CN116869151A

CN116869151A - 一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统及制备方法和应用

Info

Publication number: CN116869151A
Application number: CN202310290590.5A
Authority: CN
Inventors: 陈丽春
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2023-03-23
Filing date: 2023-03-23
Publication date: 2023-10-13

Abstract

本发明公开了一种pH响应多肽聚赖氨酸‑ATP凝聚体纳米递送系统及制备方法和应用，通过聚赖氨酸中带正电的赖氨酸残基以多价方式与带负电的ATP相互作用产生液‑液相分离形成凝聚体。还公开了制备方法：配制聚赖氨酸浓度为10‑25 mg/mL、包载物为1‑64mg/mL Cur或GOx混合物，在常温下，以300‑500rpm的速度混旋，包封率最高达64%。及利用脂质体形成层层组装，达到微环境（特别是高糖，高乳酸）缓释递送效果。凝集体具备组装简单，形成迅速，不需要有机溶剂，能有效维持蛋白质、药物在体内外的生物活性易与组织工程支架结合且能辅助细胞治疗，易于功能化。

Description

一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统及制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药生物工程技术领域，具体涉及一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统及制备方法和应用。

背景技术

液-液相分离(LLPS)概念的提出和研究为无膜区隔及其成分的动态重组提供了必要的理论基础。多价相互作用产生的化学势驱动液-液相分离(LLPS)的方式自组装而形成的微液滴结构，从化学的角度来看，即凝集体微液滴(Coacervate microdroplets)。与周围的液体环境相比，以新的“相”的形式出现，拥有微腔室结构，内部是生物大分子密集环境，具有吸附小分子物质，包载蛋白酶等生物大分子的特点，是细胞内无膜细胞器的结构与功能模型。有一些生物分子被称为多价分子，它们有许多结构模块或官能团。多价分子在一个高度复杂的网络中相互结合，形成生物分子凝聚体。多价分子间的网络相互作用是触发相分离的必要条件，当分子间相互作用驱动多价分子连接时，不溶性缩合物表现为多价分子从原来的可溶性分散态转变为不可溶性聚集态。由于多价分子的性质和浓度是动态变化的，缩合物的溶解度也是动态的变化。

液-液相分离通过液滴内与外部环境中浓度差形成的物质交换，由一个单相系统分离形成凝聚相和稀释相共存的两相状态。由于缺乏物理屏障，大多数液体凝聚体具有共同的特征，液体凝聚体能够与周围环境快速交换其组分。例如，它们具有很高的活动性和球形，但是在物理接触时会变形，融合并最终恢复为球形。当凝聚相内环境浓度低于临界浓度时，溶液是均匀的，当浓度超过临界浓度时，形成稀溶液相和浓缩相两相，浓缩相中大分子基于内外浓度差完成大分子之间的物质交换。生物大分子的相分离对物理化学条件的变化十分敏感，相分离的形成受多种外部方面因素影响，包括溶液中的温度、盐离子浓度、pH值等等。不同的缓冲液对蛋白质的相分离也会产生不同的影响。凝聚体的聚集为细胞内的一种动力学变化，相分离的发生与细胞内部耗能密切相关。一些细胞内能量相关的过程可能会对生物大分子的相分离调节起到关键作用，ATP被证明能够调节细胞内无膜细胞器的组装，增强液滴内粘度，调控蛋白之间的相互用。这种ATP调控的相分离很可能发生在细胞饥饿阶段，改变很多蛋白质的相行为。此外，凝集体液滴之间会融合、聚结，表现出液体的流动特性，该特性由其表面张力决定。

微粒制剂一直是药剂学、食品工业研究的一个热点，利用纳米颗粒荷载活性物质具有稳定界面性，可食性或全降解的天然多肽是食品、药品载体的理想材料。凝聚体液滴是一种新型药物递送载体，能传输小分子药物和蛋白质。凝集体能够将不稳定的蛋白质或药物与周围的环境分离开来，从而保持它们的生物活性。与其他常见载体，如水凝胶、纳米粒子以及树枝状大分子相比，凝集体形成迅速，不需要有机溶剂，能有效维持蛋白质药物在体内外的生物活性。凝集体具备组装简单，易与组织工程支架结合且能辅助细胞治疗，易于功能化，如靶向或增强其运载物的生物活性。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统，该递送系统由多肽聚赖氨酸通过添加ATP触发的凝聚复合而成的纳米颗粒复合物与脂质体水合制得。

一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统，该递送系统由多肽聚赖氨酸通过添加ATP触发液-液相分离形成凝聚体，所述多肽聚赖氨酸中带正电的赖氨酸残基以多价方式与带负电的ATP相互作用，具有pH敏感响应递送特性，且该凝聚体在葡萄糖氧化酶辅助下实现高糖环境pH双响应敏感控释递送。

进一步地，多肽聚赖氨酸的分子量为5000-45万g/mol。

进一步地，pH靶向控释范围稳定为7-7.8，pH波动小，pH响应敏感，在pH<4时，凝聚体不形成。

进一步地，该凝聚体纳米递送系统还包括用于形成凝聚体外层的脂质体和油脂

本发明的另一个目的在于提供一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统的制备方法，具体通过以下步骤实现：

1)将多肽聚赖氨酸和ATP分别溶于缓冲溶液中，制得浓度为25mg/mL的多肽聚赖氨酸溶液和浓度为5mg/mL的ATP溶液；添加ATP触发，形成多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体溶液，往多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体溶液中添加葡萄糖氧化酶以实现高糖环境环境pH响应与控释，其中，多肽聚赖氨酸：ATP比率为1：1.1-2；

2)将包载物溶解在步骤1)制得的多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体溶液中，形成pH响应的多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米颗粒复合物溶液，在添加步骤中持续低速涡旋，确保溶液均一，包封率可达25-85％；

3)为保护多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送，将多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米颗粒复合物溶液与脂质体进行水合，即制得脂质体保护的pH靶向控释凝聚体纳米递送系统。

进一步地，多肽聚赖氨酸的分子量为5000-45万g/mol；缓冲溶液为pH 6.2-9。

进一步比，步骤1)中，葡萄糖氧化酶的添加量占凝聚体质量的5-15％。

进一步地，步骤2)中，包载物添加比率为0.5-1.2，低速涡旋具体为在300-500rpm转速下进行磁力搅拌0.5-2h，优选400rpm。

进一步地，步骤2)中包载物为微蛋白、小分子、酶及其任两种及以上的混合物。

进一步地，步骤3)中，水合时间为3-8h，脂质体的浓度为10mg/mL，所述脂质体为磷脂、脂肪酸、结构脂中的任一种，脂质体的加入量与复合物溶液的质量比为5-9:1。

本发明的第三个目的在于提供上述制备方法在制备食品级纳米运载体上的应用。

本发明的第四个目的在于提供上述制备方法制备的凝聚体纳米递送系统在pH、高糖环境响应缓释递送中的应用。

进一步地，pH靶向控释范围为7-7.8，凝聚体纳米递送系统在高糖环境，其释放率与葡萄糖溶液浓度呈正相关。

本发明通过多肽聚赖氨酸(Ply)添加ATP触发液-液相分离过程凝聚形成的pH靶向控释凝聚体纳米递送系统，多价相互作用产生的凝聚体拥有微腔室结构，内部是生物大分子密集环境，具有吸附小分子物质，包载蛋白酶等生物大分子的特点，凝聚体能够与周围环境快速交换其组分。凝集体形成迅速，不需要有机溶剂，能有效维持蛋白质药物在体内外的生物活性。凝集体具备组装简单，易与组织工程支架结合且能辅助细胞治疗，易于功能化，如靶向或增强其运载物的生物活性。并且通过该方法制备的pH靶向控释凝聚体纳米递送系统具有较好的生物相容性、凝聚体纳米递送系统在高糖环境，其释放率与葡萄糖溶液浓度呈正相关，具有浓度依赖性。提高了负载物的在微环境中的稳定性和生物利用度，可应用于药物载体、食品功能配料。

附图说明

图1为一种凝聚体形成示意图(聚赖氨酸每个残基都含有正一个电荷，而ATP每个磷酸基团有一个负电荷，带相反电荷的大分子形成离子对，聚集成无膜的凝聚体；不同比例的ATP凝结的聚合体量及不同R比下，形成凝聚体的电位)；

图2(A)显示了包封姜黄素Ply/ATP/Cur凝集体形成的示意图；(B)Ply/ATP凝集体中不同浓度姜黄素的微观形态和姜黄素的荧光含量；(C)动态光散射仪测定了Ply/ATP/Cur凝集体中姜黄素包载量和包封率EE％。(D)包载不同姜黄素的Ply/ATP/Cur凝集体荧光强度；(E)包载不同姜黄素的Ply/ATP/Cur凝集体的粒径和电位的变化；

图3(A)Ply/ATP/Cur和Ply/ATP/FITC凝聚体在不同pH下的形成；(B)姜黄素的分子式；(C)Ply/ATP/Cur凝聚体和Ply/ATP/FITC凝聚体的白光和荧光的形态学和结构特征在50μm的显微镜下；(D)通过动态光散射仪测量的不同pH下凝聚体电荷变化；(E)用ImageJ软件处理的凝聚体的荧光强度随pH变化；

图4肿瘤微环境(乳酸和高糖环境)中凝聚体的形态学变化；(A)显示了肿瘤微环境中凝聚体变化过程的示意图；(B)葡萄糖调节的Ply/ATP/Cur和Ply/ATP/FITC凝聚体的显微结构变化图像。葡萄糖与Cox作用形成葡萄酸降低溶液pH值，导致包载物释放；(C)不同浓度的葡萄糖对凝聚体荧光强度变化的影响，随着葡萄糖浓度的增加，Ply/ATP/Cur凝聚体上包载姜黄素的量改变，荧光强度随之改变；

图5随着时间的推移，随着葡萄糖的添加，Ply/ATP/Cur凝聚体的形态学变化；(A)其中葡萄糖与凝聚体内的GO_X酶反应产生葡萄糖酸，改变溶液环境的pH值，导致凝聚体中的姜黄素颗粒减少，甚至解体；(B)凝聚体微观结构随时间的变化；(C)显示姜黄素随葡萄糖和GO_X酶反应时间的变化，荧光含量不断降低，不断解聚。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，以便更好地理解本技术方案。

实施例1

1)将分子量为5万g/mol的聚赖氨酸(Ply)，配制浓度为25mg/mL的多肽聚赖氨酸溶液，同时将ATP配制浓度为5mg/mL的ATP溶液；

2)ATP溶液添加到Ply溶液中，在添加步骤中持续速度400rpm涡旋，形成可逆的多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体，添加ATP后浊度的增加被用作凝聚层的确认；

3)分别测定不同ATP添加比率下，电位的变化及形态结构，实验表明在ATP添加比率为0.5-1.2时，呈现形态均一的多肽聚赖氨酸(Ply)-ATP凝聚体；如图1所示。

实施例2

1)将分子量为17万g/mol的聚赖氨酸(Ply)，配制浓度为10mg/mL的多肽聚赖氨酸溶液；同时将ATP配制5mg/mL溶液,Ply-ATP比率为1：1.2，形成多肽聚赖氨酸(Ply)-ATP凝聚体；

2)将包载物Cur溶解在1)步骤制备的多肽聚赖氨酸(Ply)-ATP凝聚体溶液中，得浓度为1-64mg/mL包载物溶液；

3)不同包载物溶液浓度影响凝聚体纳米递送系统的包封率，实验表明最大包封率EE％为64％，同时测定不同包封率下的Zeta电位及纳米颗粒分布PDI，如图2所示。

实施例3

将分子量为35万g/mol的聚赖氨酸(Ply)，制备包载物32mg/mL Cur的Ply/ATP/Cur凝聚体纳米递送系统，EE％为52％。

通过乳酸5mM分别加到Ply/ATP/Cur凝聚体中，调节pH分别为7.8，7.5，7.2，7，包载Cur的Ply/ATP/Cur凝聚体纳米递送系统在pH为7.5-7.8范围，具有强的荧光，并具有均一的纳米结构。但pH高于8或低于7，不断释放，如图3所示。

实施例4

1)将分子量为35万g/mol的聚赖氨酸(Ply)，包载物为32mg/mL Cur与1mg/mL GOx混合物，制备酶法辅助Ply/ATP/Cur/GOx凝聚体纳米递送系统；

2)分别在不同葡萄糖溶液0-80mM，葡萄糖在GOx酶作用下形成葡萄糖酸，pH下降，Cur释放；

3)酶法辅助Ply/ATP/Cur/GOx凝聚体纳米递送系统与葡萄糖添加量呈正相关，随葡萄糖量的增加，相同时间，释放率增加。同时，Ply/ATP/Cur/GOx凝聚体递送系统在葡萄糖环境中呈现时间依赖性，达到时间缓释效果，如图4和图5所示。

实施例5

1)将分子量为17万g/mol的聚赖氨酸(Ply)，包载物为32mg/mL Cur通过Tris-HCl，调pH为8，制备Ply/ATP/Cur凝聚体纳米递送系统；

2)将20mg/mL磷脂溶液加入到Ply/ATP/Cur凝聚体溶液(Ply/ATP/Cur为5-15％w/w)。磷脂溶液由98mol％DOPC或50mol％DOCP、22.5mol％DOPS、22.5摩尔％DOPE和5mol％Rh-PE；

3)脂质凝聚层在19℃下孵育至少8小时，使用10mL 50mM pH 7.27磷酸盐100mMNaCl缓冲液进行再水合。对溶液成像以确认脂质凝聚层形成，通过30nm过滤器进行10个循环，并在4℃下储存直到使用，可有效保护递送系统稳定性。

Claims

1.一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统，其特征在于，该递送系统由多肽聚赖氨酸通过添加ATP触发液-液相分离形成凝聚体，所述多肽聚赖氨酸中带正电的赖氨酸残基以多价方式与带负电的ATP相互作用，具有pH敏感响应递送特性，且该凝聚体在葡萄糖氧化酶辅助下实现高糖环境pH双响应敏感控释递送。

2.根据权利要求1所述的一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统，其特征在于所述多肽聚赖氨酸的分子量为5000-45万g/mol。

3. 根据权利要求1所述的一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统，其特征在于： pH靶向控释范围稳定为7-7.8，pH波动小，pH响应敏感，在pH<4时，凝聚体不形成。

4.根据权利要求1所述的一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统，其特征在于该凝聚体纳米递送系统还包括用于形成凝聚体外层的脂质体和油脂。

5.一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将多肽聚赖氨酸和ATP分别溶于缓冲溶液中，制得浓度为25mg/mL的多肽聚赖氨酸溶液和浓度为5mg/mL的ATP溶液；添加ATP触发，形成多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体溶液，往多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体溶液中添加葡萄糖氧化酶以实现高糖环境环境pH响应与控释，其中，多肽聚赖氨酸：ATP比率为1：1.1-2；

2）将包载物溶解在步骤1）制得的多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体溶液中，形成pH响应的多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米颗粒复合物溶液，在添加步骤中持续低速涡旋，确保溶液均一，包封率可达25-85%；

3）为保护多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送，将多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米颗粒复合物溶液与脂质体进行水合，即制得脂质体保护的pH靶向控释凝聚体纳米递送系统。

6.如权利要求5所述的一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统的制备方法，其特征在于步骤1）中，葡萄糖氧化酶的添加量占凝聚体质量的5-15%。

7.如权利要求5所述的一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统的制备方法，其特征在于步骤2）中，包载物添加比率为0.5-1.2，低速涡旋具体为在300-500rpm转速下进行磁力搅拌0.5-2h。

8.如权利要求5所述的一种pH响应多肽聚赖氨酸-ATP凝聚体纳米递送系统的制备方法，其特征在于步骤3）中，水合时间为3-8h，脂质体的浓度为10mg/mL，所述脂质体为磷脂、脂肪酸、结构脂中的任一种。

9.权利要求5所述的制备方法在制备食品级纳米运载体上的应用。

10.权利要求5所述的制备方法制备的凝聚体纳米递送系统在pH、高糖环境响应缓释递送中的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在pH靶向控释范围为7-7.8，所述凝聚体纳米递送系统在高糖环境，其释放率与葡萄糖溶液浓度呈正相关。