色念珠菌（ATCC 10231）取其第5代新鲜斜面培养物进行试验，用0.03mol/L PBS洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用PBS稀释至5×105~9×105cfu/mL的浓度备用。
实验步骤：称取实施例1-2、对比例1制备的Q1、Q2、Q3及实施例1的羧甲基壳聚糖原料各0.02g分别溶于20mL磷酸盐缓冲液（以下简称“PBS”）中，配置成浓度为1mg/mL的溶液，并依次命名为X1、X2、Y1、S1。
分别量取X1、X2、Y1、S1溶液各4份于试管中，每份溶液体积为5mL。分别向每个试管中滴加100μL上述白色念珠菌的PBS菌悬液，均匀混合，开始计时，作用20min，用移液枪分别取样液（0.5mL）投入含5mL PBS的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2~3个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个平皿，用凉至40~45℃的沙氏琼脂培养基15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35±2℃培养72h，作活菌落数计数。
数据处理方法：实验重复3次，样品抑菌率计算公式如下：
抑菌率（%）=（A-B）/A×100%，
其中A、B分别为空白对照平均菌落数和被试样品平均菌落数。
评价标准：抑菌率≥50%~90%，产品有抑菌作用；抑菌率≥90%，产品有较强抑菌作用。
表1 测试样品对白色念珠菌的抑菌效果
各测试样品对白色念珠菌的抑菌效果如表1所示，可以看出，未改性的羧甲基壳聚糖样品S1（对应实施例1的羧甲基壳聚糖原料）的抑菌率远低于50%，对白色念珠菌没有抑菌效果；而改性后的样品X1、X2（对应本发明实施例1、实施例2制备的阳离子型羧甲基壳聚糖Q1和Q2）对白色念珠菌的抑菌率菌远大于90%，表明样品有较强抑菌作用。样品Y1（对应对比例1的羧甲基壳聚糖季铵盐Q3）对白色念珠菌的抑菌率菌为94.2%，表明其对白色念珠菌有较强抑菌作用。
测试例2 细胞毒性测试
实验步骤：将浓度为1×105个/mL的人肾上皮细胞（HEK293细胞），接种于96孔板，每孔加入细胞培养液100μL。随后将孔板放入37℃培养箱培养24h，之后将原细胞液小心吸出并加入100μL待测样品，待测样品分别为X1、X2、Y1、S1溶液用细胞培养液稀释得到的1.0mg/mL溶液，每个待测样品设置六个平行孔。特别地，将100μL去离子水作为阳性对照组，100μL新鲜细胞培养液作为阴性对照组。加入样品后，将细胞继续培养24h，并通过标准的噻唑蓝（MTT）显色法，将待测样品、阳性对照和阴性对照的细胞数量转化为各自在570nm处的吸光度（二者正相关）。
数据处理方法：材料的细胞存活率计算公式如下：
细胞活性率（%）=（As-Ap）/（An-Ap）*100%，
其中As、Ap、An分别为待测样品、阳性对照组和阴性对照组的吸光度。
表2 不同样品处理后细胞存活率
实验计算出的细胞存活率是相对于阴性对照组（定义为100%）的相对值，可以表征材料的细胞毒性。从表2可以看出，S1（对应实施例1的羧甲基壳聚糖原料）的存活率略高于X1、X2（对应本发明实施例1、实施例2制备的阳离子型羧甲基壳聚糖Q1和Q2），三者都高于80%，细胞毒性很低；但是Y1（对应对比例1的羧甲基壳聚糖季铵盐Q3）的存活率远低于X1、X2，不到10%，表现出强烈的细胞毒性。
当阳离子型羧甲基壳聚糖用于处理白色念珠菌感染引起的妇科问题时，通常是将阳离子型羧甲基壳聚糖制作成凝胶或洗液等剂型的产品用于女性的私处清洁护理。由于白色念珠菌感染引起的炎症往往会伴随粘膜破损等状况，因此要求所用的材料应具有低细胞毒性的特点，否则会对人体造成强烈刺激从而引发过敏和炎症等问题。表2结果表明：本发明实施例的阳离子型羧甲基壳聚糖（环氧烷基季铵盐取代度≤10%）具有低细胞毒性，可以应用于人体皮肤及粘膜；但接枝过量环氧烷基季铵盐的羧甲基壳聚糖季铵盐（对比例1得到的Q3的环氧烷基季铵盐取代度为80%）具有较大的细胞毒性，不能够用于人体破损皮肤及粘膜。
应用例1 阳离子型羧甲基壳聚糖妇科洗液的制备
妇科洗液的制备方法为：将阳离子型羧甲基壳聚糖溶于水中，向其中加入保湿剂和表面活性剂，搅拌均匀，得到阳离子型羧甲基壳聚糖妇科洗液；其中，保湿剂为甘油和海藻糖中的一种或多种，表面活性剂为椰油酰胺丙基甜菜碱和十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
例如：称取0.1g阳离子型羧甲基壳聚糖Q1溶解于92mL去离子水中，加入5g甘油，1g海藻糖，1g椰油酰胺丙基甜菜碱和0.9g十二烷基硫酸钠，搅拌混合均匀，得到阳离子型羧甲基壳聚糖妇科洗液Q4。
应用例2 阳离子型羧甲基壳聚糖妇科凝胶的制备
妇科凝胶的制备方法为：将阳离子型羧甲基壳聚糖溶于水中，向其中加入保湿剂和增稠剂，搅拌均匀，得到阳离子型羧甲基壳聚糖妇科凝胶；其中，保湿剂为甘油和海藻糖中的一种或多种，增稠剂为羟乙基纤维素、黄原胶、海藻酸钠中的一种或多种。
例如：称取0.2g实施例1制备的阳离子型羧甲基壳聚糖Q1溶解于92.8mL去离子水中，加入5g甘油，1g海藻糖，0.3g羟乙基纤维素，0.3g黄原胶，0.4g海藻酸钠，搅拌混合均匀，得到阳离子型羧甲基壳聚糖妇科凝胶Q5。
按照测试例1方法，测试阳离子型羧甲基壳聚糖妇科洗液Q4和阳离子型羧甲基壳聚糖妇科凝胶Q5对白色念珠菌的抑菌效果，抑菌率依次为99.95%、99.56%。
综上所述，本发明的阳离子型羧甲基壳聚糖对白色念珠菌有较强抑菌效果，该阳离子型羧甲基壳聚糖可以用于女性的私处清洁护理，处理白色念珠菌感染引起的妇科问题。以其为主要活性成分制备的妇科洗液或凝胶也均具有较强抑菌效果。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种阳离子型羧甲基壳聚糖在制备抑制白色念珠菌感染的妇科护理产品中的应用，其特征在于，应用于人体皮肤及粘膜，阳离子型羧甲基壳聚糖采用如下制备方法制得：
（1）将环氧氯丙烷加入N,N-二甲基正辛胺中，环氧氯丙烷与N,N-二甲基正辛胺的质量比为0.75:1-1:1，40-45℃下加热搅拌反应3-5h，得到环氧烷基季铵盐；
（2）将步骤（1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4:1-5.2:1，控制温度在40-50℃，反应72-96h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖，环氧烷基季铵盐取代度≤10%。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，阳离子型羧甲基壳聚糖的制备方法为：
（1）将环氧氯丙烷加入到N,N-二甲基正辛胺中，环氧氯丙烷与N,N-二甲基正辛胺的质量比为0.75:1，45℃下加热搅拌反应3h，得到环氧烷基季铵盐；
（2）将步骤（1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4:1，控制温度在50℃，反应72h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖，环氧烷基季铵盐取代度为7%。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为85%-99%。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，羧甲基壳聚糖在5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）反应结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）反应结束后用乙醇沉淀、洗涤、真空干燥，得到阳离子型羧甲基壳聚糖。
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