CN116870254A - 人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了活细胞注射剂技术领域的一种人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法，包括如下重量份的组分：自体胶原蛋白活细胞组合物5‑7份，自愈合水凝胶载体20‑25份；所述自体胶原蛋白活细胞组合物为自体成纤维细胞及其分泌胶原蛋白和富血小板纤维蛋白释放液混合所得；所述自愈合水凝胶载体为醛基化硫酸软骨素与多聚赖氨酸交联所得。本发明提出通过制备自愈合水凝胶搭载自体胶原蛋白活细胞组合物的方式，实现了良好的生物相容性、生物降解性和抗菌效果，进而实现减少组织出现不良反应的技术效果，同时水凝胶提供适宜的微环境使移植后细胞生存率提高，进而实现较好的填充效果和较长的维持时间。
Description
技术领域
本发明属于活细胞注射剂技术领域，具体是指人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法。
背景技术
皮肤老化临床特征为皮肤松弛、萎缩和失去弹性，皱纹是皮肤老化的表现之一，皮下结缔组织萎缩、皮肤组织及间隙含水量减少及结缔组织间胶原蛋白减少会导致皱纹产生，分子量较小的胶原蛋白，与皮肤亲和性好，能够提高含水率，达到保持皮肤润泽的目的；胶原蛋白是哺乳动物中功能最丰富，分布最广泛的功能蛋白，胶原蛋白由成纤维细胞合成，是结缔组织细胞外基质的主要成分，是维持皮肤年轻态的主要功能性蛋白，其分泌量随着年龄的增长而逐渐减少，且蛋白降解也随之增加；目前市面上常用的几种异原性胶原蛋白常常因为其免疫原性导致治疗效果不理想，自体成纤维细胞作为移植材料，无毒无害，不会产生免疫反应和排异反应，在皮肤组织中补充成纤维细胞的含量，可以促进胶原蛋白的增生使真皮厚度增加，恢复皮肤的弹性，消除皮肤皱纹或使凹陷的瘢痕得到填充；水凝胶因与水有较强的亲和性，能够吸水且含水量高，可应用于创面愈合、空间损伤填充、传送生物活性物质以及刺激组织细胞实现所需组织发育等领域。
目前现有技术主要存在以下问题：1.填充注射剂易引起组织反应造成炎症，以及出现肉芽，出血，和感染等不良反应；2.注射剂量低效果不明显，移植后细胞生存率低，维持时间短。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法，为了解决注射后引起不良反应及注射后效果不明显的问题，本发明提出通过制备自愈合水凝胶搭载自体胶原蛋白活细胞组合物的方式，实现了良好的生物相容性、生物降解性和抗菌效果，进而实现减少组织出现不良反应的技术效果，同时水凝胶提供适宜的微环境使移植后细胞生存率提高，进而实现较好的填充效果和较长的维持时间。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法，包括如下重量份的组分：自体胶原蛋白活细胞组合物5-7份，自愈合水凝胶载体20-25份；所述自体胶原蛋白活细胞组合物为自体成纤维细胞及其分泌胶原蛋白和富血小板纤维蛋白释放液的混合物；所述自愈合水凝胶载体为醛基化硫酸软骨素与多聚赖氨酸交联得到的自愈合材料。
自体胶原蛋白活细胞组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、取患者术中切除的皮肤约5mm×3mm，剪碎加入中性蛋白酶II溶液中，置于摇床摇晃，4℃培养箱中消化，得到混合液；
S2、将S1所得混合液2000rpm离心5min后弃上清液，随后加入胰蛋白酶及胶原蛋白酶混合溶液中，37℃培养4h；
S3、200目无菌筛网过滤，以D-Hanks液洗去胰蛋白酶和胶原蛋白酶，经2000rpm离心5min后弃上清液，得到沉淀为成纤维细胞，原代成纤维细胞80%融合后，无血清传代细胞培养，弃去培养液得到细胞混合物；
S4、取静脉血10mL至真空负压管中，以2000rpm离心10min，离心后取中间层即为富血小板纤维蛋白（PRF），4℃条件下静置5d后，PRF蛋白凝胶会持续释放出含多种细胞因子的液态A-PRF，用无菌注射器抽吸，收集后备用；
S5、将S3所得细胞混合物与S4所得液态A-PRF均匀混合得到自体胶原蛋白活细胞组合物。
优选地，在S1中，中性蛋白酶的质量浓度为0.2-0.3%；
优选的，在S1中，培养箱消化时间为8-10h；
优选地，在S2中，胰蛋白酶的质量浓度为0.08-0.12%；胶原蛋白酶的质量浓度为0.15-0.20%；
优选地，在S3中，传代细胞培养时间为3-5天。
自愈合水凝胶载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将硫酸软骨素以8mg-12mg/mL溶于水中，然后以2-3mg/mL加入高碘酸钠，将混合物置于黑暗环境中在30-40℃的水浴中以500-700rpm的速率搅拌2h，得到混合溶液；
（2）在（1）所得混合溶液中加入二甘醇使未反应的高碘酸钠失活，二甘醇与混合溶液的体积比为1:90-120，以蒸馏水透析3天，用冷冻干燥机冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素；
（3）将多聚赖氨酸和（2）所得醛基化硫酸软骨素分别溶解于pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中配制成30-40mg/mL的溶液，将多聚赖氨酸溶液和醛基化硫酸软骨素溶液以1:2-3的体积比均匀混合，静置等待2min得到自愈合水凝胶载体。
人自体胶原蛋白活细胞注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
在醛基化硫酸软骨素溶液中依次加入自体胶原蛋白活细胞组合物和多聚赖氨酸溶液混合均匀，静置等待2min得到人自体胶原蛋白活细胞注射剂。
本发明取得的有益效果如下：通过动态自愈合水凝胶，搭载自体成纤维细胞及其分泌胶原蛋白和富血小板纤维蛋白释放液，能够减少组织出现不良反应，提升细胞生存率、增强填充效果和维持时间；富血小板纤维蛋白释放液中含有大量的血小板，激活后可释放血管内皮生长因子、转化生长因子⁃β、碱性成纤维细胞生长因子，使移植后的自体成纤维细胞处于较高水平的生长因子环境中，有利于进创面愈合、刺激血管生成，以及促进细胞增殖和迁移；通过醛基化硫酸软骨素复合多聚赖氨酸形成水凝胶，内部呈现多孔网状结构，表面粗糙，孔隙率都较高，有利于细胞的黏附以及细胞间的相互作用，醛基硫酸软骨素的醛基可以与多聚赖氨酸中的胺基进行希夫碱反应，使水凝胶因外部因素出现裂缝后能够自行恢复至初始强度和功能持续为移植细胞提供良好稳定的微环境和保护作用。
附图说明
图1为本发明实施例1-3和对比例1-3所得注射剂抑菌率结果图；
图2为本发明实施例3、对比例1-3所得注射剂在裸鼠体内培养6周后新生组织质量的结果图；
图3为本发明实施例1-3所得水凝胶降解性能测试的结果图；
图4为本发明实施例1-3所得水凝胶毒性测试的结果图；
图5为本发明实施例1-3所得水凝胶孔隙率的结果图；
图6为本发明实施例3所得水凝胶电镜结果图；
图7为本发明中对硫酸软骨素改性并与多聚赖氨酸交联的流程图。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试验菌株，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
中性蛋白酶II（CasNo:42613-33-2），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号D4693；
胰蛋白酶（CasNo:9002-07-7），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号B04919；
胶原蛋白酶（CasNo:9001-12-1），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号C2399；
硫酸软骨素（CasNo:9007-28-7），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号GC79040；
多聚赖氨酸（CasNo:25988-63-0），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号P8920；
高碘酸钠（CasNo:7790-28-5），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号A77945；
二甘醇（CasNo:111-46-6），购于北京伊诺凯科技有限公司，货号032844。
实施例1
人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法，包括如下重量份的组分：包括如下重量份的组分：自体胶原蛋白活细胞组合物5份，自愈合水凝胶载体20份。
自体胶原蛋白活细胞组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、取患者术中切除的皮肤约5mm×3mm，剪碎加入质量浓度为0.2%的中性蛋白酶II溶液中，置于摇床摇晃，4℃培养箱中消化8h，得到混合液；
S2、将S1所得混合液2000rpm离心5min后弃上清液，随后加入质量浓度为0.08-%的胰蛋白酶及质量浓度为0.15%的胶原蛋白酶混合溶液中，37℃培养4h；
S3、200目无菌筛网过滤，以D-Hanks液洗去胰蛋白酶和胶原蛋白酶，经2000rpm离心5min后弃上清液，得到沉淀为成纤维细胞，原代成纤维细胞80%融合后，无血清传代细胞培养3天，弃去培养液得到细胞混合物；
S4、取静脉血10mL至真空负压管中，以2000rpm离心10min，离心后取中间层即为富血小板纤维蛋白（PRF），4℃条件下静置5d后，PRF蛋白凝胶会持续释放出含多种细胞因子的液态A-PRF，用无菌注射器抽吸，收集后备用；
S5、将S3所得细胞混合物与S4所得液态A-PRF均匀混合得到自体胶原蛋白活细胞组合物。
自愈合水凝胶载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将硫酸软骨素以8mg/mL溶于水中，然后以2mg/mL加入高碘酸钠，将混合物置于黑暗环境中在30℃的水浴中以500rpm的速率搅拌2h，得到混合溶液；
（2）在（1）所得混合溶液中加入二甘醇使未反应的高碘酸钠失活，二甘醇与混合溶液的体积比为1:90，以蒸馏水透析3天，用冷冻干燥机冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素；
（3）将多聚赖氨酸和（2）所得醛基化硫酸软骨素分别溶解于pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中配制成30mg/mL的溶液，将多聚赖氨酸溶液和醛基化硫酸软骨素溶液以1:2的体积比均匀混合，静置等待2min得到自愈合水凝胶载体。
人自体胶原蛋白活细胞注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
在醛基化硫酸软骨素溶液中依次加入自体胶原蛋白活细胞组合物和多聚赖氨酸溶液混合均匀，静置等待2min得到人自体胶原蛋白活细胞注射剂。
实施例2
人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法，包括如下重量份的组分：包括如下重量份的组分：自体胶原蛋白活细胞组合物7份，自愈合水凝胶载体25份。
自体胶原蛋白活细胞组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、取患者术中切除的皮肤约5mm×3mm，剪碎加入质量浓度为0.3%的中性蛋白酶II溶液中，置于摇床摇晃，4℃培养箱中消化10h，得到混合液；
S2、将S1所得混合液2000rpm离心5min后弃上清液，随后加入质量浓度为0.12%的胰蛋白酶及质量浓度为0.20%的胶原蛋白酶混合溶液中，37℃培养4h；
S3、200目无菌筛网过滤，以D-Hanks液洗去胰蛋白酶和胶原蛋白酶，经2000rpm离心5min后弃上清液，得到沉淀为成纤维细胞，原代成纤维细胞80%融合后，无血清传代细胞培养5天，弃去培养液得到细胞混合物；
S4、取静脉血10mL至真空负压管中，以2000rpm离心10min，离心后取中间层即为富血小板纤维蛋白（PRF），4℃条件下静置5d后，PRF蛋白凝胶会持续释放出含多种细胞因子的液态A-PRF，用无菌注射器抽吸，收集后备用；
S5、将S3所得细胞混合物与S4所得液态A-PRF均匀混合得到自体胶原蛋白活细胞组合物。
自愈合水凝胶载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将硫酸软骨素以12mg/mL溶于水中，然后以3mg/mL加入高碘酸钠，将混合物置于黑暗环境中在40℃的水浴中以700rpm的速率搅拌2h，得到混合溶液；
（2）在（1）所得混合溶液中加入二甘醇使未反应的高碘酸钠失活，二甘醇与混合溶液的体积比为1：120，以蒸馏水透析3天，用冷冻干燥机冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素；
（3）将多聚赖氨酸和（2）所得醛基化硫酸软骨素分别溶解于pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中配制成40mg/mL的溶液，将多聚赖氨酸溶液和醛基化硫酸软骨素溶液以1:3的体积比均匀混合，静置等待2min得到自愈合水凝胶载体。
此外，本发明还提供一种人自体胶原蛋白活细胞注射剂的制备方法，所述制备方法参照实施例1施行。
实施例3
人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法，包括如下重量份的组分：包括如下重量份的组分：自体胶原蛋白活细胞组合物6份，自愈合水凝胶载体22份。
自体胶原蛋白活细胞组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、取患者术中切除的皮肤约5mm×3mm，剪碎加入质量浓度为0.25%的中性蛋白酶II溶液中，置于摇床摇晃，4℃培养箱中消化9h，得到混合液；
S2、将S1所得混合液2000rpm离心5min后弃上清液，随后加入质量浓度为0.1%的胰蛋白酶及质量浓度为0.18%的胶原蛋白酶混合溶液中，37℃培养4h；
S3、200目无菌筛网过滤，以D-Hanks液洗去胰蛋白酶和胶原蛋白酶，经2000rpm离心5min后弃上清液，得到沉淀为成纤维细胞，原代成纤维细胞80%融合后，无血清传代细胞培养4天，弃去培养液得到细胞混合物；
S4、取静脉血10mL至真空负压管中，以2000rpm离心10min，离心后取中间层即为富血小板纤维蛋白（PRF），4℃条件下静置5d后，PRF蛋白凝胶会持续释放出含多种细胞因子的液态A-PRF，用无菌注射器抽吸，收集后备用；
S5、将S3所得细胞混合物与S4所得液态A-PRF均匀混合得到自体胶原蛋白活细胞组合物。
自愈合水凝胶载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将硫酸软骨素以10mg/mL溶于水中，然后以2.6mg/mL加入高碘酸钠，将混合物置于黑暗环境中在37℃的水浴中以600rpm的速率搅拌2h，得到混合溶液；
（2）在（1）所得混合溶液中加入二甘醇使未反应的高碘酸钠失活，二甘醇与混合溶液的体积比为1：100，以蒸馏水透析3天，用冷冻干燥机冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素；
（3）将多聚赖氨酸和（2）所得醛基化硫酸软骨素分别溶解于pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中配制成35mg/mL的溶液，将多聚赖氨酸溶液和醛基化硫酸软骨素溶液以1:2.5的体积比均匀混合，静置等待2min得到自愈合水凝胶载体。
此外，本发明还提供一种人自体胶原蛋白活细胞注射剂的制备方法，所述制备方法参照实施例1施行。
对比例1
本对比例提供一种注射剂，其与实施例1的区别仅在于所有组分中不包含自愈合水凝胶载体，其余组分、组分含量与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种注射剂，其与实施例1的区别仅在于所有组分中不包含富血小板纤维蛋白释放液，其余组分、组分含量与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种，其与实施例1的区别仅在于所有组分中不包含自愈合水凝胶载体和富血小板纤维蛋白释放液，其余组分、组分含量与实施例1相同。
实验例
1.抗菌实验
取浓度为1.5×108cfu/mL的大肠杆菌、金黄葡萄球菌悬液3mL，分别加入实施例1-3和对比例1-3所得注射剂1mL作为实验组，滴加1mL生理盐水作为对照组，充分混匀后计时2min，分别取1mL滴入5mLPBS缓冲液的试管中，经过稀释后取1mL，置于无菌皿中，加入琼脂培养基，温度37度条件下培养24h，平板计数，重复实验三次，计数结果取平均，以下述公式计算抑菌率。
公式为：抑菌率=（对照组菌落数—实验组菌落数）/对照组菌落数×100%。
2.生成组织质量
取实施例3、对比例1-3中所得，每组取10只裸鼠，麻醉后，在裸鼠背部脊椎两侧选取对称位置，分别注入0.3mL注射剂；6周后取出新生组织观察并测重并记录新生组织质量m。
3.降解性能
取实施例1-3中水凝胶冻干称重，质量记作m，利用质量浓度为2%的透明质酸酶和质量浓度为1.5%蛋白酶对水凝胶冻干样进行降解，每3d更换1次降解液，分别在1，3，5，7，9，11，13d取出样品冻干称质量记作mn，以下述公式计算降解率。
公式为：降解率=（m-mn）/m×100%。
4.毒性测试
取实施例1-3中水凝胶各300mg于10mL基本培养基中浸泡24h，将浸提液过滤后再分别稀释50、20倍得到稀释液；将培养至第3代的成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化，将细胞浓度调整为1×105/mL，用基本培养基悬浮后接种到96孔板，每孔加100uL成纤维细胞悬液培养至细胞贴壁后，PBS洗2次，每孔加入100uL稀释液，加入100uL基本培养基为对照组，培养24h后加入CCK-8，每孔10uL，孵育48h后测450nm处吸光度值，以下述公式计算存活率。
公式为：存活率=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。
5.孔隙率
取实施例1-3中水凝胶冻干称重质量记作m体积记作v，浸泡于50 mL无水乙醇中，使液体充分进入凝胶孔隙，用滤纸吸干表面的乙醇，记录凝胶质量mn，重复3次平行实验，以下述公式计算孔隙率。
公式为：孔隙率=（m-mn）/0.789v×100%。
结果分析
图1为本发明实施例1-3和对比例1-3所得注射剂抑菌率结果图，如图实施例1-3和对比例1-3对大肠杆菌的抑菌率分别为99.7%、99.8%、100%、99.5%、34.6%、26.3，对金黄葡萄球菌的抑菌率分别为99.8%、99.6%、99.9%、99.6%、32.2、19.6%；相较于对比例1-3，本发明实施例1-3所得的注射剂具有更好的抗菌效果，自愈合水凝胶载体能有效提高注射剂的抗菌效果，减少细菌感染及其导致炎症的发生。
图2为本发明实施例3、对比例1-3所得注射剂在裸鼠体内培养6周后新生组织质量的结果图，如图实施例1-3和对比例1-3分别为0.136g、0.097 g、0.105 g、0.075 g；实施例3所得的新生组织质量大于对比例1，说明水凝胶自愈载体对纤维细胞在体内生长发育具有促进效果，水凝胶自愈载体能为纤维细胞生长提供良好的微环境，促进增殖和胶原蛋白的释放 ；实施例3所得的新生组织质量大于对比例2，说明血小板纤维蛋白释放液对纤维细胞在体内生长发育具有促进效果，血小板纤维蛋白释放液中含有大量的血小板，激活后可释放大量的生长因子，促进纤维细胞的生长发育，实施例3所得的新生组织质量大于对比例3，且对比例3新生组织质量明显低于对比例1-2，说明水凝胶自愈载体和血小板纤维蛋白释放液共同使用能更好的促进纤维细胞的生长发育及胶原蛋白的生成。
图3为本发明实施例1-3所得水凝胶降解性能测试的结果图，如图实施例1-3所得水凝胶在第13天降解率分别为95%、93%、97%；在13 d 时本发明实施例1-3所得水凝胶的降解率都达到了90%以上，说明本发明实施例1-3所得水凝胶具有良好的生物可降解性。
图4为本发明实施例1-3所得水凝胶毒性测试的结果图，如图，加入实施例1-3所得水凝胶50倍得到稀释液培养后存活率分别为105%、108%、109%，加入20倍得到稀释液培养后存活率分别为116%、112%、114%；实验中细胞存活率都超过100%，说明水凝胶基本无细胞毒性，细胞可以正常活动，且随着凝胶提取液的质量浓度升高，可一定程度上提高细胞的存活率，促进细胞增殖。
图5为本发明实施例1-3所得水凝胶孔隙率的结果图，如图，实施例1-3所得水凝胶孔隙率分别为79%、75%、78%，说明实施例1-3所得水凝胶有较大的空隙，有足够空间能够负载成纤维细胞在其上生长发育。
图6为本发明实施例3所得水凝胶电镜结果图，如图，水凝胶呈现出连续的多孔三维结构，这种相互连接的多孔结构为细胞增殖以及氧气和营养物质的运输提供了足够的空间。
图7为本发明中对硫酸软骨素改性并与多聚赖氨酸交联的流程图，如图，高碘酸钠氧化硫酸软骨素，使羟基氧化为醛基，所得醛基与多聚赖氨酸上伯胺进行希夫碱反应。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的应用并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：包括如下重量份的组分：自体胶原蛋白活细胞组合物5-7份，自愈合水凝胶载体20-25份；所述自体胶原蛋白活细胞组合物为自体成纤维细胞及其分泌胶原蛋白和富血小板纤维蛋白释放液的混合物；所述自愈合水凝胶载体为醛基化硫酸软骨素与多聚赖氨酸交联得到的自愈合材料。
2.根据权利要求1所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：所述自体胶原蛋白活细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、取患者术中切除的皮肤约5mm×3mm，剪碎加入中性蛋白酶II溶液中，置于于摇床摇晃，4℃培养箱中消化，得到混合液；
S2、将S1所得混合液2000rpm离心5min后弃上清液，随后加入胰蛋白酶及胶原蛋白酶混合溶液中，37℃培养4h；
S3、200目无菌筛网过滤，以D-Hanks液洗去胰蛋白酶和胶原蛋白酶，经2000rpm离心5min后弃上清液，得到沉淀为成纤维细胞，原代成纤维细胞80%融合后，无血清传代细胞培养，弃去培养液得到细胞混合物；
S4、取静脉血10mL至真空负压管中，以2000rpm离心10min，离心后取中间层即为富血小板纤维蛋白，4℃条件下静置5d后，PRF蛋白凝胶会持续释放出含多种细胞因子的液态A-PRF，用无菌注射器抽吸，收集后备用；
S5、将S3所得细胞混合物与S4所得液态A-PRF均匀混合得到自体胶原蛋白活细胞组合物。
3.根据权利要求2所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：在S1中，中性蛋白酶的质量浓度为0.2-0.3%。
4.根据权利要求3所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：在S1中，培养箱消化时间为8-10h。
5.根据权利要求4所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：在S2中，胰蛋白酶的质量浓度为0.08-0.12%；胶原蛋白酶的质量浓度为0.15-0.20%。
6.根据权利要求5所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：在S3中，传代细胞培养时间为3-5天。
7.根据权利要求6所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂，其特征在于：所述自愈合水凝胶载体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将硫酸软骨素以8mg-12mg/mL溶于水中，然后以2-3mg/mL加入高碘酸钠，将混合物置于黑暗环境中在30-40℃的水浴中以500-700rpm的速率搅拌2h，得到混合溶液；
（2）在（1）所得混合溶液中加入二甘醇使未反应的高碘酸钠失活，二甘醇与混合溶液的体积比为1:90-120，以蒸馏水透析3天，用冷冻干燥机冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素；
（3）将多聚赖氨酸和（2）所得醛基化硫酸软骨素分别溶解于pH为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中配制成30-40mg/mL的溶液，将多聚赖氨酸溶液和醛基化硫酸软骨素溶液以1:2-3的体积比均匀混合，静置等待2min得到自愈合水凝胶载体。
8.根据权利要求1-9任一项所述的人自体胶原蛋白活细胞注射剂的制备方法，其特征在于：具体步骤包括：在醛基化硫酸软骨素溶液中依次加入自体胶原蛋白活细胞组合物和多聚赖氨酸溶液混合均匀，静置等待2min得到人自体胶原蛋白活细胞注射剂。
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