CN116874510A - 一种带活性氨基的含硫化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种带活性氨基的含硫化合物及其制备方法和应用。该化合物的结构式如下。该化合物可作为硫化氢供体，其在释放递送H2S的同时可以生成荧光团以实时监测体外和体内H2S释放的过程，可以原位和实时监测复杂生物系统中的H2S释放，从而可视化和量化释放的H2S，以发挥其生物活性，并且降低毒性。

Description

一种带活性氨基的含硫化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药领域，特别是涉及一种带活性氨基的自报告型硫化氢供体化合物及其制备方法和应用。
背景技术
H2S主要通过开放ATP敏感钾通道(KATP)调节神经系统和心血管系统的功能。此外，H2S还可以通过多种细胞内信号通路(如MAPK、NF-κB等)发挥生物学效应。已发现的H2S生物学效应有：舒张平滑肌、血管新生、神经递质传递、调节细胞凋亡、抑制血小板凝结、促进肾脏的水钠排泄等。H2S既可以单独发挥作用，也可以与另外两个气体递质(NO或CO)协同作用，从而在生物体中调节各种生理或病理过程。研究表明，H2S广泛的生物活性具有剂量依赖性，一定水平浓度的H2S具有抗炎、抗氧化、神经调节、血管调节、肺部保护、肾脏保护、胃部保护和心脏保护等作用。
传统的输送H2S的方法是直接吸入，后来含硫无机盐类化合物、含硫天然产物和有机小分子发展为常用的硫化氢供体。研究发现，无机硫化物如硫化钠(Na2S)和硫氢化钠(NaHS)对大量疾病具有治疗潜力，并显示出抗炎和促炎作用；天然有机含硫化合物已被证实存在于多种植物中，结构类型主要涉及有机多硫化合物及异硫氰酸酯类化合物；有机小分子硫化氢供体在体内外实验中能缓慢释放出H2S并发挥其生物活性。
但是，现有的输送H2S的方法或者硫化氢供体存在以下缺点：
1.直接吸入H2S难以准确调节浓度，过量的H2S会导致毒性。
2.广泛使用的无机盐类硫化物水解会快速释放H2S，面临精确定量难题，在体内实验时因短时间大量释放出H2S会造成毒性反应。
3.最常见的天然H2S供体如大蒜提取物二烯丙基三硫醚(DATS)和二烯丙基二硫醚(DADS)通常会产生一些与H2S释放无关的副产物，释放能力也不稳定。
4.一般的有机小分子硫化氢供体缺乏对体内生物标志物的特异性或反应性，不能够对H2S的释放动力学和分布曲线进行体内量化。
发明内容
基于此，本发明提供了一种带活性氨基的含硫化合物，该化合物可作为硫化氢供体，其在释放递送H2S的同时可以生成荧光团以实时监测体外和体内H2S释放的过程，可以原位和实时监测复杂生物系统中的H2S释放，从而可视化和量化释放的H2S，以发挥其生物活性，并且降低毒性。
本发明的带活性氨基的含硫化合物的结构式如下：
本发明还提供了一种带活性氨基的含硫化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠在溶剂中反应，得到化合物1；
S2：在酸的作用下，化合物1和三苯基膦在溶剂中反应，将反应液用碱中和，得到化合物2；
S3：化合物2和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺在溶剂中反应，得到化合物3；
S4：在碱的作用下，化合物3和硫源在溶剂中反应，得到化合物4；
S5：在碱的作用下，化合物4和4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯在溶剂中反应，得到化合物5；
S6：将化合物5中的叔丁氧羰基保护基脱除，得到化合物HSDF-NH2，即所述带活性氨基的含硫化合物；
其反应式如下：
在其中一些实施例中，步骤S1中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：1～1.5。
在其中一些实施例中，步骤S1中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：1.1～1.2。
在其中一些实施例中，步骤S1中所述溶剂为体积比为1：20-25的水和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
在其中一些实施例中，步骤S1中所述反应的温度为90℃-110℃，反应的时间10分钟-20分钟。
在其中一些实施例中，步骤S2中化合物1、三苯基膦和酸的摩尔比为1：0.6-1.0：1-1.5。
在其中一些实施例中，步骤S2中化合物1、三苯基膦和酸的摩尔比为1：0.8-0.9：1.2-1.3。
在其中一些实施例中，步骤S2中所述酸为盐酸。
在其中一些实施例中，步骤S2中所述溶剂为体积比为1：4-6的水和四氢呋喃的混合溶剂。
在其中一些实施例中，所述酸在所述水中的浓度为0.4mol/L-0.6mol/L。
在其中一些实施例中，步骤S2中所述碱为氢氧化钠。
在其中一些实施例中，步骤S2中所述反应的温度为15℃-40℃，反应的时间20分钟-40分钟。
在其中一些实施例中，步骤S3中所述化合物2和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺的摩尔比为1：1-3。
在其中一些实施例中，步骤S3中所述化合物2和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺的摩尔比为1：1.5-2.5。
在其中一些实施例中，步骤S3中所述化合物2和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺的摩尔比为1：1.8-2.2。
在其中一些实施例中，步骤S3中所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在其中一些实施例中，步骤S3中所述反应的温度为90℃-110℃，反应的时间6小时-24小时。
在其中一些实施例中，步骤S3中所述反应的温度为95℃-105℃，反应的时间10小时-14小时。
在其中一些实施例中，步骤S4中所述化合物3、硫源和碱的摩尔比为1：1.5-2.5：1.5-2.5。
在其中一些实施例中，步骤S4中所述化合物3、硫源和碱的摩尔比为1：1.8-2.2：1.8-2.2。
在其中一些实施例中，步骤S4中所述碱为碳酸氢钠。
在其中一些实施例中，步骤S4中所述硫源为硫光气或者1,1'-硫代羰基二咪唑(TCDI)。
在其中一些实施例中，步骤S4中所述溶剂选自二氯甲烷、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种。
在其中一些实施例中，步骤S4中所述反应的温度为0℃-35℃，反应的时间10小时-20小时。
在其中一些实施例中，步骤S5中所述化合物4、4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和碱的摩尔比为1：1-4：1-4。
在其中一些实施例中，步骤S5中所述化合物4、4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和碱的摩尔比为1：2-3：2-3。
在其中一些实施例中，步骤S5中所述碱为氢化钠。
在其中一些实施例中，步骤S5中所述溶剂为四氢呋喃。
在其中一些实施例中，步骤S5中所述反应的温度为0℃-35℃，反应的时间12小时-28小时。
在其中一些实施例中，步骤S6中所述将化合物5中的叔丁氧羰基保护基脱除的方法包括：化合物5与脱Boc试剂在溶剂中反应，用碱中和，即得；所述脱Boc试剂为三氟乙酸和/或草酰氯。
在其中一些实施例中，步骤S6中所述碱为碳酸氢钠。
在其中一些实施例中，步骤S6中所述溶剂为二氯甲烷和/或甲醇。
在其中一些实施例中，步骤S6中所述脱Boc试剂为草酰氯，所述溶剂为甲醇。
在其中一些实施例中，步骤S6中所述反应的温度为15℃-40℃，反应的时间20分钟-40分钟。
本发明还提供了上述的化合物HSDF-NH2的应用，包括如下技术方案。
化合物HSDF-NH2在制备硫化氢供体药物中的应用。
化合物HSDF-NH2在制备抗炎药物中的应用。
化合物HSDF-NH2在制备用于治疗心肌梗塞的药物中的应用。
本发明的一种带活性氨基的化合物及其制备方法和应用具有以下优点和有益效果：
本发明通过将苯硼酸频哪醇酯与4-氨基-N-(4-氨基丁基)-1,8-萘酰亚胺通过硫代氨基甲酸酯连接而构建得到了一种带活性氨基的含硫化合物，该化合物可作为硫化氢供体以递送H2S，其在递送H2S的同时可以生成荧光团，可以作为荧光探针以实时监测体外和体内H2S释放的过程。该化合物中的4-氨基-N-(4-氨基丁基)-1,8-萘酰亚胺的荧光被硫代氨基甲酸酯的吸电子基团淬灭了，从而导致化合物HSDF-NH2本身没有荧光；在H2O2等ROS条件下，HSDF-NH2中的硼酸酯基团很容易被氧化裂解，然后通过自焚释放荧光团，并在碳酸酐酶的催化下从COS生成H2S，从而使没有荧光的HSDF-NH2转变为有荧光的HSDG-NH2，通过荧光变化可以原位和实时监测复杂生物系统中的H2S释放，从而可视化和量化释放的H2S，以更好的发挥H2S的生物活性，提高其生物安全性。
并且，本发明的化合物HSDF-NH2中带有活性氨基基团，增强了药物的水溶性，其成药性更好，并且有利于新型药物制剂的制备。
本发明化合物的合成方法具有原料简单易得，合成步骤短，工艺简单，收率高等优点。
附图说明
图1为HSDF-NH2对过氧化氢的荧光响应图。
图2为H2O2诱导的HSDF-NH2转化的HPLC图。
图3为HSDF-NH2释放和监测H2S的机制图。
图4为HSDF-NH2在不同物质存在下的荧光响应图。
图5为HSDF-NH2对缺氧/复氧损伤模型的H9c2心肌细胞活力的影响。
图6为HSDF-NH2对氧糖剥夺/复氧模型的大鼠海马细胞活力的影响。
图7为HSDF-NH2对氧糖剥夺/复氧模型的大鼠神经元细胞在造模后LDH释放的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下为具体实施例。
实施例1硫化氢供体(HSDF-NH2)的制备
本实施例提供了硫化氢供体(HSDF-NH2)的制备方法，其合成路线如下：
S1、将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(6.5g,23.45mmol)加入至35毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌30分钟直至溶解。将叠氮化钠(1.75g,26.9mmol)溶解在1.5毫升的水中并添加到反应体系中。将混合物加热至100℃反应15分钟，反应完全后冷却至室温，加水析出沉淀，收集沉淀并用水和乙醇洗涤沉淀物3次，通过柱层析纯化得到化合物1(4.48g，80％)。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.70–8.52(m,3H),7.86–7.77(m,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ160.47,159.93,145.20,134.37,133.94,131.37,130.33,127.32,124.51,118.81,115.12,114.60.
S2、将化合物1(4g,23.45mmol)悬浮在300毫升四氢呋喃和60毫升0.5M盐酸水溶液的混合物中，然后在搅拌下向悬浮液中缓慢加入三苯基膦(5.25g,20mmol)。室温搅拌30分钟后，将混合物用20毫升的2M氢氧化钠水溶液中和并除去溶剂。将所得混合物用乙酸乙酯稀释并过滤，得到粗固体产物。通过柱层析纯化，得到化合物2(3.5g,70％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.36(d,J＝7.2Hz,1H),8.12(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(s,2H),7.62(t,J＝7.9Hz,1H),6.82(d,J＝8.5Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ162.42,160.73,154.33,136.25,133.37,132.94,131.09,124.72,119.70,118.58,109.16,102.63.
S3、将化合物2(639.57mg,3mmol)溶解在15毫升的N,N-二甲基甲酰胺中。然后加入N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺(1.148ml,6mmol)，将反应体系在100℃搅拌12小时。反应完全后将溶液冷却至室温并倒入冰冷的水中。过滤沉淀，用水和乙醚洗涤，通过柱层析纯化得到化合物3(689.7mg,60％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.60(d,J＝8.4Hz,1H),8.41(d,J＝7.2Hz,1H),8.18(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.42(s,2H),6.84(d,J＝8.4Hz,1H),6.77(t,J＝5.8Hz,1H),3.99(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(q,J＝6.6Hz,2H),1.58(p,J＝7.3Hz,2H),1.41(q,J＝7.3Hz,2H),1.35(s,9H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.24,163.37,156.03,153.14,134.38,131.42,130.14,129.72,124.40,122.24,119.83,108.62,108.03,77.79,28.71,27.70,25.78.
S4、在冰水浴条件下，向化合物3(714.63mg,1.865mmol)和碳酸氢钠(315mg,3.75mmol)的二氯甲烷(25毫升)溶液中滴加硫光气的二氯甲烷溶液(284μl，3.725mmol硫光气溶解于25毫升二氯甲烷)，0℃反应30分钟后将反应混合物在室温下搅拌16小时。除去溶剂后，通过柱层析得到化合物4(450mg,57％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.64(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.45(dd,J＝8.4,1.1Hz,1H),7.85(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.63(d,J＝7.9Hz,1H),4.67(s,1H),4.18(t,J＝7.4Hz,2H),3.20(q,J＝6.7Hz,2H),1.77(q,J＝9.5,8.6Hz,2H),1.62(p,J＝7.0Hz,2H),1.44(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ163.63,163.12,155.93,133.96,132.17,131.26,128.88(d,J＝8.1Hz),127.90,127.48,124.44,123.11,121.02,40.05,28.42,27.59,25.41.
S5、将氢化钠(40mg,1mmol)加入10毫升的超干四氢呋喃中，在0℃下将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯(234.14mg，1mmol)加入该溶剂中。然后，逐滴添加化合物4(212.57mg，0.5mmol)的四氢呋喃(10毫升)溶液。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌24小时，反应完全后通过加入盐水使反应猝灭，并用乙酸乙酯萃取反应物。通过柱层析纯化得到化合物5(82.41mg，25％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.29(s,1H),8.54(dd,J＝20.2,7.6Hz,2H),8.30(d,J＝8.5Hz,1H),7.91(s,1H),7.74(dd,J＝24.6,7.8Hz,3H),7.38–7.26(m,2H),5.61(s,2H),4.71(s,1H),4.14(t,J＝7.4Hz,2H),3.16(q,J＝6.8Hz,2H),1.73(p,J＝7.5Hz,2H),1.58(q,J＝7.3Hz,2H),1.41(s,9H),1.35(s,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ189.47,163.95,163.45,137.66,135.04,131.58,131.39,128.90,128.31,127.47,127.18,122.99,120.65,83.97,73.48,39.91,28.41,27.52,25.39,24.87.
S6、将化合物5(65.928mg，0.1mmol)溶解在2毫升的二氯甲烷中，然后逐滴加入1毫升的三氟乙酸，室温搅拌30分钟。反应完全后减压去除溶剂，用二氯甲烷稀释反应体系。滴加饱和碳酸氢钠水溶液调节pH值到7～8，用二氯甲烷萃取后经过柱层析纯化得到HSDF-NH2(11mg,20％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(dd,J＝10.0,7.5Hz,2H),8.38(dd,J＝8.5,1.1Hz,1H),7.93–7.87(m,2H),7.68(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(d,J＝7.5Hz,2H),5.58(s,2H),4.14(s,2H),4.08(t,J＝6.7Hz,2H),2.82(t,J＝7.4Hz,2H),1.71(p,J＝6.7Hz,2H),1.61(q,J＝8.4,7.6Hz,2H),1.29(s,12H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ163.94,163.47,158.43(q,J＝31.4Hz),139.49,134.99,131.56,131.32,130.35,128.76,127.71,127.49,122.84,120.62,118.63,116.65,114.66,84.19,73.99,71.79,49.05,39.09,25.41,25.13(d,J＝3.5Hz).
实施例2硫化氢供体中间体(化合物3)的制备
溶剂、反应温度和时间、原料摩尔比如下表1所示，其他原料及其用量以及反应过程同实施例1中的步骤S3，所制备得到的化合物3的产率如表1所示。
表1
实施例3硫化氢供体中间体(化合物4)的制备
反应物和溶剂如下表2所示，其他原料及其用量以及反应过程同实施例1中的步骤S4，所制备得到的化合物4的产率如表2所示。
表2
条目 反应物 溶剂 化合物4的产率
1 硫光气 二氯甲烷 57％
2 硫光气 丙酮 45％
3 硫光气 四氢呋喃 35％
4 TCDI 四氢呋喃 43％
实施例4硫化氢供体中间体(化合物5)的制备
原料配比如下表3所示，其他原料及其用量以及反应过程同实施例1中的步骤S5，所制备得到的化合物5的产率如表3所示。
表3
实施例5 HSDG-NH2的制备
脱Boc试剂和溶剂如下表4所示，其他原料及其用量以及反应过程同实施例1中的步骤S6，所制备得到的HSDG-NH2的产率如表4所示。
表4
条目 脱Boc试剂 溶剂 HSDG-NH2的产率
1 三氟乙酸 二氯甲烷 20％
2 草酰氯 甲醇 35％
实施例6 HSDG-NH2的制备
将化合物3(191.56mg,0.5mmol)溶解在2毫升的二氯甲烷中，然后逐滴加入1毫升的三氟乙酸，室温搅拌30分钟。反应完全后减压去除溶剂，用二氯甲烷稀释反应体系。滴加饱和碳酸氢钠水溶液调节pH值到7～8，用二氯甲烷萃取后经过柱层析纯化得到HSDG-NH2(70.8mg，50％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.64(d,J＝8.4Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.18(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.51(s,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),4.04(t,J＝6.7Hz,2H),3.48(s,3H),2.82(t,J＝7.4Hz,2H),1.67(dt,J＝13.6,6.7Hz,2H),1.58(p,J＝7.2,6.1Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.36,163.45,159.11,158.80,153.36,134.47,131.51,129.92,124.39,119.07,108.65,49.02,25.33,25.16.
实施例7HSDF-NH2对过氧化氢的荧光响应
实验方法和步骤：制备3mL HSDF-NH2(10μM)溶液，然后加入碳酸酐酶(CA，25μg/mL)和H2O2(最终浓度为100μM)，然后在荧光光谱仪上在37℃下进行测试。具体而言，用二甲亚砜(DMSO)溶解HSDF-NH2，配制浓度为10mM的储备溶液待用。用PBS 7.4缓冲盐溶液配置浓度为1mg/ml的碳酸酐酶储备液，用PBS 7.4缓冲盐溶液稀释H2O2溶液十倍待用。在烧瓶中形成样品终浓度为10μM，H2O2终浓度为100μM，碳酸酐酶终浓度为25μg/mL的溶液，每孵育一段时间后，用激发波长为434nm的光源激发测定HSDF-NH2在H2O2存在下荧光强度随时间的变化。
实验过程中，取样利用HPLC方法来确认HSDG-NH2的产生。使用配备C18柱(SuperLu,5μm,250mm×4.6mm)的cds 2.x HPLC系统。流动相包含乙腈和醋酸铵缓冲液(8:2，v/v，25mM，pH 6.0)。流速为1mL/min，洗脱液在254nm处检测。
实验结果如图1所示：10μM的HSDF-NH2在480至700nm(λex＝434nm)范围内没有明显的荧光发射。然而，在H2O2和碳酸酐酶存在下，546nm处的新峰荧光强度伴随时间的延长而增加，对应于HSDG-NH2的形成(如图2所示)。该结果清楚地表明，H2O2触发了基于硼酸盐的硫代氨基甲酸盐从HSDF-NH2分子中选择性裂解以形成HSDG-NH2，从而产生发射光谱(λem＝546nm)。
由本实验结果可以得知，本发明的HSDF-NH2硫化氢供体在递送H2S的同时可以生成荧光团，可以作为荧光探针，以实时监测体外和体内H2S释放的过程。该荧光探针释放和监测H2S的机制图如图3所示：本发明的HSDF-NH2是通过将苯硼酸频哪醇酯与4-氨基-N-(4-氨基丁基)-1,8-萘酰亚胺通过硫代氨基甲酸酯连接而构建的，其中的4-氨基-N-(4-氨基丁基)-1,8-萘酰亚胺的荧光被硫代氨基甲酸酯的吸电子基团淬灭了，从而导致HSDF-NH2本身没有荧光；在H2O2等ROS条件下，HSDF-NH2中的硼酸酯基团很容易被氧化裂解，然后通过自焚释放荧光团，并在碳酸酐酶的催化下从COS生成H2S。也就是说，HSDF-NH2可以消耗ROS释放硫化羰(COS)，COS会被无处不在的碳酸酐酶(CA)水解为H2S，从而使没有荧光的HSDF-NH2转变为有荧光的HSDG-NH2，从而伴有荧光变化，通过荧光变化可以原位和实时监测复杂生物系统中的H2S释放，从而可视化和量化释放的H2S。
实施例8HSDF-NH2在不同物质存在下的荧光响应
实验方法和步骤：10μM HSDF-NH2溶液在10mL DMSO-PBS溶液(1:9，v/v，10mM pH＝7.40)和适当浓度的各ROS和生物学物质中进行相关测试。在37℃下与各种ROS孵育后记录光谱。
各ROS和生物学物质的浓度分别如下：
过氧化氢(100μM)：商用过氧化氢溶液，用去离子水稀释。
次氯酸钠(100μM)：商用次氯酸钠标准溶液，用去离子水稀释。
TBHP(100μM)：商用叔丁基氢过氧化物，用去离子水稀释。
羟基自由基(100μM)：依据Fenton反应，亚铁离子和过氧化氢水溶液可以发生反应，产生羟基自由基。所以配置硫酸亚铁水溶液(50mM)加入过氧化氢水溶液(500mM)可以制得羟基自由基溶液(50mM)，再用去离子水稀释。
单线态氧(100μM)：次氯酸水溶液(50mM)加入过氧化氢水溶液(100mM)，可以制得单线态氧溶液(50mM)，再用去离子水稀释。
过氧亚硝酸盐(100μM)：过氧化氢溶液(0.7M，1.5ml)和亚硝酸钠溶液(0.6M，3ml)用盐酸(0.6M，1.5ml)酸化，在1～2秒内加入NaOH溶液(1.5M，3ml)，以使溶液呈碱性。将所得溶液分成小等分试样，并保存在-80℃。在使用前立即解冻等分试样，将制备好的过氧亚硝酸盐储备溶液取一定量加入到0.1M NaOH中，并通过测量溶液在302nm处的吸光度来确定过氧亚硝酸根的浓度。过氧亚硝酸盐溶液在0.1M NaOH中的消光系数在302nm下为1670M-1cm-1。
氯化钙(30μM)：商用氯化钙，用去离子水溶剂。
氯化镁(30μM)：商用氯化镁，用去离子水溶剂。
氯化亚铁(30μM)：商用氯化亚铁，用去离子水溶剂。
硫酸锌(30μM)：商用硫酸锌，用去离子水溶剂。
三氯化铁(30μM)：商用三氯化铁，用去离子水溶剂。
氯化铜(30μM)：商用氯化铜，用去离子水溶剂。
葡萄糖(1.5mM)：商用葡萄糖，用去离子水溶剂。
精氨酸(1.5mM)：商用精氨酸，用去离子水溶剂。
丝氨酸(1.5mM)：商用丝氨酸，用去离子水溶剂。
实验结果如图4所示：结果表明，其他物质的存在并没有显着增加荧光强度，表明HSDF-NH2在复杂的生物环境中具有较高的选择性。活性氧(ROS)，特别是过氧化氢(H2O2)是影响缺血再灌注损伤发生和发展的重要物质，在生理过程中起着至关重要的作用。具有较高选择性的活性氧响应性的本发明化合物可以实现精准治疗，减少副作用，提高药物完全性。
实施例9HSDF-NH2对细胞的保护作用
(一)HSDF-NH2对缺氧/复氧损伤模型的H9c2心肌细胞的保护作用
使用以下程序建立H9c2心肌细胞的MIRI模型：用非葡萄糖DMEM培养基来模拟缺血，在37℃的厌氧手套箱中孵育6小时后，将细胞返回常规培养箱中，在含有高糖的新鲜培养基中孵育4小时，以模拟再灌注。使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒评估HSDF-NH2对H9c2心肌细胞凋亡的影响。将MIRI模型细胞接种在六孔板中(每孔1×105个细胞)，在用或不用HSDF-NH2或普萘洛尔处理24小时后，在结合缓冲液中用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素在室温下染色15分钟。随后，用PI标记细胞，并使用流式细胞仪评估凋亡细胞。
实验结果如图5所示：HSDF-NH2对缺氧/复氧损伤模型的H9c2心肌细胞具有保护作用，且保护作用与剂量呈现正相关。在细胞环境中HSDF-NH2被ROS激活从而释放H2S以抗凋亡，提供细胞保护免受氧化应激。HSDF-NH2在2μM的浓度条件下对缺氧/复氧损伤模型的H9c2心肌细胞的保护作用与阳性对照普萘洛尔相当。
(二)HSDF-NH2对神经元细胞的保护作用
使用以下程序建立大鼠海马细胞氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R)：将原代培养的海马神经元细胞在培养皿中正常培养(37℃，5％CO2)6天，第七天用不含葡萄糖的预热的厄尔平衡盐溶液代替培养基，然后将细胞在含有95％N2和5％CO2的培养箱中在37℃下培养2小时作为OGD，用O2分析仪检测。培养2小时后，用含HSDF-NH2的正常培养基将培养物放回正常氧培养箱中培养另外24小时作为复氧期。之后用MTT法测定细胞活力，并通过乳酸脱氢酶(LDH)的检测来评价神经元损伤情况。
实验结果如图6和图7所示：在大鼠海马细胞氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R)中，在加入不同剂量的HSDF-NH2后，MTT测试和LDH释放实验均显示HSDF-NH2对神经元细胞具有保护作用，且保护作用与剂量呈现正相关。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种化合物，其结构式如下：
2.一种权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠在溶剂中反应，得到化合物1；
S2：在酸的作用下，化合物1和三苯基膦在溶剂中反应，将反应液用碱中和，得到化合物2；
S3：化合物2和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺在溶剂中反应，得到化合物3；
S4：在碱的作用下，化合物3和硫源在溶剂中反应，得到化合物4；
S5：在碱的作用下，化合物4和4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯在溶剂中反应，得到化合物5；
S6：将化合物5中的叔丁氧羰基保护基脱除，得到化合物HSDF-NH2，即所述硫化氢供体化合物；
其反应式如下：
3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：1～1.5；和/或，
步骤S1中所述溶剂为体积比为1：20-25的水和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；和/或，
步骤S1中所述反应的温度为90℃-110℃，反应的时间10分钟-20分钟。
4.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中化合物1、三苯基膦和酸的摩尔比为1：0.6-1.0：1-1.5；和/或，
步骤S2中所述酸为盐酸；和/或，
步骤S2中所述溶剂为体积比为1：4-6的水和四氢呋喃的混合溶剂；和/或，
步骤S2中所述碱为氢氧化钠；和/或，
步骤S2中所述反应的温度为15℃-40℃，反应的时间20分钟-40分钟。
5.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述化合物2和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺的摩尔比为1：1-3；和/或，
步骤S3中所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；和/或，
步骤S3中所述反应的温度为90℃-110℃，反应的时间6小时-24小时。
6.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述化合物3、硫源和碱的摩尔比为1：1.5-2.5：1.5-2.5；和/或，
步骤S4中所述碱为碳酸氢钠；和/或，
步骤S4中所述硫源为硫光气或者1,1'-硫代羰基二咪唑；和/或，
步骤S4中所述溶剂选自二氯甲烷、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种；和/或，
步骤S4中所述反应的温度为0℃-35℃，反应的时间10小时-20小时。
7.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述化合物4、4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和碱的摩尔比为1：1-4：1-4；和/或，
步骤S5中所述碱为氢化钠；和/或，
步骤S5中所述溶剂为四氢呋喃；和/或，
步骤S5中所述反应的温度为0℃-35℃，反应的时间12小时-28小时；和/或，
步骤S6中所述将化合物5中的叔丁氧羰基保护基脱除的方法包括：化合物5与脱Boc试剂在溶剂中反应，用碱中和，即得；所述脱Boc试剂为三氟乙酸和/或草酰氯。
8.根据权利要求7所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述化合物4、4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和碱的摩尔比为1：2-3：2-3；和/或，
步骤S6中所述碱为碳酸氢钠；和/或，
步骤S6中所述溶剂为二氯甲烷和/或甲醇；和/或，
步骤S6中所述反应的温度为15℃-40℃，反应的时间20分钟-40分钟；
优选地，步骤S6中所述脱Boc试剂为草酰氯，溶剂为甲醇。
9.权利要求1所述的化合物在制备硫化氢供体药物或者抗炎药物或者用于治疗心肌梗塞的药物中的应用。
10.一种硫化氢供体的中间体化合物，其特征在于，其结构式如下：
或者/>
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