CN116874428A - 一种具有抗多发性骨髓瘤作用的pnpo抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有抗多发性骨髓瘤作用的pnpo抑制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有抗多发性骨髓瘤作用的PNPO抑制剂及其制备方法和应用，具体涉及式(I)化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、药学上可接受的盐或前药。PNPO小分子抑制剂可以有效抑制PNPO在MM细胞内及分泌的外泌体中的表达，进一步通过影响相关信号通路刺激而抑制MM细胞的增殖和破骨分化，从而发挥抗多发性骨髓瘤的作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类新型的PNPO抑制剂以及它的制备方法和在防治多发性骨髓瘤疾病中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种血液系统恶性肿瘤，其特征在于骨髓中克隆浆细胞的扩增，始于意义不明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathyof undetermined significance，MGUS)到明显的浆细胞白血病和髓外骨髓瘤[KazandjianD:Multiple myeloma epidemiology and survival:A unique malignancy.Semin Oncol2016,43:676-681.]。MM通常引起终末器官损伤，包括贫血、肾功能损害、溶骨性病变[MehdiSH,Nafees S,Mehdi SJ,Morris CA,Mashouri L,Yoon D:Animal Models of MultipleMyeloma Bone Disease.Front Genet 2021,12:640954.]和高钙血症[Mehdi SH,NafeesS,Mehdi SJ,Morris CA,Mashouri L,Yoon D:Animal Models of Multiple Myeloma BoneDisease.Front Genet 2021,12:640954.]。自1990年以来，全球发病率增加了126％[JCowan A,Allen C,Barac A,Basaleem H,Bensenor I,Curado MP,Foreman K,Gupta R,Harvey J,Hosgood HD,et al:Global Burden of Multiple Myeloma:A SystematicAnalysis for the Global Burden of Disease Study 2016.Jama Oncol 2018,4:1221-1227.]，并且，近年MM在中国发病率有逐年增高趋势[Liu J,Liu W,Mi L,Zeng X,Cai C,MaJ,Wang L:Incidence and mortality of multiple myeloma in China,2006-2016:ananalysis of the Global Burden of Disease Study 2016.J Hematol Oncol2019,12:136.]。治疗MM的药物发展从传统的化疗类和激素类药物发展到引入蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米、伊沙唑米和卡非佐米)、免疫调节剂(如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)、针对骨髓瘤细胞表面抗原的单克隆抗体(如达拉单抗、依洛珠单抗和伊萨妥昔单抗)[Frampton JE:Isatuximab:A Review of Its Use in Multiple Myeloma.Target Oncol 2021,16:675-686.]和自体造血干细胞移植[Frampton JE:Isatuximab:A Review of Its Use inMultiple Myeloma.Target Oncol2021,16:675-686.]。在过去2年中，已经批准了几类新的疗法，包括核输出抑制剂(selinexor)、肽偶联烷基化物(美法仑氟芬酰胺)和抗体药物偶联物(belantamab mafodotin-blmf)[Richardson PG,Oriol A,Larocca A,BladéJ,Cavo M,Rodriguez-Otero P,Leleu X,Nadeem O,Hiemenz JW,Hassoun H,et al:Melflufen andDexamethasone in Heavily Pretreated Relapsed and Refractory MultipleMyeloma.J Clin Oncol 2021,39:757-767.Trudel S,Lendvai N,Popat R,Voorhees PM,Reeves B,Libby EN,Richardson PG,Anderson LJ,Sutherland HJ,Yong K,et al:Targeting B-cell maturation antigen with GSK2857916antibody-drug conjugate inrelapsed or refractory multiple myeloma(BMA117159):a dose escalation andexpansion pHase 1trial.Lancet Oncol 2018,19:1641-1653.Lonial S,Lee HC,BadrosA,Trudel S,Nooka AK,Chari A,Abdallah AO,Callander N,Lendvai N,Sborov D,et al:Belantamab mafodotin for relapsed or refractory multiple myeloma(DREAMM-2):atwo-arm,randomised,open-label,pHase 2study.Lancet Oncol 2020,21:207-221.Ramasamy K,Gay F,Weisel K,Zweegman S,Mateos MV,Richardson P:Improvingoutcomes for patients with relapsed multiple myeloma:Challenges andconsiderations of current and emerging treatment options.Blood Rev 2021,49:100808.]。十二碳烯vicleucel(ide-cel)是一种针对B细胞成熟抗原(BCMA)的新型嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法，最近已获得美国FDA批准用于复发和难治性多发性骨髓瘤(RRMM)[Anderson LJ:Idecabtagene vicleucel(ide-cel)CAR T-cell therapy for relapsedand refractory multiple myeloma.Future Oncol 2022,18:277-289.George LL,Deshpande SR,Cortese MJ,Kendall EK,Chattaraj A,Shah Z,Zhao J,Anwer F:EmergingTargets and Cellular Therapy for Relapsed Refractory Multiple Myeloma:ASystematic Review.Clin LympHoma Myeloma Leuk 2021,21:741-751.]。我国MM患者可选择的药物相对较少，主要集中在小分子化疗药物和糖皮质激素类药物，以及少数免疫调节药物和蛋白酶体抑制剂。靶向药物仅有普乐沙福于2018年在中国上市。尽管在过去十年中，增加了几种用于治疗多发性骨髓瘤(MM)的新药物，并且结果有所改善，但依然存在耐药及复发的问题，而且MM复发后表现出更强的侵袭性，严重影响新药的疗效，目前仍不可治愈[Anderson LJ:Idecabtagene vicleucel(ide-cel)CAR T-cell therapy for relapsedand refractory multiple myeloma.Future Oncol 2022,18:277-289.George LL,Deshpande SR,Cortese MJ,Kendall EK,Chattaraj A,Shah Z,Zhao J,Anwer F:EmergingTargets and Cellular Therapy for Relapsed Refractory Multiple Myeloma:ASystematic Review.Clin LympHoma Myeloma Leuk 2021,21:741-751.]。因此研究并开发更多有效且安全的药物，对于MM的临床治疗意义重大。
发明内容
本发明研究发现吡哆醇5'-磷酸氧化酶(PNPO)在多发性骨髓瘤细胞内及分泌的外泌体中高度表达，促进MM细胞增殖并通过外泌体影响骨髓微环境促进破骨分化。PNPO小分子抑制剂可以有效抑制PNPO在MM细胞内及分泌的外泌体中的表达，进一步通过影响相关信号通路刺激而抑制MM细胞的增殖和破骨分化。
本发明首次发现PNPO可作为多发性骨髓瘤(MM)治疗药物研发的新靶点，通过多种作用途径开辟MM靶向治疗的新机制与新方法。
因此，本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种治疗MM的全新靶点，亦即提供一种具有抗多发性骨髓瘤作用的PNPO抑制剂。
本发明所要解决的另一技术问题是，提供所述PNPO抑制剂的制备方法，使其易于操作。
本发明所要解决的再一技术问题是，提供所述PNPO抑制剂的用途，即在抗多发性骨髓瘤药物制备中的应用。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种PNPO抑制剂，所述抑制剂为如式(I)所示的化合物：
或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、药学上可接受的盐或前药，其中：
R1表示苯环上的单取代基或多取代基，R1选自取代或未取代的碳原子数为1～6的烷基、取代或未取代的碳原子数为1～6的烷氧基、三氟甲基、卤素、硝基、氰基、羟基、羧基、酯基、氨基、四氮唑、磺酰氨基和与苯环稠合得到的芳环或杂环的任意一种或多种；
R2选自C1-C4的烷基、酯基、羟基、氨基、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-NH2，n＝1～2、含有1～2个氮原子的五元芳香杂环；
Ar选自羧基取代的苯基、呋喃基或噻吩基等芳环或芳杂环的一种。
优选的，所述化合物选自下表1化合物：
表1具体化合物
本发明的另一方面涉及制备式(I)化合物的方法，包括以下步骤：
a、以2-溴-6-硝基苯酚为起始原料，与卤苄在碱性条件下发生亲核取代反应生成衍生物(2-2)，备用；
b、取步骤a得到的衍生物(2-2)在反应溶剂中，加入羧基取代的芳基(芳杂环)硼酸、碱性溶液，在钯催化剂催化进行Suzuki偶联反应得到衍生物(2-3)，备用；
c、以步骤b得到衍生物(2-3)为原料，在乙酸乙酯溶液中经过钯碳催化下氢化和脱苄基后与盐酸溶液成盐得到中间体(2-4)，备用；
d、取步骤c得到的中间体(2-4)与酸、亚硝酸钠、市售的类化合物(2-5)和溶剂在一定温度条件下，先重氮化再偶联反应得到中间体(2-6)，备用；
e、取步骤d得到的中间体(2-6)与市售的类化合物(2-7)和有机溶剂在一定温度条件下发生缩合成环反应得到目标化合物(I)。
进一步的，步骤a中使用的溶剂包括酯类、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和乙腈等，优选乙腈。所用的碱可以为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾等，优选碳酸钠或碳酸钾。2-溴-6-硝基苯酚与卤苄、碱的摩尔比为1：1～1.5:1～1.5，与溶剂的摩尔体积比为1mol/300mL～600mL，反应温度为回流，反应时间为2～8小时。
进一步的，步骤b中Suzuki偶联选用钯催化剂所述的钯催化剂可以为醋酸钯、[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、四(三苯基膦)钯或其他适合的催化剂；优选四(三苯基膦)钯。使用的溶剂包括甲苯、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1，4-二氧六环等和水的混合溶剂等；优选1，4-二氧六环和水的混合溶剂。使用的碱包括碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化钾等，优选碳酸钠或碳酸钾。
步骤b中所述衍生物(2-2)与羧基取代的芳基(芳杂环)硼酸、催化剂和碱的摩尔比为1:1～1.5:0.02～0.2:2～5,衍生物(2-2)与水和有机溶剂的摩尔体积比为1moL/200mL～600mL，氮气保护，反应温度为回流，反应时间为2～8小时。
羧基取代的芳基(芳杂环)硼酸优选3-羧基苯硼酸。
进一步的，步骤c中所述衍生物(2-3)与钯碳的摩尔比为1：0.1～0.5，所述(2-3)与溶剂乙酸乙酯的摩尔比为1mol/200mL～600mL,氢气催化，反应温度为40℃～60℃，反应时间为20～40小时。
进一步的，步骤d中所述重氮化反应中酸为盐酸、硫酸中至少一种，更优选的所述酸为盐酸；所述重氮化反应中的中间体(2-4)与20％亚硝酸钠的水溶液的摩尔比为1：1～1.5；更优选的，所述重氮化反应中中间体(2-4)与20％亚硝酸钠的水溶液的摩尔比为1：1；所述重氮化反应中反应温度为-10℃～10℃，更优选的，所述重氮化反应中反应温度为0℃～5℃；所述偶联反应中有机溶剂为水/甲醇、水/乙醇中的至少一种，更优选的，所述偶联反应中有机溶剂为水/乙醇，质量比为1：1；所述偶联反应中的中间体(2-4)与有机溶剂的质量比为1：40～80，更优选的，所述偶联反应中的中间体(2-4)与有机溶剂的质量比为1：60；所述偶联反应中的中间体(2-4)与市售的类化合物(2-5)的摩尔比为1：0.9～1.5；更优选的，所述偶联反应中的中间体(2-4)与市售的类化合物(2-5)的摩尔比为1：1；所述偶联反应中反应温度为10℃～35℃，更优选的，所述重氮化反应中反应温度为20℃～30℃。
进一步的，步骤e中所述缩合关环反应有机溶剂为甲苯、乙醇、乙腈、醋酸、四氢呋喃中的至少一种，中间体(2-6)与有机溶剂的质量比为1:6～10。所述中间体(2-6)与类化合物(2-7)的摩尔比为1:0.8～1.5，所述反应温度为60℃～130℃。
本发明的另一方面涉及PNPO抑制剂在制备防治多发性骨髓瘤疾病的药物中的应用。
在一个实施例中，PNPO抑制剂(I)显示一定的酸性，可以把PNPO抑制剂(I)和碱金属、碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐或碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐或碱土金属碳酸氢盐反应形成盐。
进一步的，将PNPO抑制剂(I)或其盐和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
在一个实施例中，本发明提供的PNPO抑制剂(I)或其盐制成片剂时，把PNPO抑制剂(I)盐和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
在一个实施例中，本发明提供的PNPO抑制剂(I)或其盐制成胶囊剂时把PNPO抑制剂(I)盐和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
在一个实施例中，本发明提供的PNPO抑制剂(I)或其盐制成颗粒剂时，把组合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
在一个实施例中，把本发明提供的PNPO抑制剂(I)或其盐制成注射液时，取PNPO抑制剂(I)盐加入增溶剂，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：
1、本发明提供的系列PNPO抑制剂(I)可有效抑制MM细胞增殖，解决传统靶向药物毒副作用大的缺陷。
2、本发明提供的系列PNPO抑制剂(I)的制备方法，以2-溴-6-硝基苯酚为原料，依次经过亲核取代、Suzuki偶联、钯碳还原、重氮化后再偶联、缩合成环等反应，得到目标化合物，每一步反应条件温和，可操作性强，生产效率高，成本低，且成品得率高、纯度高。
本发明有益技术效果详见下文试验例。
定义：
术语“卤素”或前缀“卤”，是指F，Cl，Br或I。
“烷氧基”是指基团-OR，其中，R为取代或未取代的烷基。
像本发明所描述的，取代基画一个键连接到中心的环上形成的环体系(如式I所示)代表R1表示苯环上的单取代基或多取代基，可以在环上任何可取代的位置取代。
本发明中所述的“药学上可接受的”是指包括任意不干扰活性成分的生物活性的有效性且对它被给予的宿主无毒性的物质。
本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式Ⅰ所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(C1-24)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。
本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式Ⅰ所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(C1-24)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。
本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但不限于，非对映体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀D、L或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，前缀(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50:50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
用于本发明的药学上可接受的载体是指不会破坏一起调配的化含物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。
附图说明
图1为本发明化合物的结构通式图。
图2为本发明化合物的合成反应流程图。
图3为本发明化合物I-1与PNPO蛋白亲和力试验的试验结果图。
图4为阳性对照药对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图5为本发明化合物I-1对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图6为本发明化合物I-2对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图7为本发明化合物I-3对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图8为本发明化合物I-4对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图9为本发明化合物I-5对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图10为本发明化合物I-6对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图11为本发明化合物I-7对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图12为本发明化合物I-8对MM细胞增殖影响的试验结果图。
图13为本发明化合物I-1的H-NMR图。
图14为本发明化合物I-2的H-NMR图。
图15为本发明化合物I-3的H-NMR图。
图16为本发明化合物I-4的H-NMR图。
图17为本发明化合物I-5的H-NMR图。
图18为本发明化合物I-6的H-NMR图。
图19为本发明化合物I-7的H-NMR图。
图20为本发明化合物I-8的H-NMR图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中，化合物的结构是通过质谱(MS)和/或核磁共振(1HNMR)设备来确定的，化合物I-1～I-8的H-NMR图如图13～图20。
本发明化合物可按照本领域常规方法，并使用合适的试剂、原料和本领域技术人员已知的纯化方法制备。下面更具体地描述本发明化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
实施例1 2-苄氧基-3-溴硝基苯(2-2)合成
硝基-6-溴苯酚2.18g(10mmol)，溴化苄1.88g(11mmol)，碳酸钾1.52g(11mmol)混合在乙腈(30ml)中回流反应6小时至反应完全，冷却至室温，减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，得到2-苄氧基-3-溴硝基苯(2-2)(3.03g,98.39％)，产品为白色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.07(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),8.00(dd,J＝8.2,1.4Hz,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,2H),7.46–7.39(m,3H),7.38(d,J＝8.2Hz,1H),5.13(s,2H)。
实施例2 3’-硝基-2’-苄氧基-[1，1’-联苯]-3-羧酸的制备
将实施例1中得到的化合物2-2 2.93g(9.50mmol)，3-羧基苯硼酸1.74g(10.45mmol)，碳酸钠2.01g(19mmol)，四三苯基膦钯329.46mg(0.28mmol)，混合在1，4-二氧六环(50ml)和水(10ml)中95℃回流搅拌8小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，减压蒸发除去溶剂，加水(20ml),用l mol/L稀盐酸调pH至酸性，有固体析出，乙酸乙酯萃取，减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3’-硝基-2’-苄氧基-[1，1’-联苯]-3-羧酸(2-3)(2.87g,86.65％)，产品为淡黄色固体。
实施例3 3’-氨基-2’-羟基-[1，1’-联苯]-3-羧酸的制备
将实施例2中得到的化合物2-3 2.87g(8.25mmol)溶于乙酸乙酯(100ml)中，加入15％钯碳430.5mg，50℃加压通氢气反应过夜至反应完全，冷却至室温，过滤，浓缩，加入少量乙醇溶解，加入4N HCl搅拌浓缩至干得到3’-氨基-2’-羟基-[1，1’-联苯]-3-羧酸盐酸盐(2-4)(1.14g,52.2％)，产品为紫红色固体。
实施例4 2-[3’-(2’-羟基-3-羧酸联苯基)亚肼基]-3-氧代丁酸乙酯的制备
将实施例3中得到的化合物2-4 1.14g(4.3mmol)溶于1N盐酸100m L，冰浴下滴加亚硝酸钠296.7mg(4.3mmol)的20％水溶液，滴毕，在冰浴下反应1h，搅拌下加入乙酰乙酸乙酯559mg(4.3mmol)，继续反应45min，用三乙胺调pH至6～8，加入30mL乙醇和30mL水，升至室温，继续反应1小时，1N HCl调pH至2～3，乙酸乙酯萃取，减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为6:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到2-[3’-(2’-羟基-3-羧酸联苯基)亚肼基]-3-氧代丁酸乙酯(2-6)(910.7mg,57.2％)，产品为棕黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ14.73(s,1H),12.63(s,1H),9.45(s,1H),8.10(s,1H),7.94(d,J＝7.7Hz,1H),7.78(d,J＝7.6Hz,1H),7.66-7.54(m,2H),7.18-7.02(m,2H),4.28(td,J＝14.0,6.8Hz,2H),2.43(s,3H),1.28-1.21(m,3H)。
实施例5 3'-[2-[(2Z)-1-(4-氰基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-1)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入4-氰基苯肼盐酸盐75.5mg(0.204mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(4-氰基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-1)(41mg,46.65％)，产品为橙黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.59(s,1H),13.05(s,1H),9.77(s,1H),8.15–8.08(m,3H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.88(d,J＝8.8Hz,2H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.68(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.61(t,J＝7.7Hz,1H),7.18–7.10(m,2H),2.33(s,3H)。
实施例6 3'-[2-[(2Z)-1-(4-氟)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷
基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-2)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入4-氟苯肼盐酸盐75.6mg(0.204mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(4-氟)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-2)(31mg,35.85％),产品为橙色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.69(s,1H),13.04(s,1H),9.71(s,1H),8.13(s,1H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.94–7.90(m,2H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.70(dd,J＝7.4,1.8Hz,1H),7.61(t,J＝7.7Hz,1H),7.29(t,J＝8.8Hz,2H),7.18–7.11(m,2H),2.32(s,3H)。
实施例7 3'-[2-[(2Z)-1-(4-三氟甲基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-3)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入4-三氟甲基苯肼盐酸盐63.8mg(0.3mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(4-三氟甲基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-3)(35mg,36.28％),产品为黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.67(s,1H),13.04(s,1H),9.77(s,1H),8.16(d,J＝8.4Hz,2H),8.13(s,1H),7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(t,J＝8.0Hz,3H),7.71(d,J＝7.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.7Hz,1H),7.19–7.12(m,2H),2.35(s,3H)。
实施例8 3'-[2-[(2Z)-1-(2-甲基-4-硝基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-4)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入2-甲基-4-硝基苯肼盐酸盐61.1mg(0.3mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(2-甲基-4-硝基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-4)(43mg,45.41％),产品为黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.59(s,1H),9.74(s,1H),8.27(s,1H),8.16(d,J＝8.0Hz,1H),8.11(s,1H),7.95(d,J＝7.5Hz,1H),7.78(d,J＝7.5Hz,1H),7.72(d,J＝6.2Hz,1H),7.65(d,J＝8.8Hz,1H),7.60(t,J＝7.7Hz,1H),7.19–7.11(m,2H),2.42(s,3H),2.33(s,3H)。
实施例9 3'-[2-[(2Z)-1-(萘-1-基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-5)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入1-萘肼盐酸盐58.4mg(0.3mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(萘-1-基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-5)(40mg,43.06％),产品为黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.68(s,1H),12.98(s,1H),9.64(s,1H),8.11(s,1H),8.06–8.01(m,2H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),7.88–7.84(m,1H),7.80–7.73(m,2H),7.60(ddd,J＝10.0,7.6,4.0Hz,5H),7.16(d,J＝4.4Hz,2H),2.36(s,3H)。
实施例10 3'-[2-[(2Z)-1-(4-硝基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-6)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入对硝基苯肼盐酸盐56.9mg(0.3mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(4-硝基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-6)(39mg,42.44％),产品为黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.58(s,1H),13.00(s,1H),9.77(s,1H),8.29(d,J＝9.1Hz,2H),8.17(d,J＝9.1Hz,2H),8.13(s,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.79(d,J＝7.7Hz,1H),7.66(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(t,J＝7.7Hz,1H),7.18–7.14(m,1H),7.11(t,J＝7.8Hz,1H),2.33(s,3H)。
实施例11 3'-[2-[(2Z)-1-(4-氯-3-羟基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-7)的制备
将实施例4中得到的化合物2-6 74.1mg(0.2mmol)加入2，4-二氯苯肼盐酸盐64.21mg(0.3mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-{N'-[3-甲基-5-氧代-1-(2，4-二氯苯基)-1,5-二氢吡唑-4-亚基]肼基}-2'-羟基联苯-3-羧酸(I-7)(80.13mg,82.90％),产品为橙色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):13.56(s,1H),12.99(s,1H),9.69(s,1H),8.11(s,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),7.86(s,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.72(dd,J＝7.2,2.4Hz,1H),7.62-7.58(m,3H),7.18-7.13(m,2H),2.31(s,3H)。
实施例12 3'-[2-[(2Z)-1-(4-羧基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-8)的制备
将实施例4中得到的化合物74.1mg(0.2mmol)加入4-肼基苯甲酸45.64mg(0.3mmol)溶于5mL冰醋酸的溶液中130℃回流搅拌6小时，氮气保护，反应完成后，冷却至室温，加入石油醚减压蒸发除去溶剂，浓缩至干得到浓缩物，粗品经硅胶柱层析分离纯化，以体积比为8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂，另加1％乙酸防止硅胶柱吸附，得到3'-[2-[(2Z)-1-(4-羧基)-3-甲基-5-氧代-1,5-二氢-4H-吡唑-4-亚烷基]肼基]-2'-羟基-3-联苯羧酸(I-8)(31.40mg,34.90％),产品为黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.84–13.56(m,1H),12.91(s,2H),9.75(s,1H),8.14(d,J＝1.9Hz,1H),8.09(d,J＝8.7Hz,2H),8.03(d,J＝8.7Hz,2H),7.97(d,J＝7.7Hz,1H),7.84–7.79(m,1H),7.73(dd,J＝7.7,2.0Hz,1H),7.62(t,J＝7.7Hz,1H),7.19(dd,J＝7.6,2.1Hz,1H),7.16(t,J＝7.7Hz,1H),2.36(s,3H)。
实施例13本发明制备得到的PNPO抑制剂(I)对PNPO蛋白亲和力的实验
化合物对PNPO亲和力测试采用表面等离子体共振技术(SPR)，仪器为Reichert4SPR分子间相互作用仪。首先，将PNPO蛋白固定在葡聚糖传感器芯片通道上，相邻通道作为参比，进行动力学检测，设置I-8小分子化合物的浓度梯度进样。程序结束后，通过分析软件拟合SPR曲线，计算出PNPO与小分子化合物的Kd值。
结果(详见见图3)如下：化合物I-8与PNPO的亲和力Kd值为1.88μM，其与PNPO具有较强的结合力。该实验结果为后续研究结合位点，化合物构效关系提供了基础。因此本发明为开辟MM靶向治疗提供了新机制。
实施例14本发明PNPO抑制剂(I)对MM细胞增殖的影响
分别收集MM细胞株ARP1野生型细胞以及ARP1的PNPO OE细胞，提取蛋白，使用Western blot检测各细胞株中PNPO蛋白的表达情况，我们发现PNPO cDNA转染细胞后，PNPO蛋白的表达明显高于对照组，说明高表达PNPO的MM细胞株构建成功。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，根据其测得的吸光度值(OD)，来判断活细胞数量，OD越大，细胞活性越强。具体步骤：1)处于对数生长期的ARP1野生型，ARP1过表达和ARP1敲低的细胞株，接种在无菌96孔板中，每组设置3个复孔，加入6个浓度梯度的药物，在37℃，5％CO2的培养箱中孵育48h；2)每个孔加入新鲜配制的MTT试剂，37℃，5％CO2的培养箱中孵育4h；3)离心机中离心，每孔加入150μL DMSO；4)用酶标仪测定在570nm波长处，各孔的OD，按照下列公式计算药物对骨髓瘤细胞的生长抑制率，抑制率＝[1-(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％；绘制曲线，并求解IC50。
结果如下(详见表2-表10，及图4-图12)：以硼替佐米(BTZ)为阳性药，测试上述8个化合对MM细胞增殖的影响。上述合成的化合物对MM细胞具有良好的抗增殖活性，并且可以靶向结合PNPO来达到抑制MM细胞增殖的目的，在治疗多发性骨髓瘤上具有良好的开发前景。
表2BTZ对MM细胞的抑制率
表3I-1对MM细胞的抑制率
表4I-2对MM细胞的抑制率
表5I-3对MM细胞的抑制率
表6I-4对MM细胞的抑制率
表7I-5对MM细胞的抑制率
表8I-6对MM细胞的抑制率
表9I-7对MM细胞的抑制率
表10I-8对MM细胞的抑制率
并且通过比较分析本发明合成的化合物I-1～I-8，其中化合物I-8对MM细胞的IC50值为2.88μm，显示出最好的活性。
尽管已经示出了和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种PNPO抑制剂，所述抑制剂为如式(I)所示的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、药学上可接受的盐或前药：
其中：
R1表示苯环上的单取代基或多取代基，R1选自取代或未取代的碳原子数为1～6的烷基、取代或未取代的碳原子数为1～6的烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、甲基磺酰基、卤素、硝基、氰基、羟基、羧基、酯基、氨基、四氮唑、磺酰氨基和与苯环稠合得到的芳环或杂环的任意一种或多种；
R2选自C1-C4的烷基、酯基、羟基、氨基、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-NH2，n＝1～2、含有1～2个氮原子的五元芳香杂环；
Ar选自羧基取代的苯基、呋喃基或噻吩基芳环或芳杂环的一种。
2.根据权利要求1所述的PNPO抑制剂，其特征在于，所述化合物选自I-1至I-8：
3.一种权利要求1所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.以2-溴-6-硝基苯酚为起始原料，与卤苄在碱性条件下发生亲核取代反应生成衍生物(2-2)，备用；
b、取步骤a得到的衍生物(2-2)在反应溶剂中，加入羧基取代的芳基(芳杂环)硼酸、碱性溶液，在钯催化剂催化进行Suzuki偶联反应得到衍生物(2-3)，备用；
c、以步骤b得到衍生物(2-3)为原料，在乙酸乙酯溶液中经过钯碳催化下氢化和脱苄基后与盐酸溶液成盐得到中间体(2-4)，备用；
d、取步骤c得到的中间体(2-4)与酸、亚硝酸钠、市售的类化合物(2-5)和溶剂在一定温度条件下，先重氮化再偶联反应得到中间体(2-6)，备用；
e、取步骤d得到的中间体(2-6)与市售的类化合物(2-7)和有机溶剂在一定温度条件下发生缩合成环反应得到目标化合物(I)。
4.根据权利要求3所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤a中使用的溶剂包括酯类、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和乙腈；
所用的碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾；
2-溴-6-硝基苯酚与卤苄、碱的摩尔比为1：1～1.5:1～1.5，与溶剂的摩尔体积比为1mol/300mL～600mL，反应温度为回流，反应时间为2～8小时。
5.根据权利要求3所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述的钯催化剂为醋酸钯、[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯、四(三苯基膦)钯；
所述的反应溶剂包括甲苯、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1，4-二氧六环和水的混合溶剂；
所述的碱包括碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化钾；
步骤b中衍生物(2-2)与羧基取代的芳基(芳杂环)硼酸、催化剂和碱的摩尔比为1:1～1.5:0.02～0.2:2～5,衍生物(2-2)与水和有机溶剂的摩尔体积比为1moL/200mL～600mL，氮气保护，反应温度为回流，反应时间为2～8小时。
6.根据权利要求3所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤c中所述衍生物(2-3)与钯碳的摩尔比为1：0.1～0.5；所述衍生物(2-3)与溶剂乙酸乙酯的摩尔比为1mol/200mL～600mL，氢气催化反应温度为40℃～60℃，反应时间为20～40小时。
7.根据权利要求3所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤d中所述重氮化反应中酸为盐酸、硫酸中至少一种；所述重氮化反应中的中间体(2-4)与20％亚硝酸钠的水溶液的摩尔比为1：1～1.5；所述重氮化反应中反应温度为-10℃～10℃；所述偶联反应中有机溶剂为水/甲醇、水/乙醇中的至少一种；所述偶联反应中(2-4)与有机溶剂的质量比为1：40～80；所述偶联反应中的中间体(2-4)与类化合物(2-5)的摩尔比为1：0.9～1.5；所述偶联反应中反应温度为10℃～35℃。
8.根据权利要求3所述制备式(I)化合物的方法，其特征在于步骤e中所述缩合关环反应有机溶剂为甲苯、乙醇、乙腈、醋酸、四氢呋喃中的至少一种；其中中间体(2-6)与有机溶剂的质量比为1:6～10；所述中间体(2-6)与类化合物(2-7)的摩尔比为1:0.8～1.5，所述反应温度为60℃～130℃。
9.根据权利要求3所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤a中使用的溶剂为乙腈；所用的碱为碳酸钠或碳酸钾；
步骤b中所述的钯催化剂为四(三苯基膦)钯；
所述的反应溶剂为1，4-二氧六环和水的混合溶剂；
所述的碱为碳酸钠或碳酸钾。
步骤d中所述重氮化反应中酸为盐酸；所述重氮化反应中的中间体(2-4)与20％亚硝酸钠的水溶液的的摩尔比为1：1；所述重氮化反应中反应温度为0℃～5℃；所述偶联反应中有机溶剂为水/乙醇，质量比为1：1；所述偶联反应中(2-4)与有机溶剂的质量比为1：60；所述偶联反应中的中间体(2-4)与类化合物(2-5)的摩尔比为为1：1；所述偶联反应中反应温度为20℃～30℃。
10.权利要求1或2所述的PNPO抑制剂在制备防治多发性骨髓瘤疾病药物中的应用。
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| CN115820865A (zh) * | 2023-01-31 | 2023-03-21 | 南京中医药大学 | Pnpo基因在制备多发性骨髓瘤标志物中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 袁 瑜 霞: "P N P O 学 位 论 文 调 控 多 发 性骨髄瘤 细 胞增 殖 的 作 用 及 其机制 研 究", 南 京 中 医 药 大 学2021年硕士学位论文, 15 March 2021 (2021-03-15) * |
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