CN116879458A - 采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法及其应用 - Google Patents

采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析检测技术领域，特别涉及一种采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法及其应用。本发明的方法，包括以下步骤：取硫酸阿扎那韦加入有机溶剂制成供试品溶液；将样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用紫外检测器作为检测器，按照不加校正因子的主成分外标法测得有关物质含量，完成硫酸阿扎那韦中有关物质的测定。本发明应用高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦中有关物质，在拟定色谱条件下，各杂质峰均分离完全，在限度范围内浓度与峰面积线性关系良好(R＝0.999)，平均回收率均在85.0％～115.0％。该分析方法操作简便，专属性好，准确度高，稳定可靠，适用于硫酸阿扎那韦的有关物质的测定。

Description

采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方 法及其应用
技术领域
本发明涉及药品检验检测技术领域，特别涉及一种采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法及其应用。
背景技术
硫酸阿扎那韦为(3S,8S,9S,12S)-3,12-双-(1,1-二甲基乙基)-8-羟基-4,11-二氧代-9-(苯甲基)-6-[[4-(2-吡啶基)苯基]甲基]-2,5,6,10,13-五氮杂十四烷二酸二甲酯硫酸盐(1：1)，是一种氮杂肽类蛋白酶抑制药，其化学结构式如下式所示。美国施贵宝公司研发了硫酸阿扎那韦制剂，于2003年获美国食品药品管理局(FDA)批准上市，商品名REYATAZ。在HIV感染细胞内，通过阻断裂解病毒gag和gag-pol基因编码的病毒前体蛋白发挥强效抗HIV活性。可用于与其他抗逆转录病毒药物联合用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染。
硫酸阿扎那韦的化学结构如下式所示：
硫酸阿扎那韦是具有高选择性的HIV-1蛋白酶抑制剂(Ki<1nmol/L)。根据相关生产工艺和稳定性资料，硫酸阿扎那韦中可能存在5种杂质，来自于起始物料，中间体和降解产物，结构分别如下：
经检索，目前国内已有文献报道硫酸阿扎那韦胶囊剂的含量测定，以及顶空气相色谱法同时测定原料药中多种低沸点有机溶剂残留量，但是未检索到硫酸阿扎那韦的有关物质检查方法，故开发了一种操作方便、定量准确、专属性强及灵敏度高的硫酸阿扎那韦的有关物质测定方法并对其进行了方法学验证，该检测方法可用于硫酸阿扎那韦中有关物质的检测，对硫酸阿扎那韦的质量控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的空白，提供采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法；
所述的有关物质为以下5种杂质的一种或几种：单酰基阿扎那韦胺、(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体、BOC单酰基阿扎那韦-1、BOC单酰基阿扎那韦-2和单酰基阿扎那韦二聚体；
所述的方法，包括以下步骤：取硫酸阿扎那韦加入有机溶剂制成供试品溶液；将样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用紫外检测器作为检测器，按照不加校正因子的主成分外标法测得有关物质含量，完成硫酸阿扎那韦中有关物质的测定；
色谱条件如下：
色谱柱：采用表面多孔颗粒技术的硅胶为填料的色谱柱；色谱柱优选默克公司Express系列C8柱；
流动相：流动相A为酸性水溶液，流动相B为有机溶剂，流动相A的体积百分比与流动相B的体积百分比的和始终保持为100％，进行梯度洗脱。
所述梯度洗脱条件如下；
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.01 73 27
10 60 40
30 50 50
45 30 70
50 30 70
52 73 27
60 73 27
进一步地，所述作为流动相A的酸性水溶液中包含的酸为三氟乙酸、磷酸或高氯酸，酸性水溶液的pH值为1.0～5.0。其中包含的酸优选为磷酸。酸性水溶液的pH值优选为2.0～4.0，更优选3.5。
进一步地，所述作为流动相B的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃中的一种或者两种以上混合物。优选为甲醇或乙腈，最优选为乙腈。
进一步地，所述流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min。优选为1.0ml/min。
进一步地，所述色谱柱的温度为25℃～35℃。优选为30℃。
进一步地，所述方法还包括检测波长，所述检测波长为240nm～260nm。优选为250nm。
进一步地，所述方法还包括进样量，所述进样量为10μl～50μl。优选为20μl。
进一步地，所述方法中，各溶液的配制方法如下：
供试品溶液：取硫酸阿扎那韦样品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，用体积百分比为10％的乙腈溶液溶解并稀释，制成每1mL含阿扎那韦0.5～1.5mg的样品溶液。
对照品溶液：取阿扎那韦对照品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，并用体积百分比为10％的乙腈溶液定量稀释，制成每1ml中含阿扎那韦0.5～1.5μg的溶液。
系统适用性溶液：取阿扎那韦对照品适量，加乙腈超声使溶解，并用体积百分比为10％的乙腈溶液稀释，制成每1ml中约含阿扎那韦1mg的溶液。
进一步地，在本发明的一个优选实施方式中，
所述高效液相色谱的色谱条件如下：
色谱条件：采用Express C8(150mm×4.6mm，2.7μm)色谱柱；
流动相A：pH3.5磷酸盐缓冲液；
流动相B：乙腈；
检测波长：250nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。
在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述的采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法在控制硫酸阿扎那韦质量中的应用，将所述方法用于分离及测定硫酸阿扎那韦中有关物质。有关物质为以下5种杂质的一种或几种：单酰基阿扎那韦胺、(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体、BOC单酰基阿扎那韦-1、BOC单酰基阿扎那韦-2和单酰基阿扎那韦二聚体。
本发明的方法具有如下技术效果：
1)本发明的采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法，能够准确测定硫酸阿扎那韦中可能存在的5种杂质：单酰基阿扎那韦胺、(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体、BOC单酰基阿扎那韦-1、BOC单酰基阿扎那韦-2和单酰基阿扎那韦二聚体。在本发明色谱条件下，各杂质峰均分离完全，在限度范围内浓度与峰面积线性关系良好(R＝0.999)，平均回收率均在85.0％～115.0％。该分析方法操作简便，专属性好，准确度高，稳定可靠，适用于硫酸阿扎那韦的有关物质的测定。
2)通过本发明的方法，在质量标准拟定限度范围内适用于硫酸阿扎那韦中有关物质的测定，保证了硫酸阿扎那韦的质量可控。质量标准拟定限度为：单酰基阿扎那韦胺不得过0.15％，(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体不得过0.15％，BOC单酰基阿扎那韦-1不得过0.15％，BOC单酰基阿扎那韦-2不得过0.15％，单酰基阿扎那韦二聚体不得过0.15％，其他单个杂质不得过0.10％，杂质总量不得过0.5％。
附图说明
图1是加标样品溶液色谱图；其中：1为单酰基阿扎那韦胺峰；2为(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体峰；3为主成分阿扎那韦峰；4为BOC单酰基阿扎那韦-1峰；5为BOC单酰基阿扎那韦-2峰；6为单酰基阿扎那韦二聚体峰。
图2是空白溶剂色谱图；
图3是未降解样品色谱图；
图4是酸降解样品色谱图；
图5是碱降解样品色谱图；
图6是氧化降解样品色谱图；
图7是高温降解样品色谱图；
图8是光照降解样品色谱图；
图9是高湿降解样品色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明中涉及的设备和试剂说明如下：
仪器：沃特世2695高效液相色谱仪；AG 28型梅特勒托利多分析天平；德国WTWinoLab 730pH计。
试剂：
硫酸阿扎那韦原料药(批号:YS(957)03、1708103541、1708103544、1708103714，阿拉宾度药业有限公司)；
阿扎那韦对照品(批号:YS(957)18，含量：99.3％，阿拉宾度药业有限公司)；
单酰基阿扎那韦胺(批号:KRR(1274)98，含量：96.44％，阿拉宾度药业有限公司)；
(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体(批号:KRR(1274)74，含量：99.36％，阿拉宾度药业有限公司)；
BOC单酰基阿扎那韦-1和BOC单酰基阿扎那韦-2(批号:KRR(1274)101，含量：99.18％，阿拉宾度药业有限公司)；
单酰基阿扎那韦二聚体(批号:KRR(1370)184，含量：95.19％，阿拉宾度药业有限公司)；
乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、磷酸(～88％)、盐酸(～35％)、氢氧化钠为分析纯，过氧化氢(～30％)为试剂级，水为自制Milli-Q级。
本发明中涉及的检测试剂，对照品溶液、空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液配制方法如下：
对照品溶液：取阿扎那韦对照品适量，精密称定，加乙腈适量并超声使溶解，用体积百分比为10％的乙腈溶液溶解并稀释，制成每1ml中约含阿扎那韦1.5μg的样品溶液。
空白溶液：取乙腈10ml置于50ml洁净干燥的容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。
系统适用性溶液：取阿扎那韦对照品适量，加乙腈超声使溶解，并用体积百分比为10％的乙腈溶液稀释，制成每1ml中约含阿扎那韦1mg的溶液。
供试品溶液：取硫酸阿扎那韦样品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，用体积百分比为10％的乙腈溶液溶解并稀释，制成每1ml含阿扎那韦1mg的溶液。
实施例1
本发明的采用反相高效液相色谱法测定硫酸阿扎那韦的有关物质的方法，包括以下步骤：将样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用紫外检测器作为检测器，完成硫酸阿扎那韦中有关物质的测定。
色谱条件如下：采用Express C8(150mm×4.6mm，2.7μm)色谱柱；流动相A：pH3.5磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钾2.72g，溶于1000ml水中，用稀磷酸(取磷酸10.0ml溶于50ml水中)调节溶液pH值至3.5±0.05]；流动相B：乙腈；流动相A的体积百分比与流动相B的体积百分比的和始终保持为100％，按下表进行梯度洗脱；检测波长：250nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。
梯度洗脱条件如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.01 73 27
10 60 40
30 50 50
45 30 70
50 30 70
52 73 27
60 73 27
将样品溶液按上述实验条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，按照不加校正因子的主成分外标法测得有关物质含量，各有关物质相对保留时间和控制限度如下：
实施例2专属性试验
制备所有杂质溶液并单独进样，制备硫酸阿扎那韦原料药溶液(对照样品)和加入限度水平所有已知杂质的硫酸阿扎那韦原料药溶液(加标样品)，根据研究方法注入HPLC。通过Waters Empower软件确定峰纯度。结果为对照品溶液获得的保留时间为19.303min。供试品溶液中主峰保留时间为19.381min。对照品和供试品获得的阿扎那韦保留时间一致。对照样品和加标样品中阿扎那韦的峰纯度数据显示，该峰是均一的，没有共洗脱峰，表明该方法具有专属性。分别称取样品约50mg，按下列方式处理：①加入5ml的1mol﹒L-1盐酸溶液，85℃加热120min，再加入5ml的1mol﹒L-1氢氧化钠溶液，稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为酸降解样品。②分别加入5ml 0.025mol﹒L-1氢氧化钠溶液，85℃加热15min，再加入5mL 0.025mol﹒L-1盐酸溶液，稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为碱降解样品。③加稀释剂适量振摇使溶解，再加入30％双氧水5ml，85℃加热120min，加稀释剂至刻度，摇匀，作为氧化降解样品。④将样品平铺于称量瓶中，105℃烘箱中放置120h，取出放冷，用稀释剂冲洗样品至50ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为高温降解样品。⑤将样品平铺于称量瓶中，置于KNO3饱和溶液的干燥器(相对湿度92.5％，25℃)中120h，取出置50ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为高湿降解样品。⑥将样品平铺于培养皿中，置荧光灯和紫外灯下，照射120h，满足光照试验的总照度不低于1.2×106Lux·hr、近紫外能量不低于200w·hr/m2，取出置50ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为光照降解样品。上述研究结果见表6～表8，相应的色谱图见图1～图9。
研究结果显示，阿扎那韦纯度满足降解不超过10％。其中，强制降解研究中使用的硫酸阿扎那韦未降解样品仅含0.02％单酰基阿扎那韦二聚体，酸降解、碱降解和氧化降解样品溶液发生了降解，产生了未知的降解杂质，各杂质均能与特定的已知杂质分离。在酸降解和氧化降解样品溶液产生了微量的单酰基阿扎那韦胺杂质，其余已知杂质在其他各降解条件均未产生，上述研究结果表明，硫酸阿扎那韦在碱水解、酸水解以及氧化降解条件下容易发生降解，在其他降解条件下稳定，其单酰基阿扎那韦胺可能为潜在降解物，该检测方法具有良好的专属性。
表6各杂质的保留时间及峰纯度汇总表
表7阿扎那韦峰纯度研究结果
表8强制降解研究结果汇总表
实施例3精密度试验
系统精密度：根据试验方法制备对照品溶液并且6次重复注入HPLC。阿扎那韦峰面积的RSD小于5.0％。试验结果如表9所示，表明试验方法精密度良好。
方法精密度：使用加入限度水平已知杂质的同一批次硫酸阿扎那韦原料药，分别制备6份样品溶液。按试验方法分别注入HPLC。各有关物质峰面积的RSD均小于10.0％。结果如表9所示。
中间精密度：由另一个分析员使用不同色谱柱、不同系统在不同日期按照试验方法，使用加入限度水平的已知杂质的单批次硫酸阿扎那韦原料药(用于方法精密度)单独制备6份样品溶液，并按照试验方法将各溶液注入HPLC。各有关物质峰面积的RSD均小于10.0％。如表9所示。
试验结果表明该检测方法对于不同分析人员、不同系统、不同色谱柱和不同日期的条件下重现性好。
表9精密度试验结果
实施例4线性和范围
使用阿扎那韦对照品和硫酸阿扎那韦有关物质制备一系列浓度为限度水平的1％至150％的溶液，按照试验方法的有关物质项色谱条件，精密量取20μl，将各溶液6次注入高效液相色谱仪。从这些数据中确定包括原料药在内所有杂质的定量限后，按照上述步骤进行线性回归计算，线性可从定量限至限度水平的150％推导出，阿扎那韦和各杂质的相关系数均大于0.990，各有关物质的校正因子均在0.8～1.2之间。结果如表10所示。因此，阿扎那韦和各杂质的响应值从定量限至限度水平的150％的范围线性良好。可以从线性和准确度数据获得分析方法的范围。按限度的％报告范围。从线性和准确度实验可以得出结论，测定硫酸阿扎那韦原料药中有关物质的分析方法的范围为定量限至限度水平的150％。
表10阿扎那韦线性试验结果
实施例5检测限和定量限
根据1％-150％限度水平的线性研究中获得的各分析物的斜率值、标准偏差和响应值来确定阿扎那韦及其有关物质的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。通过制备含有预测浓度的所有已知杂质的阿扎那韦溶液来验证各预测浓度的精密度，将各溶液6次注入高效液相色谱仪。由表11结果可见，定量限和检测限的相对标准偏差(以下简称RSD)分别小于10.0％和33.0％，说明该色谱法灵敏度较高。
表11有关物质的检测限与定量限
实施例6准确度试验
按照试验方法，使用加入定量限、限度水平的50％、100％和150％的已知杂质的硫酸阿扎那韦原料药制备供试品溶液，各一式三份，并将各溶液注入HPLC。结果表明，回收率均在85.0％～115.0％，如表12所示。该试验方法对于从定量限至限度水平的150％的硫酸阿扎那韦原料药中有关物质的测定准确度良好。如表12所示：
表12准确度试验结果
实施例7供试品溶液稳定性试验
按照试验方法，通过加入限度水平的已知杂质来制备样品溶液，并在将溶液保持在室温(25～30℃)下于0h和不同时间间隔进行分析。0h和不同时间间隔所得结果的差值均小于10.0％。如表13所示，所有已知杂质的峰面积无显著变化。因此，在室温下(～25℃)，样品溶液至少能稳定24h。如表13所示：
表13供试品溶液稳定性试验结果
实施例8耐用性试验
按照试验方法制备系统适用性溶液和加入限度水平的已知杂质的样品溶液，并在不同变化条件下注入HPLC，以评估系统适用性。改变的条件包括研究方法值中的流速±10％、检测波长±5nm、流动相中有机物±2％绝对值、柱温±5℃、缓冲液的pH值±0.2单位。结果显示：阿扎那韦峰的USP塔板数均大于20000。阿扎那韦峰的USP拖尾因子小于1.5，以上不同条件下获得的加有已知杂质的硫酸阿扎那韦原料药色谱图可以看出，各变量条件下获得的RRT与正常条件下获得的RRT未发生变化。如表14、表15所示，结果表明在上述不同条件下此检测方法具有耐用性。
表14耐用性试验结果
表15耐用性试验结果
/>
实施例9系统适用性试验
取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果对照品溶液重复进样6针阿扎那韦峰面积RSD＝1.0％(n＝6)；阿扎那韦峰的USP理论塔板数为69987，USP拖尾因子为0.8，符合系统适用性要求。系统适用性试验结果如表16所示：
表16系统适用性试验结果
实施例10样品测定
按上述方法制备有关物质供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液和空白溶液，按规定色谱条件对三批硫酸阿扎那韦原料药进行测定。系统适用性溶液色谱图中，USP塔板数按阿扎那韦峰计算不得低于20000，且阿扎那韦峰的USP拖尾因子不得过1.5，其他单个和杂质总量均符合要求。样品有关物质检测结果如表17所示：
表17样品有关物质测定结果
/>
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种采用反相高效液相色谱法分离测定硫酸阿扎那韦中有关物质的方法，其特征在于，
所述的有关物质为以下5种杂质中的一种或几种：单酰基阿扎那韦胺、(SRSS)-阿扎那韦非对映异构体、BOC单酰基阿扎那韦-1、BOC单酰基阿扎那韦-2和单酰基阿扎那韦二聚体；
所述的方法，包括以下步骤：取硫酸阿扎那韦加入有机溶剂制成供试品溶液；将样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用紫外检测器作为检测器，按照不加校正因子的主成分外标法测得有关物质含量，完成硫酸阿扎那韦中有关物质的测定；
色谱条件如下：
色谱柱：采用表面多孔颗粒技术的硅胶为填料的色谱柱；
流动相：流动相A为酸性水溶液，流动相B为有机溶剂，流动相A的体积百分比与流动相B的体积百分比的和始终保持为100％，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱条件如下：
时间，分钟 流动相A，％ 流动相B，％ 0.01 73 27 10 60 40 30 50 50 45 30 70 50 30 70 52 73 27 60 73 27
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性水溶液中包含的酸为三氟乙酸、磷酸或高氯酸，酸性水溶液的pH值为1.0～5.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃中的一种或者两种以上混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的温度为25℃～35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为240nm～260nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进样量为10μl～50μl。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，各溶液的配制方法如下：
供试品溶液：取硫酸阿扎那韦样品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，用体积百分比为10％的乙腈溶液溶解并稀释，制成每1mL含阿扎那韦0.5～1.5mg的样品溶液；
对照品溶液：取阿扎那韦对照品适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，并用体积百分比为10％的乙腈溶液定量稀释，制成每1ml中含阿扎那韦0.5～1.5μg的溶液；
系统适用性溶液：取阿扎那韦对照品适量，加乙腈超声使溶解，并用体积百分比为10％的乙腈溶液稀释，制成每1ml中约含阿扎那韦1mg的溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱条件如下：
色谱条件：采用Express C8的150mm×4.6mm，2.7μm色谱柱；
流动相A：pH3.5磷酸盐缓冲液；
流动相B：乙腈；
检测波长：250nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。
10.如权利要求1-9任一项所述的采用高效液相色谱法分离测定硫酸阿扎那韦中有关物质的方法在控制硫酸阿扎那韦质量中的应用，其特征在于，所述方法用于分离及测定硫酸阿扎那韦中有关物质。
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