CN116891423A - 脂质化合物、组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸药物领域，具体涉及一类脂质化合物、组合物及其制备方法和应用。本发明提供的脂质化合物结构中至少含有一个烷基化的氨基甲酸酯基团，该类脂质化合物不仅结构新颖，而且作为核酸药物递送系统LNP的关键组分，由其制备的mRNA‑LNP产品在粒径分布、包封率、稳定性、生物相容性及体内转染效率等方面均具备优异的效果。

Description

脂质化合物、组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于核酸药物领域，具体涉及脂质化合物、组合物及其制备方法和应用。
背景技术
核酸药物，相比于传统的小分子化药和抗体药物，理论上不受靶点蛋白可成药性的限制。随着临床的推进和相关技术的成熟，具备更加广泛的应用场景。
核酸药物作为一种外源药物，其进入体内发挥作用需克服多重阻碍：不稳定性、免疫原性、细胞摄取效率低、内吞体逃逸难等。而高效安全的递送系统是核酸药物克服上述缺陷，靶向发挥稳定药效的重要保障。
目前脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)凭借其独特的结构和理化性质，在体内展现出较高的递送效率和较好的安全性，已成为核酸药物主流的递送系统之一，并在核酸新冠疫苗中得到了验证。
LNP系统主要包括四大组分：可电离脂质、结构脂质(如胆固醇)、辅助脂质(如DSPC)及聚合物缀合脂质(如PEG-脂质)。其中，可电离脂质是LNP递送系统中十分关键的组分，具有与带负电荷的核酸结合、有助于内涵体逃逸、增强核酸药物体内转染等特点。
现有技术已披露了多种可电离脂质化合物，如Moderna新冠疫苗mRNA-1273使用的可电离脂质SM102，BioNTech/辉瑞新冠疫苗BNT-162b2使用的可电离脂质ALC-0315。但已披露的可电离脂质从转染效率，稳定性等其他方面还需进一步提高，以达到更好的递送效果。
因此，本领域仍需要开发具有更高转染效率、更强稳定性及更好生物相容性的可电离脂质。
发明内容
针对本领域存在的上述问题，本发明的目的是提供一类结构新颖且效果优异的脂质化合物、组合物及其制备方法和应用。该类脂质化合物可作为LNP系统中的关键可电离脂质，在LNP递送核酸药物方面发挥十分关键的作用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：提供一类脂质化合物，所述脂质化合物的结构通式如式I示：
其中，a、b、c分别选自0～2的自然数，m、n分别选自3～8的整数；R1、R2分别选自C2～C20的直链或支链烷烃基，或C2～C20的直链或支链烯烃基，或C2～C20的直链或支链炔烃基；
M1、M2分别选自-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)O-、-(C＝O)S-、-S(C＝O)-、且至少一个为/> R3、R4分别选自C2～C8的直链烷烃基；
且a、b、c均为0时，R3不为C8的直链烷烃基。
在一些具体实施方案中，R1、R2分别选自C4～C18的直链或支链烷烃基，或C7～C10的直链烯烃基，或C7～C10的直链炔烃基；
在一些具体实施方案中，a、b、c分别选自0～1的自然数；
在一些具体实施方案中，a为1，b为0，c为1；
在一些具体实施方案中，a为0，b为0，c为0；
在一些具体实施方案中，a为0，b为1，c为1；
在一些具体实施方案中，a为1，b为1，c为0；
在一些具体实施方案中，R3选自C6～C8的直链烷烃基；
在一些具体实施方案中，R4选自C2～C6的直链烷烃基；
在一些具体实施方案中，所述脂质化合物为来自图1中化合物中的任意一种或几种的组合；
本发明还提供了具有式I结构的脂质化合物的制备方法，具体如下：
1)第一类，所述脂质化合物为含一个键的脂质化合物时，合成方法包括如下步骤：
第一中间体的合成：含有脂肪链的醇或胺在缩合试剂的作用下与含有脂肪链的醇或胺反应，缩合生成含有氨基甲酸酯键的脂肪链；
第二中间体的合成：第一中间体在碱作用下，与二溴代的脂肪链反应，生成含有烷基化的氨基甲酸酯键的溴代脂肪链；
第三中间体的合成：含有脂肪链的醇或羧酸或胺或硫醇或在缩合试剂作用下与溴代的脂肪链的醇或羧酸或胺或硫醇，生成含有酯键或硫酯键或氨基甲酸酯键或碳酸酯键的溴代脂肪链；
第四中间体的合成：将第三中间体与过量的含有氨基和羟基或氨基、羟基和醚键的化合物发生亲核取代反应，生成第四中间体；
所述脂质化合物的合成：第二中间体与第四中间体在碱性条件下发生亲核取代反应，生成所述脂质化合物。
2)第二类，所述脂质化合物为含两个烷基化的氨基甲酸酯键的脂质化合物时，合成方法包括如下步骤：将过量的含有烷基化的氨基甲酸酯键的溴代脂肪链与含有氨基和羟基或氨基、羟基和醚键的化合物发生亲核取代反应，生成所述脂质化合物。
3)第三类，所述脂质化合物为含一个键的脂质化合物时，合成方法包括如下步骤：
第一中间体的合成：含有脂肪链的胺在碱作用下与溴代脂肪链反应，生成含有仲胺的脂肪链；
第二中间体的合成：第一中间体在缩合试剂作用下与溴代脂肪醇反应，缩合生成含有烷基化的氨基甲酸酯键的溴代脂肪链；
所述第三类脂质化合物的合成：第二中间体与第一类脂质化合物合成中的第四关键中间体在碱性条件下发生亲核取代反应，生成所述脂质化合物。
所述“烷基化的氨基甲酸酯键”是指氨基甲酸酯键(-NH(C＝O)O-或-O(C＝O)NH-)上的氢原子被烷烃基取代后的键。
本发明还提供了一种脂质纳米粒组合物，包含前述脂质化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，和/或包含用前述制备方法制备的脂质化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。
所述“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物，包括但不限于本领域公知的对映异构体、非对映异构体、顺反异构体等。
所述“药学上可接受的盐”是指酸加成盐或碱加成盐。所有以游离碱或游离酸形式存在的本发明化合物可以根据本领域技术人员已知的方法用适当的无机或有机的碱或酸处理来转化为其药物可接受的盐。本发明化合物的盐可以通过标准技术转化为其游离碱或酸形成。
在一些具体实施方案中，所述组合物还包含结构脂质、辅助脂质及PEG-脂质。
所述结构脂质含有可以稳定组合物的两亲结构，包括但不限于甾醇及其衍生物和非甾醇及其衍生物。
在一些具体实施方案中，所述结构脂质包括但不限于胆固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇及其衍生物中的一种或多种。
在一些具体实施方案中，所述结构脂质为胆固醇、谷固醇、麦角固醇、皮质类固醇及其衍生物中的一种或多种的组合。
在一些具体实施方案中，所述结构脂质为胆固醇。
所述“辅助脂质”包括但不限于：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、带电脂质中的一种或多种的组合。
在一些具体实施方案中，磷脂酰胆碱为DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC中的一种或多种的组合。
在一些具体实施方案中，磷脂酰胆碱为DSPC。
在一些具体实施方案中，磷脂酰乙醇胺为DOPE。
所述“带电脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以带正电或带负电形式存在的任何脂质分子。
在一些具体实施方案中，带电脂质优选为DOTAP、DOTMA、18PA。
所述PEG-脂质由PEG与脂质分子通过化学键连接后形成，包括但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种的组合。
在一些具体实施方案中，所述PEG-脂质包括但不限于PEG-C-DOMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、神经酰胺-PEG2000、Chol-PEG2000、1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、4-0-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-0-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)、ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯、或2,3-二(四癸氧基)丙基-N-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在一些具体实施方案中，所述PEG-脂质为PEG-DMG。
在一些具体实施方案中，前述的脂质化合物与辅助脂质的摩尔比为0.5:1-15:1。
在一些具体实施方案中，前述的脂质化合物与结构脂质的摩尔比为0.5:1-5:1。
在一些具体实施方案中，前述的脂质化合物与PEG-脂质的摩尔比为5:1-250:1。
在一些具体实施方案中，前述的脂质化合物与PEG-脂质的摩尔比为1:1-200:1。
在一些具体实施方案中，所述组合物包含20～60％所述脂质化合物、30～60％结构脂质、3～25％辅助脂质、0.1～10％ PEG-脂质。其中％指摩尔百分比。
在一些具体实施方案中，所述组合物包含35～49％所述脂质化合物、35～50％结构脂质、5～20％辅助脂质、1～2％ PEG-脂质。％指摩尔百分比。
在一些具体实施方案中，所述组合物包含45～48％所述脂质化合物、40～43％结构脂质、9～12％辅助脂质、1～2％ PEG-脂质。％指摩尔百分比。
在一些具体实施方案中，所述组合物进一步包含核酸、结构脂质、辅助脂质及PEG-脂质。
所述“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包括但不限于单链DNA、双链DNA、短异构体、mRNA、tRNA、rRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微小非编码RNA(miRNA和siRNA)、端粒酶RNA(TelomeraseRNA Component)、小分子RNA(snRNA和scRNA)、环状RNA(circRNA)、合成miRNA(miRNA mimics、miRNA agomir、miRNA antagomir)、反义RNA、核酶(ribozyme)、不对称干扰RNA(aiRNA)、Dicer-substrate RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、向导RNA(gRNA)、小向导RNA(sgRNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉反义寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸或生物定制寡核苷酸中的一种或多种的组合。
在一些具体实施方案中，所述组合物进一步包含mRNA、结构脂质、辅助脂质及PEG-脂质。
本发明还提供了一种脂质纳米粒组合物在制备用于预防和治疗疾病药物中的应用。
所述药物的形式及种类没有限制，只要该药物在预防和治疗疾病中使用本发明提供的脂质类化合物均在本发明保护范围内。所述药物包括但不限于核酸药物、小分子化学药物、抗体蛋白药物、细胞治疗药物、基因编辑药物等。
在一些具体实施方案中，所述药物为核酸药物。
在一些具体实施方案中，所述药物为mRNA药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的脂质化合物结构新颖，至少含有一个烷基化的氨基甲酸酯基团，与现有技术中披露的可电离脂质结构差异明显。
本发明提供的脂质化合物制备方法简单、安全、商业化开发成本低。
本发明提供的脂质化合物可作为递送系统中关键组分应用到药物预防和治疗领域，其制备的mRNA-LNP产品在粒径分布、包封率、生物相容性及体内转染效率等方面均具备优异的效果。相较于已商业化且国际领先的可电离脂质ALC-0315，粒径分布更均匀，包封率更高，转染效率甚至可以提高2个数量级。
本发明提供的脂质化合物制备的相关产品具有极好的稳定性，即使长期贮存达90天，关键参数变化十分微小，商业化贮存及运输成本低。
附图说明
图1为本发明合成的各脂质化合物的结构式示意图；
图2为脂质化合物对小鼠IgG含量影响示意图。
术语、英文缩写解释说明：
DSPC：中文名称：二硬脂酰基卵磷脂；英文名称：1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；CAS号:816-94-4。
DPPC：中文名称：二棕榈酸磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-DIPALMITOYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOCHOLINE，CAS号:63-89-8。
DMPC：中文名称：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:18194-24-6。
DOPC：中文名称：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:4235-95-4。
POPC：中文名称：2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：2-Oleoyl-1-palmitoyl-snglycero-3-phosphocholine，CAS号:26853-31-6。
DOPE：中文名称：1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺；英文名称：1,2-DIOLEOYL-SNGLYCERO-3-PHOSPHOETHANOLAMINE，CAS号：4004-05-1。
DOTAP：中文名称：(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵；英文名称：1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride salt)，CAS号：132172-61-3。
DOTMA：中文名称：N,N,N-三甲基-2,3-双(十八碳-9-烯-1-基氧基)丙-1-铵氯化物，CAS号:1325214-86-5。
18PA：中文名称：二油酰磷脂酸，CAS号：108392-02-5。
PEG：中文名称：聚乙二醇；英文名称：Polyethylene glycol。
PEG-C-DOMG：2-二-0-烷基-sn3-氨甲酰基甘油酯，合成方法见PCT专利：PCT/US08/88676。
PEG-DLPE：聚乙二醇-1,2-二月桂酰磷脂酰乙醇胺。
PEG-DMPE：聚乙二醇-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺。
PEG-DPPC：聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱。
PEG-DSPE：聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
Chol-PEG2000：胆固醇-聚乙二醇2000。
PDI：中文名称：多分散指数；英文名称：polydispersity index。
DCM：二氯甲烷，CAS号：75-09-2。
CDI：N,N'-羰基二咪唑，CAS号：530-62-1。
DMAP：4-二甲氨基吡啶，CAS号：1122-58-3。
DCC：N,N'-二环己基碳二亚胺，CAS号：538-75-0。
DIEA：N,N-二异丙基乙胺，CAS号：7087-68-5。
EtOH：乙醇，CAS号：64-17-5。
DMSO：二甲基亚砜，CAS号：67-68-5。
EA：乙酸乙酯，CAS号：141-78-6。
Et3N：三乙胺，CAS号：121-44-8。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所使用的原料均为市售来源。
实施例一：部分脂质化合物的合成及核磁共振数据展示
1、合成化合物M01～M31，以合成化合物M13为例。反应方程式如下：
具体步骤包括：将M103-S01(1-丁醇,2.00g,27.0mmol)溶于DCM(50mL)，加入Et3N(5.3mL)、CDI(4.38g,27.0mmol),于50℃反应1h。加入M103-S02(3.84g,29.7mmol),于50℃反应16h。冷至室温，依次用5％柠檬酸(27mL×2)、饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(Heptane:EA＝10:1)纯化得产物5.71g(M103-I01)，收率：92.2％。
将M103-I01(5.50g,24.0mmol)溶于DMF(120mL)，冰浴下加入NaH(1.44g,36.0mmol),反应1.0h。加入M103-S03(8.78g,36.0mmol),缓慢升至室温，反应4.5h。冰浴下向反应液中滴加饱和氯化铵溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯(900mL),用半饱和食盐水(80mL×6)与饱和食盐水洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(Heptane:EA＝200:1,100:1,50:1)纯化得产物6.33g(M103-I02)，无色液体，收率：67.3％。
将M101-S01(3.62g，20.0mmol),M101-S02(5.12g，20.0mmol)和DMAP(0.85g，7.0mmol)溶于DCM(60mL)，降温至0℃加入DCC(4.32g,21.0mmol)，升至室温搅拌过夜。反应液过滤，浓缩，经柱分离纯化(硅胶柱，洗脱液为PE：EA＝50：1)得产物8.0g(M101-I01)，收率：89％。
将M101-I01(2.48g,5.9mmol),M101-S11(5.26g,59.0mmol)和EtOH(5.0mL)加入厚壁耐压瓶中，加热至90℃反应过夜。反应液浓缩，倒入200mL乙酸乙酯/水(1：1)萃取，取有机相水洗一次，饱和食盐水洗两次。有机相浓缩得到产物2.52g(M101-I04),收率：100％。
将M103-I02(412.9mg,1.2mmol)溶于DMF(1.0mL)，加入DIEA(272.0mg,2.1mmol)、M101-I04(300.0mg,701.4μmol),于50℃反应18h。冷至室温，加入乙酸乙酯(40mL),用半饱和食盐水(5mL×3)与饱和食盐水依次洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM:EtOH＝100:1,50:1，v/v，顺次通过两个不同体积比的层析柱)纯化，得产物212.6mg(脂质化合物M13)，收率：41.0％。
采用上述方法，替换对应的起始原料，可制备得到化合物M01～M12，M14～M31。例如：替换M101-S11为2-(2-氨基乙氧基)乙醇，可以制备得到M14；替换M101-S01为8-溴辛酸、M101-S02为2-己基癸醇，可以制备得到M15。
2、合成化合物M32、M47。以合成M32为例，反应方程式如下：
具体步骤包括：将M103-I02(770.4mg,2.0mmol)溶于DMF(1.0mL)，加入DIEA(304.5mg,2.4mmol)，M101-S11(70.0mg,785.3μmol),于50℃反应22h。冷至室温，加入乙酸乙酯(40mL),用半饱和食盐水(5mL×3)与饱和食盐水依次洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM：EtOH＝100:1,50:1，v/v，顺次通过两个不同体积比的层析柱)纯化，得产物162.4mg(脂质化合物M32)，收率：29.0％。
采用上述方法，替换起始原料M103-I02为M47所涉及的烷基化氨基甲酸酯键的脂肪链，可制备得到化合物M47。
3、合成化合物M33～M46、M48～M49，以合成化合物M36为例，反应方程式如下：
具体反应步骤包括：将M103-S02(3.35g,25.9mmol)溶于DMSO(20mL)，加入K2CO3(3.58g,25.9mmol)，M103-S07(5.00g,25.9mmol),于80℃反应36h。冷至室温，加入乙酸乙酯(200mL),依次用半饱和食盐水(20mL×5)，饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM:EtOH＝100:1～40:1，v/v)纯化得产物4.43g(M103-I11)，收率：70.9％。其中，“DCM:EtOH＝100:1～40:1”指以10为一个梯度，顺次通过该范围内不同体积比的混合液分别进行层析，后文类似描述为相同含义，不再赘述。
将三光气(Triphosgene)(202.8mg,683.3μmol)溶于DCM(4mL)，冰盐浴下，滴加DMAP(758.9mg,6.2mmol)的DCM(2mL)溶液,反应30min。滴加M103-S08(404.0mg,2.1mmol),反应30min。滴加M103-I11(500.0mg,2.1mmol),缓慢升至室温反应1.5h。于反应液中加入水(6mL),用二氯甲烷(6mL×3)洗涤水相，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(Heptane:EA＝100:1，v/v)纯化得产物762.1mg(M103-I12)，收率：79.6％。
将M103-S08和M103-I11的加料顺序对调，其它条件不变，纯化后得到产物62.1mg(M103-I12)，收率仅为6.5％。另外，采用合成M103-I12收率较高(收率：79.6％)的方法，其过程中会产生M103-I12-IMP01的杂质，该杂质会参与后续反应，并且反应后生成的杂质与目标产物的IF值一样，很难用常规方法分离纯化。反应方程式如下：
然而，采用氯甲酸对硝基苯酯替换三光气，仍然存在投料顺序不同、中间产物收率不同的问题。鉴于使用氯甲酸对硝基苯酯具备更高的产物收率和纯度，因此后续均采用氯甲酸对硝基苯酯制备相应的化合物，具体反应步骤如下：
将氯甲酸对硝基苯酯(417.4mg,2.1mmol)溶于DCM(4mL)，冰盐浴下，滴加DMAP(404.0mg,2.1mmol)的DCM(2mL)溶液,反应30min。滴加M103-S08(404.0mg,2.1mmol),反应30min。滴加M103-I11(500.0mg,2.1mmol),缓慢升至室温反应1.5h。于反应液中加入水(6mL),用二氯甲烷(6mL×3)洗涤水相，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(Heptane:EA＝100:1)纯化得产物930.9mg(M103-I12)，收率：97.2％。将M103-S08和M103-I11的加料顺序交换，其它条件不变，纯化得到的产物为42.3mg(M103-I12)，收率仅4.4％。
将M103-I12(486.7mg,1.1mmol)溶于DMF(1.0mL)，加入DIEA(272.0mg,2.1mmol)，M101-I04(300.0mg,701.4μmol),于50℃反应24h。冷至室温，加入乙酸乙酯(40mL),用半饱和食盐水(5mL×3)与饱和食盐水依次洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经柱层析(DCM:EtOH＝100:1,50:1)纯化得产物180.1mg(脂质化合物M36)，收率：31.7％，纯度＞99％。
采用上述方法，替换对应的起始原料，如替换M103-S08为6-溴己醇，可以制备得到M35，同理，替换对应的起始原料，可制备得到化合物M33～M46、M48。
4、本发明制备的示例性化合物的核磁共振氢谱数据如表1所示。
表1示例性化合物的核磁共振氢谱数据对照表
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实施例二：mRNA-LNP的制备与筛选
1、将实施例一制备的各脂质化合物(Lipid)、DSPC、胆固醇、PEG-脂质(PEG-DMG)按表2所示的摩尔关系分别溶于乙醇中，配制成不同的脂质乙醇溶液(Lipid的浓度20mg/mL)。
表2各组中组分对照表
组别 脂质化合物 DSPC 胆固醇 PEG-脂质
组1 46.5 9.5 42.5 1.5
组2 50 3.0 46.5 0.5
组3 29.6 5.9 58.5 6.0
组4 24.4 24.4 48.8 2.4
按脂质纳米粒(LNP)与mRNA质量比为10:1到30:1准备mRNA(本实施例使用的比例为15:1)，使用柠檬酸盐或醋酸钠缓冲液(pH＝3或5)将mRNA稀释至0.2mg/mL，获得mRNA溶液。
将所述脂质乙醇溶液与mRNA溶液以体积比为1:5到1:1的比例充分混匀(本实施例使用的比例为1:3)。所获脂质纳米粒通过超滤和透析的手段纯化，过滤除菌后，使用Malvern Zetasizer Nano ZS表征mRNA-LNP(包载mRNA的脂质纳米粒)的平均粒径和PDI，再使用Ribogreen RNA定量测定试剂盒测定mRNA的包封率。结果如表3所示。
表3各组mRNA-LNP效果展示
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结果显示：使用组1配方时形成的纳米粒PDI及包封率最好，因此选择组1配方制备其余脂质化合物的mRNA-LNP，并测试平均粒径、PDI和包封率，并在其余条件相同的情况下，使用市售ALC-0315、对比样品M0(M0来自发明人团队在先专利CN202211461172.X)、对比样品X1、对比样品X2分别替换脂质化合物，测试平均粒径、PDI和包封率。ALC-0315、M0的结构式如表4所示。测试结果如表5所示。
表4对照样品的结构式
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表5各组mRNA-LNP效果展示
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2、低温保存稳定性。将表5制备的M13置于4℃下干燥环境中保存，取不同时间点(0天、6天、10天、15天、30天、45天、60天、90天)，分别测试脂质纳米粒的平均平均粒径、PDI、mRNA的包封率，测定结果如表6所示。
表6低温保存不同时间下的效果对比
保存时间(天) 平均粒径(nm) PDI 包封率(％)
0 86.3 0.100 97.5
6 85.9 0.098 97.3
10 86.1 0.097 97.3
15 86.5 0.103 97.1
30 86.8 0.098 97.0
45 86.4 0.106 96.8
60 86.9 0.107 96.2
90 87.2 0.109 96.1
实施例三：mRNA-LNP转染效率及生物相容性效果展示
1、转染效率展示。选择6～8周龄的雄性ICR小鼠，各小鼠间体重、体型差异不显著，饲养在22±2℃以及相对湿度为45～75％的实验条件下，光照/黑暗周期为12h。使用编码荧光素酶的mRNA(luciferase mRNA)作为报道基因。荧光素酶催化荧光素产生生物荧光，通过检测单位时间内生物荧光强度，反映LNP的转染效率。以荧光素酶mRNA为例，准备实施例二获得的各mRNA-LNP样品(按组1配方制备)、市售对比样品ALC0315和对比样品M0、X1、X2；将各样品分别以100μg/kg mRNA的剂量，通过肌肉注射给药，每组样品设置两只小鼠重复，注射两条腿。注射样品6小时后，于小鼠腹腔注射荧光素(20μg/mL)，5分钟后，将小鼠置于小动物活体成像仪测定荧光强度，结果以平均荧光强度表示，结果如表7所示。表7中E代表科学计数法10的次方，例如：“1.35E+06”表示1.35×106。
表7转染效率对照表
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2、生物相容性。使用CCK-8试剂盒测定细胞活力。将处于指数增长期的Hep3B细胞悬浮液(100μL，细胞密度为2×104个/mL)加入96孔板中，于细胞培养箱中孵育24h。然后除去细胞培养液，并添加100μL含mRNA 20μg/mL的实施例二获得的各mRNA-LNP样品(按组1配方制备)的新制细胞培养液，和细胞共孵育4h。随后，除去细胞上清液，加入新鲜细胞培养液，继续孵育20h。除去上清液，加入含CCK-8工作溶液(10μL/mL)的新鲜的细胞培养液100μL，孵育2h。同时设置空白组：使用等量CCK-8工作溶液替代mRNA-LNP，其余条件完全相同。使用多功能微孔板检测仪检测每孔于450nm处的吸光度(检测过程中孔板中不能出现气泡)，将未加任何处理的细胞(对照组)活力设为100％。各组细胞活力计算公式如下：细胞活力(％)＝[A1-A0]/[A2-A0]×100。其中，A1为加药组吸光度，A0为空白组吸光度，A2为对照组吸光度。实验结果如表8所示。
表8细胞活力效果对照表
mRNA-LNP样品 细胞活力(％) mRNA-LNP样品 细胞活力(％)
ALC0315 94％ M16 98％
X1 95％ M19 96％
X2 94％ M32 96％
M01 96％ M33 95％
M02 98％ M34 98％
M03 97％ M35 95％
M04 95％ M36 96％
M05 98％ M37 95％
M06 96％ M38 98％
M07 97％ M39 95％
M13 95％ M40 96％
M14 95％ M41 95％
M15 97％ 空白对照组 100％
3、免疫效果动物试验。选择20只六周龄雌性Balb/c小鼠，体重15～20g，各小鼠间体重、体型差异不显著，饲养于温度22±2℃，相对湿度45～75％的实验环境中，光照/黑暗周期为12h。小鼠购入后先于动物房内适应一周后方可进行正式的动物试验。将20只小鼠随机分成4组，第一组后腿肌肉注射等体积PBS(阴性对照组)，第二组后腿肌肉注射ALC-0315、10μg的mRNA和PBS的混合物(阳性对照组)，第三组后腿肌肉注射样品M0、10μg的mRNA、PBS的混合物(对照组)，第四组后腿肌肉注射样品M13、10μg的mRNA、PBS的混合物(试验组)；以上mRNA为基于自主设计的模板通过体外转录合成的可表达Spike全长的mRNA。
在第0和14天，按以上四组将包载mRNA的LNP混合物肌肉注射到Balb/c小鼠体内。在第13和21天进行眼部取血，将血样放在37℃孵育1小时后，3500rpm离心15分钟，取上清分析。通过自制ELISA试剂盒检测一免和二免小鼠血清对Delta变异株S1蛋白特异性抗体滴度，具体操作如下：将Spike S1重组蛋白加入96孔板，每孔加0.25μg，4℃放置过夜。第二天，弃去孔内液体，使用5％ BSA的PBST溶液(200μL)在37℃条件下封闭1h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200μL洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。将小鼠血清用PBS稀释(稀释比例1：20000,v/v)，标准品用PBS稀释为一系列浓度(母液为1μg/μL，对半稀释，共14个标曲)。将稀释后的样品和标准品100μL加入空孔中，37℃孵育2h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200μL洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。加入Goat anti-mouse IgG HRP(PBS 1:5000稀释,v/v)，每孔100μL，37℃，1h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200μL洗涤3遍,每遍3min，甩板晾干。将TMB底物A液和B液等比例混合，每孔100μL，置37℃避光放置3mins。在650nm测吸光度，最高吸光度值在1.5附近时，即可加100μL终止液。加入终止液后15min内检测450nm处的吸光度值。根据标准曲线公式计算各组IgG含量，结果如图2所示。
结果显示：阳性对照组和试验组三组均可产生针对S1蛋白特异性抗体，并且试验组的抗体滴度显著高于阳性对照组，试验组可高效递送mRNA进入细胞，表达抗原，进而激起体内免疫反应，产生相应抗体，发挥保护功能。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一类脂质化合物，其特征在于：所述脂质化合物的结构通式下所示：
其中，a、b、c分别选自0～2的自然数，m、n分别选自3～8的整数；R1、R2分别选自C2～C20的直链或支链烷烃基，或C2～C20的直链或支链烯烃基，或C2～C20的直链或支链炔烃基；
M1、M2分别选自-(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-NH(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、
-O(C＝O)O-、-(C＝O)S-、-S(C＝O)-、且至少一个为/> R3、R4分别选自C2～C8的直链烷烃基；
且a、b、c均为0时，R3不为C8的直链烷烃基。
2.根据权利要求1所述脂质化合物，其特征在于：R1、R2分别选自C4～C18的直链或支链烷烃基，或C7～C10的直链烯烃基，或C7～C10的直链炔烃基。
3.根据权利要求1所述脂质化合物，其特征在于：R3选自C6～C8的直链烷烃基；R4选自C2～C6的直链烷烃基。
4.根据权利要求1所述脂质化合物，其特征在于：所述脂质化合物为如下化合物中的任意一种或几种的组合：
5.权利要求1-4任意一项所述脂质化合物的制备方法，其特征在于：
1)所述脂质化合物为含一个键的脂质化合物时，合成方法包括如下步骤：
第一中间体的合成：含有脂肪链的胺在碱作用下与溴代脂肪链反应，生成含有仲胺的脂肪链，获得第一中间体；
第二中间体的合成：第一中间体在缩合试剂作用下与溴代脂肪醇反应，缩合生成含有烷基化的氨基甲酸酯键的溴代脂肪链，获得第二中间体；
所述脂质化合物的合成：第二中间体与第一类脂质化合物合成中的第四关键中间体在碱性条件下发生亲核取代反应，生成所述脂质化合物；
2)所述脂质化合物为含一个键的脂质化合物时，合成方法包括如下步骤：
第一中间体的合成：含有脂肪链的醇或胺在缩合试剂的作用下与含有脂肪链的醇或胺反应，缩合生成含有氨基甲酸酯键的脂肪链，获得第一中间体；
第二中间体的合成：第一中间体在碱作用下，与二溴代的脂肪链反应，生成含有烷基化的氨基甲酸酯键的溴代脂肪链，获得第二中间体；
第三中间体的合成：含有脂肪链的醇或羧酸或胺或硫醇或在缩合试剂作用下与溴代的脂肪链的醇或羧酸或胺或硫醇，生成含有酯键或硫酯键或氨基甲酸酯键或碳酸酯键的溴代脂肪链，获得第三中间体；
第四中间体的合成：将第三中间体与过量的含有氨基和羟基或氨基、羟基和醚键的化合物发生亲核取代反应，获得第四中间体；
所述脂质化合物的合成：第二中间体与第四中间体在碱性条件下发生亲核取代反应，生成所述脂质化合物；
3)所述脂质化合物为含两个烷基化的氨基甲酸酯键的脂质化合物时，合成方法包括如下步骤：将过量的含有烷基化的氨基甲酸酯键的溴代脂肪链与含有氨基和羟基或氨基、羟基和醚键的化合物发生亲核取代反应，生成所述脂质化合物。
6.一种脂质纳米粒组合物，其特征在于：包含权利要求1-4任意一项所述脂质化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，和/或包含权利要求5制备的任意脂质化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述脂质纳米粒组合物，其特征在于：所述脂质纳米粒组合物包括结构脂质、辅助脂质及PEG-脂质。
8.根据权利要求7所述脂质纳米粒组合物，其特征在于：按摩尔百分比，所述脂质纳米粒组合物包含20～60％所述脂质化合物、30～60％结构脂质、3～25％辅助脂质、0.1～10％PEG-脂质。
9.根据权利要求7所述脂质纳米粒组合物，其特征在于：所述结构脂质为胆固醇，和/或，所述辅助脂质为DSPC，和/或，所述PEG-脂质为PEG-DMG。
10.权利要求6-9任意一项所述脂质纳米粒组合物在制备用于预防和/或治疗疾病药物中的应用。
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